Informație

Ce determină o expresie de succes a proteinelor în E. coli?


Unele proteine ​​se exprimă bine într-o gazdă heterologă; altele - nu. Se cunosc câteva cerințe pentru a determina expresia proteinei, cum ar fi un promotor puternic (cum ar fi T7) pentru transcripție și un site puternic de legare a ribozomului pentru traducere. Lucrez cu o proteină, care constă din 2 subunități - alfa și beta. Ambii sunt pe o plasmidă cu promotor T7 în fața subunității beta (adică constructul este promotor T7, CDS pentru subunitatea beta, CDS pentru subunitatea alfa). Subunitatea beta se exprimă bine, dar alfa nu. Credeți că acest lucru are legătură cu mediul local (promotori, RBS, etc.) și cât de mult depinde de asta? Cum pot crește expresia proteinelor?


Un aspect important atunci când se exprimă o proteină dintr-un organism diferit în E. coli este că utilizarea codonilor din organismul original este probabil diferită de utilizarea codonilor din E. coli utilizată pentru exprimare (prejudecată de utilizare a codonilor).

Deși codul genetic este degenerat, nu toți codonii sunt egali. S-ar putea codifica pentru același aminoacid, dar organismele tind să favorizeze codoni specifici față de alții, iar ARNt pentru acești codoni tind să fie prezenți în concentrații diferite. Când aveți acum mulți codoni în secvența dvs. care sunt foarte rare în E. coli, expresia va avea de suferit deoarece ARNt pentru acești codoni nu este prezent în concentrații suficient de mari pentru a susține traducerea.

Există două moduri de a compensa acest lucru, fie îți faci ca E. coli să producă mai multe tARN rare, fie îți optimizezi secvența pentru a folosi codoni diferiți. Pentru prima soluție puteți cumpăra anumite tulpini de E. coli care conțin plasmide care codifică ARNt care sunt rare în E. coli, una dintre aceste tulpini este de ex. tulpina Rosetta BL21.

Pentru optimizarea utilizării codonilor există mai multe companii care oferă sintetizarea secvențelor optimizate. Există și instrumente disponibile online, dar nu am experiență directă cu acestea.

De asemenea, optimizarea nu este la fel de ușoară ca și folosirea codonului cel mai răspândit de fiecare dată, s-a demonstrat că optimizarea codonilor pentru a se potrivi cu viteza de traducere în organismul original poate spori randamentul expresiei. Pentru unele proteine, site-urile de pauză în timpul traducerii ar putea fi necesare pentru a asigura o pliere adecvată. Dacă proteina nu se pliază corect, aceasta va fi degradată rapid și randamentul dvs. va avea de suferit. Acest lucru este descris în articolul „Expresia heterologă a proteinelor este îmbunătățită prin armonizarea frecvențelor de utilizare a codonilor ale genei țintă cu cele ale gazdei de expresie” de la Angov și colab.

Veți găsi o imagine de ansamblu frumoasă despre întregul subiect în articolul „Ești unul într-un Google: optimizarea genelor pentru expresia proteinelor” din Welsh et al.


Ați încercat să vă puneți cele două gene pe două plasmide separate (cu origini diferite de replicare și selecție a antibioticelor, desigur) și să vă co-exprimați astfel? Dacă prima dintre cele două subunități se exprimă bine, iar a doua nu este, probabil că ribozomii cad de pe ARNm înainte de a transcrie complet a doua genă. Genele sunt de origine eucariotă? Cred că este dificil să „păcălească” ribozomii E. coli în tratarea secvențelor heterologe ca un operon, dar poate cineva cu mai multe cunoștințe de traducere procariotă ar putea ajuta.

De fapt, doar adăugarea unui al doilea promotor T7 în fața genei 2 ar ajuta probabil destul de mult:

Genele sunt transcrise fie de la promotori individuali, fie de la un singur promotor, ducând la un ARNm policistronic lung. S-a raportat că expresia policistronică duce la o expresie mai scăzută a proteinei codificate în aval, care poate fi exploatată pentru a influența stoichiometria unui complex proteic (9). A fost raportată o expresie mai mare de câteva ori cu promotori individuali comparativ cu transcrierea policistronică (10). (Sursă)

Știu din experiența personală că coexpresia utilizând două plasmide poate funcționa foarte bine cu genele potrivite!


Mad Scientist a acoperit potențialele probleme de codon-bias (care pot fi ameliorate cu Rosettas), dar, în general, am văzut o variabilitate extraordinară a ratelor de expresie între diferiți vectori (pET-28 vs pET-24) fără niciun motiv aparent. Laboratorul nostru a avut un succes extraordinar cu vectori inductibili IPTG (trecând de la pBC-SK la pET-24 expresia crescută de 50 de ori).

Dincolo de expresie, proteina poate fi pierdută atunci când se prepară extractul fără celule. Este posibil să nu fie în peleta celulară dacă este exportată prin amabilitatea unei peptide semnal sau poate fi aruncată în peleta „resturi” atunci când se învârte în jos celulele lizate dacă este slab solubilă. Am auzit o teorie conform căreia problemele de solubilitate pot fi exagerate de vectori care saturează utilajele de export, care pot împiedica sinteza și / sau pot fi atât de eficiente încât provoacă doar precipitații. The Manual de sistem pET sugerează că timpul de exprimare mai lung (peste noapte) la temperaturi mai mici (15-20 ° C) poate ajuta la probleme de solubilitate. Oricare ar fi motivul, ingineria peptidei semnal a crescut drastic expresia pentru multe dintre proteinele noastre.


Am găsit o lucrare foarte frumoasă: Designing Genes for Successful Protein Expression, care acoperă majoritatea factorilor care determină expresia proteinelor. Postez părți din el, pentru că sunt sigur că va fi util unora dintre voi.

Traducerea poate fi controlată la nivelul inițierii și alungirii. Inițierea traducerii depinde în principal de secvența situsului de legare a ribozomului (RBS) și de structura secundară a ARNm timpuriu. Alți factori determinanți ai expresiei proteinelor sunt mai puțin înțelese, dar la fel de puternice.

1. Inițierea traducerii

O componentă cheie care afectează inițierea traducerii în procariote este RBS care apare între 5 și 15 baze în amonte de cadrul de lectură deschis (ORF) AUG start codon. Legarea ribozomului la secvența Shine-Dalgarno (SD) din cadrul RBS localizează ribozomul la codonul de inițiere ... Afinitatea RBS pentru ribozom este un factor critic care controlează eficiența cu care sunt inițiate noi lanțuri polipeptidice. Această interacțiune este în competiție cu posibile interacțiuni de împerechere a bazelor care implică regiunea RBS care se poate forma în interiorul mRNA în sine. Astfel, secvențele SD cu perechea de bază mai slabă la ribozom sunt mai susceptibile la interferențe din structura ARNm. Cu toate acestea, unele experimente sugerează că secvențele SD cu afinitate prea puternică pot fi dăunătoare, în special la temperaturi mai scăzute, prin blocarea alungirii inițiale. De asemenea, critică este distanța dintre RBS și codonul de start cu 5-7 baze de la consensul SD AGGAGG fiind optim.

Numeroase linii de dovezi sugerează că 15-25 codoni inițiali din ORF merită o atenție specială în optimizarea genelor. Studiile au arătat că impactul codonilor rare asupra ratei de traducere este deosebit de puternic la acești primi codoni, pentru exprimare atât la Escherichia coli, cât și la Saccharomyces cerevisiae. La E. coli, scăderea peptidil-ARNt în timpul traducerii codonilor inițiali pare a fi accentuată de prezența codonilor NGG rari. Aceste efecte par a fi independente de structura secundară a ARNm local. Este, de asemenea, adevărat că expresia poate fi recuperată prin înlocuirea secvenței 5 'chiar și pentru secvențe care nu prezintă o structură de ARNm deosebit de puternică sau conțin codoni rari sau alte elemente dăunătoare evidente în această regiune.

2. Bias codon

Al doilea mod în care pot fi utilizate frecvențele codonului gazdă este acela de a se potrivi cu frecvențe codon gazdă în gena proiectată. Acest lucru se poate face pur și simplu prin alegerea fiecărui codon cu o probabilitate care se potrivește cu frecvența codonului gazdă ... Folosind seturi de gene larg variate în caracteristicile de proiectare a genelor, Welch și colab. a constatat că variația frecvențelor sinonime de utilizare a codonilor a avut un efect profund asupra cantității de proteine ​​produse în E. coli, independent de efectele secvenței 5 'locale. Variația a cel puțin două ordine de mărime în expresie a fost văzută datorită substituției dincolo de 15 codoni inițiali ai ORF. Această variație a fost puternic corelată cu frecvențele globale de utilizare a codonilor ale genelor, deși frecvențele codonilor găsite în cele mai mari variante exprimate nu corespundeau cu cele găsite în genom sau în genele endogene extrem de exprimate ale E. coli. Analiza multivariată a arătat că frecvențele codonilor specifici pentru aproximativ șase aminoacizi ar putea prezice diferențele de expresie observate. Nu este clar care este baza biochimică pentru această corelație.

3. Structura ARNm și alungirea translațională

În timp ce multe dovezi sugerează că structura ARNm poate interfera cu inițierea translațională atât în ​​procariote, cât și în eucariote, efectele structurii asupra alungirii sunt mai puțin bine înțelese. Acest lucru se poate datora, în parte, activității helicazei intrinseci a ribozomilor, care permite translația chiar prin agrafe foarte puternice și poate împiedica multe structuri să limiteze rata de translație fie în procariote, fie în eucariote. Poate mai important, structura ARNm este dificil de prezis, în special pentru mesajele traduse activ care sunt în flux continuu între diferite stări pliate și desfășurate.

4. Factori specifici proteinelor care oferă o complexitate suplimentară

Proteina poate fi deosebit de instabilă în gazdă, mai ales dacă este prost pliată din cauza instabilității inerente, a lipsei unor factori protetici suficienți sau a modificării necorespunzătoare post-translaționale ... Expresia proteinelor secretate și a membranei poate fi limitată de mecanismele de direcționare a acestor proteine ​​către membrana. Este chiar posibil ca secvența de aminoacizi proteici să limiteze eficiența translațională. De exemplu, se crede că prolina se traduce încet în E. coli, indiferent de codonul utilizat.

Expresia proteinei poate fi toxic către celula care duce la instabilitatea vectorului de expresie sau suprimarea gazdei a sintezei proteinelor ... O strategie comună de reducere a toxicității este reducerea expresiei la niveluri tolerabile. Promotorii cu o forță variată pot fi instrumente valoroase pentru a găsi o rată optimă de expresie pentru un randament maxim ... O modalitate potențială de a evita toxicitatea unor proteine ​​este direcționarea expresiei către periplasmă sau mediu. Acest lucru poate fi realizat prin fuziunea N-terminală a unei secvențe semnal de secreție.

Pentru mai multe informații, vă rugăm să citiți întreaga lucrare. De asemenea, vă recomand să citiți parametrii de proiectare pentru a controla expresia genetică sintetică în Escherichia coli.


Plasmide 101: Tulpini de E. coli pentru exprimarea proteinelor

Într-un blog anterior Plasmids 101, am analizat caracteristicile principale ale mai multor tulpini populare de E coli pentru propagarea ADN-ului. Deși sunt minunate în scopuri de clonare, acestea E coli tulpinile nu sunt de obicei potrivite pentru exprimarea proteinelor recombinante. Multe provocări pot apărea atunci când supraexprimăm o proteină străină în E coli. Vom trece în revistă potențialele capcane ale exprimării proteinelor recombinate și unele dintre cele mai populare tulpini comerciale concepute pentru a le evita.


Pași Proiect Proces Caracteristici Cusabio Perioada de grație
1 Construcția plasmidei Sinteza genei de optimizare a codonilor Optimizarea vectorilor multipli, Mai multe opțiuni pentru clienți
Optimizați mai mulți vectori în același timp Selectați vectorul cu cel mai mare randament, care poate scurta timpul de plumb
15-20 de zile lucrătoare
Restricția digestiei produselor PCR Legarea la vectorul de expresie, de ex. Pcold-SUMO, pGEX-4T-1, pET22b-JT etc.
Transformă celule competente TOP10 E.coil
Obțineți plasmida recombinantă corectă
2 Transformarea și screeningul tulpinilor Transformă plasmida recombinantă în celule gazdă, de ex. BL21 (DE3), Rosetta-gami B (DE3) pLysS, celule C41, cultură peste noapte la 37 ℃ Optimizare multi-condiții, selecție multi-hosts
În testul mic, temperatura și IPTG sunt optimizate pentru a obține cele mai potrivite condiții de cultură. Mai multe gazde sunt transformate în același timp pentru a selecta bacteriile gazdă cu cel mai mare randament.
5 zile lucrătoare
Selectați o singură colonie pentru expresia indusă la scară mică Detectați expresia proteinelor prin SDS-PAGE Păstrați cea mai bună colonie.
Optimizați condițiile de expresie
3 Exprimarea și purificarea proteinei țintă 1-10 L expresie pe scară largă Metode multiple de purificare (opțional)
Explorează diferite condiții cromatografice, inclusiv schimbul de ioni, hidrofob și altele, utilizând AKTA, apoi determină metoda optimă de purificare.
12-15 zile lucrătoare
Purificarea proteinelor
4 Includerea renaturării corpului Reîntoarcerea dacă proteina țintă este corpul de incluziune Diverse metode de repliere
O varietate de condiții de tamponare sunt utilizate pentru a selecta rapid cea mai bună formulă de tampon de repliere. Proteinele de reîncărcare cu puritate mai mare de 90% se obțin prin renaturare prin diluare, renaturare prin dializă, renaturare prin cromatografie pe coloană și așa mai departe. Solubilizarea și replierea pot fi realizate pentru mai mult de 95% din corpurile de incluziune.
5 Servicii suplimentare (opțional) Încărca Eliminarea etichetelor prin digestie cu restricție Servicii suplimentare flexibile
Clienții pot alege flexibil dintr-o varietate de servicii suplimentare la nevoile lor specifice, de ex. Îndepărtarea endotoxinelor, sterilizarea filtrelor, îndepărtarea etichetelor, liofilizarea etc. Unele sunt gratuite, iar altele necesită o taxă suplimentară.
3 zile lucrătoare
Liber Sterilizare prin filtrare Eliminarea endotoxinelor Liofilizare (Notă: Liofilizarea și filtrarea-sterilizare nu pot fi îndeplinite simultan) 2 zile lucrătoare
6 Control de calitate Se furnizează testul purității, concentrației etc. Raport QC. Raport detaliat COA
Fișa tehnică detaliată a produsului și COA sunt furnizate pentru fiecare proiect.
3-5 zile lucrătoare
Timp de plumb total 35-45 de zile lucrătoare

Cazul 1
Caracteristici: Proteina este o proteină de fuziune și este digerată cu protează PreScission peste noapte prin coloana de cromatografie de afinitate GST, ulterior cu purificare într-o etapă pentru a obține proteine ​​fără etichetă.

  • Banda 1 : Lizat celular (Săgeata indică proteina țintă de fuziune)
  • Banda 2 : Curge prin
  • Banda 3 : Proteine ​​digerate de protează PreScission (Săgeata indică proteina țintă)
  • Banda 4 : Îndepărtați impuritățile cu PBS
  • Banda 5 : eluție GSH (Săgeata indică proteina marcată cu GST)
  • Banda 6 protein Proteină țintă concentrată

Cazul 2
Caracteristici: După exprimare, proteina țintă a fost purificată prin cromatografie de afinitate pe coloană de nichel. Puritatea a atins 90%, iar randamentul a atins 20 mg / L

  • Banda 1 : Lizat celular
  • Banda 2 : Curge prin
  • Banda de eluție imidazol 3:30 mM
  • Eluție imidazol pe banda 4:60 mM
  • Banda 5 : 200 mM eluție imidazol
  • Banda 6 : 500 mM eluție de imidazol

Cazul 3
Caracteristici: Opțiuni de etichetă multiple pot fi furnizate pentru o proteină.

  • Eluție și concentrat de imidazol pe banda 1:60 mM
  • Banda 2 ution 200 mM eluție de imidazol și concentrat
  • Banda 3 : 500 mM eluție și concentrat de imidazol

Cazul 4
Caracteristici : Proteina recombinantă este funcțional activă.

Activitatea de legare a aqpZ cu ytfE

Măsurată prin capacitatea sa de legare într-un ELISA funcțional. AqpZ imobilizat la 5 μg / ml poate lega ytfE uman, EC50 al proteinei ytfE uman este de 197,90-259,70 μg / ml.

Sisteme de expresie caracteristice

pET22b-JT plasmid + Rosetta-gami B (DE3) pLysS bacterie gazdă Sistem de expresie la temperatură scăzută

Purtați un promotor puternic T7 Conține peptidă semnal PelB Expresie secretorie indusă de temperatură scăzută, care este propice corecției plierii proteinelor și sporirii solubilității proteinelor.

Clonare fără sudură, nu este necesară nici o enzimă de restricție.

Comparativ cu eticheta convențională 6xHis, eticheta N-terminală 10xHis are o capacitate de legare mai puternică în IMAC. Între timp, site-ul trombinei facilitează îndepărtarea etichetei.

Eticheta MYC-terminal C poate fi utilizată pentru detectarea WB și are o sensibilitate mai puternică în comparație cu eticheta His.

pCold-SUMO plasmid + Rosetta-gami B (DE3) pLysS gazdă sistem de exprimare la temperatură scăzută

Carry cspA puternic promotor Conține proteine ​​de fuziune SUMO care posedă o capacitate puternică de a promova expresia.

Clonare fără sudură, nu este necesară nici o enzimă de restricție.

Comparativ cu eticheta convențională 6xHis, eticheta N-terminală 10xHis are o capacitate de legare mai puternică în IMAC. Între timp, site-ul trombinei facilitează îndepărtarea etichetei.

Eticheta MYC-terminal C poate fi utilizată pentru detectarea WB și are o sensibilitate mai puternică în comparație cu eticheta His.


Li, C., Schwabe, J.W., Banayo, E. & amp Evans, R.M. Coexpresia partenerilor receptorilor nucleari le crește solubilitatea și activitățile biologice. Proc. Natl. Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 94, 2278–2283 (1997).

Rivas, F.V. și colab. Argonaute2 purificat și un ARNsi formează RISC uman recombinant. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 340–349 (2005).

Bross, P. și colab. Co-supraexprimarea chaperoninelor GroESL bacteriene depășește parțial asamblarea pliabilă neproductivă și tetramerul E coli–Acil-CoA dehidrogenaza cu lanț mediu uman exprimată (MCAD) care prezintă mutația prevalentă K304E cauzatoare de boală. Biochim. Biofizi. Acta 1182, 264–274 (1993).

Woestenenk, E.A., Hammarstrom, M., van den Berg, S., Hard, T. & amp Berglund, H. Efectul său de etichetă asupra solubilității proteinelor umane produse în Escherichia coli: o comparație între patru vectori de expresie. J. Struct. Funct. Genomică 5, 217–229 (2004).

Kapust, R.B. & amp Waugh, D.S. Escherichia coli proteina care leagă maltoza este neobișnuit de eficientă în promovarea solubilității polipeptidelor la care este fuzionată. Protein Sci. 8, 1668–1674 (1999).

Selzer, G., Som, T., Itoh, T. & amp Tomizawa, J. Originea replicării plasmidei p15A și studii comparative asupra secvențelor de nucleotide din jurul originii plasmidelor înrudite. Celula 32, 119–129 (1983).

Davison, J. Mecanismul de control al replicării ADN și incompatibilității în plasmidele de tip ColE1 - o revizuire. Gene 28, 1–15 (1984).

Ho, T.Q., Zhong, Z., Aung, S. & amp Pogliano, J. Plasmidele bacteriene compatibile sunt direcționate către locații celulare independente din Escherichia coli. EMBO J. 21, 1864–1872 (2002).

Song, J.J., Smith, S.K., Hannon, G.J. & amp Joshua-Tor, L. Structura cristalină a Argonautei și implicațiile sale pentru activitatea de tăiere RISC. Ştiinţă 305, 1434–1437 (2004).

Liu, J. și colab. Argonaute2 este motorul catalitic al ARN-ului mamiferelor. Ştiinţă 305, 1437–1441 (2004).

Meister, G. și colab. Argonaute2 uman mediază clivajul ARN vizat de miARN și siARN. Mol. Celula 15, 185–197 (2004).

Held, D., Yaeger, K. & amp Novy, R. Noi vectori de coexpresie pentru compatibilități extinse în E coli. în Novations 18, 4–6 (2003).


Producția de proteine ​​solubile de mamifer în Escherichia coli: identificarea caracteristicilor proteinelor care se corelează cu exprimarea reușită

Fundal: În căutarea strategiilor de expresie generică pentru familiile de proteine ​​de mamifere, mai mulți vectori de expresie bacteriană au fost examinați pentru capacitatea lor de a promova randamente ridicate de proteine ​​solubile. Proteinele studiate au inclus receptori de suprafață celulară (Efrine și receptori Eph, CD44), kinaze (domeniu citoplasmatic EGFR, CDK2 și 4), proteaze (MMP1, CASP2), proteine ​​de transducție a semnalului (GRB2, RAF1, HRAS) și factori de transcripție (GATA2, Fli1, Trp53, Mdm2, JUN, FOS, MAD, MAX). Au fost efectuate peste 400 de experimente în care exprimarea a 30 de proteine ​​de lungime completă și domenii de proteine ​​au fost evaluate cu 6 parteneri de fuziune N-terminal și 8 C-terminal diferiți. Exprimarea unui set suplimentar de 95 de proteine ​​de mamifere a fost, de asemenea, efectuată pentru a testa concluziile acestui studiu.

Rezultate: Mai multe caracteristici ale proteinei s-au corelat cu randamentul exprimării proteinelor solubile, inclusiv greutatea moleculară și numărul de reziduuri hidrofobe adiacente și regiuni de complexitate scăzută. Nu a existat nicio relație între expresia de succes și proteina pI, marea medie a hidropaticității (GRAVY) sau localizarea subcelulară. Doar proteinele citoplasmatice globulare mici, cu o greutate moleculară medie de 23 kDa, nu au necesitat o etichetă de îmbunătățire a solubilității pentru exprimarea solubilă la nivel înalt. Tioredoxina (Trx) și proteina de legare a maltozei (MBP) au fost cele mai bune fuziuni de proteine ​​N-terminale pentru a promova expresia solubilă, dar MBP a fost cel mai eficient ca o fuziune C-terminală. 63 din 95 de proteine ​​de mamifere exprimate la niveluri solubile mai mari de 1 mg / l ca fuziuni N-terminale H10-MBP și cele care nu au reușit au posedat, în medie, o greutate moleculară mai mare și un număr mai mare de aminoacizi hidrofobi adiacenți și regiuni de complexitate scăzută.

Concluzii: Prin analiza caracteristicilor proteice identificate aici, acest studiu va ajuta la prezicerea proteinelor și domeniilor mamiferelor care pot fi exprimate cu succes în E. coli ca produs solubil și, de asemenea, care sunt cele mai bine vizate pentru un sistem de expresie eucariotă. În unele cazuri, proteinele pot fi tăiate pentru a minimiza greutatea moleculară și numărul de aminoacizi hidrofobi adiacenți și regiuni de complexitate scăzută pentru a ajuta la exprimarea solubilă în E. coli.


Rezultate

Pentru a permite screening-ul IMP-urilor solubilizate cu detergent utilizând pata CoFi, acesta a fost modificat și optimizat pentru utilizarea detergenților (datele nu sunt prezentate).

The E coli proteinele din prezentul studiu au fost alese și clasificate în funcție de nivelurile lor de expresie obținute în experimentele anterioare de evaluare comparativă (a se vedea Materiale și metode). Din acest set am selectat opt E coli ținte precum și o proteină de membrană umană cu expresie nulă, scăzută sau medie (Tabelul 1). Toți IMP-urile au fost supuse mutagenezei aleatorii, screeningului blotului CoFi și caracterizării.

Tabelul 1.

Proteine ​​utilizate în acest studiu

Crearea de biblioteci aleatorii de mutageneză

Bibliotecile de mutații aleatorii au fost create folosind o polimerază disponibilă comercial, cu o rată de mutație ușor de controlat, care a fost limitată la 3 & # x020137 mutații / kb. Cadrul de citire deschis mutant (ORF) a fost donat în plasmida de expresie conținând o etichetă FLAG N-terminală și o C-terminală His6 tag folosind sistemul Gateway și transformat într-o tulpină de clonare, rezultând cel puțin 15.000 de colonii. Această bibliotecă amplificată a fost apoi recoltată și transformată în tulpina de expresie C41 și ecranată cu pata CoFi. De obicei, 6000 & # x020138000 colonii au fost selectate pentru fiecare bibliotecă.

CoFi blot screening și validarea culturii lichide

În bibliotecile corespunzătoare celor patru proteine ​​MP01, 02, 06 și 08, nu am reușit să detectăm clone care se exprimă la niveluri deasupra fundalului în blotul CoFi (Fig. 1A). Toate aceste patru proteine ​​au fost desemnate anterior ca fiind scăzute sau neexprimante (Eshaghi și colab. 2005) (Tabelul 1 Fig. Suplimentară 1). Bibliotecile celor cinci proteine ​​clasificate inițial ca expresori mici sau medii (MP03, 04, 05, 07 și 09) au prezentat variații considerabile de intensitate între colonii (Fig. 1B & # x02013D). Dintre aceste bloturi CoFi am selectat între 20 și 50 de colonii cu cele mai mari intensități. Pentru MP07, doar câteva colonii puternice au fost prezente și majoritatea coloniilor selectate au fost de intensitate medie. Coloniile selectate din diferitele proteine ​​au fost crescute și induse în culturi lichide împreună cu construcții WT duplicate. Folosind o strategie de separare prin filtrare bazată pe 96 de godeuri (Knaust și Nordlund 2001), urmată de un punct blot sondat cu un reactiv Ni-chelat, au fost identificate construcții de proteine ​​solubilizate cu detergent. Pentru țintele MP03, 04, 05, 07 și 09, s-a arătat că un număr de clone selectate exprimă mai bine decât WT (Tabelul 1).

Exemplu de bloturi CoFi pentru biblioteci aleatorii de mutageneză pentru patru ținte diferite. (A) MP01 care nu conține colonii considerate pozitive. (B) MP07 care arată doar câteva colonii pozitive. (C) MP05 și (D) MP09 ilustrând pete CoFi cu variații mari în nivelurile de expresie.

Pentru a obține o estimare a performanței blotului CoFi adaptat la detergent, am comparat 24 de colonii clasificate la nivel scăzut și 24 clasificate la mare din fiecare dintre bibliotecile MP04 și 05. Pentru MP07 am inclus și colonii de intensitate medie, deoarece foarte puține coloniile au fost judecate să exprime la un nivel înalt. Construcțiile au fost cultivate în culturi lichide și s-au făcut pete de material purificat. Pentru MP04 și MP05 a existat o corelație bună între evaluarea CoFi blot și intensitățile observate în punctele de material solubilizat (Fig. 2A, B, D, E), iar pentru MP07 am reușit să identificăm corect câteva clone semnificativ mai puternice. prezente în bibliotecă împreună cu mai multe construcții care se exprimă la un nivel mediu (Fig. 1B, 2C, F).

Verificarea metodei CoFi blot pentru proteinele de membrană. (A & # x02013C) Bloturile CoFi ale bibliotecilor pentru MP04 și 05 au fost utilizate pentru a împărți clonele din fiecare blot în categorii de nivel de expresie ridicat sau scăzut. Pentru MP07 am inclus și colonii care exprimă categorii de nivel mediu. Din fiecare blot, 48 de colonii considerate expresoare mari, medii sau scăzute au fost culese, crescute și induse pentru exprimare, alături de tipul sălbatic corespunzător în culturile lichide. Au fost realizate pete de material solubilizat din acestea. De mai sus punctele de tip sălbatic cvadruplicat, sunt prezente patru probe de tip sălbatic neduse. (D & # x02013F) Intensitățile punctului se șterg A & # x02013C au fost cuantificate. Punctele de tip sălbatic au fost utilizate ca referință și au fost setate la 1. Intensitățile medii sunt descrise ca bare, iar intensitățile individuale sunt reprezentate ca benzi.

Expresie și purificare la scară medie

Pentru a confirma diferențele de niveluri de expresie, am efectuat purificări IMAC la scară medie pe cel puțin probe triplate pentru cea mai bună clonă de expresie și WT corespunzător pentru țintele MP03, 04, 05, 07 și 09. Proteinele purificate au fost analizate fie prin Western blots (MP03, 05 și 09) sau prin punct blots (MP04 și 07).

În toate cazurile, creșterea randamentului a fost semnificativă, iar diferențele din seturile de testare au fost mici (Fig. 3A și # x02013E). Cea mai mică modificare a randamentului în aceste experimente la scară medie a fost o creștere de aproximativ 1,5 ori în medie pentru MP03. Cea mai mare schimbare observată a fost pentru MP07, unde am văzut o creștere de aproximativ 12 ori în medie.

Comparație între cele mai bune clone care exprimă și tipul sălbatic corespunzător. Au fost efectuate mai multe purificări la scară medie pentru (A) MP03 n = 3, (B) MP04 n = 7, (C) MP05 n = 4, (D) MP07 n = 7, și (E) MP09 n = 4. Probele purificate au fost analizate fie prin Western blots (A,C,E) sau prin puncte (B, D) și intensitățile benzii / punctelor au fost determinate semi-cantitativ. Intensitatea de tip sălbatic a fost setată la 1 și fiecare valoare a barei reprezintă media & # x000b1 SD a n experimente. (F) Eșantioane purificate după purificări la scară largă, analizate pe SDS-PAGE. (G & # x02013I) Cromatograme de filtrare pe gel din purificări la scară largă de (G) MP03, (H) MP07 și (Eu) MP09. Vidul este indicat de o săgeată. Pentru cea mai bună expresie a clonei din fiecare țintă, am obținut în medie 1 mg de proteină pură (după o purificare în doi pași) per L de cultură LB (la un OD600 din & # x0223c2.0).

Expresie și purificare pe scară largă

Țintele MP03, 07 și 09 au fost exprimate în cultură lichidă la scară largă (4 și # x0201312 litri) și supuse purificării de afinitate și filtrării pe gel. Probele purificate au fost analizate prin SDS-PAGE colorate cu Coomassie (Fig. 3F). Cromatogramele de filtrare pe gel au arătat că proteinele pot fi purificate ca neagregate și că profilul cromatografic al fiecărei clone seamănă cu cel al WT (Fig. 3G & # x02013I).

Pentru aceste proteine, s-a făcut o determinare mai precisă a randamentului îmbunătățit al expresiei clonei prin calcularea ariei de sub curba cromatografică. Pentru MP03, creșterea randamentului a fost îmbunătățită cu 25%, similar cu cantitatea estimată din experimentele la scară medie. Clonele unu și doi din MP09 au arătat o creștere a expresiei de 60% și respectiv 80%, iar MP07 a avut o îmbunătățire a expresiei de 40 de ori (4000%).

Analiza secvenței

Clonele pozitive selectate din blotul CoFi care au dat niveluri crescute de expresie în culturi lichide au fost secvențiate pentru a determina amploarea și localizarea mutațiilor. În medie, s-au observat 0,60 substituții de aminoacizi la 100 de aminoacizi (Tabelul 1). Clonele care prezintă doar o creștere moderată, adică aproape de nivelurile de expresie de tip sălbatic, au fost, de asemenea, secvențiate și au avut aceleași rate de mutație. Deoarece nu există o structură disponibilă determinată experimental a proteinelor noastre țintă, am prezis structura secundară a proteinelor folosind TMHMM (Krogh și colab. 2001). Aceste rezultate au fost apoi utilizate pentru a crea un model de structură secundară pe care au fost reprezentate mutațiile (Fig. 4A & # x02013E). În general, mutațiile au fost distribuite uniform pe întreaga proteină. Toate substituțiile din clonele pozitive sunt rezumate în Tabelul suplimentar 1.

Predicția structurii secundare și analiza localizării mutațiilor. Topologia pentru ținte (A) MP03, (B) MP04, (C) MP05, (D) MP07 și (E) MP09 a fost prezis folosind TMHMM (22). Numărul clonei și locația mutațiilor sunt indicate prin culori diferite. Clonele care se exprimă la cele mai înalte niveluri sunt reprezentate de cercuri mai mari. Segmentele transmembranare prezise sunt afișate în gri mai închis.


I. Protocol de exprimare în E coli

Protocolul general al procesului de exprimare de la genă la proteină este dat mai jos.


Faza 1: Sinteza genei codon optimizată și construcția vectorială

  • Optimizarea structurii codonului și ARNm
  • Fuzionați gena cu o etichetă proteică și introduceți-le într-un vector de expresie
  • Verificați corectitudinea construcției prin secvențierea

Faza 2: Transformă vectorul de expresie în E coli Celule competente

  • Adăugați vectorul de expresie la celulele competente decongelate
  • Adăugați celule șocate la căldură la bulionul LB și agitați
  • Plătiți cultura celulară pe plăci de agar LB cu antibiotic adecvat

Faza 3: Cultura de început

  • Alegeți o singură colonie de tulpină de expresie în 5 ml de LB cu antibiotic adecvat
  • Se agită la 37 ° C timp de 3 până la 5 ore

Etapa 4: Extinderea culturii de început

  • Extindeți cultura adăugând cultura inițială la un volum mai mare de LB cu antibiotic (temperatura camerei)
  • Se incubează timp de 1-4 ore până când densitatea culturii OD600 ajunge la 0,5-0,6

Notă: Plasați balonul cu bumbac sau un capac de balon de cultură pentru a permite culturii să se oxigeneze fără a se contamina mediul.
Faza 5: Inducție

  • Induceți expresia prin adăugarea de IPTG la o concentrație finală de 0,5 mM după ce cultura a atins OD600 0,5-0,6
  • Induceți timp de 3-4 ore la 37 ℃ cu agitare

Notă: IPTG este o soluție înghețată în congelatorul de -20 ℃.

Opțiunea 2: Inducerea temperaturii camerei (20 ℃)

  • Se răcește cultura la temperatura camerei punând în frigider sau baie de apă cu gheață după ce a ajuns la OD600 0,5-0,6
  • Induceți expresia prin adăugarea de IPTG la o concentrație finală de 0,1 la 1,0 mM
  • Induceți peste noapte (12-18 ore) la temperatura camerei (20 ℃) ​​cu agitare

Faza 6: Colectarea celulelor și liză

  • Centrifugați celulele la 3.500 x g timp de 20 de minute
  • Resuspendă celulele în PBS rece cu gheață și recentrifugează într-un tub de dimensiuni adecvate
  • Îndepărtați supernatantul și înghețați peleta pentru procesare ulterioară
  • Lyse celule folosind protocolul adecvat

Expresia proteinei recombinate în Pichia Pastoris

Introducere in Pichia pastoris

Pichia pastoris este o drojdie metilotrofică și poate fi utilizată ca sistem de expresie heterolog [1]. Este un microorganism unicelular care este ușor de manipulat și cultivat ca. Escherichia coli [2]. Între timp, ca eucariot, posedă capacitățile de modificări post-translaționale efectuate de celulele eucariote superioare. Proteinele care se exprimă ca corpuri de incluziune inactive în sistemele de expresie bacteriană pot fi, prin urmare, produse ca molecule biologic active în P. pastoris, cu prelucrare proteolitică corectă, plierea, formarea legăturii disulfurice și glicozilarea. În plus, P. pastoris Sistemul este, de asemenea, considerat a fi mai ușor, mai rapid și mai rentabil de utilizat decât sistemele de expresie dezvoltate din eucariote superioare, cum ar fi celulele de insecte și sistemele de celule de cultură de țesuturi de mamifere. Nivelurile de exprimare a proteinelor în P. pastoris sunt, de asemenea, în general mult mai mari. Ca drojdie, împărtășește avantajele manipulărilor genetice ușoare cu Saccharomyces, în plus, are avantajul de a avea niveluri de expresie a proteinelor heteroloage cu 10-100 ori mai mari. Toate caracteristicile de mai sus au făcut Pichia un sistem foarte util de exprimare a proteinelor. It is worth mentioning that, several techniques developed for Saccharomyces initially can also be applied to Pichia, including transformation by complementation, gene disruption and replacement.

Pichia pastoris is a type of methylotrophic yeast and thus is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source [3] . The first step in the metabolism of methanol is the oxidation of methanol into formaldehyde by molecular oxygen. The reaction also generates hydrogen peroxide except for formaldehyde. To avoid the toxicity of hydrogen peroxide, methanol metabolism normally takes place within the peroxisome, a specialized cellular organelle. Alcohol oxidase, the enzyme that catalyzes the oxidation of methanol has a poor affinity for oxygen, and thus Pichia pastoris has to generate large amounts of the enzyme as compensation. In the meantime, the promoter regulating the production of the enzyme is therefore used to drive heterologous protein expression in Pichia.

There are two genes code for alcohol oxidase in Pichia, AOX1 and AOX2 [4] . Generally, a majority of the activity of the enzymes relies on the AOX1 gene. Its expression is largely controlled by methanol. A plasmid-born version of the AOX1 promoter is applied to induce expression of inserted gene of interest for the desired heterologous protein [3,4] . Although AOX2 is about 97% homologous to AOX1, its growth on methanol is much slower than that of AOX1.

To be more specific, the expression of the AOX1 gene is controlled at the level of transcription. The regulation of AOX1 gene is a two-step process, which includes a repression mechanism and an induction mechanism. Since growth on glucose can repress transcription process even when methanol exists growth on glycerol is recommended for optimal induction with methanol.

As to the expression pattern of heterologous protein in Pichia pastoris, it can be either intracellular or secreted, depending on the chosen expression vector. Secretion requires the presence of a signal peptide on the protein via secretory pathway. A major advantage of secreted expression of heterologous protein is that Pichia pastoris itself secrets very low levels of native proteins. Thus the secreted heterologous comprises the majority of the total protein in Pichia growth medium and therefore simplifies subsequent purification procedure of the protein [1] .

Typically, posttranslational modifications in Pichia include removal of signal sequences, folding, disulfide bridge formation and O-/N-linked glycosylation. In mammals, O-linked oligosaccharides are composed of sugars including N-acetygalactosamine, galactose and sialic acid [2] . While in lower eukaryotes like P.pastoris, the added O-linked oligosaccharide simply refers to mannose residues.

P. pastoris has become a highly successful system for the expression of heterologous genes. Several important factors that contribute to its rapid spread and wide range application are summarized as following points [2] .

a.A promoter derived from the alcohol oxidase I (AOX1) gene of P.pastoris that is appropriate for the precise expression of foreign genes.
b. Similar techniques of the molecular genetic manipulation in P.pastoris to those from Saccharomyces cerevisiae, one of the most well-characterized experimental systems in modern biology.
c. P.pastoris prefers respiratory growth, which is a key physiological trait which allows its culturing at high cell densities relative to fermentative yeasts.

Our trained custom service group will perform all the steps for the fastest expression of your target protein using the P.pastoris Expression System, which will definitely save your resources and time.

Experimental Outline

The flow chart below illustrates the overall experimental process required for recombinant protein production using the Pichia Expression System.

Protocol for Recombinant protein expression using the Pichia Expression System

The following protocol can be a reference for you to understand more details of the techniques utilized in our lab and workflow involved in producing the protein of interest using P.pastoris.

1. Select the appropriate Expression Vector for your target gene.

You may choose to express your protein intracellularly if your protein is cytosolic and non-glycosylated. You can also have your target protein secreted into the culture media if your protein is generally secreted, glycosylated or directed to an intracellular organelle.

2. Transformation into E.coli.

eu. Insert the target gene in frame with the expression vector.
ii. Transform the E.coli with the ligation mixture by electroporation or chemical methods.
iii. Add LB medium to the cells for recovery after heat shock or electroporation.
iv. Plate on LB medium with Zeocin.
v. Incubate overnight.

3. Analyze transformants.

eu. Select Zeocin-resistant colonies and inoculate into LB medium with Zeocin.
ii. Grow overnight and isolate plasmid DNA.
iii. Sequence the gene construct to confirm the correct insertion of gene within the vector.

4. Preparation for transformation

Prior to transformation and selection in Pichia, the plasmid should be linearized. Vector linearized within the 5’ AOX1 region will integrate into the host 5’ AOX1 region by gene insertion.

eu. Digest the plasmid DNA with selected restriction enzymes.
ii. Check the digested mixture for complete linearization by agarose gel electrophoresis.
iii. Once the vector is confirmed to be completely linearized, use heat treatment for inactivation or add EDTA to cease the reaction immediately.
iv. Use phenol/chloroform for extraction and ethanol for precipitation of the DNA.
v. Centrifuge the solution and wash the pellet DNA with ethanol.
vi. Resuspend the DNA in sterile water after air-dry for immediate use or store at -20°C.

5. Electroporation of Pichia.

The method of electroporation is strongly recommended because it gives the highest transformation frequency in Pichia.

eu. Grow the selected P.pastoris strain in yeast medium overnight.
ii. Add fresh medium in the overnight culture. Grow overnight again.
iii. Centrifuge the cells and resuspend with ice-cold, sterile water. Repeat twice.
iv. Centrifuge the cells, then resuspend with ice-cold sorbitol. Repeat twice. Place the cells on ice before use.
v. Mix the cells with linearized DNA.
vi. Transfer the mixture to an ice-cold electroporation cuvette. Incubate on ice.
vii. Add ice-cold sorbitol to the cells, then transfer the cuvette content and incubate at 30°C.
viii. Spread the cells on plates for Zeocin selection.
ix. Incubate the plates until colonies form.
X. Pick 10-20 colonies for further selection.

6. Analyze Pichia transformants

eu. Inoculate yeast medium with the chosen single colony of Pichia încordare. Grow overnight.
ii. Dilute the cells from the overnight culture and grow approximately 4-6 h.
iii. Centrifuge the cells and keep the pellet.
iv. Resuspend the cell pellet and get the competent cells.
v. The cells can be kept at room temperature and used for transformation assay at once or frozen for storage.

7. Transformation assay

The following procedure provides details of transformation of freshly prepared or frozen competent Pichia cells. Note that transformation efficiency may vary among different Pichia strains and expression vectors used.

eu. Add linearized recombinant vector DNA to the competent cells.
ii. Add solution containing PEG into the DNA/cell mixture.
iii. Incubate the transformation reaction for 1h at 30°C. Mix the reaction solution to increase transformation efficiency.
iv. Treat with heat shock and split the cells into microcentrifuge tubes for incubation.
v. Centrifuge the cells and keep the pellet.
vi. Resuspend and combine the cells.
vii. Plate the cells for selection. Incubate the plates until colonies appear.

8. Determine the Mut (Methanol Utilization Slow) phenotype.

Identify the expression levels among several chosen Mut phenotypes by SDS-PAGE analysis and screen for the high-expression Pichia recombinant clones. This may help optimize the expression condition of the recombinant clone.

The effectiveness of expression conditions of Pichia strain with Mut phenotype can be tested as follows.

eu. Include a control gene transformed with the parent vector as a control for background intracellular expression.
ii. Inoculate a single colony in a baffled shaking flask and grow at 28-30°C.
iii. Harvest the cells and centrifuge at room temperature.
iv. Discard supernatant and resuspend cell pellet. Cover the flask with 2 layers of sterile gauze and continue growth.
v. Add methanol every 24 hours to maintain induction.
vi. Transfer 1 ml of the expression culture to a fresh microcentrifuge tube to analyze expression levels at a series of time points (i.e., 0-96 h post-induction).
vii. Determine the optimal time to harvest the cells. Centrifuge the cells at room temperature.
viii. For secreted expression, transfer the supernatant to a fresh tube and store until ready to assay. While, for intracellular expression, discard the supernatant and store the cell pellets until ready to assay.
ix. Analyze the supernatants and cell pellets respectively for protein expression by SDS-PAGE and Western blot.

The above steps can be adjusted to optimize expression for your target protein.

9. Scale-up expression.

Once expression condition is optimized, larger baffled flasks or fermentation will be utilized to increase the culture volume for scale-up production of target protein.

Note that proteins secreted into the media are normally more than 50% homogeneous and need additional purification. Therefore it is an optimal step to concentrate the protein before the purification process if the expression level is low. Commonly used methods for this step are ammonium sulfate precipitation, lyophilization and centrifuge concentrator for small volumes [5] .

Referințe:

[1] Higgins D R. Overview of protein expression in Pichia pastoris[J]. Curr Protoc Protein Sci, 2001, Chapter 5: Unit5 7.
[2] Higgins D R, Cregg J M. Introduction to Pichia pastoris[J]. Methods Mol Biol, 1998, 103: 1-15.
[3] Lundblad R L. Glycosylation in Pichia pastoris[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1999, 30 ( Pt 3): 191-2.
[4] Bretthauer R K, Castellino F J. Glycosylation of Pichia pastoris-derived proteins[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1999, 30 ( Pt 3): 193-200.
[5] Buckholz R G, Gleeson M A. Yeast systems for the commercial production of heterologous proteins[J]. Biotechnology (N Y), 1991, 9(11): 1067-72.


Introducere

Membrane proteins (MP) play a central role in several biological processes, which includes cell signaling, ion and metabolites transport and energy conversion. Since the first MP structure was determined in 1986 1 , over 450 unique MP structures have been obtained (see crystal structure list from White 2 and NMR structure list from Warschawski 3 ). They provide molecular details explaining how MP work. Despite numerous breakthroughs in X-ray diffraction 4,5 , NMR 6 and electron microscopy 7 , as well as in MP production 8,9,10,11 and stabilization 12 , the structural biology of MP is hampered by the production of the recombinant protein and its purification in a functional state. In 1986, Studier and colleagues 13 set up a powerful bacterial expression system, in which the RNA polymerase from the bacteriophage T7 specifically drove the transcription of the target gene inserted in the expression plasmid, under the control of the T7 promoter. However, one of the main drawbacks of the T7 based expression system is that the rate of transcription of the target gene is rather fast because the T7 RNA polymerase (T7 RNApol) transcription activity is over ten times faster than E coli RNA polymerase. Moreover, the expression system is further enhanced by the copy number of the expression plasmid. Consequently, upon expression of the T7 RNApol, an excess of target RNA is produced, which is often toxic to the cell and triggers uncoupling between transcription and translation and growth arrest 14,15 . Therefore, several strategies have been developed to attenuate and better regulate the T7 expression system: 1. Introducing a T7/lac hybrid promoter within the expression plasmid 2. Over-expressing the T7 lysozyme, a natural inhibitor of the T7 RNApol 16 3. Expressing the T7 RNApol under the control of the tightly regulated arabinose promoter (BL21-AI, Invitrogen).

In 1996, two spontaneous mutants of the BL21λ(DE3) bacterial host, namely C41λ(DE3) and C43λ(DE3), were isolated by exploiting the toxicity of the over-expression of the oxoglutarate mitochondrial carrier gene and of atpF encoding the b subunit of the E coli ATP synthase, respectively 17 . We found that the level of accumulation of the target gene mRNA is ten times lower in C41λ(DE3) and is delayed by one hour in the C41λ(DE3)-derived bacterial host, C43λ(DE3). More recently, Wagner și colab. have shown that the level of T7 RNApol is strongly reduced in both mutants, thereby allowing the bacterial cell to mediate cell growth with protein production 18 . Ensuring viability allowed metabolic adaptation, as illustrated by the production of the b subunit of the ATP synthase. In the C41λ(DE3) host, the b subunit was found in a partially unfolded state whereas in the C43λ(DE3) host, the production of the protein was accompanied by intense membrane proliferation with the b subunit in the correctly folded state 19 . In parallel to developments in the T7 based expression system, alternative expression systems have been established by employing arabinose 20 , lactose, tetracycline 21 , or T5 promoters 22 . Today, a profusion of expression plasmids and bacterial hosts are available for protein over-production 23,24 , however there is no clear rationale for choosing the appropriate bacterial expression system in each individual case.

Our objective here was to perform a global analysis of existing expression systems in the frame of MP production and structure determination. In a first step, entry codes referring to membrane protein structures obtained from E coli were extracted from the Protein Data Bank (PDB) and the two major expression systems, T7 and arabinose promoter based, were identified. In a second step, a bibliographic database was constructed to perform an extensive analysis of expression protocols. The results we have obtained thus provide a systematic set of rules for the successful production of membrane proteins in E coli.


Introducere

Prion diseases, also referred as transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), are a family of rare progressive neurodegenerative disorders that affect both humans and animals [1]. TSEs include, for instance, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle, and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans. These disorders are characterized by long incubation periods and characteristic spongiform changes in the brain associated with neuronal loss. The causative agent of TSEs is an infectious protein known as prion (also denoted as PrP Sc ) [2]. This pathogenic beta-sheet-rich conformer derives from the normal, mostly alpha-helical isoform, cellular prion protein (PrP or PrP C ), through a conformational conversion event which leads to aggregates in the brains of affected individuals leading to neurodegeneration [3].

Since the identification of prions as the causing agent of TSEs, recombinant PrP has been instrumental to study the structural and biophysical aspects of prion amyloidosis [4].

Due to its easy handling, inexpensive medium and large-scale production, the enteric bacterium Escherichia coli (E coli) is the organism of choice for the production of numerous recombinant proteins [5]. However, expression of mammalian proteins in E coli remains difficult and often results in inactive aggregates because the recombinant proteins do not fold properly in this host [6]. For example, recombinant PrP is largely expressed as inclusion bodies [7]. Most refolding protocols require a large amount of reagents and are time consuming. Success is highly dependent on the experimenter's savoir-faire. Attempts to assist proper folding of the PrP in the cytoplasm of E coli by co-expression with bacterial chaperones failed [8]. As the formation of a disulfide bond is essential for PrP proper folding, expression of full-length PrP in the periplasm of E coli was also investigated, resulting in soluble PrP which is partially degraded at the unstructured N-terminal end [9]. It has been observed that PrP can interact with several chaperones from the endoplasmic reticulum (ER) [10], including Pdia3 (also known as ERp57) and Grp58 (ERp60) [11], suggesting that in physiological condition, PrP requires assistance to fold into the correct conformation. In addition, PrP contains a disulfide bond which is crucial for the proper α-helical fold [12]. Based on these observations, we investigated the use of QSOX as a folding catalyst for PrP in the cytoplasm of E coli. QSOX is a human chaperone that introduces disulfide bonds in secreted proteins downstream of the ER [13], and has been shown to be enzymatically active in the bacterial cytoplasm [14].

In the present study, we describe for the first time the production of soluble PrP of both mouse (MoPrP) and human (HuPrP) using co-expression with QSOX in the E coli cytoplasm.


Priveste filmarea: Despre formarea proteinelor - Meloproteine (Ianuarie 2022).