Informație

Cum pot efectua testul de neutralizare a virusului pentru gripă?


Cum pot efectua un test de microneutralizare a virusului pentru virusul gripal folosind ser de la șoareci vaccinați cu acest virus?


Există o serie de protocoale diferite, dar cel canonic este publicat pe site-ul OMS pentru gripă:

DIAGNOSTIC SEROLOGIC AL INFLUENȚEI PRIN ANALIZA MICRONEUTRALIZĂRII

Oferă un protocol detaliat, pas cu pas.


Prezentare generală a metodelor de testare a gripei

Testarea virusului gripal nu este necesară pentru a stabili un diagnostic clinic de gripă la pacienții ambulatori cu suspiciune de gripă, în special în timpul activității gripale crescute atunci când virusurile gripale sezoniere A și B circulă în comunitatea locală. Cu toate acestea, testarea virusului gripal poate informa managementul clinic atunci când rezultatele pot influența deciziile clinice, cum ar fi dacă se inițiază un tratament antiviral, se efectuează alte teste diagnostice sau se pun în aplicare măsuri de prevenire și control al infecției pentru gripă. Testarea virusului gripal este recomandată tuturor pacienților cu suspiciune de gripă care sunt internați la spital. Cel mai important, clinicienii ar trebui să înțeleagă limitările testelor de virus gripal și cum să interpreteze corect rezultatele, în special rezultatele negative. În timpul unui focar de boală respiratorie într-un cadru închis (de exemplu, spitale, unitate de îngrijire pe termen lung, vas de croazieră, internat, tabără de vară) testarea infecției cu virusul gripal poate fi foarte utilă pentru a determina dacă gripa este cauza focarului.

Teste ale virusului gripal

Testele de diagnostic disponibile pentru detectarea virusurilor gripale la probele respiratorii includ analize moleculare (inclusiv teste moleculare rapide, reacție în lanț cu transcripție inversă a polimerazei (RT-PCR) și alte teste de amplificare a acidului nucleic) și teste de detectare a antigenelor (inclusiv teste rapide de diagnosticare a gripei și teste de imunofluorescență). Cultura virală este importantă în scopuri de sănătate publică, dar nu oferă rezultate la timp pentru a informa managementul clinic. Sensibilitatea și specificitatea oricărui test pentru virusurile gripale la probele respiratorii pot varia în funcție de tipul metodei de testare și de testul specific utilizat, timpul de la debutul bolii până la recoltarea probelor, calitatea probei colectate, sursa respiratorie a probei, manipularea și prelucrarea specimenului și timpul de la colectarea specimenului până la testare. Probabilitatea post-test sau valorile predictive (valori predictive pozitive și negative) ale unui test asupra virusului gripal depind de prevalența virusurilor gripale sezoniere circulante în populația de pacienți și de caracteristicile specifice ale testului (sensibilitate și specificitate) comparativ cu standardul & ldquogold standard și comparația rdquo test (test molecular sau cultură virală). Ca și în cazul oricărui test de diagnostic, rezultatele ar trebui evaluate în contextul altor informații clinice și epidemiologice disponibile furnizorilor de servicii medicale. Testarea serologică nu oferă rezultate în timp util pentru a informa deciziile de management clinic.

Societatea de Boli Infecțioase din America (IDSA) recomandă utilizarea testelor moleculare rapide de gripă peste testele rapide de diagnosticare a gripei (RIDT) pentru detectarea virusurilor gripale la specimenele respiratorii ale pacienților ambulatori. IDSA recomandă utilizarea RT-PCR sau a altor teste moleculare pentru depistarea virusurilor gripale la specimenele respiratorii ale pacienților spitalizați. Consultați pictograma externă IDSA Influenza Clinical Practice Guidelines pentru recomandări privind testarea gripei și informații despre interpretarea rezultatelor testelor.

Tabelul 1: Metode de testare a virusului gripal

Analize moleculare rapide

Testele moleculare rapide sunt un fel de test de diagnosticare a gripei moleculare pentru detectarea acizilor nucleici ai virusului gripal la specimenele tractului respirator superior cu sensibilitate ridicată (90-95%) și specificitate. Sunt disponibile teste moleculare rapide autorizate de FDA care produc rezultate în aproximativ 15-30 de minute. Unele dintre aceste teste moleculare rapide sunt renunțate la CLIA pentru utilizarea la punctul de îngrijire.

Alte teste moleculare

Reacția în lanț cu transcripție inversă-polimerază (RT-PCR) și alte teste moleculare pot identifica prezența ARN-ului viral gripal sau a acizilor nucleici în probele respiratorii cu sensibilitate și specificitate foarte ridicate. Unele teste moleculare sunt capabile să detecteze și să discrimineze infecțiile cu virusurile gripale A și B, alte teste pot identifica subtipurile specifice ale virusului gripal sezonier A [A (H1N1) pdm09 sau A (H3N2)]. Aceste teste pot produce rezultate în aproximativ 45 de minute până la câteva ore, în funcție de test. În special, detectarea ARN-ului viral gripal sau a acizilor nucleici prin aceste teste nu indică neapărat detectarea virusului infecțios viabil sau a replicării virale gripale în curs. Este important să rețineți că nu toate testele au fost aprobate de FDA pentru utilizarea diagnosticării. Unele teste moleculare multiple sunt disponibile, care pot detecta acizii nucleici virali gripali și pot distinge infecția cu virusul gripal de alți agenți patogeni respiratori și pot fi, de asemenea, utile pentru gestionarea pacienților cu imunosupresie severă sau pentru utilizare în identificarea cauzei unui focar instituțional de boală respiratorie.

Teste rapide de diagnosticare a gripei

Testele rapide de diagnosticare a gripei (RIDT) sunt teste de detectare a antigenului care pot detecta antigene virale gripale în 10-15 minute cu sensibilitate moderată (50-70%) și specificitate ridicată. Unele teste sunt renunțate la CLIA și aprobate pentru utilizare în orice ambulatoriu, în timp ce altele trebuie utilizate într-un laborator clinic moderat complex. Unele RIDT utilizează un dispozitiv de citire a analizorului pentru a standardiza rezultatele pentru a îmbunătăți sensibilitatea (75-80%). FDA cere acum RIDT-uri pentru a atinge 80% sensibilitate. Detectarea antigenului virusului gripal nu indică neapărat detectarea virusului infecțios viabil sau a replicării virale gripale în curs.

Niciunul dintre testele rapide de diagnostic gripal nu oferă informații despre subtipurile virusului gripal A. Tipurile de specimene acceptabile pentru utilizare (adică aspirații nazofaringiene sau nazale, tampoane sau spălări) variază, de asemenea, în funcție de test. Specificitatea și, în special, sensibilitatea testelor rapide de diagnostic gripal sunt mai mici decât pentru cultura virală și RT-PCR și variază în funcție de test. Cele mai multe dintre testele rapide de diagnosticare a gripei care pot fi făcute într-un cabinet medical și rsquos sunt aproximativ 50-70% sensibile la detectarea antigenelor virusului gripal și mai mari de 90% specifice. Recent, FDA a reclasificat RIDT-urile și a publicat cerințele pentru o precizie îmbunătățită, inclusiv o sensibilitate mai mare. Testele cu sensibilitate scăzută până la moderată și specificitate ridicată pot produce rezultate fals negative mai frecvent decât rezultate fals pozitive, în special în timpul activității de vârf a gripei în comunitate. Datorită sensibilității mai scăzute a testelor rapide de diagnosticare a gripei, clinicienii ar trebui să ia în considerare confirmarea rezultatelor testelor negative cu analize moleculare, în special în perioadele de activitate comunitară maximă de gripă și / sau în timpul unor focare de gripă instituționale suspectate din cauza posibilității rezultatelor fals negative RIDT. În schimb, rezultatele RIDT fals-pozitive sunt mai puțin probabile, dar pot apărea și sunt mai frecvente în perioadele cu activitate gripală scăzută. Prin urmare, atunci când interpretează rezultatele unui test rapid de diagnosticare a gripei, clinicienii trebuie să ia în considerare testul în contextul nivelului de activitate gripală în comunitatea lor (vezi Algoritmul pentru a ajuta la interpretarea rezultatelor testelor gripale și la luarea deciziilor clinice în perioadele atunci când virusurile gripale circulă în comunitate și în algoritm pentru a ajuta la interpretarea rezultatelor testelor gripale și la luarea deciziilor clinice în perioadele în care virusurile gripale NU circulă în comunitate pentru mai multe informații). Fișele de ambalare și laboratorul care efectuează testul trebuie consultate pentru mai multe detalii cu privire la utilizarea testelor rapide de diagnosticare a gripei.

Imunofluorescența

Testele de imunofluorescență sunt teste de detectare a antigenului care necesită în general utilizarea unui microscop fluorescent pentru a produce rezultate în aproximativ 2-4 ore cu sensibilitate moderată și specificitate ridicată. Ambele teste de colorare directe (DFA) și indirecte cu anticorpi fluorescenți (IFA) sunt disponibile pentru detectarea antigenelor virale gripale A și B la specimenele tractului respirator. Subtiparea sau identificarea ulterioară a virusurilor gripale A nu este posibilă prin teste de imunofluorescență. Un test rapid de imunofluorescență este un RIDT și utilizează un dispozitiv de analiză pentru a produce rezultate în aproximativ 15 minute.

Cultura virală

Rezultatele culturii virale nu dau rezultate la timp pentru a informa managementul clinic. Rezultatele culturii țesutului flacon-coajă pot dura 1-3 zile, în timp ce rezultatele culturii tradiționale cu celule tisulare virale pot dura 3-10 zile. Cu toate acestea, cultura virală permite o caracterizare antigenică și genetică extinsă a virusurilor gripale. Colectarea unor eșantioane respiratorii pentru cultura virală este esențială pentru supravegherea și caracterizarea antigenică a noilor tulpini de virus gripal sezonier A și B care ar putea fi necesare în anul următor și vaccinul gripal rsquos.

Testarea serologică

Testarea serologică a gripei nu este recomandată pentru luarea deciziilor clinice. Deși oferite de unele laboratoare comerciale, rezultatele testelor serologice pentru anticorpi împotriva virusurilor gripale A sau B pe un singur specimen de ser nu pot fi interpretate în mod fiabil. Testarea serologică adecvată pentru diagnosticarea gripei necesită seruri pereche acute și convalescente colectate la 2-3 săptămâni distanță, cu teste fiabile la un număr limitat de laboratoare de sănătate publică sau de cercetare pentru a evalua o creștere de 4 ori sau mai mare a anticorpilor specifici tulpinii virusului gripal. Prin urmare, testarea serologică pentru gripă nu oferă rezultate la timp pentru a ajuta la luarea deciziilor clinice și nu este recomandată, cu excepția cercetărilor și a investigațiilor de sănătate publică.

Noi infecții cu virusul gripal A

Dacă se suspectează o infecție umană cu un nou virus gripal A de origine animală (de exemplu, virusul gripei aviare A sau virusul gripei porcine A), departamentul de sănătate local și de stat ar trebui contactat pentru a efectua RT-PCR pentru virusurile gripale sezoniere și virusurile gripale A noi . Testele de diagnosticare a gripei disponibile în comerț nu detectează în mod specific noi virusuri gripale A și un rezultat pozitiv pentru virusul gripal A nu poate distinge virusul gripal sezonier A de infecțiile cu virusul gripei A aviare sau porcine. Informații despre noi virusuri gripale A sunt disponibile la:

Referințe

Merckx J, Wali R, Schiller I, Caya C, Gore GC, Chartrand C, Dendukuri N, Papenburg J. Acuratețea diagnosticului testelor rapide noi și tradiționale pentru infecția gripală în comparație cu reacția în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă: o analiză sistematică și meta-analiză . Ann Intern Med. 2017 septembrie 19167 (6): 394-409.

Vos LM, Bruning AHL, Reitsma JB, Schuurman R, Riezebos-Brilman A, Hoepelman AIM, Oosterheert JJ. Testele moleculare rapide pentru gripă, virusul sincițial respirator și alte virusuri respiratorii: o revizuire sistematică a preciziei diagnostice și a studiilor de impact clinic. Clin Infect Dis. 2019 28 ian. Doi: 10.1093 / cid / ciz056. [Epub înainte de tipărire]


Titru de microneutralizare Calculați

Acest capitol descrie câteva metode utilizate în mod obișnuit de titrare a virusului gripal, caracterizare antigenică și metode serologice prin detectarea anticorpilor. Aceste metode sunt esențiale nu numai pentru caracterizarea virusului, ci și pentru identificarea de noi variante antigenice, selectarea tulpinii vaccinale și studii sero-epidemiologice privind transmiterea și prevalența virusului gripal. Pentru a determina cantitatea de particule de virus dintr-o probă sunt utilizate metode de titrare a virusului, cum ar fi testul de hemaglutinare, doza infecțioasă de cultură de ou sau 50% țesut și testul de placă. Testul de inhibare a hemaglutinării este o tehnică fiabilă, relativ simplă și ieftină pentru a caracteriza antigenic izolatele virusurilor gripale. Metodele serologice, cum ar fi neutralizarea virusului și inhibarea hemaglutinării, sunt instrumentele fundamentale utilizate în studiile sero-epidemiologice privind transmiterea și prevalența virusului gripal și în evaluarea imunogenității vaccinului. În timp ce metodele serologice rareori generează un diagnostic precoce al infecției cu virusul gripal acut, probele de ser acurate și convalescente, bine temporizate, pot stabili diagnosticul unei infecții gripale recente chiar și atunci când încercările de detectare a virusului sunt negative.

Cuvinte cheie: titrarea virusului, testul de hemaglutinare, testul plăcii, 50% doză infecțioasă cu ouă, testul de inhibare a hemaglutinării, 50% doză infecțioasă a culturii țesuturilor, microneutralizare, neutralizare a virusului, anticorpi neutralizanți, gripă

1. Introducere

Există o serie de metode de titrare a virusului gripal pe baza caracteristicilor sale biologice, cum ar fi capacitatea virusului de a aglutina celulele roșii din sânge (RBC) ale diferitelor specii (1). Capacitatea particulelor de virusuri infecțioase și neinfecțioase de a aglutina RBC este baza testului de hemaglutinare (HA). Analiza plăcii, 50% doză infecțioasă cu culturi tisulare (TCID50) și 50% doză infecțioasă cu ouă (EID50) sunt metode utilizate pentru a determina cantitatea de infecțioase

Yoshihiro Kawaoka și Gabriele Neumann (eds.), Virusul gripal: metode și protocoale,

Methods in Molecular Biology, vol. 865, DOI 10.1007 / 978-1-61779-621-0_3, © Springer Science + Business Media, LLC 2012

particule de virus într-o probă. Metodele serologice, cum ar fi neutralizarea virusului și inhibarea hemaglutinării (HAI) sunt instrumentele fundamentale utilizate în studiile sero-epidemiologice privind transmiterea și prevalența virusului gripal și în evaluarea imunogenității vaccinului. Ambele teste se bazează pe legarea anticorpilor de hemaglutinină (HA), glicoproteina majoră de suprafață a gripei. Anticorpii neutralizanți direcționați împotriva HA sunt mediatorul major al imunității de protecție împotriva gripei.

Titrarea corectă a virusului este esențială pentru analiza proprietăților antigenice ale proteinelor majore de suprafață ale virusului, hemaglutininei și neuraminidazei. Analiza antigenică comparativă a diferitelor tulpini utilizând antiser standard, în special din dihorii postinfecționare, joacă un rol important în monitorizarea evoluției antigenice a virusurilor gripale de diferite tipuri și subtipuri. Caracterizarea antigenică este un instrument important în selectarea celor mai actualizate tulpini de vaccin.

Metoda standard pentru titrarea virusului gripal se bazează pe capacitatea virusului hemagglutinină (HA) de a aglutina eritrocitele de diferite specii (a se vedea nota 1). De obicei, globulele aviare, cum ar fi de la găini sau curcani, sunt utilizate în testul de hemaglutinare (a se vedea nota 2). RBC aviare sunt mici și nucleate, se instalează rapid și formează un buton compact pe partea inferioară a plăcii de microtitrare a puțului V în absența virusului, oferind astfel o determinare clară a diluției punctului final. RBC non-nucleate de mamifere (uman, cobai, cal etc.) apar ca un „chihalo” sau un cerc de celule așezate pe fundul puțurilor de control ale plăcii de microtitrare în puț U, ceea ce face dificilă citirea diluției punctului final.

Testul de hemaglutinare (HA) depinde de cantitatea de hemagglutinină de pe suprafața virusurilor gripale și nu de capacitatea virusului de a se replica (2). Testul HA este capabil să cuantifice particulele virale indiferent de infectivitate. Obiectivul HA este determinat de cea mai mare diluare a virusului care determină hemag-glutinare completă. Titrul HA este reciprocul diluării virusului în ultima sondă cu hemaglutinare completă. O unitate HA (HAU) este definită ca cantitatea de virus necesară pentru a aglutina un volum egal de eritrocite standardizate (3). Această „unitate” de hemaglutinare este o unitate operațională și nu o măsură a unei cantități absolute de virus. Virusul gripal izolat în cultura celulară, cum ar fi linia celulară Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sau ouă de pui embrionate, este titrat prin efectuarea unei diluții seriale duble a supernatantului izolat într-un tampon folosind o placă de microtitrare cu 96 de godeuri. Primul godeu conține doar izolatul, al doilea și godeurile ulterioare conțin 50 ml de tampon și virusul diluat. HAU sunt utilizate în testul HAI pentru a determina diluția standardizată a antigenului necesară pentru efectuarea testului.

EID50 este o metodă biologică pentru a determina cantitatea de virus infecțios dintr-o probă prin determinarea celei mai mari diluții a probei care poate infecta 50% din ouăle de pui embrionate.

Acest test implică efectuarea de diluții seriale ale probei de ou. Pentru a determina diluția necesară pentru a produce un rezultat pozitiv de 50%, se utilizează metoda Reed-Muench (4). Metoda Reed-Muench necesită utilizarea a trei sau mai multe ouă pe diluție pentru a determina valoarea finală de 50% prin efectuarea unei analize de hemaglutinare pentru fiecare ou inoculat.

Testul plăcii se bazează pe capacitatea virusului gripal de a forma plăci în monostrat celular acoperit cu agar sau agaroză (5, 6). Plăcile se formează datorită efectului citopatic (CPE) cauzat de virusul și moartea celulelor infectate ducând astfel la formarea unor zone circulare de celule lizate pe monostrat. Doar particulele de virusuri infecțioase ar trebui să infecteze celula gazdă și să poată produce o placă. Unitățile de formare a plăcilor (PFU) reprezintă o măsură cantitativă a cantității de virus infecțios dintr-o probă prin determinarea numărului de plăci formate într-un monostrat celular (de obicei se utilizează celule MDCK). La o diluare ridicată a stocului de virus, fiecare placă reprezintă zona celulelor infectate de o singură particulă de virus. Prin urmare, titlul unui stoc de virus poate fi calculat în PFU pe mililitru. Analiza plăcii este efectuată prin efectuarea de diluții seriale de zece ori și apoi infectarea monostratului celular. O acoperire de agaroză este plasată în godeurile monostratului de celule infectate. Agaroza este îndepărtată, virusul este inactivat cu etanol și cristalul violet este adăugat la monostrat pentru a vizualiza plăcile.

Atașarea specifică a anticorpilor la situsurile antigenice de pe molecula HA interferează cu legarea dintre HA virală și receptorii de pe globulele roșii. Acest efect inhibă hemaglutinarea și stă la baza testului HAI. Testul HAI, descris inițial de Hirst (7) și modificat ulterior de Salk (8), se efectuează în prezent pe plăci de microtitrare cu 96 de godeuri. Pe scurt, o cantitate standardizată de antigen HA este amestecată cu diluții seriale de antiser și se adaugă RBC pentru a determina legarea specifică a anticorpului la molecula HA. Prezența anticorpilor anti-HA specifici va inhiba aglutinarea, care altfel s-ar produce între virus și eritrocite (7). Această analiză este fiabilă, relativ simplă și este o tehnică ieftină. Limitările testului HAI includ necesitatea eliminării aglutininelor nespecifice în unele probe de ser deoarece acestea pot provoca rezultate fals negative, necesitatea de a standardiza concentrația de virus de fiecare dată când se efectuează un test și necesitatea unei expertize specializate în citirea rezultatelor testul.

Testul de microneutralizare este un test extrem de sensibil și specific pentru identificarea anticorpilor neutralizanți specifici virusului gripal în serurile animale și umane (9). Testul de 2 zile se efectuează în două etape. În ziua 1 a testului (1) o etapă de reacție virus-anticorp, în care virusul este amestecat cu diluții de ser și timpul permis pentru reacția anticorpilor și (2) o etapă de inoculare, în care amestecul virus-ser este inoculat în sistemul gazdă adecvat, celulele MDCK din acest test. În ziua 2 a testului se efectuează un test ELISA pentru a detecta celulele infectate cu virus. Absența infectivității constituie o reacție de neutralizare pozitivă și indică prezența anticorpilor specifici virusului în proba de ser. Probele de ser preferate în cazurile de boală asemănătoare gripei sunt probe de ser pereche acută și convalescentă cu acutele colectate la mai puțin de 7 zile de la apariția simptomelor și convalescențele colectate la cel puțin 14 zile de la proba acută și, în mod ideal, în termen de 2-3 luni de la boală. debut. O creștere de patru ori sau mai mare a titrului anticorpului demonstrează o seroconversie și este considerată a fi diagnostic. Cu probe de ser unic, trebuie acordată atenție interpretării titrurilor scăzute, cum ar fi 20 și 40. În general, este necesară cunoașterea titrurilor de anticorpi într-o populație martor potrivită vârstei pentru a determina un titru minim care să indice un răspuns anticorp specific la virus utilizat în test.

Testele convenționale de neutralizare a virusurilor gripale bazate pe inhibarea formării CPE și / sau detectarea activității de hemaglutinare în culturile de celule MDCK sunt laborioase și destul de lente. De obicei, CPE este citit în zilele 3-7. Testul de microneutralizare descris aici folosește un ELISA în ziua 2 a testului pentru a detecta celulele infectate cu virus. Studiile au arătat că testele de neutralizare care utilizează ELISA pentru detectarea celulelor infectate cu virus sunt mai puțin variabile decât neutralizarea evaluată utilizând CPE și / sau detectarea activității hemag-glutinare, posibil datorită lungimii extinse a acestor teste, utilizarea lor a unui punct final care este mai mult dificil de măsurat decât absorbția și / sau utilizarea lor de monostrat preformat (10, 11). Etapele implicate în analiza microneutralizării virusului gripal sunt următoarele. Serurile diluate în serie sunt preincubate cu o cantitate standardizată de virus înainte de adăugarea celulelor MDCK. Anticorpii serici neutralizanți împotriva virusului gripal hemaggluti-nin inhibă infectarea celulelor MDCK cu virus. După o incubare peste noapte, celulele sunt fixate și prezența nucleoproteinei virusului gripal A (NP) în celulele infectate este detectată de ELISA. Detectarea NP indică absența anticorpilor neutralizanți la acea diluție serică.

Testul de microneutralizare oferă cel mai direct răspuns la întrebarea dacă un individ are anticorpi care pot neutraliza infectivitatea unei tulpini de virus date. Testul are mai multe avantaje suplimentare pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului gripal. În primul rând, testul detectează în primul rând anticorpii împotriva virusului hemag-glutinină și astfel poate identifica anticorpi funcționali, specifici tulpinii, în serurile animale și umane. În al doilea rând, deoarece virusul infecțios este utilizat, testul poate fi dezvoltat rapid după recunoașterea unui virus nou și este disponibil înainte ca proteinele virale purificate adecvate să devină disponibile pentru utilizare în alte teste. Cu toate acestea, utilizarea virusului viu în această analiză prevede, de asemenea, necesitatea respectării liniilor directoare privind biosecuritatea, așa cum este subliniat în Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/ bmbl5toc.htm).

2.1. Hemaglutinare 1. Plăci de microtitrare cu 96 de godeuri (Nunc, Thermo Fisher Scientific): Testare titrare fund V pentru RBC aviare sau fund U pentru RBC mamifer.

2. Soluție salină tamponată cu fosfat 0,01 M (PBS), pH 7,2-7,4 (Invitrogen, Corporation, Cat. # 4539).

3. RBC standardizate (a se vedea notele 1 și 2): 0,5% pentru aviari și 0,75% pentru RBC la mamifere. Se filtrează eritrocitele prin tifon steril, se centrifugează la 200 xg timp de 10 minute la 4-8 ° C, se aspiră plasma, se alveează și se învelește, se adaugă PBS, se centrifugează și se repetă de două ori. Resuspendati globulele roșii în PBS și reglați la concentrația necesară. A se păstra la 4-8 ° C (vezi Nota 3).

2.2.50% Ou 1. Ouă de pui embrionate în vârstă de 9 până la 11 zile, lumânate pentru a se asigura

Doza infecțioasă că embrionii sunt viabile (a se vedea nota 4).

2. Diluant pentru virus: se adaugă 10 ml PBS cu 1 ml soluție de penicilină-streptomicină (100 U / ml penicilină G și 100 mg / ml streptomicină) (Invitrogen, nr. Cat. 15140) și 0,2 ml 50 mg / ml stoc de gentamicină (10 mg / ml) (Invitrogen, Cat. # 15750060). Filtru cu filtru cu membrană de 0,2 mm și poate fi păstrat până la 2 luni la 4-8 ° C.

3. RBC standardizate (0,5% pentru păsări și 0,75% pentru mamifere), se filtrează prin tifon steril, se centrifugează la 200 xg timp de 10 minute la 4-8 ° C, se aspiră din plasmă, alsevers și stratul tampon, se adaugă PBS, se centrifugează și se repetă de două ori. Resuspendati RBC in PBS la concentratia necesara. A se păstra la 4-8 ° C.

4. Plăci de microtitrare cu 96 de godeuri (Nunc, Thermo Fisher Scientific): fundul V pentru RBC aviare sau fundul U pentru RBC mamifere.

2.3. Analiza plăcii 1. 2x mediul de testare a plăcii: Mediul Eagle modificat al lui Dulbecco

(DMEM) (Invitrogen) suplimentat cu penicilină-streptomicină (100 U / ml penicilină G și 100 mg / ml streptomicină), l-glutamină 4 mM și tampon HEPES 50 mM. Pentru a steriliza, filtrați printr-un filtru cu membrană de 0,2 mm. A se păstra timp de cel mult 2 luni la 4-8 ° C.

2. Lonza SeaKem Le Agarose (Thermo-Fisher Scientific, Cat. # 5004).

3. Celulele MDCK (ATCC # CCL-34) confluente într-o placă de cultură tisulară cu 6 godeuri (Nunc, Thermo-Fisher Scientific, Cat. # 150239).

4. Mediul de spălare cu testul plăcii: se adaugă 490 ml DMEM cu 5 ml penicilină-streptomicină (100 U / ml penicilină G și 100 mg / ml streptomicină). Se filtrează printr-un filtru cu membrană de 0,2 mm. Poate fi păstrat până la 2 luni la 4-8 ° C.

5. L-1-Tosilamidă-2-feniletil clorometil cetonă (TPCK) -tripsină (2 mg / ml) soluție de lucru: supliment 10 ml de identificare a anumitor produse este furnizat ca un ghid pentru a ajuta la selectarea produselor echivalente, adecvate

DMEM cu 20 mg tripsină tip XIII tratată cu TPCK din pancreasul bovin (Sigma-Aldrich, Cat. # T1426-100 mg). Sterilizați prin filtrare. A se păstra în alicote mici la -70 până la -80 ° C până la prima dată de expirare a produselor.

7. Pata primară de cristal violet Gram (Becton, Dickinson și Company, Cat. # 212525).

2.4. Hemaglutinare 1. Enzima distrugătoare a receptorului (RDE) (II) "Seiken" (Denka Seiken Inhibition Assay Co, Ltd.), dizolvată în ser fiziologic (0,85% NaCI).

3. Plăci de microtitrare cu 96 de godeuri (Nunc, Thermo Fisher Scientific): fundul în V pentru RBC aviare sau fundul U în RBC pentru mamifere.

4. RBC standardizate (0,5% pentru aviare și 0,75% pentru mamifere): filtrați RBC-uri prin tifon steril, centrifugați la 200 xg timp de 10 minute la 4-8 ° C, aspirați din plasmă, alsevers și stratul tampon, adăugați PBS, centrifugați și repetați de două ori. Resuspendati globulele roșii în PBS la concentrația necesară. A se păstra la 4-8 ° C (vezi Nota 3).

2.5. MDCKCell Culture 1. Mediul MDCK preparat din DMEM (Invitrogen, Cat. #

11965-092), suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) (Hyclone Cat. # SH30070.03), 100 U / ml penicilină și 100 mg / ml streptomicină (Invitrogen, Cat. # 15140-122) și 2 mM l-glutamină (Invitrogen Cat. # 25030-081). Sterilizați prin filtrare.

2. Soluție de tripsină (0,05%) și acid etilendiamină tetraacetic (EDTA) (Invitrogen, nr. De cat. 25300-054) (a se vedea nota 5).

2.6. Test TCID Materialele necesare pentru TCID sunt aceleași cu cele enumerate pentru Determinarea funcționării testului de microneutralizare.

Diluarea virusului pentru microneutralizare

2.7. Microneutra 1. Diluant de virus preparat utilizând DMEM, suplimentat cu 1% lizare Test albumină serică bovină (BSA) (fracțiunea V, fără protează, Roche,

Pisică. # 03117332001, preparat ca o soluție de 10% g / v în dH2O, filtrat sterilizat și depozitat la 4-8 ° C) 100 U / ml penicilină, 100 mg / ml streptomicină și 20 mM HEPES (Invitrogen, Cat. # 15630 -080). Pregătiți proaspete pentru fiecare test. Sterilizați prin filtrare.

2. PBS (0,01 M PBS, pH 7,2). Sterilizați prin autoclavare.

3. Fixativ: 80% acetonă rece în PBS. Pregătiți și utilizați 80% acetonă într-un BSC care este ventilat extern sau într-o hotă chimică. Purtați EIP standard care include mănuși din latex sau nitril, haina de laborator și ochelari de protecție. Pregătiți-vă cu o zi înainte de utilizare și păstrați-l la -20 ° C. Este esențial ca fixatorul să fie rece atunci când este utilizat. După utilizare, aruncați în mod corespunzător.

4. Tampon de spălare: PBS + 0,3% Tween 20 (Sigma-Aldrich, Cat. P1379). Pregătiți proaspete zilnic.

5. Diluant anticorp: PBS + 0,3% Tween 20 + 5% greutate / lapte (lapte uscat fără grăsime). Pregătiți zilnic proaspete. Este nevoie de aproximativ 1 L pentru 40 de plăci de testare cu microtitrare.

6. 1 ° anticorp: anticorp monoclonal anti-gripal NP de șoarece (Millipore, Cat. # MAB8257 și MAB8258, ambele amestecând Ig purificate în cantități egale). Se diluează în diluantul anticorpului la concentrația optimă, determinată prin titrare (vezi Subpoziția 3.7.2, etapele 5-11).

7. Anticorp 2 °: IgG anti-șoarece de capră conjugat cu peroxidază de hrean (hRP) (KPL, Cat. # 074-1802). Se diluează în diluantul anticorpului la concentrația optimă, determinată prin titrare (vezi Subpoziția 3.7.2, etapele 1-4).

8. Substrat: diclorhidrat de a-fenilendiamină (OPD) în tampon citrat. Se prepară tampon citrat amestecând o capsulă tampon (Sigma-Aldrich Cat. # P4922) cu 100 ml dH2O. Conținutul unei capsule dizolvate în 100 ml de dH2O produce 0,05 M tampon fosfat-citrat, conținând 0,03% perborat de sodiu ca înlocuitor pentru H2O2, pH 5,0 la 25 ° C. Manipulați comprimatele OPD într-un BSC care este ventilat extern sau într-o hotă chimică. Purtați EIP standard care include mănuși din latex sau nitril, haina de laborator și ochelari de protecție. După dizolvarea tabletelor, substratul poate fi utilizat pe blatul de laborator BSL-2. Pregătiți OPD imediat înainte de utilizare adăugând tablete OPD (Sigma-Aldrich, Cat. # P8287) în tamponul de citrat, câte un comprimat pentru fiecare 20 ml de tampon de citrat. După utilizare, aruncați în mod corespunzător.

9. Soluție de oprire OPD (acid sulfuric 0,5 M). Se adaugă 28 ml acid sulfuric concentrat (18 M) la 972 ml dH2O pentru a obține 0,5 M acid sulfuric. Pregătiți această soluție într-un BSC care este ventilat extern sau într-o hotă chimică. După adăugarea de dH2O, soluția de oprire poate fi utilizată pe banca de laborator BSL-2. Purtați EIP standard care include mănuși din latex sau nitril, haina de laborator și ochelari de protecție. După preparare, păstrați 0,5 M H2SO4 pe bancă. După utilizare, aruncați în mod corespunzător.

10. Virusul gripal (a se vedea nota 6). TCID (doza infecțioasă de cultură tisulară) trebuie determinată pentru fiecare număr de lot de virus înainte de a începe un test MN. Virusul propagat în celulele MDCK sau în fluidul alantoic al ouălor trebuie depozitat la -70 ° C sau mai rece în alicote de unică folosință. Decongelați repede cu puțin timp înainte de utilizare și puneți-l pe gheață. Odată efectuată diluarea virusului pentru test, orice virus rămas în alicota dezghețată trebuie aruncat în mod corespunzător. Virusul care a fost înghețat nu trebuie utilizat.

11. Probele de ser pentru testare. Toate probele de ser trebuie depozitate congelate la -20 până la -80 ° C. Decongelați rapid probele de ser la 37 ° C

baie de apă. De îndată ce s-a dezghețat, puneți-l pe gheață. Păstrați pe gheață sau la 4-8 ° C până când reveniți la congelator. Dacă se testează din aceeași parte alicotă a doua zi, este acceptabil să se păstreze probele de ser la 4-8 ° C peste noapte și să se întoarcă la congelator a doua zi. Această metodă de dezghețare rapidă și manipulare la 4-8 ° C minimizează denaturarea anticorpilor. Înainte de utilizare în testul de microneutralizare, probele de ser uman trebuie să fie inactivate la căldură la 56 ° C timp de 30 de minute. Probele de ser de animale, de exemplu, serurile de control pozitive și negative, trebuie tratate cu RDE înainte de utilizare (a se vedea subpoziția 3.4.1). Tratamentul RDE include o etapă de inactivare a căldurii.

12. IgG de șoarece purificat (Thermo-Fisher Cat. # 31202) este necesar pentru determinarea diluției de lucru a anticorpului 2 ° (conjugat).

3. Metode

3.1. Hemaglutinare În testul de hemaglutinare, diluțiile seriale ale virusului sunt amestecate cu o cantitate constantă de eritrocite. Eritrocitele conțin numeroși receptori pentru hemaglutinina virusului și apare aglutinarea, dacă concentrația virusului este suficient de mare. Dacă se adaugă ser, aglutinarea eritrocitelor de către virusul gripal va fi blocată, aceasta este baza testului HAI. Control antiserum and antigens should be included in every HAI assay to verify the specificity of the test.

1. An aliquot (100 ml) of each influenza virus isolated in tissue culture or embryonated chicken eggs (see Note 7) is placed in a well at the first row (row 1) of the 96-well microtiter plate (Fig. 1). Add 50 ml of PBS to rows 2 through 12. Perform a serial twofold dilution series down the 96-well plate transferring 50 ml from row 1 to row 2, etc., disposing of the final 50 ml from the last well. Add 50 ml of the standardized RBCs to all wells. Tap the plate gently to mix or use a mechanical plate shaker. Incubate the plates at room temperature (20-25°C) for the incubation time required for the RBCs used (Table 1).

2. After the incubation period, the HAU are observed for their endpoint of agglutination (Fig. 2). The RBCs will settle to the bottom of the V-well microtiter plate in negative samples, and in positive samples they will agglutinate. The wells in column 8 contain no virus. RBCs that agglutinate will evenly distribute within the well, whereas RBCs that do not agglutinate will form a button in the bottom of the V-well. The HA titer is the last dilution that shows complete hemagglutination activity (see Note 8).

OOOOOOOO' 00000000' 00000000' 00000000' oooooooo 00000000 00000000 00000000 00000000 + oooooooo.

Fig. 1. The 96-well microtiter plate layout for the hemagglutination titration assay.

Recommended time of incubation at 20-25°C for the hemagglutination assay with the use of different species of RBCs


Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop

Immune recognition of protein antigens relies on the combined interaction of multiple antibody loops, which provide a fairly large footprint and constrain the size and shape of protein surfaces that can be targeted. Single protein loops can mediate extremely high-affinity binding, but it is unclear whether such a mechanism is available to antibodies. Here we report the isolation and characterization of an antibody called C05, which neutralizes strains from multiple subtypes of influenza A virus, including H1, H2 and H3. X-ray and electron microscopy structures show that C05 recognizes conserved elements of the receptor-binding site on the haemagglutinin surface glycoprotein. Recognition of the haemagglutinin receptor-binding site is dominated by a single heavy-chain complementarity-determining region 3 loop, with minor contacts from heavy-chain complementarity-determining region 1, and is sufficient to achieve nanomolar binding with a minimal footprint. Thus, binding predominantly with a single loop can allow antibodies to target small, conserved functional sites on otherwise hypervariable antigens.

Cifre

Figure 1. C05 neutralizes multiple influenza virus…

Figure 1. C05 neutralizes multiple influenza virus subtypes from groups 1 and 2


Functional virus assays: research and high throughput methods

There are different types of functional assays to study how a virus works, such as how it infects cells and which mechanisms and enzymes are important for the virus. Functional methods are employed for both: basic research as well as for HTS drug screening.

  • Methods in basic research: in basic research, functional virus assays help to find immunogenic components for vaccines and potential drug targets for therapy. Microplate-based tests employed for virus characterization, mainly use plates up to 96 wells. As soon as a virus is understood and potential drug targets are identified, higher throughput virus assays search for molecules interfering with pathogenic processes.
  • High throughput assays: the development of antivirals requires to screen compound libraries for various aspects and relies on high throughput compatible virus assays. These are performed in plate formats of 384 wells or 1536 wells. In addition to the plate density, high throughput virus assays are automatically prepared with the use of automated liquid handlers and industrial robots.

The FDA suggests the use of in vitro virus assays for measuring CPE, mechanism of action and testing of resistance to novel antivirals before proceeding with clinical studies 15 . The basic assay principles of high throughput and research tests are similar and virus specific. Some examples are described below.

Neuraminidase assay

Neuraminidase is one of two key glycoproteins found on the surface of influenza viruses (the other being hemagglutinin, fig. 10). Neuraminidase is crucial to the release of influenza from infected cells and enables spread within the respiratory tract. Viral neuraminidase cleaves sialic acid groups from glycoproteins on the host cell surface, leading to release of virus particles from infected cells. It is therefore the target of new therapies such as the FDA-approved neuraminidase inhibitors zanamivir and oseltamivir 16, 17 . Its activity further reports on viral titer and potential neuraminidase inhibitor resistance.

Figure 10: Structure of the influenza virus.

Neuraminidase activity and inhibition is mainly measured using a synthetic substrate which releases a fluorophore, if processed by the enzyme. In this assay, the virus is mixed with the substrate and fluorescence intensity is measured on a microplate reader. The intensity is directly related to neuraminidase activity. A fluorescence-based neuraminidase assay was measured by Hong Kong-based researchers on the CLARIOstar microplate reader and revealed a neuraminidase inhibitory activity by traditional multi-herb formulations 18 .

A second type of neuraminidase assay employs chemiluminescence instead of fluorescence and provides higher sensitivity 19 . This virus assay uses a sialic acid derivative which emits light in the presence of active neuraminidase.

RNA dependent RNA Polymerase assays

Another target for RNA viruses such as such as SARS, hepatitis C and influenza is viral RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP) (fig. 10). Viruses localized in the cytoplasm of a cell do not have access to the host’s RNA polymerase and encode their own polymerase to allow replication. The RdRP enzyme transcribes RNA from a viral RNA template, in contrast to DNA-dependent RNA polymerase that transcribes RNA from the host DNA template. RdRP enzyme activity and inhibition are important virus assays and rely on multiple RNA-dependent RNA polymerase assays.

RNA transcribed by RdRP is measured by fluorescent RNA dyes that increase their fluorescence in the presence of RNA. Recombinant RdRP or RdRP isolated from infected cells catalyses in vitro RNA synthesis. The increase in RNA is then measured using RNA dyes such as SYTO-9 20 , Quantifluor 21 or a protein-based sensor 22 .

Measuring nucleotide incorporation is a traditional virus assay to determine the activity of RdRP by in vitro RNA transcription. The RdRP enzyme is mixed with a biotin-labelled primer to initialize the reaction and labelled nucleoside triphosphates (NTPs). If the enzyme is active, it elongates the primer strand and incorporates the labelled NTPs. The complex of primer and newly synthesized RNA is subsequently immobilized on a streptavidin coated microplate and excessive NTPs can be washed away. Dependent on the activity of RdRP, the amount of NTPs immobilized onto the microplate differs. In the past, the NTPs were radioactively labelled. Today fluorophores are used and quantified in a fluorescence microplate reader 23 .

A fluorescence polarization-based (FP) assay also uses the in vitro complementation of a template RNA strand by RdRP to determine its activity. A single stranded “template” RNA is fluorescently labelled and displays a low FP value. If RdRP synthesizes the complementary strand, the molecule enlarges its mass (double-stranded) leading to an increase in FP 24 .

Fig. 11: Principle of a fluorescence polarization-based assay to measure activity of an RNA-dependent RNA Polymerase. A fluorescently labelled template RNA (green) serves for RNA synthesis by RdRp. Full length RNA synthesis leads to a high polarization and the biggest difference in FP (black line) compared to single strand template RNA, whereas incomplete RNA synthesis (yellow and purple lines) have a lower increase in FP change.

Viral neutralization assays

The effectiveness of an antibody, vaccine treatment or infection-related immunity is tested with a neutralization assay. The purpose of this virus assay is to evaluate the ability of an antibody to bind viral surface antigens that are required for a successful viral replication thus neutralizing the infection 36 . The neutralization assay combines incubation of the virus or pseudotypes with samples containing potentially neutralizing antibodies, e.g. sera of vaccinated humans/animals or therapeutics. This is followed by a cell-based infection assay, which provides information as to whether the virus can infect the cells despite treatment.

Neutralization assays were traditionally performed with a virus solution mixed with the neutralizing samples at different concentrations. Due to the infection risk of using the native pathogen, today, pseudotypes are used. Pseudo viruses are chimeric viruses bearing the viral glycoproteins of interest without the disease-causing phenotype. For a neutralization assay, they are engineered to express reporter genes for luciferase or GFP that are activated in the infected cell when undergoing replication. This way, the neutralization assay is easily detected in a fluorescence or luminescence microplate reader (fig. 12).

Fig. 12: a neutralization assay overview. In a luminescence-based neutralization assay, virus pseudotypes are pre-incubated with neutralizing samples such as sera of immunized organisms or antibodies. Subsequently, cells are added and incubated with the virus samples to allow infection. Upon addition of the luciferase substrate, luminescence is measured on a microplate reader. Neutralized viruses are not capable of infecting cells and display low luminescence while infectious pathogens show high luminescence.

Visit our blog post “Vaccine Development: past, present and future” for more information on neutralization tests and other vaccine development assays.

Virus infectivity assays to study antiviral activity

Methods used to test the antiviral effect of compounds overlap with assays used to diagnose infections. Pentru in vitro and high throughput assays, cell-based microplate assays are employed.

Studying the cytopathic effect of a virus in presence and absence of a compound identifies if it prevents infection. Infectivity assays to detect cytopathic effects in screening are mainly based on measuring viability with an ATP-dependent luciferase such as CellTiter-Glo ® or ToxiLight TM . These assays are compatible with a 1536 well format and reagents can be added directly to cells after the appropriate incubation of cells, virus and compound. The microplate is subsequently measured on a high throughput luminescence plate reader where low signals correlate to a high cytopathic effect. In addition to a toxic effect related to infection, this assay reports on toxicity induced by the compounds themselves in control wells with compound and cells lacking the virus.

In this short talk, Ahlam Ali from Queen’s University Belfast, UK shows a screen for SARS-CoV-2 antivirals, measuring the cytopathic effect on a CLARIOstar Plus in 384-well plates.

Another infectivity assay suited to screening uses recombinant viruses that are engineered to express fluorophores or a luciferase after infection. Cells and virus are incubated together with the compounds. If infection is inhibited by one of the compounds, the fluorescent or luminescent signal is low, whereas infection is reported by high signals, as demonstrated in the application note Studying the molecular mechanism of viral replication in real time using the CLARIOstar Plus with ACU.

Binding assays for compound screens

In the context of virus research and antiviral development, binding assays screen for molecules that interact with target structures essential for the virus lifecycle. Popular target structures are: receptors on host cells used by viruses to attach and enter the cell, proteases cleaving viral precursor proteins or cell proteins, polymerases, integrases and methyltransferases required for genome replication.

Binding assays rely either on proximity assays such as resonance energy transfer, AlphaScreen assays, or the use of fluorescence polarization to track binding-induced changes in molecular weight.

A) Proximity based virus assays

Proximity assays employ donor molecules that transfer a signal to an acceptor molecule if found nearby. Two binding partners of an interaction are labelled, one with the donor molecule, the other with the acceptor molecule. The acceptor only emits a signal if binding occurs and donor and acceptor are close. Screening for binding molecules uses a competitive setup: a target molecule bearing the donor and a known target binder bearing the acceptor lead to acceptor signal emission. If a compound of a screening library displaces the acceptor-labelled molecule, acceptor signal decreases due to separation. Therefore, the signal decreases if a compound binds the viral target.

Upon excitation, the donor beads in AlphaScreen-based assays release singlet oxygen which can travel up to 200 nm and react to release light if the acceptor bead is in close proximity.

A research group of the National Institutes of Health (NIH) used this method to establish a high-throughput virus assay in 1536 well format to find inhibitors of the interaction between SARS-CoV-2 spike protein and ACE2 receptor. The viral spike protein attaches to the ACE2 receptor for cell entry and an inhibitor of the interaction is a promising therapeutic. The assay measured on a PHERAstar FSX provided an excellent assay quality with Z’ > 0.7 and identified 25 compounds out of 3400 which inhibited spike protein – ACE2 interaction 25 . To learn more about an AlphaLisa-based approach to study the interaction of the cellular ACE2 receptor and a viral spike protein, see our AN 357: Development of an AlphaLISA protein-protein interaction assay to screen for re-purposed drugs as targeted disruptors.

The second type of proximity assays are based on resonance energy transfer taking place between two fluorophores (FRET) or between a luciferase and a fluorophore (BRET). High throughput screens rely on simple mix and read, homogeneous assays with low background signals. The homogeneous mix and read approach applies to any resonance transfer assay.

Low background signals are observed with NanoBRET TM assays that use red shifted acceptor fluorophores, and with Time Resolved FRET (TR-FRET) that uses long lifetime donor fluorophores. TR-FRET emissions can be measured after a delay that allows autofluorescence to fade prior to signal detection. A TR-FRET based assay was used by US researchers to screen inhibitors of the interaction of HIV-1 integrase and its main co-factor. They determined a potent inhibitor which acted on integration of HIV-1 as well as on post-integration steps, therefore being regarded as a promising candidate for HIV therapy 26 .

Fig. 13: the principle of TR-FRET-based virus assays. A donor molecule (e.g. virus protein) coupled to a long-lifetime fluorophore (A) interacts with an acceptor molecule (B). The acceptor molecule (e.g. an inhibitor) is bound to an acceptor fluorophore which receives the energy of the donor and emits light. As energy transfer occurs only in proximity of donor and acceptor, the acceptor emission intensity directly reports on a binding event.

B) Fluorescence polarization-based virus assays

Fluorescence polarization is a cost effective and high throughput compatible method to assay the interaction of virus structures such as nucleic acids and proteins with either virus components required for replication, host proteins, or inhibitors. The fluorescence polarization of fluorophore emission increases with an increase in molecular weight of the fluorescent molecule. Therefore, binding assays based on fluorescence polarization rely on gain and loss of molecular weight of the fluorescent molecule upon binding and dissociation, respectively. Since it is easy and inexpensive to label oligonucleotides with fluorophores, FP is ideal for studying interactions between the viral genome and replication proteins. A virus assay published in “Scientific reports” employed a FAM-labelled RNA template from the Zika virus to compare how tight the polymerase subunit RdRp of NS5 and full length NS5 bind the RNA. The results helped to identify the full length NS5 protein including RdRp as well as a methyltransferase as a potential target for Zika virus therapy 27 .


Toxin Neutralization Assay

Toxin Neutralization Assay A. Cell death by toxin
B. Neutralization of toxin and prevention of cell death
Image source Brock Biology of Microorganisms

Neutralization of a microbial toxin by a specific antibody occurs when the toxin and specific antibody combine in such a way that the active portion of the toxin is blocked. Neutralization reactions can block the effects of many bacterial exotoxins.

  1. Schick test: It is a diphtheria toxin-antitoxin neutralization test done to assess the immune status of a person. It was used in the past to know the susceptibility of individuals to Corynebacterium diphtheriae. The test is performed by intradermal injection of 0.1 mL of a purified standardized toxin. If the patient has no antitoxin, the toxin will cause inflammation at the site 4 to 7 days later. If no inflammation occurs, anti-toxin is present and the patient is immune.
  2. Nagler’s reaction: Opalescence on egg yolk agar produced by α-toxin of Clostridium perfringens is inhibited when anti-α-toxin is added to the medium, which neutralizes the α-toxin.

Aplicații

Antitoxin therapy is used in the medicine to neutralize the toxins of Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani și Clostridium botulinum to prevent the development of diphtheria, tetanus, and botulism respectively.


Discuţie

Addition, removal or substitution of N-glycosylation sites of the glycan shield are one of the common strategies for RNA viruses to evade recognition by antibodies [20,48–50]. In this study, we demonstrated that 2G12, despite being elicited as an anti-HIV antibody, also has the ability to broadly neutralize human H3N2 influenza viruses that have evolved over the past five decades. Through comprehensive and evolutionary trajectory-based site-specific glycoproteomics, mutagenesis, and nsEM imaging, we found that neutralization by 2G12 is achieved through binding to two high mannose glycans present on N-glycosylation sites, N165 and N246, that are proximal to the HA RBS. 2G12 then likely represents a neutralizing antibody against human influenza viruses that only recognizes a glycan epitope on the HA. The emergence of N246 around 1980 endowed H3N2 viruses with an oligomannose cluster at N246 and N165 that can be recognized by 2G12. Escape mutants at these sites are then likely to have a high fitness cost, since abolition of the conserved N165 decreases viral fitness as shown here and in a previous study [42], and abolition of the N246 site could not be rescued in recent viruses.

How similar are the glycosylation profiles of antigens derived from virus with soluble recombinant proteins is one of the important issues for vaccine design [51–54]. For example, some differences in the glycoforms of soluble and viral HIV-1 Env have been found that may affect neutralization and elicitation of bnAbs [52, 53]. From our data on H3N2 influenza viruses, the site-specific high mannose glycans are conserved between recombinant HA from 293F cells and viral HAs derived from MDCK-SIAT1 cells (Madin-Darby canine kidney cells overexpressing the α-2,6-linked sialic acid receptor). This finding also implies that soluble recombinant HA could be used as an immunogen to attempt to elicit anti-carbohydrate antibodies. Although self-glycans are poorly immunogenic, if in high enough density on viral glycoproteins, they can become a focus of the immune response by antibodies that interact with both glycan and protein [4,35,55,56]. Multivalent binding to the high mannose glycans contributes to a potent IC50 of 2G12 against HIV-1. Notably, 2G12 exhibited neutralization (IC50 from 1 to 10 μg/ml) of sensitive HIV-1 viral strains through involvement of four major N-glycosylation sites that constitute the high mannose patch [26,57]. In our study, 2G12 neutralized sensitive H3N2 influenza strains only at sub-micromolar IC50 through targeting a mannose cluster that is formed by only two N-glycosylation sites, and is less potent compared to bnAb CR9114 by five to ten-fold. The 1 to 2-log difference seems to result from fewer high mannose N-glycosylation sites within the HA trimer compared to HIV-1 Env. Incomplete neutralization by 2G12 may be a consequence of other nearby N-glycosylation sites (N133, N285) that may contain ligands for 2G12, which distract from its neutralizing ability, e.g. 2G12 binding to wild type Bris07 HA has other minor poses that may include these glycans (Fig 5B). Heterogeneity in the glycan composition can also result in incomplete neutralization, especially for 2G12 if any complex glycans were present in addition to any heterogeneity in high mannose glycans. In a previous study, at low concentration (0.5 mM) of Man7, Man8, and Man9, 2G12 binding to gp120 was almost the same for Man9 and Man8 and less for Man7 (by

20%) [58]. Incomplete neutralization is also found in several antibodies against HIV-1 possibly as a result of glycan heterogeneity [59–61].

Since 2G12-like antibodies are not typically found to be induced by influenza virus HA, it seems to indicate that the mannose cluster on the HA has not yet been a focus of immune selection pressure. Many enveloped virus pathogens, such as Ebola virus, Hepatitis C virus, Lassa fever virus and coronaviruses, including Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS CoV-2), are highly glycosylated and present oligomannose on their surface antigens (Fig 6). [44,54,62,63].

(A) From left to right, HK68 HA, Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) spike, SARS-CoV-2 spike, MERS-CoV spike, Vic11 HA, LASV GPC, HIV-1 Env (PDB ID: 4FNK, 5X58, 6VSB, 5X59, 4O5N, 5VK2, 5ACO, respectively) [15,38,93–96]. Glycans are colored according to site-specific oligomannose-type glycan content [44,45], as per the key. (B) Glycans are colored according to Man8/9GlcNAc2 content (2G12 epitopes), as per the key.

Indeed, besides H3N2 HAs and HIV-1 Env, 2G12 has been purported to bind SARS-CoV-2 S by recognizing high mannose glycans on the S2 subunit [64]. Mannose clusters on surface antigens can also be recognized or captured by various lectins, such as human mannose binding lectin (MBL) or DC-SIGN [65–67]. Similar to our finding of high mannose glycans near the RBS on H3 HA, some high mannose glycans are also found near the RBS of the glycoprotein of Lassa virus [44,54]. Based on our findings, it is possible that other clusters of high mannose glycans present near the critical functional sites of highly glycosylated viruses could be a target for 2G12. Furthermore, 2G12-like, Fab-dimerized glycan-reactive antibodies were recently isolated from an HIV-1 naïve population with a precursor frequency of 1 in 340,000. Such glycan-reactive antibodies were also found in rhesus macaques infected with simian-human immunodeficiency virus (SHIV), and Fab-dimerized glycan-reactive antibody precursors could be boosted through vaccination [68]. Thus, 2G12-like anti-carbohydrate antibodies without a domain swap can indeed be elicited through vaccination. Here, we reveal that 2G12 could neutralize human H3N2 viruses due to the emergence of an N246 glycosylation site around 30–35 years ago during H3N2 evolution from the 1968 pandemic. As 2G12 also binds to high mannose epitopes on HIV-1 Env, this raises the question whether such carbohydrates could act as a universal epitope on enveloped RNA viruses. The ontogeny of 2G12 has not been documented and most antibodies against viruses that have carbohydrate in their epitopes to date have been found in patients with chronic HIV-1 infection. While 2G12-like Fab-dimerized glycan antibodies and precursors have been discovered in HIV-1-naïve human subjects [68], further vaccination studies would shed light on eliciting 2G12-like anti-carbohydrate antibodies against highly glycosylated viruses.


Introducere

Influenza virus continues to cause seasonal epidemics and pandemics despite vaccine availability. Between 2010 and 2018, seasonal influenza virus infection resulted in an estimated 140,000–810,000 hospitalizations and 12,000–61,000 deaths in the United States alone(1). In the most recent influenza pandemic in 2009, the virus claimed >10,000 lives(2). In addition, highly pathogenic avian influenza viruses cause sporadic outbreaks in humans with a high mortality rate, posing potential risk of human adaptation and are considered pandemic threats(3). Of the four types of influenza viruses (A–D), only influenza A and B viruses cause high morbidity and mortality in humans. Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the only targets for neutralizing antibodies on the virus envelope. HA is required for viral entry into the host cell through binding to sialic acid moieties on glycoproteins or glycolipids and mediates fusion of the viral membrane with host endosomal membranes. NA cleaves sialic acid and promotes the release of progeny viruses from infected cells. Neutralizing antibodies are primarily directed against HA and can either compete for receptor-binding, inhibit the membrane fusion machinery, or cause virus aggregation. Antibodies to NA can sometimes have neutralizing activity, but are thought to primarily limit virus egress by inhibiting enzyme activity and release of virus thereby inhibiting viral spread. Based on the genetic and antigenic properties of HA and NA, influenza A viruses are divided into group 1 and 2, each of which have several subtypes defined primarily by HA. To date, there are 18 HA and 11 NA subtypes identified and characterized(4). Currently, strains of H1N1 and H3N2 influenza A viruses co-circulate in humans. In addition, several other subtypes of animal influenza viruses (e.g., H5N1, H6N1, H7N9, H9N2, and H10N8) can also infect humans and occasionally result in mortality. In contrast to influenza A viruses, which have an avian reservoir and can achieve sustained transmission in several mammalian species (e.g., swine, dogs, horses, and bats), influenza B viruses are isolated almost exclusively from humans with a more limited evolutionary history and have diverged into only two genetically and antigenically-distinct lineages (Victoria- and Yamagata lineages), which presently co-circulate in humans(5).

Due to the wide diversity and continuous evolution of influenza viruses, repeated vaccinations remain the most effective approach to mitigate influenza burden in humans. Current influenza vaccines confer protection primarily to the strains closely related to those used in its preparation, thus reformulation is needed each season to match the antigenic properties of circulating strains. As a result, the effectiveness of seasonal influenza vaccines varies widely (<10–60%) depending on the adequacy of this match(6, 7). Moreover, current seasonal influenza vaccines confer no protection against animal viruses that can cause human diseases, such as H5N1 or H7N9 highly pathogenic avian influenza viruses in animal models. There are also limitations in current manufacturing approaches and general public apathy for immunization. Therefore, new vaccine options for influenza are urgently needed and have become a high priority for public health officials(8). The current approach for qualifying vaccines each year and licensing vaccines for public use is largely based on the ability of new or reformulated vaccines to induce neutralizing antibodies targeting the receptor-binding site (RBS) in the HA head, which have hemagglutination inhibition (HAI) activity. The HAI assay depends on the availability of HA to bind receptors on red blood cells and was developed as a surrogate for measuring neutralizing activity in the 1940s. The HAI assay is also complicated because some influenza strains do not have enough hemagglutination activity to be useful in this assay.

The discovery of broadly neutralizing antibodies (bnAbs) capable of neutralizing multiple influenza virus subtypes in humans opens an opportunity for developing a universal influenza vaccine which elicits such antibodies(9–11). Many of these antibodies target conserved epitopes in the HA stem and neutralize virus by inhibiting the viral fusion machinery and hence, the activity is not detectable by HAI assay. Several less broad bnAbs bind to the RBS in the HA head and prevent the virus from engaging sialic acid moieties on the host cell surface, thus exhibiting HAI activity(12). Currently, most universal influenza vaccine candidates aim to induce protective levels of such bnAb response(11, 13). Therefore, comprehensive analysis of the neutralization breadth and potency regardless of HAI activity is critical to accelerate the efforts to develop effective universal influenza vaccines.

The influenza microneutralization (MN) assay is the most commonly used assay to measure virus neutralizing activity of antibodies to influenza virus(14). The assay measures virus replication by detecting viral nucleoprotein (NP) levels with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), titrating hemagglutination titers, or through monitoring virus-induced cytopathic effects. Plaque-reduction neutralization assay is also commonly used for influenza and other viruses. These approaches are labor-intensive, not easily scalable and the handling of live viruses of animal origin requires high-containment laboratories. There is also significant performance variability between laboratories due to multi-step signal amplification or reliance on experienced operators. Given these inevitable limitations of the current MN assay, there is a need to transform the MN assay to be safe, high-throughput, robust, easy to standardize, and automation compatible(15).

The use of reporter viruses for developing high throughput and reproducible neutralization assays has greatly advanced our ability to measure and characterize antibody responses induced by infection and/or vaccination(16–18). While pseudotyped reporter lentiviruses have been constructed for influenza and utilized effectively for rank-ordering neutralizing activity (19), they are often criticized for being too sensitive and may not accurately represent some of the key properties of influenza viruses like entry through the endosome under low pH conditions(20, 21). Therefore, building influenza viruses with a reporter feature is an attractive alternative. Amongst several approaches to produce influenza reporter viruses, a replication-competent reporter virus can be developed by fusing a reporter gene to a viral gene (e.g. PA or NS)(22). This new virus remains as virulent and replication-competent as the parental virus, making it suitable for viral pathogenesis studies, yet still subject to precautions regarding handling in high-containment laboratories. In contrast, single-cycle infectious or replication-restricted reporter (R3) influenza viruses can be prepared by replacing one of the essential viral genes (e.g. PB1, or HA) with a reporter gene(22–25). Thereby the R3 virus is capable of replicating only in cells engineered to express the deleted viral gene in trans, making it safe to rescue and propagate in low-containment laboratories.

In the present study, we developed a comprehensive panel of R3 viruses to enable high-throughput and in-depth influenza virus neutralization profiling. We generated a robust neutralization matrix of 24 monoclonal antibodies and 55 R3 viruses spanning 6 subtypes of influenza virus, and compared the R3 virus-based assay with the gold-standard ELISA-based MN assay(14). The reporter virus assay provides a more robust method for probing the breadth of anti-influenza immunity needed for developing universal influenza vaccines.


7. Strategies to Augment ADCC Activity

Augmenting ADCC activity is a novel research direction in cancer research. Target cell killing activities triggered by ADCC mAbs can be substantially increased by the addition of ADCC-promoting agents, which has attracted substantial attention in cancer research [134,135]. Means of augmentation of these responses in cancer research might shed light on influenza research as well. Different strategies for enhancing ADCC were developed and employed in clinical trials in recent studies.

Considering Fc- FcγRIII interaction is required to elicit ADCC activities, the potency of ADCC can be improved by strengthening this interaction. By selecting Fc variants with optimized Fc-FcγRIII affinity, antibodies can elicit a more robust activating signal to the effector cells [59]. Lazar et al. report that Fc variant S239D/I332E has the capacity to optimize Fc-FcγR interaction and enhance effector function both in vitro și in vivo [136].

Other strategies have been attempted to promote the secretion of cytokines by activating effector cells. Reovirus and toll-like receptor (TLR) agonists can increase NK-mediated ADCC by facilitating cytokines secretion [137]. TLR agonists can significantly enhance ADCC by increasing the percentage of activated NK cells. It has been reported that CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG ODN), TLR9 agonists, have the effect of promoting the cytokines secretion from an activated NK cell [138].


Animal Influenza Virus

This third edition aims to provide new and updated methods on animal influenza viruses as well as more advanced protocols that will guide the reader in designing research. Chapters detail influenza in peridomestic animals, marine mammals, savian influenza, swine influenza, equine influenza, hemagglutination, genome sequencing, and influenza in other mammals. Scris în mare succes Metode în biologie moleculară series format, chapters include introductions to their respective topics, lists of the necessary materials and reagents, step-by-step, readily reproducible laboratory protocols, and tips on troubleshooting and avoiding known pitfalls.

Authoritative and cutting-edge, Animal Influenza Virus: Methods and Protocols, Third Edition aims to ensure successful results in the further study of this vital field.

“The book is targeted to researchers in animal disease, specifically animal influenza viruses. … This book is a useful resource for individuals involved in animal influenza research, specifically those addressing avian, equine, or swine influenza viruses, but has little application for veterinary practitioners and those investigating non-influenza viruses or other disease agents.” (Marcella Ridgway, Doody’s Book Reviews, July 10, 2020)


Priveste filmarea: Primeiros Sintomas do HIV - Síndrome Retroviral Aguda (Ianuarie 2022).