Informație

3.4: Detectarea cantitativă a proteinelor (activitate) - Biologie


Context experimental

Albumina serică bovină (BSA) este o proteină care circulă în sângele vacilor. BSA purificat poate fi utilizat cu soluție Biuret în diluții seriale pentru a genera un Curba standard. Curba standard va ilustra relația dintre concentrație ( variabilă dependentă) și absorbanță la 540 nm ( independent variabil). Putem folosi această curbă pentru a estima concentrația probelor necunoscute.

1. Pe un grafic, vă amintiți care axă este dependentă și care este variabila independentă?

2. În tabelul de mai jos, puteți identifica care eșantioane sunt controale negative și care sunt controale pozitive?

3. Care este predicția absorbanței sau intensității culorii diferitelor tuburi?

Diluați standardele BSA

  1. Etichetați 9 tuburi 1-9.
  2. Combinați componentele din tabelul de mai jos pentru a genera concentrația adecvată de soluții.

  1. Așezați tubul 1 (gol) într-o cuvă și măsurați absorbanța (A) în spectrofotometru la 540 nm.
  2. Calibrați spectrofotometrul pentru a citi 0 la A540nm.
  3. Citiți secvențial fiecare probă la A540nm și înregistrați valorile în tabelul de mai jos.

  1. Trasați fiecare diluție BSA într-un program de foaie de calcul, cum ar fi Excel, ca diagramă de dispersie.
  2. Generați linia cea mai potrivită pentru aceste standarde cu ecuația liniei.
  3. Utilizați ecuația liniei pentru a estima concentrația eșantionului necunoscut.

Montarea curbei

Rulați simularea de mai jos pentru a înțelege cum puteți utiliza seria de diluție standard pentru a estima concentrațiile probei.

Faceți clic pe imaginea de mai sus pentru a începe simularea pe montarea curbei.

Tutorial Scatterplot

Utilizați tutorialul de mai jos și urmăriți la 1,25 X pentru a vă grafica propriile date.


3.4: Detectarea cantitativă a proteinelor (activitate) - Biologie

O revizuire a testelor de cuantificare a proteinelor și un sondaj despre testele de proteine ​​pe baza publicațiilor formale.

Cuantificarea precisă a proteinelor este esențială pentru studiile de proteine ​​într-o multitudine de subiecte de cercetare. O gamă largă de metode diferite au fost dezvoltate pentru a cuantifica atât amestecuri complexe de proteine, cât și un singur tip de proteine. Metodele de cuantificare a proteinelor totale cuprind metode tradiționale, cum ar fi măsurarea absorbției UV la 280 nm, acid bicinchoninic (BCA) și teste Bradford, precum și metode alternative precum Lowry sau teste noi dezvoltate de furnizori comerciali, care oferă adesea un design bine conceput, kit convenabil pentru fiecare tip de test. Metodele individuale de cuantificare a proteinelor includ testul imunosorbent legat de enzime (ELISA), analiza Western blot și, mai recent, spectrometria de masă, printre altele. Cuantificarea precisă a proteinelor este esențială pentru toate experimentele legate de studiul proteinelor într-o multitudine de subiecte de cercetare. Diferite O gamă largă de metode diferite au fost dezvoltate pentru a cuantifica atât amestecuri complexe de proteine ​​într-un test dat pentru conținutul total de proteine, cât și pentru un singur tip de proteine. Metodele de cuantificare a proteinelor totale cuprind metode tradiționale, cum ar fi măsurarea absorbanței UV la 280 nm, acid bicinchoninic (BCA) și teste Bradford, precum și metode alternative precum Lowry sau teste noi dezvoltate de furnizori comerciali. De obicei, furnizorii comerciali care oferă adesea un kit convenabil și bine proiectat pentru fiecare tip de test. Metodele individuale de cuantificare a proteinelor includ analiza imunosorbentă legată de enzime (ELISA), analiza Western blot și, mai recent, spectrometria de masă, printre altele. În anumite cazuri, reglementările sau legile grupurilor comerciale pot necesita metode specifice pentru cuantificarea proteinelor. De exemplu, International Serum Industry Association (www.serumindustry.org), un grup comercial pentru furnizorii de ser, recomandă metoda Biuret pentru determinarea conținutului de proteine ​​din produsele serice.

Aici discutăm câteva dintre metodele comune utilizate pentru a determina concentrația de proteine ​​în soluție, subliniind utilitățile și limitările acestora. Este important să rețineți că niciuna dintre aceste analize de proteine ​​nu este specifică proteinelor, ceea ce înseamnă că componentele non-proteice pot interfera, sau uniform precise și compatibile cu toate proteinele. Mai mult, modificările proteinelor pot interfera cu estimarea concentrației proteinelor pentru unele dintre teste în comparație cu proteina nemodificată [3, 4]. În plus, unele teste, de exemplu testul 3- (4-carboxibenzoil) chinolină-2-carboxaldehidă (CBQCA), sunt de asemenea eficiente atunci când sunt utilizate pentru a cuantifica peptidele sau proteinele atașate la suprafață sau încapsulate [5].

Tabelul 1 rezumă analizele comune de cuantificare a proteinelor totale. Mai puțin frecvente, cum ar fi Pierce 660 de la Thermo (catalog nr. 22660) [6], cuantificarea proteinelor NanoOrange [7], fluorometrul Qubit [8], kitul de testare a sintezei proteinelor pe bază de O-proparil-puromicină pentru proteinele născute [9], nu sunt discutate. Este important să evaluați compatibilitatea fiecărui test cu tipurile de eșantioane, intervalul de testare, volumul eșantionului și disponibilitatea unui spectrofotometru adecvat, precum și timpul și costul.

test absorbţie mecanism limita detectiei avantaje dezavantaje
Absorbția UV280 nmabsorbția tirozinei și triptofanului0,1-100 ug / mlvolum mic de eșantion, rapid, cost redusincompatibil cu detergenții și agenții denaturanți, variabilitate ridicată
Acid bicinconinic562 nmreducerea cuprului (Cu 2+ la Cu 1+), reacție BCA cu Cu 1+ 20-2000 ug / mlcompatibil cu detergenți și agenți denaturanți, variabilitate redusăcompatibilitate redusă sau deloc cu agenții reducători
Bradford sau Coomassie albastru strălucitor470 nmformare complexă între colorantul albastru strălucitor Coomassie și proteine20-2000 ug / mlcompatibil cu agenții reducători, rapidincompatibil cu detergenții
Lowry750 nmreducerea cuprului prin proteine, Folin-Ciocalteu reducerea prin complexul cupru-proteină10-1000 ug / mlsensibilitate și precizie ridicateincompatibil cu detergenți și agenți reducători, procedură lungă

Aminoacizii aromatici tirozină și triptofan conferă proteinelor absorbția lor ultravioletă (UV) caracteristică la 280 nm, care este utilizată în mod obișnuit pentru a estima concentrația de proteine. Legăturile de fenilalanină și disulfură contribuie, de asemenea, la absorbția la 280 nm, deși ușor. Această metodă este simplă și poate fi realizată cu un volum de probă extrem de mic, de până la 0,5 ul, deoarece spectrofotometrele noi folosesc un sistem de reținere a probelor în timpul măsurării. Cu toate acestea, proba de proteine ​​nu trebuie să conțină niciun component non-proteic cu absorbție substanțială la 280 nm, cum ar fi contaminanții cu acizi nucleici [10]. Pentru probele de proteine ​​pure, trebuie cunoscută secvența exactă de aminoacizi a proteinei analizate și trebuie calculat un coeficient de absorbție specific proteinei anterioare înainte de determinarea concentrației soluției [11, 12]. Această metodă este cea mai rapidă, dar predispusă la erori și este incompatibilă cu o gamă largă de metode de extracție a proteinelor care utilizează frecvent detergenți și agenți de denaturare.

Testul acidului bicinchoninic (BCA) a fost inventat în 1985 de Paul K. Smith la Pierce Chemical Company, principalul distribuitor al acestui test [13]. Ambele teste BCA și Lowry se bazează pe conversia Cu 2+ în Cu 1+ în condiții alcaline. Această conversie se numește Reacția Biuret (Figura 1) și este influențat de mai multe resturi de aminoacizi (cisteină, cistină, tirozină și triptofan) și de coloana vertebrală a peptidei.

BCA este un reactiv cromogen specific pentru Cu 1+ și în a doua etapă a reacției două molecule BCA reacționează cu un ion Cu 1+. Cantitatea de Cu 2+ redusă este o funcție a concentrației de proteine ​​care poate fi determinată spectrofotometric printr-o schimbare de culoare a soluției probei din albastru în violet, care absoarbe lumina la 562 nm. Absorbanța este direct proporțională cu cantitatea de proteine ​​prezentă în soluție și poate fi estimată prin comparație cu un standard proteic cunoscut, cum ar fi albumina serică bovină (BSA) [10, 14, 15]. Deoarece BSA și proteina / peptida măsurată pot avea o dezvoltare cromoforică diferită, cantitatea de proteină / peptidă trebuie ajustată. De exemplu, Nortley R și colab. Au multiplicat concentrația măsurată a peptidelor beta-amiloide cu setul de testare a proteinei Pierce BCA și BSA ca standard cu un factor de 1,51 [16].

Testul BCA este, în general, tolerant la detergenții ionici și neionici, cum ar fi NP-40, Triton X-100 și agenți denaturatori precum ureea și clorura de guanidiniu care tind să interfereze cu alte teste colorimetrice ale proteinelor, cum ar fi Lowry (Tabelul 2) [15]. Cu toate acestea, unii reactivi, cum ar fi acidul etilendiaminetetraacetic (EDTA) [17], reducând zaharurile [18, 19] și lipidele [20], pot interfera cu testul BCA. Efectele unor astfel de interferențe pot fi ameliorate prin strategii precum reducerea substanțelor care interferează prin dializă, filtrare pe gel sau dacă concentrația de proteine ​​este suficient de mare, prin diluarea probei. Reichelt și colab. Au propus ajustări simple ale metodei care pot duce la îmbunătățiri vizibile ale preciziei măsurătorilor, în special pentru proteinele nepurificate în soluții complexe, cum ar fi mediile de cultură [21]. Ei folosesc un factor de corecție dat de măsurarea unui vârf intern de proteină BSA adăugat la fiecare probă. Pe baza studiilor lor, precizia cuantificării proteinei BCA ar putea fi îmbunătățită de cinci ori, făcând precizia cuantificării BCA comparabilă cu cea a abordărilor mai scumpe [21].

Un alt factor care interferează cu acuratețea testului BCA este prezența reziduurilor modificate chimic în proteină. Brady și Macnaughtan au evaluat impactul metilării lizilului asupra testelor Bradford și BCA și au constatat că pentru testul BCA, concentrațiile de proteine ​​din probele de proteine ​​metilate au fost constant supraestimate [4].

NP-40Zaharoza
EmulgenGlicină, pH 2,8
HEPESGlucoză
TDTEDTA
Triton X-100NaCI
UreeNaOH
Guanidină HCISulfat de amoniu
Acetat de sodiu, pH 5,5SDS

Thermo Fisher Pierce are o nouă versiune a testului de proteine ​​BCA, numit Pierce ™ BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible, care tolerează ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (BME), TCEP și alți agenți reducători ai disulfurii [22].

Testul BCA are o mulțime de avantaje. Comparativ cu alte metode, testul BCA este unul dintre cele mai sensibile (poate detecta proteinele la concentrații de până la 5 ug / ml). Are o variabilitate mai mică decât altele (de exemplu, testul Bradford) și poate fi utilizat pentru a măsura o gamă largă de concentrații de proteine. Mai mult, sensibilitatea sa poate fi mărită prin efectuarea testului în prezența nanosenzorilor plasmonici, ca și în testul SPR-BCA (Surface Plasmon Resonance – BCA) propus de Liu și colab. [23]. Cu acest test, limita de detecție a fost de 3,4 ng / ml și domeniul general de lucru a fost de 0,5 până la 1000 μg / ml, scăzând astfel concentrațiile de proteine ​​care pot fi măsurate cu testul tradițional BCA.

Testul Bradford, descris inițial de Dr. Marion Bradford în 1976, este o metodă populară de determinare a concentrației de proteine. Se bazează pe formarea unui complex între colorantul albastru strălucitor G-250 Coomassie și proteinele în soluție. Colorantul liber există în patru forme ionice diferite. Forma albastră mai anionică se leagă de proteine ​​și are o absorbanță la 595 nm (Figura 2). Concentrația de proteine ​​este determinată de cantitatea de colorant sub formă ionică albastră măsurată prin absorbția soluției la 595 nm folosind un spectrofotometru [24]. Vopseaua se leagă în principal de resturile de arginină, triptofan, tirozină, histidină și fenilalanină [10].

Majoritatea cercetătorilor folosesc BSA ca standard proteic, deoarece este ieftin și ușor de accesat, dar nu este întotdeauna potrivit. Într-adevăr, un dezavantaj al utilizării BSA este că prezintă un răspuns puternic la colorant și poate duce la subestimarea concentrațiilor de proteine ​​din probe. Aceasta nu este o problemă dacă sunt necesare doar concentrații relative de probe. Cu toate acestea, dacă este necesară o măsură precisă a concentrației de proteine, imunoglobulina G (IgG), lizozima sau alte standarde proteice sunt adesea alegeri mai bune, în funcție de proteina eșantion [24].

Printre avantajele testului Bradford se numără compatibilitatea cu agenții reducători utilizați pentru stabilizarea proteinelor în soluție, care nu sunt compatibile cu testul Lowry și într-o oarecare măsură nu sunt compatibile cu testul BCA. De asemenea, deoarece vopseaua nu se leagă de peptide cu MW scăzut puteți măsura concentrațiile proteinelor cu greutate moleculară mare (MW) în prezența peptidelor contaminante [10, 24].

Principala limitare a testului Bradford este incompatibilitatea sa cu majoritatea detergenților, utilizați în mod obișnuit pentru a solubiliza proteinele de membrană. (Interesant este că nivelurile foarte scăzute de detergent neionic, cum ar fi Triton X-100, pot îmbunătăți sensibilitatea și variabilitatea testului Bradford [25]). Detergenții pot fi îndepărtați prin filtrare pe gel sau dializă sau prin precipitare cu fosfat de calciu [24] sau acetonă. Aceste metode pot duce la diluarea probei sau pierderea probei, cu recuperarea a 70% sau mai puțin din cantitatea inițială de proteine. Cheng și colab. Au descris o precipitare a proteinelor și o metodă bazată pe testul Bradford care permite cuantificarea rapidă a proteinelor, chiar și atunci când soluția proteică conține substanțe care interferează [26]. Metoda realizează o rată îmbunătățită de recuperare a proteinelor după o precipitare de numai o oră cu acetonă după adăugarea zaharozei, o componentă care nu interferează cu testul Bradford.

Testul Lowry, propus de Oliver H. Lowry în 1951, se bazează pe două reacții chimice (Figura 3). Prima reacție este reducerea ionilor de cupru în condiții alcaline, care formează un complex cu legături peptidice (reacția Biuret discutată mai sus). Al doilea este reducerea reactivului Folin-Ciocalteu de către complexul de legătură cupru-peptidă, care determină ulterior o schimbare a culorii soluției în albastru cu o absorbție în intervalul 650 - 750 nm detectabilă cu un spectrofotometru [10]. Cantitatea de proteină din probă poate fi estimată utilizând o curbă standard a unei soluții de proteine ​​standard selectate, cum ar fi BSA.

Avantajele acestei analize sunt sensibilitatea și, cel mai important, precizia. Cu toate acestea, necesită mai mult timp decât alte teste și mulți compuși utilizați în mod obișnuit în tampoane pentru prepararea proteinelor (cum ar fi, detergenți, carbohidrați, glicerol, Tricină, EDTA, Tris) interferează cu testul Lowry și formează precipitate (Tabelul 3) [10] . Cu toate acestea, efectul acestor substanțe poate fi redus prin diluarea probei, dar numai dacă concentrația de proteine ​​este suficient de mare [27]. Mai mult, s-a demonstrat că timpul pentru efectuarea acestui test poate fi redus prin creșterea temperaturilor sau folosirea unui cuptor cu microunde [27].

DetergențiCompus disulfură
CarbohidrațiFenol
GlicerolAcid uric
TricinăGuanine
EDTAXanthine
TrisMagneziu calciu
Compuși de potasiuCompuși sulfhidril

3- (4-carboxibenzoil) chinolin-2-carboxaldehidă (CBQCA) este un reactiv fluorogenic sensibil utilizat pentru detectarea aminelor din proteine. Deoarece poate detecta doar aminele accesibile din proteina testată, această metodă are aceleași limitări ale metodelor spectrofotometrice pentru care rezultatul depinde de numărul anumitor aminoacizi din proteină. Cu toate acestea, CBQCA este foarte sensibil și poate detecta de la 10 ng la 150 ug de proteine ​​într-un volum de 100 ul. De asemenea, pe partea pozitivă, reactivul CBQCA funcționează bine în prezența unor substanțe, cum ar fi lipidele, cunoscute că interferează în multe alte metode de determinare a proteinelor [28], sau când este utilizat pentru a cuantifica peptidele sau proteinele atașate la suprafață sau încapsulate [5] .

Un pas crucial al multor experimente biomedicale de laborator este cuantificarea unei proteine ​​specifice în soluție. Au fost folosite mai multe tehnici pentru a realiza acest lucru. Cele comune ale acestor metode de cuantificare sunt ELISA, analiza Western blot și spectrometria de masă. ELISA și Western blot sunt discutate în aplicațiile anticorpilor, specificațiile de masă sunt discutate aici pe scurt și sunt discutate în articolul de revizuire Labome Bioanaliza cantitativă a proteinelor prin spectrometrie de masă.

Spectrometria de masă a proteinelor este o metodă relativ nouă și în curs de dezvoltare pentru cuantificarea proteinelor. Pe lângă caracterizarea proteinelor, un pas important în analiza proteomică este posibilitatea de a cuantifica o proteină specifică. Multe tehnici au fost introduse și implementate pentru cuantificarea proteinelor prin spectrometrie de masă. Când este posibilă etichetarea proteinelor, o probă de proteină sau peptidă este marcată cu un izotop mai greu stabil (de exemplu, 13 C sau 15 N) în timp ce o a doua probă (standard intern) este etichetată cu un izotop mai ușor (de exemplu, 12 C sau 14 N) . Probele sunt amestecate, iar diferențele de masă datorate etichetelor fac posibilă analiza raportului dintre cele două intensități de vârf ale probei de către un analizor de masă, care corespunde raportului lor de abundență relativă. Metodele alternative permit cuantificarea proteinelor prin spectrometrie de masă fără etichetarea probelor [29].

Deosebit de interesantă este capacitatea de a folosi spectrometria de masă ca abordare universală pentru efectuarea atât a testelor cantitative, cât și a celor calitative într-o singură măsurare. De exemplu, recent au fost publicate mai multe metode bazate pe MS dezvoltate pentru cuantificarea proteinelor specifice în probe biologice. Acestea includ o metodă pentru cuantificarea factorului 1 de creștere asemănător insulinei în ser [30], o metodă pentru cuantificarea albuminei în urină [31] și a ubiquinonei în ser / plasmă [32]. Metode de cuantificare a proteinelor țintă mai puțin specifice pot fi găsite și în literatura recentă [33-35]. Au fost publicate liniile directoare pentru măsurători de spectrometrie de masă țintite ale peptidelor și proteinelor [36] pentru a încerca să asigure metode exacte și comparabile în această abordare în dezvoltare rapidă. Cu toate acestea, această metodă necesită instrumente costisitoare pe care multe laboratoare nu le pot permite și acest lucru limitează utilitatea acestei abordări [14, 37].

Pentru cuantificarea spectrometrică de masă a proteinelor, standardele interne de peptide pentru mai multe proteine ​​pot fi concatenate pentru a permite analiza multiplexă a proteinelor (proteina QCAT) [38]. A fost dezvoltată o extensie a acestei metode în care aceste peptide concatenate includeau epitopi antigenici pentru anticorpi multipli. Proteinele de calibrare concatenate denumite DOSCATs (Double Standard conCATamers) pot satisface nevoile atât pentru spectrometrie de masă, cât și pentru western blot [39].

Expresia proteinelor poate fi monitorizată în celulele vii prin legarea genetică a unei proteine ​​de interes cu o proteină raportor sau un epitop, cum ar fi proteina fluorescentă verde (GFP). Conectarea proteinei de interes la reporter cu un anumit element de hidrolază cu acțiune cis numit „Protein Quantitation Reporter” (PQR) [1] permite proteinei și reporterului să fie transcrise împreună, dar traduse ca proteine ​​funcționale separate.Acest lucru poate asigura exprimarea stoichiometrică atât a proteinei, cât și a raportorului, astfel cantitatea de proteină poate fi dedusă din intensitatea fluorescentă (Figura 4).

Limitările metodelor de cuantificare discutate mai sus au condus la dezvoltarea de noi strategii pentru determinarea concentrațiilor de proteine ​​în soluții simple și complexe. Una dintre cele mai populare profită de proprietățile optice ale nanoparticulelor [40]. Pe scurt, lungimea de undă la care anumite nanoparticule absorb lumina se schimbă datorită legării altor molecule sau agregării [41]. Deoarece intervalul de absorbție a luminii este în spectrul vizibil, această schimbare este percepută ca o schimbare de culoare. Nanoparticulele au fost utilizate până acum împreună cu particulele care leagă proteinele, de exemplu, anticorpi, peptide sau aptameri. Rogowski și colab. Au propus un nou tip de senzor de nanoparticule pentru detectarea și cuantificarea proteinelor, pe care le-au numit „nas chimic” [42]. Senzorul lor constă dintr-un amestec de nanoparticule de aur cu diferite forme care prezintă agregare diferențială atunci când interacționează cu diferite proteine ​​(Figura 5). Pe baza spectrelor lor de absorbție a luminii, particulele permit detectarea și cuantificarea proteinelor purificate în soluții apoase sau a proteinelor nepurificate în soluții complexe.

Kong și colab. Au dezvoltat o metodă care utilizează molecule purtătoare de ADN lungi și nanopori de sticlă în stare solidă pentru a măsura concentrația proteinelor în soluție în domeniul nanomolar [2]. În această metodă, moleculele purtătoare de ADN, capabile să lege proteinele în locații specifice, se translocează prin nanopori cu ajutorul unui curent electric. La translocare, ADN-ul provoacă un semnal de cădere de curent. O picătură suplimentară este înregistrată atunci când o proteină este atașată la ADN. Cu cât este mai mare concentrația de proteine, cu atât purtătorul este mai „încărcat”. Frecvența picurilor de scădere a curentului secundar crește, de asemenea, odată cu creșterea concentrației de proteine ​​(Figura 6).

Labome a chestionat publicații selectate aleatoriu, revizuite de colegi, citând teste totale de proteine. Laboratoarele Thermo Fisher Pierce și Bio-Rad sunt identificate ca fiind furnizorii principali de kituri totale de testare a proteinelor (Tabelul 4). Cele mai des utilizate metode sunt BCA și Bradford.

TestFurnizorNumEșantion de referință
BCA / pe bază de cupru
Thermo Fisher13023275 [43], 23225 [44]
MilliporeSigma8
Beyotime2
Asistență medicală GE12-D quant [45]
Bradford
Bio-Rad57 [46, 47], 5000006 [48]
Thermo Fisher Pierce11 [49], 23200 [50]
MilliporeSigma1
Expedeon1 [44]
Carl Roth1Roti-nanoquant [51]
Test Lowry / DC modificat
Bio-Rad17 [52]
MilliporeSigma1
Detectare UV la 280 nm
Thermo Scientific (Nanodrop)3

Aproape toate testele de proteine ​​BCA citate în cohorta anchetată au fost furnizate de Pierce, unde unul dintre oamenii de știință a inventat testul în urmă cu mulți ani. Thermo Fisher a cumpărat Pierce acum câțiva ani. Testele BCA Thermo Fisher Pierce au fost utilizate pentru a studia, de exemplu, separarea fazelor proteazomilor [53], creșterea Salmonella [54], expresia Cox-2 și mPGES-1 în celulele dendritice derivate din măduva osoasă de șoarece [55], efectul oligomeri beta amiloizi pe pericite și capilare [16], neurodegenerarea patologică α-sinucleină în boala Parkinson [56] și altele [57, 58]. Trusele sale de testare a proteinelor Micro BCA au fost utilizate pentru a măsura tau mutant recombinant purificat [59].

Au fost citate și reactivul MilliporeSigma BCA și trusa de testare a proteinei Bio-Rad BCA.

Thermo Fisher Pierce este, de asemenea, unul dintre principalii furnizori de kituri de testare Bradford. Kapogiannis D și colab au măsurat conținutul de proteine ​​ale probelor de exosom și plasmă înainte de Western blot cu un test Bradford de la Thermo Fisher (catalog: 23200) [50]. Reactivii de testare a proteinelor Bio-Rad Bradford au fost folosiți pentru măsurarea conținutului de proteine ​​în extracte de histone brute (catalog: 5000006) [60], în lizatele celulare ale cancerului de sân [47] și în lizatele celulare A549 [48].

Alți furnizori au furnizat, de asemenea, kiturile de testare Bradford, de exemplu, Carl Roth [51] și Expedeon [61].

Testul Pierce Lowry (numărul de catalog 23240) a fost utilizat în [62], iar Bio-Rad Laboratories Testul Lowry a fost utilizat în [63] și [64] pentru cuantificarea proteinelor. Testul proteinei Bio-Rad DC este o versiune modificată a testului Lowry. Este un test popular de proteine, datorită compatibilității sale cu detergenți. Această analiză a fost utilizată pentru a determina concentrația de proteine ​​pentru a studia structura și funcția proteinei CD81 a membranei tetraspaninei umane [65] efectul ablației specifice a mușchilor scheletici a gamma (cito) -actinei asupra fenotipului mdx [62], printre altele [66]. , 67].

Cel mai bun standard pentru cuantificarea proteinelor este aceeași proteină ca cea examinată. Cu toate acestea, acest lucru de obicei nu este fezabil. BSA (albumina serică bovină) este cel mai frecvent utilizat standard proteic. Are limitări. Este mai sensibil în testul Bradford decât alte proteine, astfel încât concentrația probei de proteine ​​este probabil subestimată [68]. În plus, BSA, ca proteină serică, nu poate fi preparată / obținută la o puritate foarte mare, deoarece se leagă de mulți alți factori. Alte proteine, cum ar fi imunoglobulina G și lizozima, au fost folosite și ca standarde proteice. Cea mai bună opțiune într-un anumit experiment poate varia în funcție atât de proteinele dvs. de interes, cât și de metoda de cuantificare pe care o alegeți.

Nu. Este foarte important ca punctele de date ale eșantionului să se încadreze în domeniul curbei standard, deoarece curba poate varia imprevizibil la concentrații mai mari sau mai mici. Diluarea probelor și / sau standardelor dvs. ar trebui să fie ajustată pentru a menține probele în curba standard.


Fundal

Întreaga montură in situ hibridizarea (WISH) este utilizată pentru a studia modelul de expresie a ARN-ului genelor în contextul țesuturilor în care funcționează ARN-urile [1,2]. Cromogen in situ tehnicile de hibridizare (ISH) sunt utilizate în mod obișnuit în diferite modele de organisme în acest scop și se bazează pe o reacție enzimatică care transformă un substrat incolor într-un precipitat vizibil întunecat. Folosind ISH cromogen, până la trei mARN diferiți pot fi detectați simultan în Drosophila embrioni [3,4]. Cu toate acestea, detectarea a cel mult două transcrieri diferite a fost realizată până acum la embrionii de pește zebră folosind această metodă [4].

Comparativ cu ISH cromogen, fluorescent in situ hibridizarea (FISH) oferă o rezoluție mai mare și o detectare îmbunătățită a tiparelor de expresie genică suprapuse într-o singură probă [5-7]. Combinarea FISH cu microscopia confocală poate furniza astfel informații spațiale referitoare la expresia ARN-ului investigat în cadrul unor probe tridimensionale complexe, cum ar fi embrioni. Semnalul generat în FISH se bazează pe legarea unui anticorp conjugat cu peroxidază de ridiche de cal (HRP) la ribonucleotidele modificate ale sondei, urmată de amplificarea semnalului tiramidic (TSA), unde HRP convertește o tiramidă conjugată la fluorofor într-un intermediar fluorescent reactiv care se leagă covalent de resturile de aminoacizi din apropiere, de obicei tirozină. În timp ce FISH multicolor poate fi utilizat potențial pentru detectarea mai multor transcrieri prin utilizarea diferitelor substraturi fluorescente tiramidice, metoda este mai puțin eficientă, în special pentru ARN-urile exprimate la niveluri scăzute [6]. Pentru a depăși acest dezavantaj al metodei, au fost prezentate modificări la protocolul FISH original care sporesc semnificativ sensibilitatea testului [7,8]. Cu toate acestea, ca și alte metode WISH, acest protocol se bazează și pe generarea de produse difuzibile care pot reduce rezoluția localizării transcrierii.

A fost raportată o metodă alternativă recent dezvoltată care permite etichetarea fluorescentă simultană a până la cinci transcrieri prin utilizarea unei amplificări ortogonale cu reacții în lanț de hibridizare (HCR) [9]. În această metodă, un set de sondă de una până la nouă specii de sondă este utilizat pentru a viza fiecare moleculă de ARNm. În urma hibridizării sondei, agrafele fluorescente din ARN se autoasamblează în polimeri de amplificare fluorescentă [9]. Mai recent, a fost dezvoltată o nouă tehnologie numită ARNscop pentru detectarea ARN in situ. Această metodă se bazează pe amplificarea semnalului fluorescent la hibridizarea sondei țintă [10] (Figura 1) și, spre deosebire de alte metode ARN ISH, inclusiv HCR, este un protocol rapid care poate fi finalizat în mai puțin de 2 zile. Important, ca rezultat al proiectării inovatoare a sondei și a unei strategii de detectare care se bazează pe produse fluorogene nedifuzibile, această metodă permite detectarea transcrierilor rare la rezoluție înaltă, generând în același timp un semnal de fundal scăzut [11-14]. În această metodă, sondele speciale sunt proiectate astfel încât să hibridizeze cu ARNm țintă, fiecare sondă conținând o secvență de coadă diferită, care oferă baza pentru asamblarea unei schele de amplificare a semnalului. Deoarece această schelă se va forma doar pe o pereche de sonde flancante, specificitatea semnalului este crescută dramatic (Figura 1). Această metodă permite detectarea simultană a până la patru specii de ARNm în liniile celulare canceroase încorporate în parafină și secțiunile de țesut tumoral fixate în formalină, utilizând fie detectare fluorescentă, fie cromogenă [10]. Până în prezent, ARNscopul a fost utilizat în cercetarea medicală și pentru detectarea biomarkerilor histopatologici în diagnosticul clinic [11-15]. Ca test sensibil și specific cu capacități multiplex, RNAscope permite măsurători cantitative ale nivelurilor de ARN în contextul țesutului [11], precum și detectarea fiabilă a moleculelor de ARN cu abundență redusă prin citometrie în flux [16]. Introducerea sondelor relativ mici înainte de generarea produselor de amplificare imobile poate contribui la o bună penetrare în embrion și la etichetarea eficientă a transcrierilor rare.

Principiul RNAscope. Hibridizarea sondei țintă: Seturi de sonde oligonucleotidice specifice pentru ARNm diferiți sunt proiectate, astfel încât fiecare pereche de două sonde în formă de Z (fiecare aproximativ 20 bp) hibridizează cu ARNm țintă specific. În total, sunt proiectate 20 de perechi pentru fiecare ARN de interes. În plus față de secvența complementară de ARN, fiecare sondă conține un distanțier, precum și o secvență de coadă de care se leagă structura pre-amplificatorului în etapa următoare. Amplificarea semnalului: Ca rezultat al interacțiunii pre-amplificatorului cu secvența cozii, se formează o schelă asemănătoare unui copac care oferă mai multe site-uri de legare pentru etichetele fluorescente. Etichetare fluorescentă: Ulterior, se adaugă simultan etichete fluorescente distincte. Împreună, numărul mare de etichete fluorescente legate de fiecare pereche de sondă țintă oferă un semnal puternic, permițând detectarea speciilor rare de ARNm.

În timp ce ARNscopul a fost utilizat cu succes pentru materialul secționat, determinarea modelelor de expresie a ARN în probe biologice mai mari, cum ar fi embrioni intacti, ar fi extrem de benefică în cercetarea biomedicală și biologia dezvoltării și atunci când se analizează probe clinice mari. Adaptarea acestei metode pentru embrioni intacti ar permite analiza simultană de înaltă rezoluție a genelor importante din punct de vedere al dezvoltării și ar oferi informații cantitative detaliate privind tiparele de expresie și nivelurile de expresie din embrionul și țesutul în curs de dezvoltare.

Pe baza ARNscopului ISH În principiu, oferim un protocol ajustat pe care l-am dezvoltat pentru probe mari de țesut, așa cum se exemplifică aici prin utilizarea embrionilor de pește zebră cu montaj întreg. Protocolul conceput include pași care promovează păstrarea eficientă a integrității embrionilor, permițând în același timp penetrarea eficientă a sondelor și un raport excelent semnal-zgomot. Este un protocol rapid și robust care facilitează detectarea cantitativă simultană a mai multor transcrieri într-un embrion. Important, în plus față de dezvăluirea distribuției spațiale a moleculelor de ARN, protocolul permite determinarea simultană a modelelor de expresie a proteinelor și a localizării subcelulare a proteinelor.


Rezultate

Dezvoltarea metodei

Principiul metodei este prezentat în figura 1. La început, C-P4H se leagă pentru a captura anticorpii cuplați cu margele magnetice. Anticorpii monoclonali împotriva subunității α (mab-α) au fost aleși pentru captarea proteinelor pentru a evita blocarea sistemului cu subunități PDI / β libere abundente. Cantitatea de subunități PDI / β gratuite în producerea C-P4H E coli celulele sunt ridicate, deoarece producția începe cu expresia subunităților PDI / β pentru a păstra subunitățile α exprimate ulterior într-o formă solubilă [14]. După etapa de legare, complexul este spălat și incubat cu anticorpi de detectare. Detectarea proteinelor cu anticorp policlonal împotriva unei alte subunități C-P4H (PDI / β) garantează că vor fi măsurate numai proteinele care conțin atât subunități α, cât și PDI / β. IgG anti-iepure de capră marcat cu fosfatază alcalină (GAR-AP) se atașează la anticorpul de detectare, iar fosfataza alcalină catalizează reacțiile de transformare a substratului cu generarea de produse fluorescente. Semnalul de fluorescență este proporțional cu concentrația de C-P4H.

Principiul sandwich ELISA pe bază de mărgele pentru C-P4H. Tetramerul C-P4H este captat de anticorpul monoclonal împotriva subunității α (mab-α) cuplat cu margele magnetice. După o etapă de spălare, anticorpul policlonal de iepure împotriva subunității β (pab-β) se leagă de proteină. IgG anti-iepure de capră marcat cu fosfatază alcalină (GAR-AP) este utilizat pentru detectarea complexului. AP catalizează reacțiile de transformare a substratului cu generarea semnalului de fluorescență.

Fixarea Mab-α la margele magnetice

Au fost testate etichetarea mab-α cu molecule de biotină și atașarea lor pe suprafața mărgelei de streptavidină (Figura 2A). Prin urmare, granulele magnetice acoperite cu streptavidină au fost incubate cu cantități diferite de mab-α biotinilat. Anticorpul atașat la margele prin interacțiunea biotină-streptavidină. Complexul format a fost spălat și detectat cu IgG anti-șoarece de capră marcat cu fosfatază alcalină (GAM-AP).

Atașarea mab-α la margele magnetice și influența diluțiilor mab-α și GAM-AP asupra semnalului fluorescent. (A) Principiul testului. Mab-α se leagă de margele magnetice prin interacțiunea biotină-streptavidină. Complexul este detectat cu IgG anti-șoarece de capră etichetat cu AP (GAM-AP). (B) Semnalele generate obținute atunci când au fost utilizate concentrații diferite de mab-α și GAM-AP. Barele de eroare arată ± SD a trei experimente paralele.

Diferite concentrații de anticorpi mab-α și GAM-AP au fost utilizate în experiment. Semnalele fluorescente generate s-au dovedit a fi apropiate de cele maxime observate vreodată pentru testul fluorescent pe bază de margele, indiferent de diluțiile anticorpilor (datele nu sunt prezentate). Fluorescența de fond obținută fără adăugarea de mab-α a fost de 20-140 de ori mai mică comparativ cu semnalele specifice. Cea mai bună relație între semnal și fundal (raportul semnal FLU / fundal) a fost realizată cu cel mai diluat mab-α (diluție 1/500) și GAM-AP (diluție 1/2500) (Figura 2B), deoarece fluorescența de fond a crescut cu creșterea concentrațiilor de anticorpi. S-a decis selectarea exactă a concentrațiilor optime de anticorpi în ELISA sandwich folosind tetramerul C-P4H ca țintă. S-au ales diluții 1/500 ale mab-α și diluții 1/2500 pentru anticorpul secundar de detectare pentru alte experimente.

Alegerea pab-β optimă

Patru anticorpi policlonali diferiți împotriva PDI umană au fost testați ca anticorp sandwich C-P4H pentru detectarea ELISA (Figura 3). 1, 10 și 20 ng de C-P4H purificat au fost utilizate ca țintă. Diluțiile de anticorpi au fost după cum urmează: 1/500 pentru mab-α și pentru fiecare pab-β și 1/5000 pentru GAR-AP utilizate aici ca anticorp secundar de detecție. Concentrația anticorpului secundar (GAR-AP) a fost aleasă mai mică decât pentru anticorpul GAM-AP utilizat în experimentul anterior, deoarece aici se aștepta o cantitate mai mică de complexe detectabile.

Comparația anticorpilor de detectare produși de diferiți producători. C-P4H purificat a fost măsurat cu sandwich-ul ELISA folosind diferiți anticorpi pab-β: pab-β A (Abcam), pab-β B (Calbiochem, Germania), pab-β C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) și pab- β D (Stressgen Bioreagents). Barele de eroare arată ± SD a trei experimente paralele.

Rapoartele semnal / fundal au fost comparate pentru fiecare pab-β. Acest parametru a fost de aproximativ 3 ori mai mare când s-a utilizat pab-β C, prin urmare acest anticorp a fost selectat pentru alte experimente.

O mare variabilitate observată pentru rezultate s-a datorat aglomerării mărgelelor în unele experimente. Pentru a evita acest efect, creșteți eficiența spălării și sensibilitatea testului, metoda a fost optimizată în experimentul urmat.

Optimizarea metodei

Influența diferiților parametri (timpul de hibridizare, concentrația de sare în tamponul de spălare și rata de agitare) a fost studiată pentru a optimiza sensibilitatea, acuratețea și reproductibilitatea testului (Figura 4). Răspunsurile au fost prezentate ca semnal absolut minus semnal de fundal în loc de raport semnal / fundal utilizat anterior pentru a vizualiza mai bine efectul parametrilor modificați. Cel mai mare semnal fluorescent comparativ cu nivelul de fundal și cea mai mică deviație standard au fost obținute atunci când proteina a fost incubată cu fiecare anticorp timp de 1 oră. Deși o hibridizare mai lungă (mai mult de 1 oră) ar putea avea un efect pozitiv asupra semnalului, nu a fost testată, deoarece ar crește considerabil timpul total de testare. Viteza de agitare în timpul etapei de hibridizare nu a influențat în mod semnificativ rezultatele (Figura 4A) și a fost selectată viteza de agitare de 700 rpm deoarece previne sedimentarea granulelor. O concentrație crescută de NaCI în tamponul de spălare era de așteptat să crească eficiența spălării, dar nu a avut un efect semnificativ asupra semnalului (Figura 4B). Era evident că plăcile trebuie agitate în timpul fazelor de spălare între etapele de hibridizare. Fără a scutura mărgelele aglomerate și spălarea nu a fost suficient de eficientă, provocând variații crescute între replici (Figura 4B).

Optimizarea procedurilor de hibridizare și spălare a sandwich-ului C-P4H ELISA. (A) Optimizarea timpului de hibridizare. (B) Optimizarea condițiilor de spălare (viteza de agitare și concentrația de NaCl în tamponul de spălare). 1 tg de C-P4H purificat a fost folosit ca țintă. Barele de eroare arată ± SD a trei experimente paralele.

Optimizarea concentrațiilor de anticorpi

Concentrațiile anticorpilor utilizați în sandwich-ul ELISA au fost optimizate utilizând o abordare de proiectare experimentală.

Proiectarea factorială completă a metodologiei suprafeței de răspuns (RSM) a fost aleasă pentru a explora nivelul optim al celor trei anticorpi (Tabelul 1). Raportul semnal FLU / fundal a fost măsurat cu ELISA sandwich pentru 1, 20 și 50 ng de C-P4H și utilizat ca răspuns (Fișier suplimentar 1, tabelul S1). Datele au fost echipate cu regresie multiplă la o ecuație de model polinomial de ordinul doi utilizând software-ul MODDE 8.

Analiza varianței (ANOVA) a fost aplicată pentru a testa potrivirea semnificației ecuației modelului. Importanța fiecărei variabile și interacțiunile lor au fost evaluate folosind P-valori. P-valori mai mici de 0,05 indică faptul că termenii modelului sunt semnificativi (nivel de semnificație de 5%). În cazul măsurării a 1 ng de C-P4H, valorile codificate ale fiecărei diluții de anticorpi, interacțiunea dintre diluțiile mab-α și GAR-AP și valoarea codată pătratic codată a diluției pab-β sunt termeni de model semnificativi (Fișa suplimentară 2, tabelul S2).Semnificația statistică a modelului a fost verificată prin teste F (fișier suplimentar 3, tabel S3). Primul test F, care compară varianța modelabilă și nemodificabilă, a fost satisfăcut încă de la P-valoarea a fost & lt 0,05. Al doilea, lipsa de potrivire, testul, comparând modelul și erorile de replicare între ele, a fost, de asemenea, satisfăcut de la P-valoarea a fost & gt 0,05. În plus, modelul a fost evaluat utilizând alți parametri statistici care arată că modelul este bun (Fișier suplimentar 3, tabelul S3).

Modelele create pe baza raportului semnal / fundal pentru 20 și 50 ng de C-P4H au avut parametri similari cu modelul prezentat pentru 1 ng de C-P4H (datele nu sunt prezentate).

Folosind instrumentul de optimizare software MODDE 8 s-au ales cele mai bune concentrații de anticorpi (Tabelul 2). Modelul indică faptul că concentrația anticorpului mab-α este cel mai important parametru și trebuie setată la cel mai înalt nivel. Cel mai probabil, este posibil să obțineți un răspuns mai bun folosind un anticorp chiar mai puțin diluat, dar nu a fost făcut deoarece anticorpul mab-α este cel mai scump reactiv al testului. Pentru a reduce semnificativ metoda, al patrulea parametru, costul anticorpului mab-α, a fost inclus în optimizator. După această corecție, au fost selectate următoarele diluții de anticorpi: 1/500 pentru mab-α, 1/700 pentru pab-β și 1/3000 pentru GAR-AP.

Graficul suprafeței de răspuns prezentat în figura 5 ilustrează influența parametrilor pab-β și GAR-AP asupra raportului semnal la fundal. Acest grafic a fost obținut pentru parametrul mab-α care a fost fixat la diluția 1/500. În cele din urmă, testul a fost efectuat folosind diluțiile selectate ale anticorpilor, iar rezultatele s-au dovedit a fi apropiate de valorile prezise ale raportului semnal / fundal (Figura 6).

Graficul suprafeței de răspuns arată efectele concentrațiilor de pab-β și GAR-AP. Semnalul FLU la raportul de fundal a fost utilizat ca răspuns de concentrație mab-α a fost stabilită la nivelul 0 (diluare 1/500). Diluțiile de anticorpi sunt prezentate în valorile lor codificate (Tabelul 1).

Compararea răspunsurilor prezise de model și obținute în experiment. C-P4H purificat a fost folosit ca țintă. Diluțiile de anticorpi: mab-α 1/500, pab-β 1/700, GAR-AP 1/3000. Barele de eroare arată ± SD a trei experimente paralele.

Sensibilitate și autonomie

Nivelul de sensibilitate al testului și intervalul au fost determinate folosind 0 - 40 ng de tetramer C-P4H purificat (Figura 7). Pentru a simula fundalul natural, 1 μg de E coli extract de celule întregi a fost adăugat la fiecare probă. Limita de detecție a fost estimată la 0,1 ng de C-P4H. Acest număr corespunde semnalului care este peste media semnalului de fundal de trei ori al deviației standard a semnalului gol. Dependența observată între cantitatea de C-P4H și semnalul fluorescent poate fi utilizată pentru estimarea concentrației C-P4H în probe reale. Răspunsul a fost prezentat ca semnal absolut minus semnalul de fundal pentru a putea estima cantitatea de proteină din probe mai precis.

Curba standard a sandvișului ELISA pe bază de margele pentru C-P4H. 0 - 40 ng de C-P4H purificat au fost utilizate ca țintă. Barele de eroare arată ± SD a trei experimente paralele

Analiza expresiei recombinante C-P4H în Escherichia coli

Efectul materialului biologic asupra semnalului sandwich ELISA a fost studiat prin măsurarea cantității de C-P4H în diferite diluții de extracte celulare de E coli celule care exprimă C-P4H (0,5 - 10 μg de proteine ​​totale). Celulele care exprimă C-P4H au fost cultivate și perturbate așa cum se explică în metode, diluate cu tamponul principal și utilizate ca țintă pentru sandwich-ul ELISA în cantitate de 10 μL, corespundeau 0,5 - 10 μg de proteine ​​totale. Efectul de inhibare a fost observat odată cu creșterea concentrației totale de proteine ​​în probe (Figura 8). Pentru a minimiza acest efect, cantitatea de proteine ​​celulare totale analizate cu testul nu trebuie să depășească 1 μg.

Efectul lizatului celular asupra semnalului sandwich ELISA. Cantitatea de C-P4H a fost măsurată în 0,5 - 10 μg de extract de E coli celule care exprimă C-P4H. Barele de eroare arată ± SD a trei experimente paralele.

Rezultatele obținute cu sandwich-ul ELISA pentru C-P4H au fost comparate cu o analiză a activității bazată pe formarea prolinei 4-hidroxi [14 C] într-un substrat marcat cu prolină [14 C] care constă din lanțuri polipeptidice procolagene nehidroxilate [17]. Activitatea a 10 probe brute de C-P4H produse în E coli a fost măsurată. Aceleași probe au fost analizate cu sandwich-ul ELISA pentru C-P4H și rezultatele au fost comparate așa cum se arată în figura 9. S-au observat o funcție liniară și un coeficient de corelație de R 2 = 0,986, demonstrând o corelație ridicată între cele două metode. Corelația observată este valabilă numai pentru experimentele efectuate, deoarece corelația dintre activitatea specifică și cantitatea de enzimă poate fi diferită în condiții diferite, cum ar fi nivelurile de expresie, liza celulară sau condițiile de producție.

Corelația dintre activitatea C-P4H detectată cu testul radioactiv și cantitatea de C-P4H măsurată cu sandvisul ELISA pe bază de mărgele. Cantitățile reprezentate de C-P4H și unitățile de activitate au fost prezentate la 10 μg din total E coli proteină.

Optimizarea unui proces de fermentare în loturi pentru producția de C-P4H în Escherichia coli

Metoda dezvoltată a fost utilizată în optimizarea unui proces de fermentare pe loturi alimentate de producție recombinantă de C-P4H prin E coli. Experimentul a avut ca scop evaluarea efectului unei rate reduse de transfer de oxigen după prima inducție (IPTG) și a influenței densității celulare la primul timp de inducție asupra cantității de enzime produse. S-a propus că o rată mai mică de transfer de oxigen ar putea prezenta o influență pozitivă asupra expresiei recombinante a C-P4H de către E coli. Spre deosebire de culturile cu baloane de agitare în care anhidrotetraciclina (aTc) a provocat o inducție a subunității α pe termen lung, inducția aTc a fost tranzitorie numai în culturile bioreactoare cu aerare puternică, posibil printr-o oxidare și, prin urmare, inactivarea inductorului aTc [20]. Mai mult, gazda de producție pentru C-P4H a fost E coli Origami, un mutant dublu (trxB gor), care, de asemenea, ar putea beneficia de o oxigenare mai mică a culturii. Acest mutant este puternic deranjat în sistemul redox citoplasmatic și crește în mod rezonabil numai dacă este combinat cu o mutație supresoare în ahpC genă. Cu toate acestea, aceste tulpini arată o expresie constitutivă ridicată a regulatorului transcripțional al răspunsului la stres oxidativ, OxyR [21]. Prin urmare, pe baza comparației rezultatelor anterioare pentru creșterea celulară și supraexpresia C-P4H în baloane de agitare și în bioreactoare cu o rată de transfer de oxigen mult mai mare, am sugerat mai devreme că un nivel scăzut de oxigenare poate reduce acest stres oxidativ [16].

Pentru a evita cultivările laborioase în bioreactor, condițiile alimentate-lot au fost efectuate în baloane agitate folosind un sistem de auto-eliberare a glucozei (EnBase ®) care simulează condițiile unui lot alimentat cu glucoză limitată, cu o rată constantă de alimentare cu glucoză [22].

Valoarea ridicată a ratei de agitare a fost aleasă ca fiind 220 rpm ca în experimentele anterioare. Valoarea scăzută a fost setată la 100 rpm după prima inducere pentru a crea o schimbare semnificativă în comparație cu valoarea ridicată fără a provoca o trecere la metabolismul anaerob sau un șoc din cauza limitării extreme a oxigenului. Rata de agitare înainte de inducții a fost menținută la 220 rpm în fiecare experiment.

Inducția cu IPTG a fost efectuată fie la un OD600 de aproximativ 3 sau la OD600 = 10. Condițiile de cultivare pentru experimente sunt rezumate în tabelul 3. Fiecare combinație de valori ale parametrilor a fost repetată o dată.

Creșterea celulară a culturilor este prezentată în figura 10. Transferul mai mare de oxigen a dus la o prelungire a fazei exponențiale care a fost urmată de o scădere temporară a creșterii. Inducție la OD600 = 10 a condus la densități celulare finale care au fost în medie cu 40% mai mari decât valorile obținute prin inducție anterioară.

Creșterea E coli a produs C-P4H recombinant în diferite condiții de cultivare. Celulele au fost cultivate cu ajutorul tehnologiei EnBase ®, variind rata de agitare și timpul de inducție. Săgețile indică inducerea expresiei subunităților PDI / β și α cu IPTG și respectiv aTc

Producția de C-P4H a fost monitorizată la 5,5, 12,5 și 24,5 ore după prima inducție utilizând ELISA dezvoltat (Figura 11). Experimentele cu rată ridicată de agitare și inducție timpurie au arătat cel mai mic randament al produsului, crescând ușor în timp (bare negre). Inducție cu IPTG la un OD600 din 10 în loc de 3 a crescut considerabil producția de proteine ​​(bare gri închis). Cu această combinație de parametri (rata mare de agitare și inducția târzie), s-au atins cele mai mari valori după 12,5 ore în raport cu volumul culturii (partea inferioară a figurii 11). Cultivările cu viteză redusă de agitare după efectuarea primei inducții la DO600 = 3 a avut ca rezultat cel mai mare randament global al produsului, raportat la cantitatea totală de proteine ​​celulare (bare gri deschis, partea superioară a figurii 11). Când prima inducție a fost efectuată la nivel înalt (OD600 = 10) și rata de agitare a scăzut la 100 rpm ulterior, a fost obținut al doilea randament cel mai scăzut al produsului în comparație cu celelalte experimente (bare albe). A existat o creștere liniară a expresiei C-P4H pe proteină totală în timpul cultivării.

Producția de C-P4H de către E coli cultivat cu utilizarea EnBase ® tehnologie, rata de scuturare variabilă și timpul de inducție. Experimentele cu condiții identice sunt prezentate ca valori medii cu bare de eroare care indică 2 valori efective din analiză. Partea superioară: cantitatea de C-P4H (ng) măsurată în 1 μg de proteină celulară totală. Partea inferioară: concentrația de C-P4H (mg pe un litru de mediu de cultivare).

Semnificația factorilor (rata de agitare și timpul de inducție) a fost evaluată statistic folosind software-ul MODDE 8 (Tabelul 4). Un efect pozitiv al factorului înseamnă că schimbarea valorii factorului duce la modificări semnificative ale răspunsului. Este evident că factorii au fost dependenți unul de celălalt, deoarece a existat întotdeauna o interacțiune între variabile. Mai mult decât atât, rata de agitare continuă de 220 rpm a avut o influență negativă asupra producției de proteine ​​pe celulă la toate perioadele de prelevare. Timpul de inducere a efectului nu a fost evident în majoritatea cazurilor.


Proiectarea unui experiment cantitativ Western Blot

Western blot este o tehnică care a fost în practică de mai bine de trei decenii, care a început ca un mijloc de detectare a unei ținte proteice într-o probă complexă. Deși au existat progrese semnificative atât în ​​tehnologia imagistică, cât și în cea a reactivilor pentru a îmbunătăți sensibilitatea, gama dinamică de detectare și aplicabilitatea detectării țintei multiplexate, tehnica de bază a rămas în esență neschimbată. În trecut, Western blot a fost utilizat pur și simplu pentru a detecta o anumită proteină țintă într-un amestec complex, dar acum editorii și revizorii de reviste solicită interpretarea cantitativă a datelor Western blot în ceea ce privește modificările ori ale expresiei proteinelor între probe. Calculele se bazează pe densitometria diferențială a semnalelor chemiluminescente și / sau fluorescente asociate din pete și acest lucru necesită acum o schimbare fundamentală în metodologia experimentală, achiziția și interpretarea datelor. Am publicat recent o abordare actualizată pentru a produce date densitometrice cantitative din western blot (Taylor și colab., 2013) și aici rezumăm fluxul complet de lucru Western blot, cu accent pe pregătirea eșantionului și analiza datelor pentru western blot.

1. Introducere

Tehnologiile proteomice, cum ar fi electroforeza bidimensională și spectrometria de masă, sunt instrumente valoroase în studiile de profilare a proteinelor semiquantitative, pentru a identifica modele largi de expresie care să permită o mai bună înțelegere a evenimentelor moleculare, căilor de semnalizare și mecanismelor [1]. Datele rezultate sunt de obicei confirmate printr-o a doua metodă independentă, cum ar fi western blot. Western blot a fost introdus de către Towbin și colab. [2] în 1979 și de atunci a devenit o tehnică obișnuită utilizată în laboratoarele de cercetare la nivel global pentru imunodetecția și cuantificarea proteinelor specifice în omogenatele celulare complexe. În ultimele trei decenii, sensibilitatea, robustețea și flexibilitatea sistemelor de indicatori corespunzătoare au crescut semnificativ [3, 4]. În plus, dezvoltarea continuă a mediilor de detectare și a reactivilor a oferit comunității științifice sisteme de imagistică ultrasensibilă, oferind o gamă largă dinamică de detecție, permițând cuantificarea precisă și exactă a semnalelor provenite atât din proteinele cu expresie scăzută, cât și cu cea ridicată, din aceeași pată. Deși laboratoarele au achiziționat rapid cele mai noi tehnologii de detectare și reactivi pentru western blot, tehnicile asociate utilizate pentru a produce datele densitometrice nu au evoluat, ducând la date publicate care sunt dificil sau imposibil de interpretat sau reprodus [5-7].

Pentru a obține date cantitative din western blots, trebuie utilizată o metodologie riguroasă așa cum s-a descris anterior [8]. Pe scurt, validarea anticorpilor (Ab) este critică atât pentru a se asigura că interacțiunea Ab / antigen este specifică și corectă, cât și pentru a determina factorul de diluare a probelor care este necesar pentru încărcarea proteinelor în domeniul dinamic liniar cantitativ pentru fiecare anticorp. Mai mult, trebuie luată în considerare selecția adecvată a metodei de normalizare (pe baza semnalelor de referință obținute fie prin proteine ​​menajere (HKP) după colorarea imunochimică, fie prin intensitatea totală a proteinei (TP) pe membranele de ștergere după colorarea totală a proteinelor) pentru a se asigura că pliul raportat se modifică proteina țintă nu este un artefact al semnalului de referință. Astfel, normalizarea datelor este crucială pentru identificarea și corectarea erorilor experimentale în care instabilitatea de referință devine din ce în ce mai importantă cu măsurarea diferențelor mai mici în expresia țintă a proteinelor între probe [9]. Efectul direct al unei normalizări slabe este evident la încărcarea probei peste 10 μEste necesar un g de lizat proteic total pe bandă, deoarece HKP-uri tradiționale de încărcare, cum ar fi GAPDH, actină și tubulină, sunt supraîncărcate și, prin urmare, nu servesc scopului normalizării datelor [8, 9]. De asemenea, aceste HKP pot fi afectate de condițiile de tratament ale experimentului, oferind rezultate distorsionate pentru exprimarea proteinelor țintă care nu reflectă biologia probelor testate [10-15]. Alternativ, normalizarea prin proteina totală, transferată prin blot, s-a dovedit recent să ofere date excelente pentru lizatele proteice totale tipice [16].

Aici, descriem câteva tehnici generale pentru a produce probe de proteine ​​de bună calitate, cu degradare minimă, pentru o reproductibilitate îmbunătățită între experimente. De asemenea, sunt sintetizați pașii de bază ai western blotului cantitativ și o abordare standardizată pentru calcularea datelor densitometrice asociate din mai multe bloturi.

2. Proiectarea experimentală atentă produce date fiabile și reproductibile

Spre deosebire de testele bazate pe ADN care măsoară un tip predictibil de moleculă care este de obicei stabilă într-o varietate de condiții, proteinele pot varia semnificativ în expresia, stabilitatea, conformația și activitatea lor în diferite condiții tampon și experimentale. Mai mult, prezența proteinelor contaminante într-un omogenat poate afecta foarte mult integritatea și activitatea proteinelor țintă [17]. Prin urmare, trebuie acordată atenție proiectării oricărui test pe bază de proteine, pentru a se asigura că diferențele aparente dintre probele de caz și cele de control nu sunt un artefact al condițiilor experimentale sau al manipulării probelor. Factorii care pot avea o influență majoră asupra proteomului includ timpul și temperatura de incubație, precum și parametrii pentru prelucrarea probelor, cum ar fi cantitatea de timp dintre colectarea țesutului și înghețarea ulterioară sau chiar condițiile și momentul pentru dezghețarea peletelor de țesut sau celule (Tabelul 1).

Procedura experimentuluiGrupuri de controlReplicăCondițiile experimentuluiPrelucrarea probelor
Boli sau grupuri de tratamentStudiul cursului de timp (adică

3. Pregătirea probei

Există mai multe capcane asociate cu prepararea eșantionului care pot afecta direct densitatea benzilor pe un western blot incluzând: (1) manipularea necorespunzătoare a specimenelor de țesut sau celulă rezultând degradarea variabilă și / sau exprimarea proteinelor între probe, (2) detergenți inadecvati , săruri și inhibitori de protează în tamponul de liză, (3) tehnică slabă de omogenizare.

Deoarece lizatele proteice sunt extrem de complexe cu contaminanți precum resturi celulare sau tisulare, grăsimi, agregate de proteine ​​hidrofobe, acizi nucleici și proteaze care pot afecta direct și negativ rezultatele de la Western blots, este important să se utilizeze tampoane de liză celulară și tehnici de omogenizare care eliminați efectele acestora [17]. În general, tampoanele de omogenizare care conțin detergenți neionici precum NP-40 și Triton X-100 sunt mai puțin dure decât detergenții ionici, cum ar fi SDS și deoxicolat de sodiu. Sărurile cum ar fi NaCI sau KCl sunt de obicei adăugate la o concentrație de 100 până la 150 mM pentru a preveni agregarea proteinelor. Tampon RIPA (1% NP-40 sau Triton X-100, 1% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,8, 1 mM EDTA) și tablete de cocktail complete pentru mini inhibitori de protează (aplicat Roche Știință) în combinație cu instrumente de omogenizare mecanice sau manuale au fost utilizate pentru a produce omogenate care oferă date solide pentru testele Western blot.

Alegerea corectă a tehnicii de omogenizare a țesuturilor este o condiție prealabilă pentru o testare Western blot de succes, iar metoda utilizată depinde în totalitate de tipul eșantionului (adică creier versus mușchi versus țesut hepatic spre deosebire de celulele placate sau suspendate) [18, 19]. Un bun exemplu de protocol de liză tisulară este după cum urmează: (1) Îngheață țesutul în azot lichid și apoi tăie țesutul în bucăți de 1 mm cu un bisturiu într-un mortar pe gheață uscată. Asigurați-vă că bisturiul sau râșnița sunt, de asemenea, înghețate pe gheață uscată pentru a menține țesutul tăiat sau măcinat aproape de temperatura gheaței uscate pe tot parcursul procedurii. (2) Adăugați țesutul cubulete / măcinat în tamponul RIPA rece ca gheața. (3) Transferați preparatul de țesut la un omogenizator de țesut rece (Deat) (Wheaton) și Dounce 25x pe gheață. (4) Sonicați (Tekmar Sonic Disrupter) țesutul omogenizat pe gheață pe gheață pentru

secunde la 50% putere și curățați extractele prin centrifugare la 34.000 × g la 4 ° C timp de 30 de minute. (5) Transferați supernatantul într-un tub nou și efectuați testul proteinelor (vezi mai jos). (6) Păstrați supernatanții la -80 ° C sau în azot lichid pentru depozitare pe termen lung.

Pentru liza celulară, adăugați celulele peletizate (în cazul suspensiilor de celule) la tamponul RIPA rece ca gheața sau pentru celulele placate, adăugați tamponul RIPA rece ca gheața direct pe placă după spălarea celulelor și răzuiați și pipetați celulele în sus si jos. Continuați cu pasul (3) de mai sus.

Concentrația totală de proteine ​​a omogenatului din lizatele celulare sau tisulare ar trebui să fie măsurată folosind un test de proteină compatibil cu detergent, cum ar fi testul de proteină RC DC de la Bio-Rad.În mod ideal, omogenizații ar fi diluați la o concentrație de cel puțin 2 mg / ml, care ar permite încărcarea între 10 μg și 80 μg pe banda a unui mini-poliacrilamid SDS-gel de 1 mm grosime.

4. Determinați gama dinamică liniară de încărcare a proteinelor

Majoritatea laboratoarelor încarcă o cantitate aleatorie de proteine ​​în fiecare bandă a unui gel pentru Western Blot, care este de obicei între 10 μg și 100 μg de lizat total și de obicei nu există o bază științifică pentru alegerea acestei cantități. Acest lucru duce adesea la supraîncărcarea proteinelor țintă foarte exprimate și în special a controalelor de încărcare care sunt utilizate pentru a normaliza datele. Acest lucru oferă de obicei densități de bandă uniforme între benzi pentru proteinele de menaj, ceea ce nu se datorează încărcării consistente a proteinelor, ci mai degrabă din supraîncărcarea membranei cu proteina țintă (Figura 1). Pentru a atenua efectul saturației membranei, ar trebui să se producă o curbă standard a încărcăturii de proteine ​​față de densitatea benzii pentru fiecare proteină țintă. Acest lucru poate fi realizat făcând o serie de 1/2 diluție a unei probe grupate din toate lizatele din grupul de studiu începând cu 100 μîncărcare de proteine ​​g pe cel puțin 12 diluții pe un gel SDS fără pete TGX (Bio-Rad). Detectarea fără pete pe sistemul de camere ChemiDoc MP (Bio-Rad) poate fi utilizată pentru a verifica încărcarea, calitatea și separarea omogenatului, urmată de transferul către o membrană PVDF cu fluorescență scăzută folosind proteina Trans Blot Turbo (Bio-Rad) sistem de transfer [8].


Date fiabile western blot pot fi generate numai atunci când se utilizează cantitatea adecvată de probă de proteină. Încărcarea unei cantități prea mari de proteine ​​duce la saturația semnalului în western blots, dar prea puțin produce semnale slabe. Odată stabilite setările și condițiile experimentale pentru test, nu modificați încărcarea probei, metoda de transfer, timpul de transfer, diluarea anticorpilor, timpul de incubație a anticorpului sau temperatura în experimentele ulterioare, deoarece acești factori pot modifica semnificativ semnalele de detecție.

Urmează o metodologie tipică pentru determinarea încărcării adecvate pentru probele de proteine: (1) Transferul și ștergerea corespunzătoare prin incubarea anticorpului proteic țintă primar și asociat secundar fiecărei pete cu cel puțin patru etape de spălare de 3 minute între fiecare incubare. (2) Adăugați un substrat de chemiluminescență compatibil cu imagerul, cum ar fi Clarity (Bio-Rad), pentru a dezvolta semnalul imunochimic și pentru a captura semnalul utilizând un aparat de fotografiat pe bază de cameră CCD, cum ar fi ChemiDoc MP (Bio-Rad). (3) Imaginați bloturile utilizând un software care oferă instrumente densitometrice exacte, scăzute din fundal, cum ar fi Image Lab (Bio-Rad) și produce un grafic de densitate relativă versus diluare a pliurilor pentru fiecare anticorp primar. (4) Validați anticorpii determinând domeniul lor dinamic liniar (adică domeniul în care se obține o scădere consistentă, 1/2 a densității). (5) Selectați încărcătura de proteine ​​pentru fiecare anticorp care corespunde mijlocului intervalului dinamic liniar.

Diluarea probelor individuale din grupul de studiu până la punctul de mijloc din gama dinamică liniară a probei combinate pentru fiecare anticorp poate însemna că probele individuale de proteine ​​necesită diluții foarte diferite pentru fiecare anticorp. Acest lucru va asigura că datele densitometrice pentru fiecare proteină țintă se vor încadra în intervalul liniar dinamic (cantitativ) pentru a da rezultate precise și reproductibile care reflectă adevărata biologie între probe din setul de studiu (Figura 2). Încărcarea necorespunzătoare a probelor poate duce la nicio diferență cuantificabilă între probe pentru o țintă dată, pur și simplu datorită supraîncărcării membranei.


(Din [9] cu permisiunea autorilor și Bio-Rad.) Comparația liniarității măsurării proteinelor totale fără pete și imunodetecția a trei proteine ​​de menaj în 10-50 μg de lizat celular HeLa. În stânga sunt imagini reprezentative ale (a), pete fără pete și pete chimice pentru (b), β-actina (c), β-tubulină și (d), GAPDH. Etichetele de bandă corespund încărcăturii totale de proteine ​​(μg). Deși semnalele de actină și tubulină par liniare, raportul densitometric a fost cu mult sub „răspunsul cantitativ” prevăzut al încărcării efective, în timp ce semnalul fără pete s-a corelat cu rezultatul scontat (e).

5. Determinați semnalul de referință adecvat pentru normalizarea datelor

Un semnal de referință bun sau „control de încărcare” este unul care este coexprimat cu proteina țintă din aceeași probă și exprimat în mod constant între probe. HKP cum ar fi tubulina, β-actina și GAPDH au servit în mod tradițional ca controale de încărcare, dar există trei dezavantaje potențiale în utilizarea acestor controale. (1) HKP-urile nu pot fi exprimate în mod uniform între condițiile experimentale care vor da rezultate eronate [10-15]. Aceeași problemă a fost găsită cu genele de referință utilizate pentru qPCR, unde selectarea țintelor instabile a condus la rezultate opuse atunci când este contrastată cu țintele stabile [20, 21]. (2) HKP-urile sunt foarte abundente în lizați și au saturat de obicei membrana pentru probe încărcate peste 4 μg pe bandă (a se vedea secțiunea anterioară) (Figura 2). Acest lucru ar conferi acestor proteine ​​„aspectul” unor bune controale de normalizare, deoarece densitățile benzilor asociate ar fi toate similare între benzi ca un „artefact” al saturației membranei. (3) Normalizarea datelor cu HKP se bazează doar pe un singur punct de date și oferă o reflectare slabă a posibilelor neconcordanțe ale procesului.

Având în vedere problemele care apar cu controalele HKP, metodele alternative de normalizare au fost căutate de comunitatea științifică și propunem ca un control excelent al încărcării (LC) să îndeplinească următoarele criterii. (1) Are o bună reacție (1: 1) la modificările cantității totale de proteine ​​din probele individuale. (2) Este insensibil la influența diferitelor condiții și tratamente fiziologice și, prin urmare, trebuie cuantificată din membrană în sine pentru a lua în considerare efectul eficienței transferului [22, 23]. (3) Achiziționarea LC ar fi ideală posibilă în toate fazele procesului western blot (adică vizualizarea proteinelor pe benzile de gel pretransfer, blot posttransfer și benzi gel posttransfer) permițând astfel un control al procesului consistent. (4) Achiziționarea LC trebuie să fie rapidă, ușoară și foarte reproductibilă. (5) Nu ar trebui să fie necesar un proces îndelungat pentru optimizarea și stabilirea LC. (6) Metoda pentru detectarea LC ar trebui să fie compatibilă cu colorarea imunochimică.

Pentru a aborda aceste probleme, comunitatea științifică adoptă acum utilizarea densității totale a benzii din proteina transferată de blot ca mijloc de normalizare a datelor [24-26]. Există o serie de pete care pot fi utilizate pentru a vizualiza, imagina și cuantifica proteina transferată pe pete, inclusiv Ponceau S, Coomassie R-350, Amido Black, MemCode și Deep Purple. Cu toate acestea, fiecare dintre aceste pete are probleme individuale de a fi slab reproductibile pe o bază de zi cu zi, a unui interval dinamic limitat și a compatibilității restrânse cu membranele de ștergere și colorarea imunochimică [25]. Mai recent a fost introdusă tehnologia fără pete (Bio-Rad) [24-26] și îndeplinește toate cele șase criterii menționate mai sus pentru un LC bun cu un interval dinamic liniar între aproximativ 10 și 80 μg de încărcare totală de proteine ​​dintr-un lizat tipic de celule sau țesuturi [8, 9]. Acest lucru permite utilizarea densității totale a benzii din pata fără pete pentru normalizarea între piste pentru majoritatea studiilor Western blot.

Tehnica normalizării totale a benzii utilizând tehnologia de testare fără pete a fost bine descrisă, dar pe scurt este după cum urmează: (a) Calitatea separării electroforetice poate fi verificată în câteva minute. După activarea UV, benzile proteice sunt vizibile în gel și pot fi înregistrate cu un sistem de cameră. Semnalul fluorescent generat rămâne stabil timp de câteva ore. (b) Blotul este imaginat imediat după transfer pentru a verifica transferul de proteine ​​din fiecare bandă. (c) Datele imaginii din densitatea totală a tuturor benzilor de proteine ​​transferate de blot pe bandă sunt apoi înregistrate utilizând software-ul Image Lab selectând o singură bandă în fiecare bandă și întinzând lățimea benzii pentru a acoperi toate vârfurile de volum din profilul benzii. . (d) Discul de rulare în fundal este ajustat la o valoare scăzută (între 1 și 5) pentru toate benzile pentru a se asigura că numai normalul este obținut doar densitatea totală scăzută din suma tuturor benzilor pe bandă.

În plus, tehnologia fără pete este compatibilă atât cu membranele de nitroceluloză, cât și cu cele PVDF, iar normalizarea datelor cu imagini SF blot se bazează pe multe puncte de date, care sunt superioare HKP-urilor.

6. Analiza datelor: Problema de scădere a fundalului

Scăderea de fond este un motiv comun pentru a obține date variabile sau incorecte din western blots [27]. Folosind metode tradiționale de analiză densitometrică, cum ar fi analiza volumului din benzile și fundalul, pot apărea variații ale datelor scăzute din fundal, deoarece fundalul nu este scăzut din aceeași casetă în care banda se află. Mai mult, caseta în care este selectată o bandă conține întotdeauna densitate atât din bandă, cât și din fundalul asociat, care devine mai răspândit cu benzile cu densitate mică [8]. Combinația acestor factori poate duce la date foarte variabile atunci când se testează probe cu o proteină țintă exprimată diferențial folosind un anticorp nespecific cu fundal ridicat. O alternativă bună la analiza volumului utilizând cutii este un algoritm de scădere a fundalului discului rulant, cuplat cu un instrument de profilare a benzii (Figura 3). Software-ul Image Lab este proiectat cu aceste două instrumente care pot fi utilizate simultan pentru a se asigura că lățimea corespunzătoare a benzii și fundalul benzii sunt selectate pentru fiecare bandă (Figura 3).


(Din [8] cu permisiunea autorilor și Bio-Rad.) Achiziționarea imaginii și analiza densitometrică. Software-ul Image Lab versiunea 5.0 (Bio-Rad) a fost utilizat pentru achiziționarea imaginii și analiza densitometrică a gelurilor, pete și film în acest studiu. Software-ul interpretează datele brute în trei dimensiuni cu lungimea și lățimea benzii definite de instrumentul „Lanes and Bands” împreună cu instrumentul „Lane Profile” astfel încât semnalul chemiluminiscent emis de blot să fie înregistrat în a treia dimensiune ca un vârf care se ridică din suprafața petei. Densitatea unei benzi date a fost măsurată ca volum total sub vârful tridimensional, care putea fi vizualizat în două dimensiuni folosind instrumentul „Profil de bandă” pentru a regla lățimea exactă a benzii pentru a ține cont de zona de sub vârful umbrit de interes. Scăderea fundalului a fost setată utilizând setarea discului rulant în instrumentul „Lanes”. Valorile discului de rulare au fost setate astfel încât fundalul să fie scăzut sub banda (adică vârful) de interes într-un mod uniform între benzile unei pete date. În acest caz, discul de rulare pentru cele două benzi analizate a fost setat la 18 și, respectiv, la 25, astfel încât vârfurile de interes au fost tăiate la un nivel consistent între markerii arătați cu un „X”.

7. Analiza computațională a datelor densitometrice

Există numeroase calcule din datele densitometrice folosind formule îngropate în foi de calcul EXCEL care acoperă mai multe foi de lucru și fișiere pentru a obține date cantitative din western blots. Este adesea dificil să urmăm baza calculelor și am constatat că, atunci când membrii laboratorului se confruntă cu întrebarea directă a modului de prelucrare a datelor brute obținute din western blot la rezultate publicabile, există adesea confuzie. Analiza datelor Western blot poate fi realizată folosind o metodologie foarte similară cu qPCR prin calcularea expresiei relative, normalizate a proteinelor, așa cum este descris în pașii următori (Tabelele 2 și 3). (1) Pentru fiecare blot, înmulțiți densitatea scăzută în fundal (volumul în software-ul Image Lab) al proteinei țintă (TP) în fiecare bandă cu raportul densității controlului de încărcare (LC) (fie proteina de menaj sau densitatea totală a benzii) de la un eșantion de control încărcat în banda 1 a tuturor pete de studiu la celelalte benzi din gel. Aceasta va da densitatea normalizată controlului de încărcare (NDL) (Tabelul 2). Proba martor este de obicei un omogenizat colectat din toate probele dintr-un studiu dat alicotat în mai multe tuburi pentru a permite încărcarea unei probe martor proaspete în banda 1 a fiecărei pete de studiu. (2) Calculați diferența de pliere (FD) pentru fiecare replică biologică / tehnică împărțind NDL din fiecare bandă de NDL din proba de control din banda 1 (Tabelul 2). (3) Determinați FD mediu și asociat

valorile pentru replicile biologice importând FD de la pasul (2) de mai sus într-un pachet software de analiză statistică, cum ar fi PRISM sau Analize IT (Tabelul 3).


Abstract

Lipide fosfatidilinozitol polifosfat, cum ar fi fosfatidilinozitol 3,4,5-trisfosfat [PI (3,4,5) P3], reglează procesele biologice critice, dintre care multe sunt aberante în ceea ce privește boala. Aceste lipide acționează adesea ca liganzi site-specific în interacțiunile care impun asocierea membranelor partenerilor de legare a proteinelor. Aici, descriem dezvoltarea sondelor de activitate bifuncționale corespunzătoare grupului de cap de PI (3,4,5) P3 care sunt eficiente pentru identificarea și caracterizarea partenerilor de legare a proteinelor din probe complexe, și anume extracte de celule canceroase. Aceste sonde conțin atât o etichetă de fotoafinitate pentru marcarea covalentă a proteinelor țintă, cât și un mâner secundar pentru detectarea sau manipularea ulterioară a proteinelor marcate. Au fost exploatate sondele care au diferite etichete secundare, fie prin atașarea directă a unui colorant fluorescent pentru detecție optică, fie prin utilizarea unui alchin care poate fi derivatizat după etichetarea proteinelor prin chimia clicurilor. În primul rând, descriem designul și strategia sintetică modulară utilizată pentru a genera mai multe sonde cu diferite etichete de reporter de utilizare pentru caracterizarea proteinelor marcate cu sondă. În continuare, vom raporta studii inițiale de etichetare folosind proteine ​​purificate, domeniul PH al Akt, în care s-au găsit probe care etichetează această țintă, după cum se judecă prin detectarea în gel. Mai mult, etichetarea proteinelor a fost abrogată prin controale, inclusiv concurența cu un PI (3,4,5) P nemarcat3 analog al grupului de cap, precum și prin denaturarea proteinelor, indicând etichetarea specifică. În plus, sonde cu linkere de diferite lungimi între PI (3,4,5) P3 grupul de cap și eticheta de fotoafinitate au condus la variații în etichetarea proteinelor, indicând faptul că un linker mai scurt a fost mai eficient în acest caz. În cele din urmă, s-au efectuat studii de etichetare proteomică folosind extracte de celule, proteine ​​marcate au fost observate prin detectare în gel și caracterizate folosind postetichetare cu biotină, cromatografie de afinitate și identificare prin spectrometrie de masă tandem. Aceste studii au produs un total de 265 proteine, incluzând atât candidatul cunoscut cât și cel nou PI (3,4,5) P3-proteine ​​de legare.


Interacțiuni genetice în evoluție

Rezumat

Interacțiunea genetică, sau dominanța fiziologică și epistaza, este o condiție necesară, dar nu suficientă, pentru interacțiunile statistice ale genelor. Efectele genetice statistice sunt componente ale varianței care pot fi atribuite efectelor genetice fiziologice subiacente. Deoarece selecția necesită o variație ereditară pentru a fi eficientă, efectele genetice mai degrabă statistice decât fiziologice sunt cele importante în evoluție. Varianța genetică aditivă prezintă un interes primordial în schimbarea evoluției, totuși, componentele variației statistice datorate dominanței și epistazei sunt importante deoarece pot contribui la varianța genetică aditivă, iar această contribuție se modifică pe măsură ce frecvența alelelor se schimbă. Între deme această creștere a varianței genetice aditive este asociată cu schimbarea efectelor medii locale ale alelelor, determinând populațiile să divergă pentru efectul lor asupra alelelor, astfel încât o alelă care este bună într-o populație poate avea performanțe slabe la o altă populație.


Teste calitative și cantitative pentru aminoacizi și proteine

Există șase teste pentru detectarea grupelor funcționale în aminoacizi și proteine. Cele șase teste sunt: ​​(1) Test Ninhidrina (2) Testul Biuret (3) Testul xantoproteic (4) Testul Millon & # 8217s (5) Testul Hopkins-Cole și (6) Test nitroprusian.

Împărțim alimentele pe care le consumăm în trei clase principale: carbohidrați, corpul și lipidele cele mai ușor disponibile pentru sursa de energie, corpul și principala rezervă energetică și proteinele, corpul și sursa de energie pentru creștere și întreținere celulară.

Proteinele alcătuiesc, de asemenea, a doua cea mai mare porțiune de celule, după apă. Sunt compuși polimerici mari pe care celulele le sintetizează din diferite blocuri de construcție numite aminoacizi.

Structura generală a unui aminoacid este prezentată în figura următoare:

Rețineți că toți aminoacizii conțin grupe de acid carboxilic (-COOH), grupări amino (-NH2) și lanțuri laterale substituibile sau înlocuibile (-R). Douăzeci de aminoacizi diferiți, care diferă doar prin structurile lanțurilor lor laterale, sunt folosiți de celulele umane pentru a construi proteine. Structura lanțului lateral determină clasa aminoacidului: nepolar, neutru, bazic sau acid.

Celulele umane pot sintetiza majoritatea aminoacizilor de care au nevoie pentru a construi proteine. Cu toate acestea, aproximativ 8 aminoacizi numiți aminoacizi esențiali nu pot fi sintetizați de celulele umane și trebuie să fie obținuți din alimente. Aminoacizii încorporați în proteine ​​sunt legați covalent prin legături peptidice. Legăturile peptidice sunt legături amidice formate între gruparea acidului carboxilic a unui aminoacid și gruparea amino a celui de-al doilea aminoacid.

Ecuația 1 de mai jos arată o formare de legătură peptidică între doi aminoacizi:

Este indicată legătura peptidică. Rețineți că, deoarece fiecare aminoacid conține cel puțin o grupare amino și o grupare acid carboxilic, este posibil ca o legătură peptidică să se formeze în două moduri diferite. De exemplu, cu glicină și valină, este de asemenea posibil ca legătura peptidică să se formeze între grupul acidului carboxilic al valinei și grupul amino al glicinei, producând valilglicină.

Proteinele sunt compuse din sute de aminoacizi legați prin legături peptidice, formând un lanț peptidic. Definim direcția în care se leagă aminoacizii, referindu-ne la cele două capete ale lanțului ca fiind capătul N-terminal și capătul C-terminal. Capătul N-terminal este aminoacidul terminal din lanț care conține singura grupă amino care nu face parte dintr-o legătură peptidică.

Capătul C-terminal este celălalt aminoacid terminal din lanț, conținând singura grupă de acid carboxilic care nu face parte dintr-o legătură peptidică. Rețineți că capătul N-terminal și C-terminal nu sunt determinate de lanțurile laterale. Numărul de aminoacizi constituenți și ordinea în care sunt legați începând de la capătul N-terminal, sunt denumiți structura primară a proteinei și # 8217s.

I. Solubilitatea aminoacizilor și a proteinelor:

Proprietățile fizice ale aminoacizilor și proteinelor sunt în principal rezultatul structurii lor, atât în ​​stare solidă, cât și în diverse soluții. În această parte a experimentului veți investiga solubilitatea aminoacizilor și proteinelor selectate în diverse soluții. Folosind datele dvs., veți compara caracteristicile structurale ale aminoacizilor și proteinelor.

Solubilitatea ca funcție a pH-ului soluției:

Prezența grupărilor amino și acid carboxilic permite aminoacizilor să accepte protoni din și să doneze protoni către soluție apoasă și, prin urmare, să acționeze ca acizi și baze. Deoarece proteinele conțin atât lanțuri laterale acide, cât și bazice, și ele pot dona sau accepta protoni. O moleculă care funcționează simultan ca acid și ca bază este cunoscută sub numele de moleculă amfoteră.

În soluțiile apoase neutre, aminoacizii acționează ca molecule amfotere. De exemplu, un aminoacid cu un lanț lateral neutru conține două sarcini: una pozitivă, datorită protonației grupării amino și una negativă, datorită disocierii protonului acidului carboxilic. Această formă ionică dublă a unui aminoacid este forma zwitterionică. Figura următoare prezintă un aminoacid în formă zwitterionică.

Aminoacizii sub formă zwitterionică au multe proprietăți fizice care sunt asociate și cu sărurile ionice. De exemplu, aminoacizii zwitterionici sunt solide cristaline incolore, nevolatile, cu puncte de topire peste 200 ° C, de obicei topindu-se cu descompunere. Sunt solubili în apă, dar nu și în solvenți organici nepolari, cum ar fi ciclohexanul.

În comparație cu aminele organice și acizii carboxilici cu greutate moleculară similară, aminoacizii au puncte de topire mult mai mici și sunt foarte solubili în solvenți organici polari, dar doar puțin solubili în apă. Grupurile amino și acid carboxilic ale aminoacizilor constitutivi, precum și natura diferitelor lanțuri laterale, permit proteinelor să posede unele dintre aceleași proprietăți. Cu toate acestea, există mulți alți factori care trebuie luați în considerare atunci când se discută despre solubilitatea proteinelor.

Solubilitatea aminoacizilor și proteinelor depinde în mare măsură de pH-ul soluției. Modificările structurale ale unui aminoacid sau proteine ​​care au loc la diferite valori ale pH-ului modifică solubilitatea relativă a moleculei. În soluțiile acide, ambele grupe amino și carboxilice sunt protonate. În soluțiile de bază, ambele grupuri sunt ne-protonate. Figura următoare prezintă un aminoacid în soluții acide, neutre și bazice.

Valoarea pH-ului la care concentrațiile grupelor anionice și cationice sunt egale este punctul izoelectric pentru respectivul aminoacid sau proteină. Aminoacizii și proteinele sunt cel mai puțin solubile în punctele lor izoelectrice. Majoritatea proteinelor găsite în țesuturile și fluidele umane au puncte izoelectrice sub pH 7,0 (sub pH-ul corpului uman) și, prin urmare, există mai ales în formele lor anionice.

II. Reacții chimice ale grupurilor funcționale de aminoacizi și proteine:

Anumite grupe funcționale din aminoacizi și proteine ​​pot reacționa pentru a produce produse colorate caracteristic. Intensitatea culorii produsului format dintr-un anumit grup variază între proteine, proporțional cu numărul de grupuri funcționale sau libere care reacționează prezente și accesibilitatea lor la reactiv. Acum vom discuta diferiți reactivi (coloranți) producători de culoare pentru a detecta calitativ prezența anumitor grupări funcționale în aminoacizi și proteine.

Test Ninhidrina:

Aminoacizii conțin o grupare amino liberă și o grupă liberă de acid carboxilic care reacționează împreună cu ninhidrina pentru a produce un produs colorat. Atunci când o grupare amino este atașată la primul, sau alfa, carbon pe lanțul de carbon aminoacizi și # 8217, grupul amino și atomul de azot # 8217 fac parte dintr-un produs albastru-violet, așa cum se arată în ecuația 2. Proteinele conțin, de asemenea, amino liberi se grupează pe carbonul alfa și pot reacționa cu ninhidrina pentru a produce un produs albastru-violet.

Aminoacizii care au atașamente secundare ale grupului amino reacționează și cu ninhidrina. Cu toate acestea, atunci când grupa amino este secundară, produsul de condensare este galben. De exemplu, aminoacidul prolină, care conține o grupare amino secundară, reacționează cu ninhidrina, așa cum se arată în ecuația 3. Produsele de reacție albastru-violet și galben identifică pozitiv grupurile amino libere pe aminoacizi și proteine.

Test Biuret:

Testul biuret pentru proteine ​​identifică pozitiv prezența proteinelor în soluție cu o culoare violet intens. Biuret, H2NCONHCONH2, reacționează cu ionii de cupru (II) într-o soluție de bază pentru a forma un complex violet profund. Legăturile peptidice din proteine ​​seamănă cu cele din biuret și formează, de asemenea, complexe violete profunde cu ioni de bază cupru (II) în soluție. Complexul general sau biuret format între legăturile proteice și ionul de cupru (II) al testului biuret este prezentat în figura următoare.

Testul xantoproteic:

Unii aminoacizi conțin grupe aromatice care sunt derivați ai benzenului. Aceste grupări aromatice pot suferi reacții caracteristice benzenului și derivaților benzenici. O astfel de reacție este nitrarea unui inel benzenic cu acid azotic. Aminoacizii tirozină și triptofan conțin inele de benzen activate și sunt supuse la nitrare.

Aminoacidul fenilalanină conține, de asemenea, un inel benzenic, dar inelul nu este activat și, prin urmare, nu suferă cu ușurință nitrare. Această reacție de nitrare, atunci când este utilizată pentru a identifica prezența unui inel benzenic activ, este cunoscută în mod obișnuit ca testul xantoproteic, deoarece produsul este galben.

Xanthoproteic provine din cuvântul grecesc xanthos, care înseamnă galben. Intensitatea culorii galbene se adâncește atunci când reacția are loc în soluție de bază. Această reacție este una dintre reacțiile care apar dacă vărsați pe piele o soluție concentrată de acid azotic. Proteinele din piele conțin tirozină și triptofan, care se nitrează și devin galbene.

Testul Millon & # 8217s:

Testul Millon & # 8217s este un test specific pentru tirozină, singurul aminoacid care conține o grupare fenol, o grupare hidroxil atașată la un inel benzenic. În testul Millon & # 8217s, gruparea fenol a tirozinei este mai întâi nitrată de acid azotic în soluția testată. Apoi, tirozina nitrată complexează ionii mercur (I) și mercur (II) din soluție pentru a forma un precipitat roșu sau o soluție roșie, ambele rezultate pozitive. Prin urmare, proteinele care conțin tirozină vor produce un rezultat pozitiv.

Cu toate acestea, unele proteine ​​care conțin tirozină formează inițial un precipitat alb care devine roșu atunci când este încălzit, în timp ce altele formează imediat o soluție roșie. Ambele rezultate sunt considerate pozitive. Rețineți că orice compus cu o grupare fenol va da un test pozitiv, deci trebuie să fiți sigur că proba care urmează să fie testată nu conține alți fenoli în afară de cei prezenți în tirozină.

Testul Hopkins-Cole:

Testul Hopkins-Cole este specific pentru triptofan, singurul aminoacid care conține o grupare indol. Inelul indol reacționează cu acidul glioxilic în prezența unui acid puternic pentru a forma un produs ciclic violet. Reactivul Hopkins-Cole reacționează numai cu proteinele care conțin triptofan. Soluția proteică este hidrolizată de acidul sulfuric concentrat la interfața soluției. Odată ce triptofanul este liber, acesta reacționează cu acidul glioxilic pentru a forma produsul violet.

Test nitroprusian:

Testul nitroprusidic este specific pentru cisteină, singurul aminoacid care conține o grupare sulfhidril (—SH). Grupul reacționează cu nitroprusidă în soluție alcalină pentru a produce un complex roșu.


DEPANARE

Condițiile & # x0201cpilot & # x0201d descrise mai sus funcționează bine pentru multe proteine ​​de legare. Cu toate acestea, dacă legarea nu este detectată, protocolul poate necesita modificări. În tabelul 3 sunt prezentate câteva probleme, interpretări și soluții comune.

SINCRONIZARE

Pașii 1 și # x020133, Prepararea gelului: mai puțin de 3 ore

Pașii 4 și # x020136, Preelectroforeză: 30 min. până la 1 oră

Pasul 7, Pregătirea probelor și echilibrarea: 1 până la 1,5 ore. Acest pas poate fi inițiat în timpul pre-electroforezei (pașii 4 și # x020136).

Pasul 8, Electroforeză: 30min până la 5 ore. Timpul necesar va varia în funcție de experiment.

Pașii 9 și # x0201312, Detectarea benzilor electroforetice: de obicei 30 min. la câteva zile. Timpul de expunere autoradiografică va depinde de concentrația de acid nucleic și de radioactivitatea sa specifică.


Biologie celulară orizontală: monitorizarea schimbărilor globale ale statelor de interacțiune cu proteinele cu testul de deplasare termică celulară cu proteomă largă (CETSA)

Testul de deplasare termică celulară (CETSA) este o tehnică biofizică care permite studii directe de legare a ligandului de proteinele din celule și țesuturi. Implementarea la nivelul proteomei a CETSA cu detectare prin spectrometrie de masă (MS-CETSA) a fost acum aplicată cu succes pentru a descoperi ținte pentru medicamente clinice orfane și lovituri de pe ecranele fenotipice, pentru a identifica ținte în afara și pentru a explica polifarmacologia și toxicitatea medicamentelor. Implementările multidimensionale MS-CETSA extrem de sensibile pot acum să acceseze și legarea liganzilor fiziologici de proteine, cum ar fi metaboliții, acizii nucleici și alte proteine. MS-CETSA poate furniza astfel informații complete despre modulațiile stărilor de interacțiune a proteinelor în procesele celulare, inclusiv efectele din aval ale medicamentelor și tranzițiile între diferite stări celulare fiziologice. Astfel de informații orizontale cu privire la modularea ligandului în celule sunt în mare parte ortogonale față de informațiile verticale cu privire la nivelurile diferitelor proteine ​​și, prin urmare, oferă noi oportunități de a înțelege aspectele operaționale ale proteomilor celulari.

Cuvinte cheie: analiza deplasării termice celulare dezvoltarea medicamentului biomarkeri mecanici interacțiune proteică stare cantitativă proteomică implicare țintă.


Priveste filmarea: From DNA to protein - 3D (Ianuarie 2022).