Informație

Dinamica nanoparticulelor celulare din sânge


Încerc să modelez matematic dinamica unei anumite celule în circulație și legarea acesteia de o altă nanoparticulă care este injectată intravenos. Concentrația acestei celule este foarte scăzută (aproximativ 5 celule per ml de sânge). Vreau să văd câte nanoparticule sunt necesare pentru a se lega de cât mai multe dintre aceste celule rare.

Deci, mai întâi, încerc să modelez dinamica celulară în fluxul sanguin. Nu sunt sigur cum să încep. Am vrut să modelez mișcarea celulară prin întregul sistem cardiovascular, dar ar trebui să o simplific. Mă gândesc să modelez fluxul sanguin prin unele dintre principalele sisteme de organe și să estimez absorbția prin capilare. Mă gândesc la ceva asemănător modelului farmacocinetic bazat pe fiziologie (PBPK). Cu toate acestea, ar exista câțiva parametri de care nu aș ști despre care aș avea nevoie pentru model (cel puțin asta cred, sunt nou în farmacocinetică). De asemenea, pentru dinamica fluidelor reale, nu sunt sigur cum să modelează acest lucru, deoarece sângele nu este doar un fluid și are multe alte celule, așa că nu știu dacă există alte efecte.

Deci, întrebarea mea este, în ce direcție ar trebui să merg pentru a modela dinamica acestei celule în circulație? Vreau să modelez circulația în întregul sistem cardiovascular, pentru că trebuie să modelez și celelalte dinamici nanoparticulare și cât de probabil este să găsim și să ne legăm de unii receptori ai celulei. Există un exemplu de model similar care a fost făcut?


Pentru a merge pe ruta PBPK:

Aș recomanda utilizarea parametrilor și structurii organismului din modelul întregii platforme a corpului de către Shah și Betts.

  • Șah, D.K. & Betts, A.M. J Pharmacokinet Pharmacodyn (2012) 39: 67. doi: 10.1007 / s10928-011-9232-2

Aceștia au atribuit un volum spațial plasmatic, fluxul plasmatic, volumul spațiului celulelor sanguine și fluxul celulelor sanguine pentru fiecare organ și corpul total. Structura modelului de bază pentru circulație este completă dacă folosiți ecuațiile pentru spațiul celulelor sanguine din această lucrare ca bază (ecuația 2 și ecuația 5).

Odată ce structura modelului este completă, pasul 2 este de a modela toate procesele care pot afecta celula din fiecare compartiment. Dacă celula aderă la o nanoparticulă, o ecuație de compartiment ar putea fi:

d [celula] / dt = (flux in - flow out) / volum + Kon x [nano] x [cell] - Koff x [complex celula-nano]

Pentru a modela interacțiunea celulei cu nanoparticulele, va trebui să le modelați pe ambele în cadrul aceleiași structuri. O revizuire a modelării PBPK pentru nanoparticule poate fi găsită aici:

  • Modelarea farmacocinetică bazată pe fiziologie a nanoparticulelor Mingguang Li, Khuloud T. Al-Jamal, Kostas Kostarelos și Joshua Reineke ACS Nano 2010 4 (11), 6303-6317 doi: 10.1021 / nn1018818

Un model farmacocinetic (de sus în jos, clasic) pentru nanoparticule din sistemul circulator poate oferi, de asemenea, informații despre modul de modelare a proceselor care afectează nanoparticulele in vivo. Acest model explică dinamica fluidelor, mărimea porilor și proprietățile specifice nanoparticulelor.

  • Kirtane, A. R., Siegel, R. A. și Panyam, J. (2015), Un model farmacocinetic pentru cuantificarea efectului permeabilității vasculare asupra alegerii purtătorului de medicamente: un cadru pentru nanomedicina personalizată. J. Pharm. Sci., 104: 1174-1186. doi: 10.1002 / jps.24302

Modelarea transportului nanoparticulelor sub flux sanguin folosind o abordare bazată pe agent

Livrarea de nanoparticule mediate de sânge este un domeniu nou și în creștere în dezvoltarea terapiei și diagnosticului. Proprietățile nanoparticulelor precum dimensiunea, forma și chimia suprafeței pot fi controlate pentru a le îmbunătăți performanța în sistemele biologice. Acest lucru permite modularea interacțiunilor sistemului imunitar, a profilului de eliminare a sângelui și a interacțiunii cu celulele țintă, ajutând astfel livrarea eficientă a încărcăturii în celule sau țesuturi. Capacitatea lor de a viza și de a intra în țesuturi din sânge depinde în mare măsură de comportamentul lor sub fluxul sanguin. Aici am produs un model bazat pe agent de comportament al nanoparticulelor sub fluxul sanguin în capilare. Am demonstrat că celulele roșii din sânge sunt extrem de importante pentru o distribuție eficientă a nanoparticulelor în capilare. Mai mult, folosim acest model pentru a demonstra cum dimensiunea nanoparticulelor poate viza selectiv țesutul tumoral peste țesutul normal. Demonstrăm că polidispersitatea populațiilor de nanoparticule este o considerație importantă în realizarea specificității optime și pentru a evita efectele în afara țintei. În viitor, acest model ar putea fi utilizat pentru informarea noului design de nanoparticule și pentru a prezice proprietățile generale și specifice de absorbție sub fluxul sanguin.


Nanoparticulele pot limita inflamația prin distragerea atenției sistemului imunitar

O descoperire surprinzătoare sugerează că o injecție de nanoparticule poate ajuta la combaterea sistemului imunitar atunci când acesta devine neclintit, au arătat cercetătorii de la Universitatea din Michigan. Nanoparticulele deviază celulele imune care provoacă inflamația departe de locul afectării.

Inflamația este o sabie cu două tăișuri. Când funcționează, ajută corpul să se vindece și să lupte împotriva infecțiilor. Dar, uneori, sistemul imunitar reacționează excesiv. O leziune pulmonară acută, suferită de inhalarea fumului, de exemplu, poate duce la producerea de lichide fugare care îneacă în mod esențial o persoană.

Acum, experimentele la șoareci sugerează că nanoparticulele de plastic simple, administrate de IV, pot fi capabile să mențină un tip de celulă imună - numită neutrofil - prea ocupat pentru a provoca inflamații. Alte boli în care neutrofilele provoacă inflamații excesive includ sepsisul și întărirea arterelor sau ateroscleroza.

"Neutrofilele sunt prima linie de apărare. Ele sunt cele mai active și cele mai optimizate pentru a oferi un răspuns inflamator", a declarat Omolola Eniola-Adefeso, profesor de inginerie chimică și inginerie biomedicală la U-M, care a condus cercetarea. "Sunt persoanele subacvatice ale celulelor albe din sânge și vedem că poate trebuie să le acordăm mai multă atenție."

Nu a început să caute să redirecționeze sistemul imunitar cu nanoparticule. Mai degrabă, munca ei a explorat dinamica din vasele de sânge care ajută sau afectează capacitatea nanoparticulelor de a livra medicamente în peretele vaselor de sânge și nu numai. În experimente, studenții ei treceau sânge prin vase de sânge artificiale - canale gravate într-un cip și căptușite cu același tip de celule care acoperă pereții vaselor de sânge.

La început, au văzut doar că neutrofilele își alungă particulele de plastic, care au fost proiectate să se atașeze de peretele vaselor de sânge. Aceasta a fost o problemă, deoarece dacă particulele nu s-au putut lega, nu ar putea livra medicamente în țesutul bolnav. Dar, după ce au vizionat filmările microscopului de mai multe ori, și-au dat seama că și neutrofilele au dispărut - nici ele nu se legau de peretele vaselor de sânge.

„Oh, Dumnezeul meu” al groazei legate de particula noastră s-a transformat într-un entuziasm asupra acestor particule făcând ceva celulelor care nu fuseseră explorate anterior ”, a spus Eniola-Adefeso. „Aceste interacțiuni grozave dintre celule și particule au împiedicat oricare dintre ele să poată face ceea ce doreau să facă.”

Echipa ei a proiectat un experiment care a rănit o parte a peretelui vasului de sânge în cipurile microfluidice și a confirmat că neutrofilele își redirecționează atenția, de la crearea inflamației la locul leziunii, până la îndepărtarea particulelor străine.

Apoi, Eniola-Adefeso s-a conectat cu Michael Holinstat, profesor de farmacologie la Michigan Medicine, care are tehnologie care poate vedea în vasele de sânge ale șoarecilor vii. La șoarecii cu leziuni pulmonare acute, au descoperit că injectarea nanoparticulelor cu IV ar putea reduce numărul de neutrofile care se adună la locul leziunii cu jumătate sau mai mult.

De fapt, concentrația de neutrofile a fost similară concentrației găsite în sângele șoarecilor nevătămați. În schimb, neutrofilele duceau particulele în ficat, unde puteau fi eliminate din circulație. Eniola-Adefeso intenționează să continue cercetarea în această direcție, aflând dacă o injecție de nanoparticule este un tratament viabil pentru afecțiuni cu inflamație excesivă.

Grupul ei va continua, de asemenea, depanarea nanoparticulelor ca vehicule pentru livrarea țintită a medicamentelor. O modalitate de a ține departe neutrofilele este de a acoperi particulele cu așa-numitele materiale care nu sunt contaminante - materiale rezistente la preluarea proteinelor din sânge.

Deoarece substanțele chimice pe care echipa le folosește pentru a atașa nanoparticulele de pereții vaselor de sânge sunt aceleași cu cele folosite de neutrofilele înseși, un strat care combină materialele care nu sunt contaminante cu substanțele chimice vizate va arunca majoritatea celulelor albe din sânge de pe parfum.

"Până în prezent, am încercat multe materiale care nu au încrustare. Dar, în cele din urmă, acestea sunt greșite, deoarece natura este foarte sofisticată", a spus ea.

Alternativ, alte grupuri de cercetare au încercat să preia membranele din celule care se deplasează în mod natural către țesutul vizat - de exemplu, neutrofilele care se atașează la peretele vasului de sânge - și să plaseze nanoparticule în interiorul lor. La fel ca extraterestrul din pielea umană din filmul „Men in Black”.


Rezultate si discutii

Capcarea optică a nanoparticulelor în interiorul peștilor zebră vii

Transparența optică a larvelor subțiri de zebră (Suplimentar Film 1 Suplimentar Fig. 1) este unică printre in vivo modele de vertebrate și unul dintre principalele motive ale popularității sale imense ca sistem de modele. Având în vedere acest lucru, am testat dacă peștele zebră a fost, de asemenea, „vizibil” pentru raza laser cu infraroșu a pensetelor optice și dacă această abordare ar putea fi utilizată pentru a manipula diferite structuri din interiorul larvei vii.

O aplicație recentă emergentă a peștilor zebră ca sistem model este în domeniul nanomedicinei 12. Pentru aceasta, pot fi injectate nanoparticule încărcate cu medicamente și decorate la suprafața lor cu factori (potențial) de direcționare, permițând monitorizarea biodistribuției și a circulației sanguine utilizând imagini live. Pentru a determina dacă astfel de particule injectate pot fi prinse în interiorul mediului complex al peștilor, am injectat particule de latex în larve de pește vechi de 2 zile (conform unui protocol 12 recent dezvoltat, vezi și Metode, Filmul suplimentar 2 și Fig. Suplimentară 2 ). Particulele repartizate cu ușurință în circulația fluxului sanguin și, cu timpul, o porțiune crescândă a nanoparticulelor, fie au aderat la căptușeala endoteliului vaselor de sânge, fie au fost preluate de macrofage.

După montarea peștilor în microscopul cu pensete optice (Fig. Suplimentar 3), am folosit microscopia de transmisie pentru a selecta particulele de interes care au aderat la endoteliul care acoperă vena caudală (Fig. 1a). Apoi, OT au fost pornite și am reușit să îndepărtăm cu atenție unele particule de pe endoteliu (Fig. 1a la 3,5 s, a se vedea și filmul suplimentar 3). Ulterior, particulele ar putea fi deplasate și, de asemenea, mișcate împotriva direcției fluxului rapid de sânge (200 μm s -1 în venă și ∼ 700 μm s -1 în artera 14) indicând o captare puternică. În exemplul prezentat (Fig. 1a), la punctul de timp 5.4 s, un eritrocit lovește capcana optică, decuplând astfel particula din capcană. În mod ciudat, particula dislocată a fost ulterior trasă înapoi, ca un arc, până la punctul de aderență original. Acest lucru a indicat faptul că particula a fost conectată printr-un nanotub (așa cum s-a descris anterior 15), care a exercitat o forță de tragere asupra particulei, care a re-încorporat legătura în endoteliu după retragere. Aceste manipulări ar putea fi realizate la o setare a puterii laserului de captare de 500 mW, aproximativ 10% din forța maximă disponibilă (corespunzând la aproximativ maxim 75 mW în eșantion). Acest lucru demonstrează că particulele aderente static pot fi prinse în peștele zebră, făcând posibilă investigarea detaliilor de interacțiune care nu sunt posibile cu alte metode.

(A) O particulă (vârf de săgeată verde) aderată la endoteliul venei caudale (indicată cu linii punctate albastre) este îndepărtată de endoteliu în fluxul rapid de sânge (săgeată purpurie) folosind o pensetă optică (miros negru). La 5,5 s un eritrocit este atras în capcană. Aceasta înlocuiește particula din capcană care este ulterior trasă înapoi către punctul de aderență original al endoteliului, probabil datorită unui nanotub de conectare. Experiment repetat de cel puțin 80 de ori. (b) Patru particule separate (numerotate) sunt pescuite din fluxul sanguin și deplasate către o regiune protejată la vârful cozii. Săgețile purpurii indică direcția de curgere. Experimentul a fost repetat de cel puțin 10 ori. Bara de scalare, 5 μm.

După ce am stabilit că o particulă deja aderată ar putea fi prinsă, am investigat apoi dacă a fost posibil să se prindă particule care au fost injectate în fluxul sanguin și care se mișcau cu fluxul la viteză mare 14. Pentru a face acest lucru, am folosit opțiunea de multiplexare de partajare a timpului disponibilă a sistemului de pensete optice prin scanarea laserului de captare la viteză mare în mai multe poziții, pot fi create mai multe capcane care pot fi utilizate pentru a prinde în paralel un număr mare de obiecte 16. Am distribuit astfel mai multe capcane de „pescuit” în fluxul sanguin. În Fig. 1b (Filmul suplimentar 4) folosind două capcane, două particule (marcate cu „1” și „2”) fuseseră deja mutate spre coadă într-o regiune cu viteză de curgere mai mică în afara fluxului principal de sânge (săgeți purpurii). Apoi, o altă particulă („3”) a fost prinsă (19,7 s) și deplasată împreună cu celelalte două particule în timp ce o altă particulă („4”) a fost prinsă în flux la t= 20 s. Pentru a demonstra controlul de poziționare pe care îl permit pensetele multiplexate in vivo, particulele au fost poziționate mai întâi în linie dreaptă (32 s) și apoi repoziționate într-o formă pătrată (39,1 s). Prinderea mai multor particule în fluxul sanguin și reorganizarea ulterioară a pozițiilor lor relative demonstrează robustețea prinderii și versatilitatea experimentelor care sunt posibile, de exemplu, prin stabilirea unui contact simultan între mai multe particule și celule specifice (Film suplimentar 5 suplimentar Fig. 4).

Capcana a fost posibilă pe tot parcursul peștilor și până la adâncimi de 100 μm distanță de sticla de acoperire de jos (inclusiv pește zebră și mediu, Fig. Suplimentar 3) și noi, de exemplu, am prins celule și particule în interiorul inimii care bătea. Cu toate acestea, am constatat că cea mai simplă captare se poate face în vena și artera caudală în regiunea cozii (mai subțiri) a peștilor, la o adâncime de aproximativ 50 μm, unde fluxul sanguin arterial se transformă din transportul retrograd către coadă în anterograd. transport către capul peștilor. Experimentele demonstrează că proprietățile adezive ale particulelor pot fi testate în interiorul peștilor vii folosind micromanipulare, chiar și în sângele care curge rapid în artera caudală. Am reușit să prindem și să mutăm particule de polistiren cu diametrul de 200 nm la 1 μm, dar am efectuat cele mai multe experimente cu particule cu diametrul de 840 nm (a se vedea secțiunea Metode, vârf de emisie de fluorescență la ∼ 700 nm) sau 1 μm (non-fluorescent) datorită clarității lor vizibilitate și rigiditate mai mare la prindere 17. Încetinirea fluxului sanguin cu ajutorul anestezicului tricaină 18 facilitează captarea optică și permite deplasarea particulelor mai mici până la 200 nm, deși acest lucru a fost mai dificil din cauza rigidității mai mici a captării și a faptului că particulele mai mici erau dificil de discriminat folosind microscopie cu transmisie de câmp. Cu toate acestea, folosind microscopia confocală cu fluorescență, particulele ar putea fi identificate. Particulele mai mari ar putea fi prinse fără daune evidente de încălzire pentru perioade lungi de timp în interiorul vasculaturii cu puteri laser de la 100 mW la 3 W (aproximativ 15 mW la ~ 450 mW în probă). Cu toate acestea, câteva zone întunecate împrăștiate (posibil pigmenți care s-au dezvoltat în ciuda utilizării feniltiourii (PTU), vezi Metode) au interacționat puternic cu OT și, atunci când OT a fost deplasat tranzitor peste aceste zone, acestea au devenit vizibil deteriorate, probabil din cauza încălzirii. Cu toate acestea, evitând aceste zone nu s-au observat daune perceptibile pe parcursul experimentelor.

Prinderea celulelor în peștele zebră viu

În mod tradițional, pentru experimentele cu pensete optice se folosesc particule sferice cu indice de refracție ridicat, deoarece acestea pot fi prinse cu o rigiditate ridicată și sunt potrivite în special pentru calibrarea capcanelor pentru experimentele cantitative. Cu toate acestea, pentru alte aplicații, micromanipularea spațială este caracteristica crucială, deoarece obiecte precum celule, particule sau alte obiecte la scară nanomicronică pot fi aduse în contact între ele în puncte și poziții de timp bine definite, deschizând posibilitatea analizei dinamica neaccesibilă prin observarea pasivă.

Deoarece am constatat că particulele pot fi ușor și robust prinse în întregul pește zebră, am întrebat dacă celulele ar putea fi micromanipulate în interiorul peștilor. În absența particulelor și folosind puteri laser mai mari (setarea sistemului de aproximativ 2 W, aproximativ 250 mW în probă), am activat capcana optică din mijlocul venei caudale, care a condus aproape instantaneu la imobilizarea unui eritrocit în capcană. Aceste celule ar putea fi menținute stabil în poziție împotriva fluxului complet al fluxului sanguin (Fig. 2a Filmul suplimentar 6) și ar putea fi chiar deplasate în direcția împotriva fluxului sanguin. Am constatat că nucleul eritrocitelor 19 de pește zebră a fost prins cel mai puternic. În Fig. 2a, o membrană în formă de „sac” poate fi observată în spatele nucleului blocat stabil, această deformare este cauzată de forța de tracțiune pe care sângele o exercită și seamănă cu bulele care se formează datorită încălzirii locale a celulelor 20. Acest experiment arată că în captura optică a eritrocitelor în peștele zebră este puternică și pare mai robustă decât cea realizată în urechea șoarecelui 8, unde captarea trebuia făcută treptat, făcând o utilizare crucială a peretelui vasului de sânge. O posibilă explicație pentru acest lucru poate fi că eritrocitele la șoareci nu au un nucleu.

(A) Un eritrocit este prins și mutat în fluxul sanguin. Bara de scală, 10 μm. Experiment repetat de cel puțin 10 ori. (b) Un macrofag fluorescent rezident în sânge (contur galben, verde în t= 0 s) a fost micromanipulat și mutat în 3D într-un vas de sânge. Conturul alb indică un alt macrofag non-mobil. Punctele roșii sunt particule injectate. Bara de scalare, 5 μm. Experiment repetat de cel puțin 5 ori. (c) O particulă injectată (culoare roșie) care a fost asociată cu un macrofag a fost testată pentru aderență. Mai întâi particula a fost îndepărtată (t= 0-21,7 s) după care OT a fost scurt oprit. Acest lucru nu a dus la scurgerea particulei cu sângele, sugerând că un nanotub (care nu este vizibil) lega particula de lângă particula a fost adusă cu atenție în contact și s-a îndepărtat din nou (52,3-101,6 s), indicând că nu a existat o legătură puternică. stabilit. În cele din urmă, particula a fost mutată mai departe în macrofag cu o forță de împingere mai mare, după care particula nu a mai putut fi detașată (t= 107,6–136,1 s). Bara de scală, 10 μm. Experimentul a fost repetat de cel puțin 5 ori.

Apoi, am testat dacă alte tipuri de celule ar putea fi, de asemenea, prinse în larva de pește zebră. Cu toate acestea, nu este întotdeauna banal să se identifice diferite tipuri de celule bazate doar pe utilizarea imaginii de transmisie în mediul aglomerat și dinamic al unui organism viu. Prin urmare, am folosit o caracteristică pe care am implementat-o ​​pe sistemul de imagistică a pensetelor optice utilizat aici (adaptat Nanotracker JPK Instruments AS, Berlin, vezi Metode), și anume posibilitatea de a face capturi paralele și imagini confocale și de transmisie (vezi și ref. 21). Folosind o linie transgenică de pește zebră cu macrofage fluorescente, (Tg (mpeg1: mcherry)) 22 ne-am propus astfel să testăm potențialul de captare a acestor celule. În această linie de pește, un număr relativ mare de macrofage sunt rezidente în țesut și aceste celule nu pot fi manipulate folosind OT. Cu toate acestea, mai multe macrofage au fost prezente liber în lumenul vaselor de sânge. În Fig. 2b (vezi și filmul suplimentar 7) a fost selectată o zonă cu două macrofage în vena caudală, aceste macrofage putând fi identificate folosind imagistica fluorescentă, una care era imobilă (contur alb) și alta care putea fi deplasată folosind OT. În primul rând, macrofagul a fost mutat în raport cu peștele (utilizând repoziționarea pe bază de deviere acusto-optică t= 0-18 s și 39-81 s), în timp ce la t= 20 s întreaga etapă, inclusiv peștele și macrofagul nemobil, a fost deplasată (orizontal și axial), în timp ce capcana a fost ținută într-o poziție stabilă. Capcana combinată și imagistica confocală din peștele zebră demonstrează că tipurile de celule specifice pot fi identificate și prinse folosind acest sistem versatil. Există o mulțime de linii transgenice de pește zebră 10 și pot fi abordate diferite tipuri de celule și întrebări fiziologice. Ca un alt exemplu, în filmul suplimentar 8 (și figura suplimentară 5) o particulă (culoare roșie, emisie 640 nm) a fost mutată în pește zebră cu celule endoteliale fluorescente (verzi) (Tg (fli1: EGFP) 23.

Am întrebat apoi dacă particulele care erau asociate cu un macrofag puteau fi mutate folosind penseta în mod specific, ne-am întrebat dacă au aderat la suprafața macrofagelor sau au fost interiorizate de celulă. Pentru aceasta, am folosit din nou tricaină pentru a încetini fluxul sanguin. În Fig. 2c (Filmul suplimentar 9), un macrofag fluorescent a fost identificat în vena caudală a larvei de pește zebră utilizând imagini confocale. Apoi, o particulă (culoare roșie, indicată cu o săgeată verde) a fost prinsă cu penseta și s-a îndepărtat, ceea ce a dus la detașarea ei de macrofag (t= 0-21,7 s), indicând astfel că nu se afla în interiorul macrofagului. Oprirea scurtă a OT nu a dus la scurgerea particulei cu sângele, deoarece se poate observa că fac alte particule (punctele roșii) în timp ce trec pe lângă macrofagele staționare și nanoparticulele roșii staționare. Acest lucru sugerează că particula a rămas legată de macrofag printr-un nanotub (nu este vizibilă fie din cauza faptului că se află într-un plan diferit decât planul imagistic confocal sau pentru că era foarte subțire și nu foarte strălucitoare). Apoi, particula a fost mutată din nou către macrofag, însă nu a putut fi observată nicio interacțiune (52,3-101,6 s). În cele din urmă, particula a fost deplasată cu o forță de împingere mai mare împotriva macrofagului, după care a aderat robust și nu a mai fost posibil să se detașeze particula (chiar și la 5 W, cea mai mare putere disponibilă pe sistemul nostru). Macrofagele joacă un rol central în curățarea obiectelor mai mari 24 și este crucial să înțelegem această interacțiune pentru nanomedicina bazată pe nanoparticule și livrarea de medicamente. Sistemul de pensete zebraf-optice face posibilă studierea dinamicii interacțiunilor, contactul cu o anumită zonă a celulei și poate fi, de asemenea, utilizat pentru a investiga rolul forțelor de contact cu care particula interacționează atunci când sunt împinse împotriva unui macrofag într-un mod controlat.

Capcane multiple pentru in vivo formarea nanotuburilor

Pentru a studia mai detaliat aderența particulelor la celulele endoteliale in vivo, a fost testat un sistem mai complex care implică mai multe celule. Într-un pește zebră în care fluxul sanguin a fost încetinit (folosind tricaină), am localizat mai întâi o particulă care a aderat la endoteliu. Apoi, am aplicat mai multe capcane optice pentru a elimina zona de operare a tuturor celulelor: patru eritrocite care erau prezente aproape de particula aderată au fost îndepărtate (Fig. 3a Film suplimentar 10). În primul rând, celula '1' a fost îndepărtată (comportându-se ca o bilă de biliard care împinge celelalte celule înainte) și după ce a îndepărtat-o ​​a fost ținută prinsă la distanță, permițând asamblarea unui 'gard' împreună cu alte câteva capcane plasate în adiacente. poziții. Apoi, celula '2' a fost mutată și plasată în spatele celulei '1' 'gardul' format din mai multe capcane optice a împiedicat celulele să curgă și să se difuzeze înapoi în regiunea de operare. În plus, celulele care nu erau focalizate au experimentat o forță de împrăștiere care le-a „suflat” departe de zona gardului. La t= 36,4 s particula identificată mai devreme a fost îndepărtată de endoteliu. Cu toate acestea, această particulă nu s-a desprins pe deplin, deoarece o proeminență de membrană subțire a fost scoasă din celula endotelială. Astfel de legături de membrană sau nanotuburi au fost studiate în detaliu in vitro deoarece pot dezvălui informații despre, de exemplu, interacțiunile membrană-citoschelet, continuitatea membranei și proprietățile sale biofizice 25,26,27. Experimentele noastre folosind OT în interiorul larvelor vii de pește zebră arată pentru prima dată că nanotuburile se pot forma într-un organism multicelular in vivo folosind micromanipulare activă și că aceste nanotuburi ar putea funcționa ca o aderență flexibilă, unde obiectele aderate pot fi îndepărtate în timp ce rămân legate.

(A) Într-un vas de sânge mai mic, mai multe eritrocite sunt curățate (0-36,4 s) și îngrădite, după care o particulă aderată a fost îndepărtată de endoteliu și s-a format un nanotub de legare (36,4-42,2 s). Bara de scalare, 5 μm. (b) Cuantificarea probabilității de aderență a particulelor goale și acoperite cu PEG, clasificate ca: detașabile (albe), puternic aderente (solide) și legate (linii). Experimentul a fost repetat de cel puțin 60 de ori.

Cuantificarea proprietăților de aderență și „stealth”

Înțelegerea modului în care nanoparticulele aderă la diferite tipuri de celule și modul în care dinamica aderenței este reglată este crucială pentru livrarea de medicamente pe bază de nanoparticule. Prin urmare, am dorit să testăm sistematic aderența particulelor la celulele endoteliului care acoperă vasele. Pentru a face acest lucru, am experimentat două tipuri de particule: „gol” și particule de polistiren glicol (PEG) acoperite cu polistiren (1 μm diametru). PEG ar trebui să ofere un strat care scade afinitatea nespecifică a particulelor pentru celule precum macrofagele. PEG a fost utilizat pe scară largă pentru a oferi proprietăți „stealth” nanoparticulelor concepute pentru, de exemplu, terapia cancerului, facilitând un timp de circulație mai lung în fluxul sanguin. Într-un alt proiect, am utilizat particule acoperite cu PEG în ZF și le-am monitorizat în mod eficient biodistribuirea și le-am caracterizat proprietățile de țintire și „stealth” către celulele canceroase 11. Au fost detectate particule injectate de 1 μm care aderau la endoteliu și s-au încercat să le îndepărteze la o putere laser fixă ​​de 500 mW. Pentru particulele goale de polistiren am constatat că majoritatea particulelor au aderat puternic la endoteliu (Fig. 3b) și nu a fost posibil să le îndepărtăm de la puterea laserului utilizată (adesea nu la puteri mai mari, deoarece au fost puternic aderate) . Din cele 30 de particule testate în larve, 29 nu au putut fi mișcate și doar 1 a putut fi trasă, dar au rămas totuși conectate printr-o legătură și au fost trase înapoi după închiderea capcanei (Fig. 3b, bara stângă). Apoi, am testat particulele injectate cu un strat PEG. Aceste particule au fost, de asemenea, aderate la endoteliu și am determinat legarea acestor particule PEGilate (Fig. 3b, dreapta). Din cele 30 de particule acoperite cu PEG care au fost găsite imobilizate la endoteliu 26 s-au putut desprinde, în timp ce patru au format o legătură. Niciuna dintre aceste particule nu a fost atașată atât de puternic încât a fost imposibil să le îndepărtăm de endoteliu. Acest lucru demonstrează că PEG scade afinitatea de legare a particulelor de polistiren pentru celulele endoteliale in vivo, chiar dacă au aderat într-o oarecare măsură la endoteliu.

Faptul că particulele acoperite cu PEG formează mai des legături indică faptul că particulele aderă, dar cu o rezistență semnificativ mai mică decât particulele ne-acoperite. Forța inițială necesară pentru formarea legăturii depinde puternic de dimensiunea zonei de aderență și formarea mai frecventă a legăturii implică faptul că aria de aderență la celulele endoteliale este mai mică în cazul particulelor PEGilate. Particulele goale probabil aderă prin zone mai mari, rezultând o forță de prag mai mare pentru formarea nanotuburilor 15,28 decât poate furniza penseta.

Am investigat apoi dacă heparina 29 ar afecta legarea nanoparticulelor de mucoasa endotelială, având în vedere că proteinele și medicamentele cu situsuri de legare a heparinei care leagă endoteliul pot fi detașate în prezența heparinei. Am evaluat acest lucru mai întâi prin compararea circulației particulelor fluorescente în ZF injectat cu amestecuri (3 nl) de particule (polistiren neacoperit) împreună cu sau fără heparină (concentrații de 40 și 100 mg ml -1). Imagistica fluorescentă confocală nu a evidențiat nicio diferență în proprietățile de aderență în prezența sau absența heparinei chiar și la cea mai mare concentrație de medicament. Apoi am folosit pensete optice pentru a evalua dacă proprietățile de aderență ale particulelor s-au schimbat la un „nivel mai subtil” în prezența heparinei. Ca și în cazul particulelor acoperite cu PEG (Fig. 3b), am folosit OT pentru a trage nanoparticule aderente la endoteliu (putere laser de 500 mW). Aceste experimente arată că nu a existat nicio diferență semnificativă în proprietățile de aderență în prezența sau absența heparinei (Fig. Suplimentară 6).

Captarea optică și manipularea bacteriilor injectate

După ce am demonstrat captarea particulelor injectate și a celulelor de pește zebră care apar în mod natural în interiorul larvei vii de pește zebră, am testat dacă această abordare poate fi aplicată și pentru a studia bacteriile injectate. Bacteriile au fost printre primele particule biologice care au fost prinse optic in vitro în soluțiile apoase 2, dar, din câte știm, nu există rapoarte despre captarea bacteriilor în interiorul vertebratelor vii. Bacteriile în formă de tijă sunt mai greu de captat decât particulele sferice (polistiren) și sunt mai mici decât macrofagele și eritrocitele. Ca dovadă a principiului manipulării optice a bacteriilor din peștele zebră, am injectat bacteria peștilor M. marinum, care provoacă tuberculoza peștilor și care a fost utilizat pe scară largă și eficient ca model pentru tuberculoza umană în larva de pește zebră 12,30.

Pentru acest experiment am selectat o regiune în care fluxul sanguin a fost foarte lent (din nou folosind tricaină) și, folosind fie fluorescența, fie imagistica prin transmisie, am putut detecta prezența bacteriilor (fluorescente roșii) care fuseseră injectate (Fig. 4). Apoi, o bacterie a fost prinsă și mutată împotriva endoteliului folosind OT (Filmul suplimentar 11). Înainte ca capcana să fie activată, bacteria a fost văzută mișcându-se într-o manieră browniană prin vasul de sânge, rotindu-se și difuzându-se. Poate fi imaginat într-un instantaneu în timp ce este orientat în planul de imagine (Fig. 4a, vezi și filmul suplimentar 11). Activarea pensetelor optice (Fig. 4b) a dus la orientarea bacteriei într-o direcție perpendiculară pe planul imagistic (în direcția fasciculului pensetei). Această reorientare este de așteptat pentru obiectele alungite. Apoi, bacteria a fost împinsă împotriva endoteliului (Fig. 4c). În mod curios, în Fig. 4d s-a putut observa o celulă (probabil un macrofag 31) târându-se spre punctul de contact. După ce bacteria a fost mutată în mod repetat împotriva endoteliului, celula imunitară a fost văzută pentru a-și opri mișcarea și în cele din urmă părea că „decide” să se deplaseze peste bariera endotelială (Fig. 4g-i). Se știe că macrofagele colectează bacteriile 31, iar controlul poziției și al timpului bacteriilor și al interacțiunilor cu diferite celule face posibilă studierea acestui fenomen într-un mod controlat. OT poate fi, de exemplu, utilizat pentru a determina cât timp o bacterie trebuie să rămână în contact pentru a adera la o celulă sau pentru a evoca un răspuns sau dacă bacteriile multiple vor crește recrutarea macrofagelor sau vor influența dinamica fagocitozei.

(A) O bacterie difuză (săgeată mov) este (bd) prins, împins împotriva și îndepărtat de endoteliu (linia roșie în A). Acest lucru pare să activeze o celulă imună (vârfurile săgeții verzi), care se deplasează spre punctul de contact (cf). Contactul repetat cu endoteliul pare să atragă din nou atenția celulei târâtoare, care (geu) se mută în cele din urmă în venă. Durata totală a experimentului este de ∼ 2 min. Bara de scală, 10 μm. Experimentul a fost repetat de cel puțin 4 ori.

De asemenea, am testat efectele medicamentelor antiinflamatoare asupra migrației celulelor imune către zonele invadate de bacterii. Experimentele noastre preliminare folosind linii de pește, fie cu neutrofile fluorescente, fie cu macrofage fluorescente, au confirmat că medicamentele antiinflamatoare diclofenac și indometacin 32 au inhibat recrutarea neutrofilelor (și macrofagelor într-un grad mai mic, rezultate nepublicate) în locurile în care au fost injectate bacterii 12. Cu toate acestea, aceste experimente au nevoie de o urmărire sistematică pentru ca semnificația lor să fie verificată.

Colectiv, experimentele pe care le-am descris demonstrează pentru prima dată o micromanipulare activă a unei scări complete de structuri de dimensiuni nano până la micron în interiorul unei vertebrate vii, folosind larva de pește zebră transparentă. Structurile manipulate au variat de la nanoparticule injectate și bacterii la celule de pește zebră care apar în mod natural ca eritrocite și macrofage.

Prevedem multe utilizări ale acestei abordări, cum ar fi (dar nu limitat la), caracterizarea proprietăților de interacțiune a nanoparticulelor cu celule specifice pentru aplicații de nanomedicină. În special proprietățile nanoparticulelor ar putea fi studiate, de exemplu, prin funcționalizarea lor cu liganzi pentru direcționarea către celule specifice sau cu straturi precum PEG pentru a preveni interacțiunile cu alte celule. Alternativ, nanoparticulele manipulate optic care eliberează un compus specific ar putea fi aduse în apropierea structurii organismului de interes pentru testarea răspunsurilor celulare locale la substanțe chimice (așa cum s-a demonstrat deja elegant cu celulele in vitro 33), cum ar fi pentru studii privind funcția vasculară și integritatea endotelială.

Investigațiile controlate privind recrutarea și activarea celulelor imune, prin micromanipularea bacteriilor, a altor microorganisme sau a particulelor acoperite cu antigen în regiuni specifice din organism, vor face posibilă investigarea aderenței și activării / recrutării celulelor imune, de exemplu în prezența anti- medicamente inflamatorii, mai ales în combinație cu imagistica. În cele din urmă, pensetele optice cantitative au fost esențiale pentru înțelegerea proprietăților biomecanice celulare și a rolului lor de reglare în funcție. Cu toate acestea, acest lucru s-a făcut mai ales in vitro cu celule în cultură, iar lucrarea prezentată aici deschide multe posibilități de a efectua astfel de experimente pe tot parcursul unei vertebrate vii.


4. Aplicații de nanoparticule în biologie

4.1 Nanoparticulele ca senzori

Platformele NP, cum ar fi NP-urile aurii, au fost utilizate pe scară largă ca senzori datorită chimiei suprafeței lor. O metodă de utilizare a chimiei de suprafață unice a NP-urilor de aur pentru amplificarea transducției semnalului este metoda bio-cod de bare dezvoltată de grupul Mirkin. Această metodă a fost aplicată pentru detectarea țintă a proteinelor 50 și ADN 51. Pentru detectarea ADN-ului țintă, se poate obține o sensibilitate asemănătoare PCR. Această tehnică a fost raportată pentru detectarea citokinelor la o concentrație de 30 aM (atomolar) 52 și pentru detectarea unui biomarker patogen solubil pentru boala Alzheimer la o concentrație de aproximativ 100 aM. 53 Mai recent, grupul a folosit această metodă pentru a detecta antigenul specific prostatei (PSA), un biomarker de cancer investigat frecvent, care poate indica prezența cancerului de prostată atunci când este exprimat la niveluri ridicate. 54 În abordarea de testare a codurilor de bare, NP-urile de aur funcționalizate cu ADN (30 nm) sunt conjugate cu anticorpi PSA-specifici pentru a genera sonde NP de aur PSA (Fig. 2). 55,56 Catenele ADN sunt codurile de bare bio. O microparticulă magnetică (MMP) funcționalizată cu anticorpi monoclonali la PSA este amestecată cu proteina țintă PSA. După o etapă de spălare, sondele PSA aur NP sunt adăugate la PSA legat de MMP. După o separare suplimentară prin aplicarea câmpului magnetic și pașii de spălare, codurile de bare ADN specifice PSA sunt eliberate în soluție și analizate folosind testul scanometric, care profită de îmbunătățirea argintului catalizat de aur NP. Această analiză a atins o sensibilitate de 330 fg mL −1 al PSA.

Fig. 2 Metoda bio-cod de bare. (A) Dezvoltarea sondei NP. (B) Metodă de detectare utilizând sonde NP de aur conjugate cu antigen specific prostatei. Reprodus din ref. 56.

Metoda ADN bio-cod de bare combină capacitatea de a conjuga un număr mare de fire ADN pe suprafețe de aur NP și detectarea acestor fire ADN folosind tehnici precum amplificarea PCR sau analize scanometrice. O altă abordare pentru detectare care utilizează proprietăți optice ale suprafeței NP a fost dezvoltată de grupul Rotello. 57 Au descoperit că polimerii fluorescenți anionici se pot lega și disocia reversibil de NP-urile cationice funcționalizate prin interacțiuni chimice non-covalente. Când polimerul fluorescent este legat de NP, fluorescența acestuia este stinsă. Când este disociată de NP, fluorescența este restabilită. Acest fenomen este baza unui sistem de „nas chimic”. 58 În acest sistem, proteina țintă este detectată în funcție de diferitele sale răspunsuri de fluorescență la legarea la diferite tipuri de NP-uri de aur modificate la suprafață. Un model de răspuns la fluorescență este generat și apoi analizat prin metode statistice. Acest proces poate detecta, cuantifica și distinge diferite ținte moleculare între ele. Acest proces a fost inițial dezvoltat pentru detectarea și detectarea proteinelor 58, dar a fost adaptat și pentru detectarea și detectarea bacteriilor, 59 pentru detectarea diferențelor fizico-chimice dintre celulele mamare sănătoase, canceroase și metastatice ale omului și pentru diferențierea izogenelor. celule sănătoase și transformate (Fig. 3). 60,61 Detectarea „nasului chimic” oferă, de asemenea, avantajul de a nu utiliza anticorpi pentru detectare, deoarece identitatea analitului țintă nu trebuie cunoscută pentru a detecta analitul.

Fig. 3 Interacțiunile dintre complexele NP-GFP și suprafețele celulare generează diferite modele de fluorescență. Reprodus din ref. 61.

NP-urile de aur pot îmbunătăți, de asemenea, împrăștierea Raman cu suprafață îmbunătățită (SERS) pentru detectarea și identificarea biomoleculelor la suprafața NP.Tehnica SERS a fost folosită frecvent pentru a detecta analiți specifici prin spectrele lor vibraționale unice. Lățimea îngustă a spectrelor SERS permite detectarea mai multor analite în amestecuri complexe, inclusiv detectarea până la nivelul unei singure molecule. 33 Astfel, tehnicile SERS au fost folosite pentru detectarea ultrasunetivă a biomoleculelor precum glucoza, 62 hemoglobina, 63 bacterii, 64 și viruși. 65 Folosind această abordare, un grup a demonstrat că NP-urile de aur codificate cu reporteri Raman și conjugate cu anticorpi cu variante cu lanț unic (ScFv) pot viza biomarkeri de cancer precum receptorii factorului de creștere epidermică (EGFR) in vitro și in vivo (Fig. 4) . 66,67 Recent, anchetatorii au demonstrat, de asemenea, un sistem SERS bazat pe o matrice NP cu film subțire auto-asamblată la interfața lichid-lichid pentru detectarea analizei de urmărire în mai multe faze. 68 Grupul a fost capabil să detecteze analiți monofazici, precum și mai mulți analiți dizolvați în faze de apă și organice.

Fig. 4 Spectrele de împrăștiere Raman (SERS) îmbunătățite la suprafață și imagistica plasmonică corelată de suprafață a celulelor canceroase unice marcate cu NP de aur conjugate cu ScFv. Reprodus din ref. 67.

Au fost de asemenea dezvoltați nanosenzori care exploatează proprietățile magnetice ale NP magnetice, cum ar fi SPION-urile. Există un interes considerabil pentru NP-urile magnetice, deoarece acestea au proprietăți magnetice puternice și majoritatea probelor biologice prezintă o susceptibilitate magnetică neglijabilă. 69 SPION-uri au fost utilizate ca etichete magnetice pentru multe tipuri diferite de senzori, inclusiv biosenzori magnetorezistenți gigantici (GMR), care se bazează pe legarea particulelor magnetice de suprafața senzorului. 70 Câmpurile magnetice ale particulelor pot modifica câmpurile magnetice ale senzorului, rezultând modificări ale rezistenței electrice a senzorului. Recent, Wang și colegii de la Universitatea Stanford au demonstrat utilizarea acestei tehnici pentru un test de detectare a proteinelor, în care se utilizează o serie de senzori GMR pentru a detecta evenimente de legare ale proteinelor la matrice de anticorpi legați la suprafață cu utilizarea SPION-urilor ca etichete magnetice. . 71 În acest test, antigenul țintă este între doi anticorpi, unul legat de senzor și celălalt marcat cu un SPION. Prezența sau absența NP magnetizat este detectată de senzorul subiacent. Grupul a demonstrat că analiza este insensibilă la matrice la diferite fluide biologice, dar încă capabilă să detecteze proteinele până la concentrații atomolare și într-o gamă largă de concentrații. Folosind o strategie similară, au demonstrat, de asemenea, detectarea proteinelor asociate cancerului în ser de 50% la concentrații sub-picomolare utilizând particule MACS (SPION comercializate pentru separarea celulelor). 72 Recent, aceștia au folosit NP antiferromagnetice funcționalizate cu streptavidină pentru a detecta ADN-ul cu sensibilitate ridicată (10 pM). 73

Proprietatea superparamagnetică a IONP-urilor este, de asemenea, baza comutării magnetice de relaxare. Grupul Weissleder a studiat comutatoarele magnetice de relaxare formate din SPION de 3-5 nm acoperite cu dextran gros de 10 nm și stabilizate prin reticulare. 74 SPION-urile vizate sunt dezvoltate prin funcționalizarea lor cu grupe amino pentru atașarea unei game de molecule purtătoare de sulfhidril. 75 Nanoswitch-urile pot fi supuse unei asamblări reversibile (grupare și decluster) în prezența unei molecule care este recunoscută de liganzii imobilizați pe NP, rezultând o schimbare a relativității magnetice transversale (1 / T 2) a protonilor de apă din jur. Modificările ratelor de relaxare ca urmare a asamblării NP pot fi folosite pentru a detecta o varietate de ținte biologice, inclusiv ADN și proteine ​​la nivelul scăzut al femtomolului (0,5-10 fmol). 76 Recent, grupul Weissleder a dezvoltat un sistem de rezonanță magnetică diagnostic (DMR) bazat pe cip pentru detectarea rapidă și cantitativă a țintelor biologice. 77 DMR folosește, de asemenea, IONP ca senzori pentru a amplifica interacțiunile moleculare cauzate de ansamblurile SPION-urilor. Ei au demonstrat dovada conceptului prin detectarea cu sensibilitate ridicată a prezenței proteinelor în paralel și prin detectarea bacteriilor. Comparativ cu relaxometrul RMN de pe bancă, sistemul DMR avea o limită de detectare a masei îmbunătățită cu două ordine de mărime (limită de detecție de 15 fmol).

Senzorii magnetici de relaxare NP au fost utilizați și în teste în care baza testării este relaxarea momentelor magnetice din cadrul NP magnetice. 78 Relaxarea browniană este mecanismul dominant pentru acești biosenzori NP. În această metodă, NP-urile formează agregate după recunoașterea analiților țintă, ducând la o dimensiune hidrodinamică mai mare și, astfel, răspunsuri de relaxare browniene mai lente decât NP-urile individuale. Folosind acest principiu, un grup a detectat recent un anticorp bacterian la sensibilitatea de 0,3 nM cu un susceptometru AC. 79

Grupul Weissleder a folosit, de asemenea, NP-uri acoperite cu anticorpi într-un dispozitiv microfluidic pentru a detecta bacteriile. 82 De asemenea, au raportat că NP-urile miez-miez cu miezuri metalice Fe au o sensibilitate sporită în comparație cu IONP-urile pentru detectarea celulelor bacteriene. Recent, grupul a dezvoltat, de asemenea, un test bazat pe o strategie de codare magnetică a barei care nu necesită anticorpi și ar putea detecta mutațiile unei singure gene. 83 În această abordare, genele micobacteriene amplificate cu PCR sunt capturate în mod specific de secvență pe margele polimerice care sunt modificate cu ADN complementar, marcate de SPION și detectate de RMN. Platforma ar putea detecta M. tuberculosis și a identifica tulpini de rezistență la medicamente din probele de spută în 2,5 ore. Anchetatorii au dezvoltat, de asemenea, un sistem similar care utilizează ARNr ca marker țintă pentru etichetarea NP. 84 Abordarea a folosit o sondă universală și specifică a acidului nucleic care detectează ARNr 16S, care este abundentă și comună multor specii bacteriene. Dispozitivul a fost suficient de sensibil pentru a detecta doar 1-2 bacterii E. coli în 10 ml de sânge și pentru a estima cu precizie încărcătura bacteriană.

Multe grupuri au folosit, de asemenea, NP-uri funcționalizate cu molecule mici pentru a marca bacteriile. Un grup a dezvoltat un sistem magnetic glico-NP care putea detecta tulpini de E. coli în 5 minute și permite îndepărtarea de până la 88% din probă prin exploatarea interacțiunii bacteriene cu carbohidrații de pe suprafețele celulelor de mamifere (Fig. 5). 85,86 Un alt grup a raportat utilizarea SPION-urilor modificate de vancomicină într-un test de captare magnetică pentru diferite bacterii Gram-pozitive și Gram-negative. 87 De asemenea, au demonstrat că, pe măsură ce dimensiunea și acoperirea ligandului pe NP cresc, timpul necesar pentru o etichetare eficientă a bacteriilor cu NP scade.

Biosensarea optică a bacteriilor a fost, de asemenea, utilizată utilizând atât NP metalice, cât și QD-uri. Abordarea de testare a codului de bare 50 oferă amplificare și posibilitatea de a detecta simultan mai multe ținte diferite într-un eșantion. Folosind această metodă, ADN-ul genomic dublu catenar Bacillus subtilis a fost detectat la o concentrație de 2,5 fM. 88 În mod similar, Salmonella enteritidis a fost detectată la 0,2 fM. 89 QD-uri au fost, de asemenea, utilizate ca senzori de agenți patogeni. Edgar și colab. a raportat o tehnică care combina biotinilarea in vivo a bacteriofagului specific gazdei proiectat și atașarea fagului la QD-uri acoperite cu streptavidină. 90 Metoda asigură detectarea specifică a E. coli printre mai multe tulpini bacteriene diferite și poate detecta doar 10 bacterii per ml de probe experimentale.

Tehnicile imunomagnetice NP sunt unele dintre metodele mai frecvent utilizate pentru identificarea și captarea CTC-urilor. Aceste tehnici implică utilizarea de NP magnetice pentru a viza și a izola CTC-urile utilizând un mecanism bazat pe receptor-ligand. În prezent, dispozitivul CellSearch, care utilizează o tehnică imunomagnetică, este singurul test aprobat de FDA pentru evaluarea CTC. 92,93 CellSearch se bazează pe o selecție pozitivă a moleculelor de adeziune a celulelor epiteliale (EpCAM) a CTC-urilor și folosește NP-uri de fier acoperite cu un strat de polimer care poartă analogi de biotină și conjugate cu anti-EpCAM, pentru captarea CTC-urilor in vitro. Acest sistem poate fi, de asemenea, utilizat pentru marcarea și identificarea leucocitelor utilizând un anticorp anti-CD45-APC ca ligand de țintire NP. Recent, un grup a demonstrat, de asemenea, că IONP-urile funcționalizate cu anti-HER2 sau anti-HER2 / neu ar putea fi folosite pentru a separa 73,6% din celulele canceroase HER2 / neu supra-exprimate care au fost spiked în 1 ml de sânge. 94 Interacțiunile receptor-ligand au dus la captarea preferențială a celulelor canceroase. Într-un alt studiu preclinic, abordarea in vivo a detectării CTC a fost realizată folosind NP magnetice PEGilate. 95 de anchetatori au vizat în mod dual CTC-urile in vivo cu NPs magnetice conjugate cu activator de plasminogen (uPA) și nanotuburi orientate spre folat pentru detectarea ulterioară utilizând citometrie de flux fotoacustică.

Incorporarea polimerilor, care pot permite detectarea țintită și captarea suprafeței, în alte platforme NP organice și anorganice poate duce la noi senzori NP pentru detectarea CTC. 96 Recent, un grup a folosit NPs de aur acoperite cu polimer țintit și tehnica SERS pentru a măsura direct CTC în prezența globulelor albe din sânge (Fig. 6). 97,98 peptide EGF au fost conjugate cu NPs de aur acoperit cu polimer care au fost codificate cu reporteri QSY. PN-urile au identificat cu succes CTC în sângele periferic al a 19 pacienți cu carcinom cu celule scuamoase ale capului și gâtului, cu un interval de sensibilitate de la 1 la 720 CTC pe ml de sânge integral.

Fig. 6 Detectarea dispersiei Raman cu suprafață îmbunătățită (SERS) a celulelor tumorale circulante. (A) Schema NP-urilor conjugate cu peptide EGF. (B) Spectrele SERS ale diferitelor numere de celule canceroase introduse în proba de celule albe din sânge. (C) Spectrele SERS ale unei probe de sânge incubate cu PN-uri vizate și nevizate. Reprodus din ref. 98.

Alte tehnici de identificare și separare a celulelor includ utilizarea nanotehnologiei biomimetice, care profită de procesele naturale. Grupul Hong a investigat abordările biomimetice pentru a dezvolta dispozitive microfluidice pentru identificarea și separarea celulelor. Aceste dispozitive exploatează procesul natural de rulare celulară, care rezultă din interacțiunile adezive dintre moleculele de selectină exprimate pe venulele endoteliale și receptorii glicoproteinelor de pe celulele canceroase. 99 Recent, procesul de laminare a celulei folosind E-selectin a fost aplicat la detectarea CTC pentru sensibilitate și specificitate sporite ale suprafeței. 100 Dendrimeri poli (amidoaminici) (PAMAM) de generația a șaptea (G7) au fost de asemenea utilizați pentru a proiecta suprafețe de captare a celulelor pentru legarea simultană a mai multor liganzi la receptori multipli (legare multivalentă). Combinațiile biomimetice ale efectului multivalent mediate de dendrimer și laminarea celulelor au îmbunătățit semnificativ captarea de suprafață a CTC.

4.2 Nanoparticulele ca agenți de imagistică

NP-urile anorganice, cum ar fi QD, sunt printre cele mai promițătoare etichete fluorescente pentru imagistica celulară. QD-urile pot emite lumină de lungimi de undă specifice și, de asemenea, pot fi reglate pentru a emite în regiunea NIR a spectrului, în care autofluorescența țesuturilor este redusă și penetrarea luminii de excitație a crescut. 110 QD monofuncționalizate au fost utilizate pentru a urmări proteinele individuale din celulele 111 și receptorii implicați în mișcarea celulelor în timpul dezvoltării și metastazelor. 112 QD-uri au fost utilizate pentru imagistica biomarkerilor tumorali specifici, cum ar fi utilizarea QD-urilor NIR conjugate cu peptide arginină-glicină-acid aspartic (RGD) pentru direcționarea integrinei αvβ3. 113 QD-uri vizate au fost, de asemenea, studiate pentru capacitatea lor de imagistică multiplex, care implică imagistica simultană a multor ținte moleculare folosind diferite QD-uri care utilizează lungimi de undă de emisie diferite. Recent, QD-urile au fost aplicate pentru imagistica moleculară multiplexă a ganglionilor limfatici, 114 celule stem embrionare, 115, precum și a celulelor tumorale și a vasculaturii. 116.117

NP-urile aurii au fost studiate ca o modalitate neinvazivă pentru imagistica in vivo a cancerului folosind molecule organice mici ca reporteri SERS în infraroșu apropiat (NIR). Recent, NP-urile de aur conjugate cu anticorpi au fost utilizate împreună cu un reporter de cianină sensibil și stabil care a fost dezvoltat și selectat dintr-o bibliotecă combinatorie de reporteri SERS pentru detectarea tumorilor HER2-pozitive în modelele de xenogrefă. 118 Alte eforturi recente de imagistică in vivo s-au îndreptat către utilizarea mai multor NPs aurii SERS țintă pentru imagistica multiplexată la modelele de șoarece. 119.120

NP-urile magnetice sunt una dintre platformele NP mai bine studiate pentru imagistica moleculară țintită. Sistemele magnetice de imagistică NP au arătat potențial pentru vizualizarea în timp real a evenimentelor biologice, cum ar fi migrarea / traficul celular, activitățile enzimei 121-123, 124 și alte interacțiuni biologice la nivel molecular și celular. 25 de PN magnetice au arătat, de asemenea, o utilizare promițătoare ca agenți de contrast în imagistica prin rezonanță magnetică (RMN), o tehnică biomedicală bazată pe rezonanța magnetică nucleară a diferitelor nuclee care interacționează. SPION-urile, formate din cristale de oxid de fier acoperite cu dextran sau carboxidextran, sunt agenți de contrast RMN utilizați pe scară largă pentru imagistica cancerului. 20 Când s-a injectat la pacienți, s-a demonstrat că SPION-urile rămân în tumori 24 de ore după injectare, comparativ cu 1 oră pentru agenții MR pe bază de gadolinium. 125 Această diferență se datorează absorbției mai ușoare a NP de către tumoare și difuzivității mai scăzută a NP în afara tumorii.

Multe studii au investigat utilizarea SPION-urilor pentru detectarea țintită a tumorilor și a metastazelor acestora. 126–129 SPION-uri au fost, de asemenea, direcționate către celulele canceroase fără a utiliza liganzi care vizează. Într-un studiu, s-a demonstrat că o coajă de proteină feritină cu lanț greu uman recombinant conținând IONP-uri a vizat celule tumorale care supraexprimă receptorul transferinei 1. 130 Miezul oxidului de fier a catalizat și oxidarea substraturilor peroxidazei în prezența peroxidului de hidrogen pentru a produce o reacție de culoare. care este folosit pentru a vizualiza țesuturile tumorale. Într-un alt studiu, investigatorii au asamblat SPION-urile și peptidele de țintire pe o schelă virală modificată pentru a crește numărul SPION-urilor care ajung la celulele tumorale. 129 reziduuri de acid glutamic au fost introduse în stratul proteic al M13, un virus care infectează bacteriile. Reziduurile încărcate negativ au promovat ansamblul electrostatic al NP-urilor de-a lungul structurii filamentoase a stratului M13. Învelișul viral a fost, de asemenea, redat pentru a afișa o peptidă care vizează glicoproteina SPARC, care este supraexprimată în diferite tipuri de cancer. Comparativ cu abordările tradiționale în care NP-urile sunt funcționalizate direct cu liganzi de direcționare, această abordare poate amplifica contrastul atunci când se efectuează imagistica MR.

NP noi cu proprietăți magnetice avansate au fost, de asemenea, urmărite pentru vizualizarea evenimentelor biologice. O astfel de clasă este NP de ferită dopată cu metal, cu o compoziție de MFe2O4, unde M este +2 cation al Mn, Fe, Co sau Ni, pentru a regla proprietățile magnetice specifice. 127 MnFe2O4 S-a constatat că NP-urile sunt non-toxice in vitro și posedă cea mai mare susceptibilitate magnetică, ceea ce sugerează că ar putea face sonde RMN mai bune. Când acești NP au fost conjugați cu anticorpi, au arătat o sensibilitate sporită la RMN pentru detectarea markerilor de cancer. Alte platforme NP au fost combinate cu SPION-uri, inclusiv dendrimeri (magnetodendrimeri) 123 și lipozomi (magnetolipozomi). 131 Aceste SPION au fost utilizate pentru aplicații precum monitorizarea migrației celulelor sau vizualizarea măduvei osoase in vivo. 132

4.3 Nanoparticulele ca vehicule de livrare

PN-urile oferă o soluție potențială la provocările din livrarea siRNA. Lipidele cationice sau NP-urile polimerice au fost utilizate pentru transportul acizilor nucleici anionici în celule datorită capacității lor de a forma un complex condensat cu acizi nucleici. 136 Acest lucru le stabilizează și le protejează de degradarea enzimatică. Materialele cationice pot ajuta, de asemenea, NP-urile să scape de sechestrarea în endozomi / lizozomi. Grupuri precum azotii din polietilenimina polimerică cationică (PEI), care devin protonate în mediul pH al endozomilor / lizozomilor, pot facilita evadarea endosomală prin creșterea Cl aflux ca răspuns la protonație la pH acid. Rezultatul este o creștere a presiunii osmotice și a umflăturilor, ceea ce duce la explozia de organite și la eliberarea PNS siRNA. Acest fenomen este denumit „efectul buretelui proton”. Cu toate acestea, un studiu recent a arătat că livrarea de siRNA într-un sistem NP lipidic cationic a fost substanțial redusă, deoarece aproximativ 70% din siRNA internalizat a fost reciclat în mediul extracelular datorită ieșirii NP lipidice din endosomii / lizozomii tardivi. 137 Astfel, livrarea siRNA ar putea fi îmbunătățită prin proiectarea de noi vehicule NP care pot scăpa de căile de reciclare. Metodele active de direcționare a absorbției non-endocitice a livrării NP de acizi nucleici au fost, de asemenea, explorate folosind peptide fuzogene și peptide penetrante celulare. 138 Pentru a înțelege mai bine interacțiunile siRNA NP cu sistemele biologice, sondele siRNA au fost utilizate pentru a studia traficul intracelular 139, precum și asamblarea și dezasamblarea siRNA NPs. 140

Recent, NP-urile au fost folosite pentru a elibera siARN pentru a reduce la tăcere genele din celulele imune, deoarece aceste celule pot avea roluri esențiale în homeostază și boală. 141 Într-un studiu, NP-urile au fost utilizate pentru a reduce în mod selectiv ciclina D1 (CyD1), o moleculă de reglare a ciclului celular, în leucocite in vivo pentru a determina rolul exact al moleculei în inflamația intestinului. 141 NPs au fost încărcate cu CyD1 siARN și funcționalizate cu anticorpi la β7 integrină. Studiul a dezvăluit că aceste NPs vizate au redus la tăcere CyD1 în leucocite și au inversat colita indusă experimental la șoareci prin suprimarea proliferării leucocitelor și a expresiei citokinei celulei T helper 1. Un alt raport recent a descris, de asemenea, utilizarea lipidelor NP pentru livrarea in vivo a ARNsi pentru a reduce la tăcere genele bolii din celulele imune. 142 Studiul a demonstrat silențierea mediată de ARNsi în tipurile de celule mieloide de primate neumane și a stabilit fezabilitatea de a viza mai multe ținte genetice în celulele mieloide de rozătoare. Potențialul terapeutic a fost validat utilizând siARN care vizează factorul de necroză tumorală-α (TNFα). Un alt studiu a folosit NPs pentru a explora mecanismele imunologice care declanșează steatohepatita nealcoolică (NASH). 142 Anchetatorii au descoperit că TNFα produs de celulele Kupffer poate declanșa dezvoltarea NASH prin producția sporită de chemokine IP-10 și MCP-1. Mai mult, mutarea TNFα în celulele mieloide a redus producția de chemokine și a împiedicat dezvoltarea NASH, sugerând potențialul TNFα ca țintă terapeutică nouă în NASH.

NP-urile au fost, de asemenea, utilizate ca vehicule pentru a livra siARN în celulele vegetale pentru a studia căile celulare la nivelul celulei unice. 143 Un grup a folosit NPs polimerice conjugate cu amină ca vehicule pentru a furniza siARN care vizează gene specifice din calea biosintezei celulozei. Au descoperit că NtCesA-1, un factor implicat în sinteza peretelui celular în plante întregi, joacă, de asemenea, un rol esențial în regenerarea peretelui celular în protoplastele izolate.

Capacitatea de a modifica cu ușurință și de a funcționaliza NP-urile a dus la un interes recent în utilizarea acestor vehicule pentru a livra agenți la organele subcelulare. PN-urile vizate se pot lega de țintele localizate pe suprafața celulei și pot intra în celulă prin endocitoză. Cu toate acestea, dacă ținta este localizată intracelular, NP-urile și încărcătura lor ar putea să nu poată atinge ținta de interes din cauza sechestrării intracelulare a NP-ului sau din cauza lipsei capacităților de direcționare subcelulară.În special, NP-urile care poartă oligonucleotide trebuie să scape de endozom și apoi să fie vizate pentru a fi eficiente. Apar instrumente pentru țintirea subcelulară eficientă pentru livrarea țintită către nucleu, 146 citosol, 147 mitocondrii, 148 endozomi, 149 și lizozomi. 150 În general, sunt cercetate două abordări pentru proiectarea NP-urilor pentru direcționarea subcelulară: (1) direcționarea pasivă a NP-urilor către un anumit organet prin caracteristici variabile ale NP, cum ar fi dimensiunea, forma și compoziția 151 și (2) direcționarea activă a NP-urilor la organelul de interes prin funcționalizarea suprafețelor NP cu liganzi de țintire direcționați către organet. Aceste abordări au fost aplicate cu diferite niveluri de succes.

Obstacolele în direcționarea sub-celulară cu succes includ bariere biologice specifice organitei țintă. De exemplu, NP-urile vizate către nucleu trebuie să intre în membrana celulară, să scape de căile endozomale-lizozomale, să posede o modalitate de a interacționa cu complexul porilor nucleari și să fie suficient de mici pentru a traversa membrana nucleară. 146 Liganzi de direcționare, cum ar fi semnalul de localizare nucleară (NLS), au fost folosiți pentru a spori livrarea nucleară prin mecanismul de transport activ. 152 Într-un studiu, localizarea NLS conjugat NPs de aur la nucleul unei celule canceroase a deteriorat ADN-ul. 152 În schimb, într-un alt studiu, NLS-urile conjugate din aur nu au reușit să țintească nucleul celulelor din afara membranei plasmatice, deoarece nu au putut intra în celule sau au fost prinși în endozomi. În schimb, NP-urile conjugate atât cu NLS, cât și peptidele endocitozei mediate de receptor (RME) au ajuns în nucleu. 153

Pentru NP-urile vizate mitocondriile, barierele biologice includ transportul intracelular către mitocondrii și membranele mitocondriale exterioare și interioare și toxicitatea. 154 Până în prezent, majoritatea studiilor au dezvoltat în principal oxid de metal sau NPs lipozomale pentru livrarea către mitocondrii. Livrarea către mitocondrii sa bazat, de asemenea, pe interacțiuni electrostatice între NP și organet. Mitocondriile au un potențial de membrană negativ în comparație cu alte membrane celulare, ceea ce poate duce la acumularea de cationi lipofili. 155 Acest concept a fost utilizat în fabricarea lipozomilor direcționați cu stearil trifenil fosfoniu (STPP) cu agenți anticanceroși ceramidă 156 și scarleol 157 pentru a viza mitocondriile. STPP a fost ales deoarece prezintă atât proprietăți cationice, cât și lipofile. Un alt grup a folosit un sistem NP polimeric pentru a livra terapeutice care acționează mitocondriile la destinația lor. 158 PN-urile au fost sintetizate cu un cation lipofil trifenilfosfoniu (TPP), despre care se știe că se traversează în spațiul matricei mitocondriale. Prin screening-ul in vitro al unei biblioteci de NPs cu sarcină și dimensiune variabilă, grupul a identificat un NP vizat optimizat care a îmbunătățit eficacitatea și a scăzut toxicitatea pentru cancer, boala Alzheimer și obezitate în comparație cu NP-uri nevizate sau terapeutica cu molecule mici. 158

4.4 Efectele biologiei asupra PN

Recent, s-a demonstrat că absorbția NP de către celule in vitro poate fi influențată de faza ciclului celular. 104 Studiul a constatat că NP-urile internalizate de celule nu sunt exportate din celule, ci sunt împărțite între celulele fiice atunci când celula se divide. Rezultatele pot avea implicații pentru eliminarea sau acumularea NP in vivo. Un alt studiu recent a demonstrat că starea imunitară globală, cum ar fi echilibrul citokinelor Th1 – Th2 și macrofagelor M1 – M2, poate afecta și procesul de eliminare a NP. 105 Anchetatorii au arătat că tulpinile de șoarece care sunt predispuse la răspunsuri imune Th1 au eliminat NP-urile la o rată mai mică decât șoarecii predispuși Th2. Macrofagele izolate din tulpinile Th1 au preluat, de asemenea, mai puține particule in vitro decât macrofagele din tulpinile Th2. Rezultatele au fost confirmate la macrofagele derivate din monocite umane, sugerând că reglarea imunitară globală poate afecta clearance-ul NP la om.

Datorită dimensiunilor mici și a efectului EPR, NP-urile sunt adesea vizate pasiv sau activ către tumorile canceroase. 106 Cu toate acestea, clearance-ul și distribuția NP pot depinde, de asemenea, în mare măsură de vasculatura tumorii. Jain și colegii săi au sugerat că vasele de sânge scurte și slab organizate ale tumorilor canceroase pot duce la o creștere a presiunii lichidului interstițial în interiorul tumorilor, reducând aportul de sânge către acestea și afectând astfel livrarea agenților către tumori. 107 Au arătat că repararea vaselor anormale din tumorile mamare, prin blocarea receptorului-2 al factorului de creștere endotelial vascular, îmbunătățește livrarea de NP mai mici (12 nm), în timp ce împiedică livrarea de NP mai mari (125 nm). De asemenea, a fost explorat rolul altor proteine, cum ar fi TGF-β în normalizarea vasculaturii tumorale pentru livrarea de NP în tumori. S-a constatat că blocajul TGF-β scade semnificativ creșterea tumorii și metastaza la șoareci. De asemenea, a crescut recrutarea și încorporarea celulelor perivasculară în vasele de sânge tumorale, a crescut fracția vaselor perfuzate și a scăzut conținutul de colagen I al matricei interstițiale tumorale. Anchetatorii au descoperit că, ca urmare a normalizării vaselor și a matricei interstițiale, blocada TGF-β a îmbunătățit absorbția intratumorală a terapiei NP, ducând la un control mai bun al creșterii tumorii.

4.5 Nanoparticule pentru studierea proceselor biologice

Platformele NP pot permite, de asemenea, perturbarea locală a activităților proteice în celule la o scară subcelulară. În special, NP-urile magnetice pot fi acoperite cu un strat de suprafață biocompatibil care poate fi funcționalizat cu liganzi care vizează receptori specifici de suprafață celulară, care apoi pot fi activați de la distanță prin câmpuri magnetice aplicate. Într-un studiu recent, investigatorii au folosit această abordare pentru a studia modul în care activarea mediată de NP a căilor de semnalizare specifice poate duce la modificări ale răspunsurilor celulare. 161 NP-urile magnetice sunt atașate cu proteine ​​active de semnalizare și pot fi deplasate de forțe magnetice în diferite locații ale celulei. Odată ce aceste NP-uri conjugate cu proteine ​​sunt inserate în celule, ele leagă proteinele partenere de suprafețele lor și stimulează local căile de transducție a semnalului. Această strategie a fost aplicată membrilor Rho-GTPases, un set de comutatoare moleculare cunoscute pentru a regla morfologia celulară. S-a constatat că semnalul Rac1 mediat de NP induce polimerizarea actinei în zonele protrusive ale celulelor, în timp ce în celelalte zone ale celulei nu s-a observat polimerizarea actinei indusă de NP, sugerând că Rac1 se asociază cu un alt partener pentru a polimeriza actina în regiunile cu activitate ridicată a membranei. Anchetatorii au demonstrat că activarea mediată de NP a căilor de semnalizare ar putea duce, de asemenea, la o modificare locală a morfologiei celulare și remodelarea citoscheletului actinic. Astfel, strategiile utilizate în acest studiu ar putea fi utilizate pentru a îmbunătăți înțelegerea modului în care alte biomolecule sunt modulate spațial și integrate la nivel celular.

Utilizarea NP magnetice pentru controlul căilor de semnalizare celulară a fost demonstrată într-un alt studiu realizat de Cheon și colegii săi. 162 Grupul a arătat că NP-urile magnetice funcționalizate ar putea activa semnalizarea celulelor apoptozei atunci când se aplică un câmp magnetic. Comutatorul magnetic dezvoltat a constat din IONP dopate cu zinc conjugate cu un anticorp care vizează receptorul de moarte 4 (DR4) al celulelor cancerului de colon DLD-1. Când s-a aplicat un câmp magnetic pentru a agrega IONP-uri conjugate cu DR4 legate de receptorii de suprafață celulară, a fost promovată o cale de semnalizare a apoptozei. Acest control magnetic al apoptozei a fost demonstrat in vivo folosind pește zebră ca organism model. IONP-urile pot fi, de asemenea, utilizate pentru a activa celulele și pentru a regla de la distanță producția de proteine. 163.164 Stanley și colegii săi au folosit IONP-uri conjugate anti-His pentru a se lega de un canal TRPV1 marcat cu epitop modificat. Canalul TRPV1 sensibil la temperatură a fost activat cu încălzirea locală a IONP-urilor anti-His legate, rezultând activarea unui Ca 2+ -promotor sensibil care a stimulat sinteza și eliberarea insulinei bioinginerate. Acest rezultat, împreună cu scăderea glicemiei a fost confirmat in vivo cu șoareci care exprimă gena insulinei bioinginerate. Anchetatorii au mai arătat că celulele pot fi proiectate pentru a sintetiza NP de feritină codificată genetic și pentru a elibera insulină. Utilizarea IONP-urilor în tehnici neinvazive pentru manipularea celulelor oferă potențial un instrument util pentru cercetarea de bază în biologie.

Alte platforme anorganice NP au arătat, de asemenea, potențial ca instrumente de reglare a activităților celulare cu control spațial și temporal. Recent, NP-urile de aur cu absorbție infraroșie au fost utilizate ca întrerupătoare optice ale interferenței genelor și au fost controlate de la distanță folosind lumina. 165 Tehnica a presupus funcționalizarea NP-urilor cu oligonucleotide dublu catenare și la momente specifice și locații intracelulare, iluminarea NIR a fost utilizată pentru încălzirea fototermală a NP-urilor de aur, determinând denaturarea oligonucleotidelor cu catenă dublă la temperatura lor de topire și eliberarea oligonucleotidelor antisens de la transportatori.

La scară macroscopică, organizarea spațială a celulelor în cultura celulară poate fi importantă în cercetarea biologică de bază. Deoarece activitățile celulare din cultura de celule 2D convenționale diferă de cele găsite in vivo, multe eforturi s-au concentrat asupra dezvoltării culturii de celule 3D pentru un microambient mai relevant din punct de vedere fiziologic. Recent, Pasqualini și colegii săi au raportat o abordare inovatoare a culturii de țesut 3D bazată pe levitația magnetică a celulelor cu un hidrogel format din NP-uri de aur, IONP și particule de fag derivate din M13 care afișează liganzi care vizează integrina. 163 Prin controlul spațial al câmpului magnetic, autorii au reușit să controleze geometria masei celulare și să producă gruparea concentrată a diferitelor tipuri de celule în co-cultură. De asemenea, au descoperit că celulele cu glioblastom uman levitate magnetic au prezentat profiluri similare de expresie a proteinelor cu cele observate la xenogrefele tumorale umane. Rezultatele indică faptul că levitația magnetică a celulelor poate fi o metodă utilă pentru recapitularea expresiei proteinei in vivo fără utilizarea unui mediu specific, schele sau matrice proiectate.


Nanoparticule deghizate în celule roșii din sânge pentru a furniza medicamente care luptă împotriva cancerului

Cercetătorii de la Universitatea din California, San Diego au dezvoltat o metodă nouă de deghizare a nanoparticulelor sub formă de celule roșii din sânge, care le va permite să se sustragă sistemului imunitar al organismului și să livreze medicamente împotriva cancerului direct către o tumoare. Cercetările lor vor fi publicate săptămâna viitoare în ediția timpurie online a Lucrările Academiei Naționale de Științe.

Metoda presupune colectarea membranei de pe o celulă roșie din sânge și înfășurarea ei ca o mantie puternică de camuflare în jurul unei nanoparticule de polimer biodegradabil, umplută cu un cocktail de medicamente cu molecule mici. Nanoparticulele au o dimensiune mai mică de 100 nanometri, aproximativ aceeași dimensiune ca un virus.

Aceasta este prima lucrare care combina membrana celulelor naturale cu o nanoparticula sintetica pentru aplicatii de livrare de droguri. a spus Liangfang Zhang, profesor de nanoeningeering la Școala de Inginerie UC San Diego Jacobs și la Centrul de Cancer Moores UCSD. Aceasta platforma de nanoparticule va avea un risc redus de raspuns imun.

Cercetătorii lucrează de ani de zile la dezvoltarea sistemelor de administrare a medicamentelor care imită comportamentul natural al organismului pentru o administrare mai eficientă a medicamentelor. Aceasta înseamnă crearea de vehicule precum nanoparticulele care pot trăi și circula în corp pentru perioade îndelungate fără a fi atacate de sistemul imunitar. Celulele roșii din sânge trăiesc în organism timp de până la 180 de zile și, ca atare, sunt „vehiculul de livrare cu circulație lungă a naturii”, a declarat studentul lui Zhang Che-Ming Hu, doctor în UCSD. candidat la bioinginerie și primul autor pe hârtie.

Nanoparticulele stealth sunt deja utilizate cu succes în tratamentul clinic al cancerului pentru a furniza medicamente pentru chimioterapie. Acestea sunt acoperite cu un material sintetic, cum ar fi polietilen glicol, care creează un strat de protecție pentru a suprima sistemul imunitar, astfel încât nanoparticulele să aibă timp să-și livreze sarcina utilă. Zhang a spus că vehiculele sigure de livrare a medicamentelor cu nanoparticule de astăzi pot circula în corp ore întregi, în comparație cu minutele pe care o nanoparticule le-ar putea supraviețui fără această acoperire specială.

Dar, în studiul lui Zhang, nanoparticulele acoperite în membranele celulelor roșii din sânge au circulat în corpurile șoarecilor de laborator timp de aproape două zile. Studiul a fost finanțat printr-un grant de la Institutul Național de Sănătate.

O trecere la medicina personalizată

Folosirea propriilor celule roșii din sânge marchează o schimbare semnificativă în concentrare și o descoperire majoră în domeniul cercetării personalizate privind livrarea medicamentelor. Încercarea de a imita cele mai importante proprietăți ale unei celule roșii din sânge într-un strat sintetic necesită o înțelegere biologică aprofundată a modului în care funcționează toate proteinele și lipidele pe suprafața unei celule, astfel încât să știți că imitați proprietățile potrivite. În schimb, echipa lui Zhang ia doar întreaga membrană de suprafață dintr-o celulă roșie reală.

„Am abordat această problemă din punct de vedere ingineresc și am ocolit toată această biologie fundamentală”, a spus Zhang. „Dacă celula roșie din sânge are o astfel de caracteristică și știm că are ceva de-a face cu membrana - deși nu înțelegem pe deplin exact ce se întâmplă la nivel de proteine ​​- luăm doar întreaga membrană. pune mantia pe nanoparticulă, iar nanoparticula arată ca o celulă roșie din sânge. "

Folosirea nanoparticulelor pentru a elibera medicamente reduce, de asemenea, orele necesare pentru a picura lent soluțiile de medicamente de chimioterapie printr-o linie intravenoasă la doar câteva minute pentru o singură injecție de medicamente nanoparticulate. Acest lucru îmbunătățește semnificativ experiența pacientului și respectarea planului terapeutic. Descoperirea ar putea duce la o livrare mai personalizată a medicamentului, în care o mică probă de sânge al pacientului ar putea produce suficientă membrană esențială pentru a deghiza nanoparticulele, reducând riscul de răspuns imun la aproape nimic.

Zhang a spus că unul dintre pașii următori este de a dezvolta o abordare pentru fabricarea pe scară largă a acestor nanoparticule biomimetice pentru uz clinic, care se va face prin finanțare de la Fundația Națională pentru Știință. Cercetătorii vor adăuga, de asemenea, o moleculă de țintire la membrană, care va permite particulelor să caute și să se lege de celulele canceroase și să integreze tehnologia echipei pentru încărcarea medicamentelor în miezul nanoparticulelor, astfel încât mai multe medicamente să poată fi livrate în același timp.

Zhang a spus că capacitatea de a livra mai multe medicamente într-o singură nanoparticulă este importantă, deoarece celulele canceroase pot dezvolta o rezistență la medicamentele livrate individual. Combinându-le și oferind nanoparticulelor capacitatea de a viza celulele canceroase, întregul cocktail poate fi aruncat ca o bombă din interiorul celulei canceroase.


Opțiuni de acces

Cumpărați un singur articol

Acces instant la PDF-ul complet al articolului.

Calculul impozitului va fi finalizat în timpul plății.

Abonați-vă la jurnal

Acces online imediat la toate numerele începând din 2019. Abonamentul se va reînnoi automat anual.

Calculul impozitului va fi finalizat în timpul plății.


Transportul celulelor și nanoparticulelor în microvasculatura tumorii: rolul dimensiunii, formei și funcționalității suprafeței nanoparticulelor

Prin nanomedicină, se dezvoltă metode de schimbare a jocului pentru a livra molecule de medicament direct în zonele bolnave. Una dintre cele mai promițătoare dintre acestea este livrarea țintită de medicamente și agenți de imagistică prin intermediul platformelor bazate pe purtătorul de medicamente. Astfel de sisteme de eliberare a medicamentelor pot fi acum sintetizate dintr-o gamă largă de materiale diferite, realizate într-un număr de forme diferite și acoperite cu o serie de molecule organice diferite, inclusiv liganzi. Dacă sunt optimizate, aceste sisteme pot spori eficacitatea și specificitatea livrării în comparație cu cele ale sistemelor nevizate. Experimentele, modelele și simulările integrate pe mai multe niveluri au deschis ușa pentru aplicații medicale nesfârșite. Blocajele actuale în proiectarea particulelor care transportă medicamente sunt lipsa de cunoștințe despre dispersia acestor particule în microvasculatură și internalizarea lor ulterioară de către celulele bolnave (Bao și colab. 2014 J. R. Soc. Interfață11, 20140301 (doi: 10.1098 / rsif.2014.0301)). Descriem tehnici de modelare pe mai multe scale care studiază modul în care purtătorii de medicamente se dispersează în microvasculătură. Metoda cu elemente finite moleculare imersate este adoptată pentru a simula sângele integral, inclusiv plasma sanguină, celulele roșii din sânge și nanoparticulele. Cu o nouă metodă de dinamică a particulelor disipative, etapele inițiale ale endocitozei nanoparticulelor conduse de receptor pot fi înțelese în detaliu. Folosind această metodă de modelare pe mai multe scale, vom elucida modul în care dimensiunea, forma și funcționalitatea suprafeței nanoparticulelor vor afecta dispersia lor în microvasculatură și internalizarea ulterioară de către celulele vizate.

1. Introducere

O serie de bariere biofizice pot împiedica agenții circulanți să se acumuleze la locurile tumorale la niveluri satisfăcătoare. Astfel, eficiența de livrare a moleculelor de medicament, precum și a agenților de imagistică poate fi foarte scăzută. Barierele biofizice includ sechestrarea în organele sistemului reticulo-endotelial (RES) [1,2], absorbția celulară de către celulele imune [3,4], degradarea prin absorbția proteinelor (opsonizare) în fluxul sanguin [5], permeabilitate scăzută a vaselor de sânge și a presiunii lichidului interstițial advers în tumorile solide [6-10]. Prin urmare, moleculele de medicament administrate liber nu pot fi livrate eficient în locul tumorii. De exemplu, numai mai puțin de 0,1% din moleculele de medicament injectate pot fi găsite în 1 g de țesut tumoral, semnalând livrarea ineficientă a acestor molecule libere. Cu toate acestea, atunci când aceste molecule sunt încapsulate în lipozomi, acumularea lor maximă poate fi îmbunătățită cu unul sau două ordine de mărime. Astfel, deschide o nouă cale pentru purtătorii de medicamente bazate pe nanoparticule (NP) pentru a livra în mod eficient moleculele de medicament sau agenții de imagistică în locurile bolnave.

În tratamentul și imagistica cancerului, strategia standard pentru maximizarea acumulării de NP la nivelul locurilor tumorale se bazează pe efectul de permeație și retenție sporită (EPR) [11-14]. La locurile tumorale, pereții vaselor tind să fie discontinui cu fenestrații. Mărimea acestor fenestrații este de aproximativ 100-200 nm pentru șoareci, în funcție de tipul tumorii, stadiul și locația [11]. Prin urmare, NP suficient de mici (mai mici decât dimensiunea fenestrațiilor) pot ieși pasiv din vasele tumorale și se pot difuza în țesutul tumoral. Acumularea acestor NP atinge de obicei un vârf la 12-24 ore după injectare. Apoi, aceste NP trebuie stabilizate steric și rezistente la opsonizare în fluxul sanguin, pentru a permite timpi de circulație lungi (ore până la zile). Cu toate acestea, organele RES majore, cum ar fi ficatul și splina, sunt, de asemenea, caracterizate de un endoteliu fenestrat și adoptă același mecanism de sechestru a obiectelor străine circulante, adică molecule medicamentoase și NP. Astfel, nu este surprinzător, majoritatea moleculelor de droguri injectate sistemic și NP se acumulează în organele RES.În plus, ar trebui să subliniem că strategia de livrare bazată pe EPR este limitată exclusiv la terapia și imaginarea cancerului și nu oferă o metodă generală de administrare a medicamentelor, așa cum a discutat Nie [15]. Prin urmare, principiul de proiectare pentru purtătorii de medicamente a fost extins nu numai prin luarea în considerare a efectului EPR (direcționare pasivă), ci și a mediului local (direcționare activă), cum ar fi valoarea pH-ului [16,17], pentru livrarea de medicamente direcționată.

Până în prezent, există mai multe clase de NP care demonstrează proprietăți promițătoare ca purtători terapeutici, cum ar fi NP lipidice solide, lipozomi, puncte cuantice, dendrimeri și micele polimerice. Prin încărcarea moleculelor de medicament în aceste PN, biodistribuția, farmacocinetica și toxicitatea lor pot fi îmbunătățite dramatic, în comparație cu omologii lor administrați liber [19-21]. Cu toate acestea, acumularea acestor PN în siturile bolnave este încă nedorit de scăzută și poate fi îmbunătățită. Pentru a rezolva această problemă, există multe strategii dezvoltate pentru a proiecta purtători de medicamente eficienți pe bază de NP [22-24]. De exemplu, direcționarea vasculară a fost propusă ca o strategie generală pentru a spori concentrația de NP și a moleculelor de medicament asociate, în țesutul bolnav. În acest caz, NP-urile injectate sunt decorate cu porțiuni de țintire (liganzi) care recunosc în mod specific și se leagă ferm de receptorii specifici supra-exprimați pe pereții anormali ai vaselor [25-27].

Proprietățile fiziochimice ale NP, cum ar fi dimensiunea, forma, funcționalitatea suprafeței și rigiditatea (parametrii 4S), pot afecta clearance-ul biologic al acestora [18,23,24,28,29]. Prin urmare, NP-urile pot fi modificate în diferite moduri pentru a-și prelungi timpul de circulație [13,14]. În ultimele decenii, proiectarea NP pentru aplicații biomedicale a fost avansată prin studierea răspunsurilor lor biologice. Evoluția purtătorilor NP a urmat progresele în înțelegerea modului în care parametrii 4S le afectează eficacitatea. După cum se arată în figura 1, există trei generații de PN dezvoltate pentru aplicații biomedicale [18,23]. În prima generație de NP-uri, acestea sunt funcționalizate cu chimii de suprafață de bază (sarcini / liganzi) și sunt evaluate prin biocompatibilitatea și toxicitatea lor. Cu toate acestea, aceste PN sunt instabile și de obicei interiorizate de celulele imune (macrofage) în timpul circulației. Pentru a depăși aceste probleme, în a doua generație, suprafețele NP sunt altoite cu lanțuri polimerice, îmbunătățind solubilitatea lor în apă și permițându-le să evite agregarea și opsonizarea. În comparație cu prima generație, a doua generație de NP demonstrează o stabilitate și o direcționare îmbunătățite în sistemele biologice. Cu toate acestea, direcționarea activă a acestor NP către celulele tumorale sau alte celule bolnave este încă dezamăgitoare. Astfel, NP-urile din a treia generație mută paradigma de proiectare de la materiale stabile la materiale „inteligente” și ecologice, cu capacități de direcționare îmbunătățite. Modificările locale de mediu (adică valoarea pH-ului) determină modificarea proprietăților acestor NP într-un mod prescris. Aici ar trebui să subliniem că, deși proiectarea NP-urilor trece de la prima generație la a treia generație, NP-urile din prima și a doua generație au încă multe aplicații în diferite domenii, dar comportamentele lor sunt încă slab înțelese. Mai mult, o înțelegere cuprinzătoare a NP-urilor din prima și a doua generație ne va ajuta să proiectăm eficient NP-urile din a treia generație, care vor fi urmărite în acest studiu.

Figura 1. Evoluția proiectării nanoparticulelor cu proprietățile și provocările biologice ale acestora. MPS, EPR și PEG denotă un sistem fagocitar mononuclear, permeație și retenție sporită și, respectiv, polietilen glicol. Consultați textul principal pentru mai multe discuții. Adaptat din [18]. (Versiune online color.)

Când purtătorii de medicamente pe bază de NP sunt injectați în fluxul sanguin, aceștia vor experimenta mai mulți pași importanți în timpul călătoriei lor de viață pentru a fi livrați în locul bolnav [28]: (i) microcirculație cu globule roșii (globule roșii), globule albe din sânge (WBC), trombocite și multe altele în fluxul sanguin, (ii) absorbție fermă de către peretele vasului în jurul situsului tumorii, (iii) difuzare către locul tumorii și (iv) recunoaștere și absorbție de către celulele tumorale. Datorită complexității procesului de administrare a medicamentelor, este de obicei dificil să se urmărească comportamentele NP pas cu pas în acest proces și să se înțeleagă comportamentele acestora. Dimpotrivă, odată cu progresele în modelarea computațională, comportamentele NP-urilor din fluxul sanguin și interacțiunile lor cu celulele bolii pot fi cuantificate mai exact [18,28,30-32]. Prin urmare, mecanismele fizice detaliate care stau la baza livrării de medicamente mediate de NP pot fi înțelese prin aceste simulări, care vor fi utile în ghidarea proiectării NP cu eficacitate ridicată.

Această lucrare este organizată după cum urmează. Secțiunea 2 rezumă cunoștințele actuale despre livrarea de medicamente mediate de NP, concentrându-se pe transportul NP-urilor în fluxul sanguin și internalizarea ulterioară a acestora de către celulele bolnave. Efectele dimensiunii și formei NP vor fi explorate în continuare prin intermediul simulărilor imersate cu elemente finite moleculare (IMFEM) în §3. Secțiunea 4 va demonstra modul în care forma PN și funcționalizarea suprafeței le vor influența comportamentele de internalizare. În cele din urmă, §5 încheie prezentul studiu și discută direcțiile viitoare de cercetare cu progresele în modelarea pe mai multe scale.

2. Starea cunoașterii

2.1. Dinamica vasculară a nanoparticulelor

2.1.1. Comportamentul de marginare a nanoparticulelor

Sângele este o suspensie densă de celule deformabile în plasmă, cu eritrocite cuprinzând aproximativ 35-45% din volum, în timp ce globulele și trombocitele ocupă mai puțin de 1%. Fracția de volum a eritrocitelor se numește hematocrit. În vasele mari, datorită ratelor de forfecare ridicate, sângele poate fi modelat pur și simplu ca un fluid newtonian. Cu toate acestea, în microcirculație și în apropierea pereților vaselor, dinamica de transport, rulare și aderență a NP este afectată de prezența globulelor roșii. În special, este bine documentat faptul că globulele roșii în mișcare rapidă tind să împingă lateral globulele și NP circulante, afectând astfel dinamica și depunerea peretelui [26,33]. Prin urmare, în microcirculație și în apropierea pereților vaselor, importanța potențială a efectelor non-newtoniene justifică o investigație atentă.

În experimente, se constată că diferite componente din fluxul sanguin, inclusiv globulele roșii, globulele, trombocitele și NP-urile, se separă în condiții fiziologice normale [34,35]. RBC-urile tind să migreze departe de peretele navei și să se concentreze în mijlocul navei. Astfel, în apropierea peretelui vascular se formează un „strat fără celule”, care are o grosime de aproximativ 1 µm [36]. Cu toate acestea, globulele, trombocitele și unele dintre NP preferă să migreze în acest „strat fără celule”. Acest comportament se numește „marginare”. În eliberarea medicamentului mediată de NP, moleculele medicamentului pot fi livrate mai eficient către tumoare prin comportamentul de marjare a NP-urilor, ceea ce crește interacțiunea NP-urilor cu peretele vascular. Acest lucru permite PN-urilor să „simtă” mai bine anomaliile biofizice și biologice, cum ar fi prezența fenestrațiilor sau expresia receptorilor specifici, pe suprafața celulelor endoteliale. Ulterior, NP poate adera ferm la peretele vasului sub flux, dacă forțele hidrodinamice sunt echilibrate prin interacțiunile adezive interfațiale dintre NP și peretele vasului. Interacțiunea adezivă poate fi specifică, adică formarea de legături ligand-receptor și nespecifică, adică interacțiuni van der Waals, electrostatice și sterice. Marginarea și adeziunea ulterioară a NP-urilor la endoteliu permit NP-urilor să transmigreze pe peretele endotelial și să intre într-o zonă bolnavă de țesut, livrând în cele din urmă moleculele medicamentului. Prin urmare, indiferent de mecanismul de țintire (specific sau nespecific), un purtător eficient de medicament ar trebui să poată migra în „stratul fără celule” de la locul tumorii, maximizând astfel interacțiunea sa cu peretele vascular tumoral.

2.1.2. Efectele parametrilor 4S asupra înclinației de marjare

Înclinarea marginării depinde de parametrii 4S ai NP. Efectele acestor parametri asupra marginării NP sunt rezumate în tabelul 1. Mărimea NP este un parametru important în proiectarea purtătorilor de medicamente. PN-urile mai mici de 10 nm vor fi curățate de fluxul sanguin prin rinichi sau prin extravazare de la o tumoare [49]. Cu toate acestea, PN-urile mai mari de 200 nm prezintă riscul de a fi filtrate de ficat sau splină sau distruse de măduva osoasă. Charoenphol și colab. [40] au studiat efectul dimensiunii NP utilizând sfere cu diametre cuprinse între 0,5 și 10 µm în sânge. Se constată că înclinația de marginare crește odată cu diametrul sferei. Recent, Lee și colab. [38] a explorat efectul de dimensiune NP prin combinat in vivo și in Silicon studii, utilizând polistiren sferic NP cu diametre de 10–1000 nm. Simularea și rezultatele experimentale confirmă faptul că PN-urile mai mari (mai mari de 500 nm) pot migra în „stratul fără celule”, în timp ce PN-urile mai mici (mai puțin de 200 nm) sunt în mare parte prinse între RBC în regiunea de bază. Cu toate acestea, până în prezent, nu există un consens cu privire la o dimensiune optimă a NP pentru marjare [31,34,37,38,40].

Tabelul 1. Rezumatul efectelor parametrilor 4S asupra marginării NP.

Marginarea și aderența diferitelor NP-uri au fost teoretice și experimentale (in vitro) studiat. Au fost comparate NP sferice, cvasiemisferice și discoidale [34,35]. NP-urile discoidale subțiri prezintă viteze de derivație laterale (rata de migrație) mai mari decât alte NP, sub influența forțelor hidrodinamice [34,35]. Aceste rezultate indică faptul că PN-urile discoidale subțiri interacționează mai probabil cu peretele vascular. Unele dintre teoretice, in vitro și in vivo Rezultatele experimentale au arătat că particulele subțiri discoidale pot adera mai ferm la pereții laterali sub flux de forfecare în comparație cu particulele sferice și cilindrice subțiri [26,50,51]. Se observă că NPs discoidale subțiri oferă o suprafață mai mare de aderență și o secțiune transversală mai mică, ducând la forțe hidrodinamice mai mici și la o interacțiune adezivă mai mare. În mod similar, Gentile și colab. [35] au constatat că NP-urile în formă de disc și emisferice au migrat mai mult comparativ cu omologii lor sferici. Mai mult, nanorodurile de aur prezintă o înclinație de marjare mult mai mare decât nanosferele de aur, după cum a arătat Toy și colab. [37]. Dovezile demonstrează în mod clar că forma NP poate afecta dramatic dinamica lor vasculară.

Efectul rigidității NP a fost explorat prin marginarea WBC. Freund a studiat amestecul de globule roșii și globule în flux [45]. Când rigiditatea globulelor eritrocitare a fost mărită cu un factor de 10, modificarea observată a înclinației de marjare a globulelor eritrocitare a fost neglijabilă. Astfel, autorul a concluzionat că deformabilitatea eritrocitelor nu afectează comportamentele de marginare ale eritrocitelor. Kumar & amp Graham [46] au modelat o suspensie diluată de capsule elastice sub un flux de forfecare simplu. În contradicție cu rezultatele raportate de Freund [45], au descoperit că particulele rigide (cum ar fi WBC) tind să se margineze, în timp ce particulele moi („floppy”) (cum ar fi RBC) se acumulează în apropierea centrului canalului [46]. Ulterior, au studiat un sistem care conțin ambele tipuri de particule și au constatat că particulele rigide și moi imitau comportamentul globulelor și globulelor în fluxul sanguin [47]. Marginarea particulelor rigide este atribuită coliziunilor eterogene dintre aceste particule [48]. Recent, deformabilitatea (rigiditatea) particulelor și efectul acesteia asupra transportului în circulația sângelui a fost remarcată de grupul DeSimone [52]. Ei au adoptat abordarea PRINT, care este similară cu strategia hidrogel-șablon, pentru a demonstra că microparticulele deformabile (5 µm) cu formă concavă pot circula mai mult decât omologii lor rigizi [52].

Prin simulările Monte Carlo, Wang & amp Dormidontova [53,54] au studiat legarea dintre un NP sferic legat de liganzi și o suprafață a celulei plane cu receptori mobili. Mărimea nucleului NP, densitatea grefei, lungimea legăturii și procentul de funcționalizare de către liganzi s-au dovedit a juca roluri importante în afinitatea de legare a NP pentru suprafața celulei. Radhakrishnan și colegii săi [55,56] au dezvoltat o metodă Monte Carlo pentru a calcula energia liberă de legare între NPs funcționalizate și suprafețele celulelor endoteliale. Rezultatele obținute demonstrează că există o densitate critică a anticorpilor, sub care afinitatea de legare scade dramatic. Toate aceste rezultate demonstrează rolul important jucat de proprietățile de suprafață ale NP, adică lanțurile altoite și lungimea lor, densitatea altoirii și densitatea ligandului. În plus, se constată, de asemenea, că forma și dimensiunea NP-urilor au o influență mare asupra rezistenței adezivului [26,50]. Astfel, studierea afinității de legare între NP și peretele vasului sub influența combinată a parametrilor 4S și a fluxului de forfecare este esențială pentru a înțelege pe deplin mecanismele care controlează eficacitatea administrării medicamentului [57].

Deși au fost efectuate studii experimentale ample pentru a înțelege efectul parametrilor 4S ai NP asupra eficacității lor de administrare a medicamentelor, au fost raportate multe rezultate contradictorii pentru condiții variate. De exemplu, Toy și colab. [37] a măsurat marginea NP sferice cu diametre cuprinse între 60 și 130 nm într-o soluție fără sânge. Au descoperit că PN-urile mai mici s-au difuzat mult mai repede decât PN-urile mai mari datorită mișcării browniene [21]. Cu toate acestea, printr-un combinat in vivo și in Silicon studiază, Lee și colab. [38] au constatat că 1 µm NPs au prezentat în apropierea dispersiei peretelui, în timp ce 200 nm NPs au fost distribuite aleatoriu în vasul de sânge când RBC erau prezente. PN-urile mai mici par a fi prinse în spațiile dintre RBC-uri, încetinind difuziunea lor către peretele vascular și sugerând că PN-urile mai mici nu pot fi întotdeauna mai bune. Diferitele rezultate raportate de aceste studii sunt induse de hematocrit diferit. Pentru a rezolva controversele de mai sus și pentru a oferi o imagine unificată a modului de proiectare a NP-urilor eficiente, trebuie să creăm o metodă de calcul multi-scară pentru studierea transportului vascular și a depunerii NP-urilor cu diferite proprietăți 4S, în aceleași condiții fiziologice relevante, cum ar fi diametrul vasului, forfecarea rata și hematocritul.

2.2. Internalizarea nanoparticulelor

După ce NP se apropie de suprafața celulelor tumorale, trebuie internat pentru a furniza moleculele de medicament atașate în interiorul celulei. Acest proces, așa-numita „endocitoză”, implică mai mulți pași importanți: (i) NP-urile sunt legate specific de membrana celulară, (ii) NP-urile sunt înfășurate de membrană și se formează un complex NP legat de membrană, (iii) se formează un endosom în stadiu incipient datorită ciupirii membrului înmugurit și (iv) eliberării endosomale a NP în timpul etapei tardive a endosomului. Rețineți că endocitoza este, de asemenea, un proces important pentru celule pentru a internaliza molecule mici, cum ar fi proteinele și alte macromolecule.

Mărimea și forma NP-urilor au fost identificate ca doi parametri cheie pentru a controla comportamentele lor de internalizare [58-60]. Aoyama și colegii săi au explorat efectul de dimensiune al endocitozei în regiunea subvirală, utilizând punctul cuantic lipofil CdSe acoperit cu oxid de trioctilfosfină [59]. Comparând PN-urile cu diametre diferite, adică 5, 15 și 50 nm, au găsit un efect dramatic de dimensiune, deoarece mai târziu, Chan și colegii săi au studiat în mod sistematic efectul dimensiunii NP utilizând Au PN-uri cu diametre diferite de la 10 la 100 nm [ 60]. Timpul de absorbție al Au NPs cu diametre de 14, 50 și 74 nm este de 2,1, 1,90 și respectiv 2,24 ore. Din nou, ei descoperă că Au NP-urile cu diametrul de 50 nm pot fi preluate cel mai eficient de către celulele bolnave. Astfel, atât cinetica cât și concentrațiile de saturație ale NP pot fi puternic influențate de dimensiunile lor fizice. De asemenea, au explorat efectul potențial al formei NP folosind NP sferice și de tip tijă. Se consideră că absorbția NP depinde de forma, iar absorbția NP-urilor de tip tijă este mai puțin eficientă decât omologii lor sferici [60]. De exemplu, cu 500 și cu 375% mai multe NP sferice de 74 și 14 nm pot fi internalizate de celule decât NP-uri de tipul bastonului de 74 × 14 nm, respectiv. Alte studii arată că curbura locală a NP-urilor non-sferice controlează cinetica endocitară atunci când NP-urile se apropie de suprafața celulei [61,62].

Pentru a înțelege dimensiunea și efectele formei NP, s-au urmărit atât studii teoretice, cât și computaționale în ultimii ani [63-68]. Lucrarea de pionierat realizată de Gao și colab. [63] subliniază că endocitoza NP se bazează pe concurența dintre îndoirea membranei și difuzia receptorilor liberi la locul de andocare atunci când NP se apropie de suprafața celulei. Prin urmare, atât NP-urile mici, cât și cele mari nu pot fi preluate eficient din cauza barierei energetice a îndoirii membranei și, respectiv, a limitării receptorilor liberi. Modelul lor teoretic prezice dimensiunea optimă a NP de aproximativ 25-50 nm [63], ceea ce este de acord cu observațiile experimentale anterioare. Cu toate acestea, datorită procesului cinetic complex implicat în timpul endocitozei NP non-sferice, studiul teoretic poate fi folosit doar pentru a explica calitativ efectul formei NP. Mai multe informații au fost dezvăluite prin simulări moleculare la scară largă (de exemplu [67,69-71]). Aceste rezultate ale simulării arată că NP sferice sunt cei mai eficienți purtători care trebuie acceptați de celulele bolnave. Energia de îndoire a membranei este motivul principal pentru care NP-urile non-sferice sunt mai puțin eficiente pentru a fi livrate în celula bolnavă. Cinetica endocitozei joacă un rol important în proiectarea purtătorilor de medicamente. De exemplu, eficacitatea purtătorilor de medicamente nu depinde doar de câte persoane, ci se bazează și pe cât de repede pot intra în celula bolnavă. După cum s-a demonstrat în prezentul studiu, atât proprietatea suprafeței NP cât și forma pot afecta dramatic cinetica endocitară, care ar trebui luată în considerare la proiectarea purtătorilor de medicamente.

În ultimii ani, rigiditatea NP-urilor a fost, de asemenea, recunoscută ca un parametru cheie pentru controlul cineticii lor endocitice. Studiile teoretice [74], computaționale [75] și experimentale [76,77] au descoperit că NP-urile rigide pot fi mai ușor interiorizate de celule, comparativ cu omologii lor moi. Modelul teoretic dezvoltat de Yi și colab. [74] a explicat excelent modul în care rigiditatea NP-urilor le poate controla internalizarea. De exemplu, atunci când un NP moale se apropie de membrana celulei, se poate răspândi pe suprafața celulei cu un unghi mare umed. Apoi, NP extrem de răspândit introduce o mare curbură locală pe frontul de răspândire. În acest fel, endocitoza unui NP moale întâlnește o membrană foarte mare care îndoiește bariera energetică asemănătoare formei răspândite.În cele din urmă, înfășurarea cu membrană a NP moale poate fi prevenită de bariera mare de energie (tabelul 2).

Tabelul 2. Rezumatul efectelor parametrilor 4S asupra internalizării NP.

NP-uri moleculare specifice au fost dezvoltate cu scopul de a îmbunătăți acumularea specifică tumorii. Suprafața acestor NP este acoperită cu molecule de ligand capabile să recunoască și să lege receptorii exprimați pe celulele țintă [72]. În ciuda extraordinarei lor in vitro eficiență, această abordare a demonstrat un succes limitat in vivo. Motivele potențiale includ modificări ale afinității de legare a ligandului, imunogenitatea ligandului și constrângeri asupra prezentării ligandului, în special pe NP-uri mici cu suprafață limitată. Ca rezultat, țintirea tumorii cu NP-uri moleculare specifice rămâne controversată, așa cum au subliniat Nie și colegii de muncă [15,73]. Prin urmare, proiectarea funcționalității suprafeței NP este încă o provocare, care trebuie explorată în detaliu.

3. Transportul vascular al nanoparticulelor prezis prin metoda cu elemente finite moleculare imersate

3.1. Model și metodologie

IMFEM [78-83] este un cadru de calcul pentru a trata simultan interacțiunile fizice relevante în mediile biologice [80,84,85], inclusiv interacțiunea fluid-structură (FSI) [82,86,87], interacțiunea celulă-celulă [81,88,89], fluctuația termică [78,79,90], electrocinetica [83,91,92], comportamentul auto-asamblării [79,93-95] și alte efecte mezoscale și moleculare [96]. În această lucrare, IMFEM va fi utilizat pentru a simula fluxul sanguin, precum și microcirculația NP. În acest caz, eritrocitele deformabile vor fi scufundate într-un fluid newtonian, reprezentând plasma sanguină. Microcirculația NP din sânge va fi analizată în funcție de parametrii 4S și de condițiile vasculare locale, adică diametrul vasului și viteza de curgere. Apoi, interacțiunile celulă-celulă, celulă-NP și NP-NP vor fi explicate în mod explicit așa cum este descris mai jos și vor fi cuplate cu un domeniu fluid Eulerian în cadrul IMFEM. NP-urile sunt tratate ca solide lagrangiene în domeniul fluidului eulerian, așa cum este descris în figura 2. Forțele FSI sunt calculate pe suprafețele RBC și NP și apoi distribuite pe domeniul fluidului înconjurător printr-o funcție delta Dirac sau prin metoda de reproducere a particulelor de nucleu (RKPM) [97,98]. Ecuația de bază pentru fluidul eulerian este ecuația Navier-Stokes, care poate fi rezolvată direct de un rezolvator de fluid. Mișcarea RBC și NP este determinată de forțele hidrodinamice și de fluctuațiile termice, precum și de interacțiunile acestora.

Figura 2. Cadrul matematic pentru metoda cu elemente finite moleculare imersate, care se bazează pe un rezolvator de ecuații Navier-Stokes. Ecuația structurală este tratată ca o forță de interacțiune fluid-structură distribuită în domeniul fluidului prin funcția de reproducere a metodei particulelor de nucleu. (Versiune online color.)

Forma inițială a RBC este o discoidă biconcavă cu profilul său de secțiune transversală definit printr-o expresie matematică [81]. Deformarea eritrocitelor este definită de o funcție de energie a tensiunii hiperelastice, Mooney – Rivlin. Proprietățile materiale ale membranei RBC au fost calibrate din rezultatele experimentale privind tensiunea uniaxială a unui singur RBC [99], așa cum este dat în figura 3. Interacțiunea RBC-RBC este descrisă de un potențial de tip Morse, care a fost teoretic furnizat de Neu și colab. [100.101]. Pentru a preveni suprapunerea dintre RBC și NP în simulări, adoptăm un potențial Lennard-Jones pentru interacțiunile RBC-NP și NP-NP [31,38]. Pentru a capta corect natura multifazică a amestecurilor plasmă-celulă-NP, interacțiunile lor sunt, de asemenea, cuplate cu ecuația Navier-Stokes pentru domeniul fluid. Forțele de interacțiune sunt calculate pentru fiecare element de pe suprafețele RBC-urilor sau NP-urilor utilizând o distanță de tăiere pentru a determina ce elemente ale celulelor din apropiere se află în domeniul de influență. Forțele de interacțiune sunt integrate pe suprafața din domeniul afectat. Forțele calculate pe suprafețele RBC și NP sunt distribuite pe domeniul fluidului înconjurător prin RKPM [97,98]. Aceste FSI sunt, de asemenea, incluse în ecuațiile de mișcare pentru domeniul fluidului. După rezolvarea ecuațiilor de guvernare, vitezele domeniului fluidului sunt interpolate pe suprafețele RBC-urilor și NP-urilor, ceea ce asigură starea limită de alunecare pe suprafețele RBC-urilor sau NP-urilor. Aici ar trebui să subliniem că, deși domeniul fluidului este modelat ca un fluid newtonian, comportamentul non-newtonian în microcirculație apare din amestecul multifazic de RBC și NP și este captat corect prin simulările noastre IMFEM.

Figura 3. Validarea metodei cu element finit imersat pe o singură eritrocită (RBC): (A) comportamentul de deformare a RBC sub tensiune uniaxială, (b) deformarea RBC de-a lungul direcțiilor de tracțiune și transversale atunci când este sub tensiune uniaxială și (c) comportamentul de călcare a rezervorului RBC sub un flux de forfecare (viteza maximă de forfecare este de 100 µm s –1). Ipotezele experimentale și rezultatele în (A) și (b) sunt reproduse cu permisiunea de la [99]. Comportamentul de călcare a rezervorului RBC sub fluxul de forfecare a fost observat în experimente de [102]. (Versiune online color.)

Simularea IMFEM a fluxului sanguin a fost validată și verificată prin comparații cu următoarele experimente: (i) deformarea RBC de-a lungul direcțiilor de tracțiune și transversale atunci când se află sub tensiune uniaxială [99], (ii) comportamentul de călcare a rezervorului RBC sub un fluxul de forfecare [102.103], (iii) descărcarea hematocritului din vas [104], (iv) descărcarea hematocritului din vas [104] și (v) grosimea stratului fără celule la diferiți hematocriți [105.106], ca discutat în studiul nostru recent [38]. Pentru toate aceste cazuri, rezultatele experimentale sunt în acord cu simulările noastre, susținând acuratețea și validitatea abordării propuse. După validarea modelului și metodelor, coeficientul dispersiei radiale Dr a PN-urilor care reglează acumularea lor aproape de perete în vasele de sânge pot fi determinate prin simulările IMFEM. Pentru un număr dat de PN, N, coeficientul de dispersie Dr este definit ca

3.2. Efectele dimensiunii și formei nanoparticulelor asupra comportamentului microcirculației

Pentru a înțelege efectul mărimii NP asupra comportamentului său de microcirculație, 100 NP rigide, sferice cu diametru egal (variind între simulări de la 20 la 1000 nm) sunt distribuite aleatoriu în capilar în configurațiile inițiale, așa cum este descris în figura 4. În condițiile fiziologice normale condiții, constatăm că deformarea RBC modifică câmpul de flux local înconjurător. Mai exact, eritrocitele deformate sunt împinse de peretele vasului și tind să se acumuleze în centrul vasului de sânge, ducând la formarea unui „strat fără celule”. Câmpul de flux local modificat din jurul globulelor roșii modifică dramatic comportamentele de microcirculare ale NP-urilor (cf. figura 4). Când diametrul NP-urilor este mai mare de 500 nm, NP-urile sunt împinse departe de centrul vasului de sânge, din cauza căderii RBC-urilor. Astfel, NP-urile mari migrează în „stratul fără celule” și tind să se acumuleze în apropierea peretelui vasului. Un astfel de comportament de marjare a NP-urilor mari imită globulele și trombocitele în timpul circulației. Când diametrele NP-urilor sunt mai mici de 500 nm, ele pot rămâne în spațiul dintre RBC în timpul circulației. Interesant este că NP-urile distribuite în centrul vasului de sânge nu pot scăpa, deoarece mișcările lor sunt blocate de RBC. Coeficienții de dispersie radială Dr de PN de diferite dimensiuni sunt de asemenea calculate în timpul simulărilor. Dr de NP cu diametre de 1000 nm se găsesc a fi de șase ori mai mari decât cele de 100 nm NP, indicând rolul important jucat de dimensiunea PN.

Figura 4. (A) Configurația inițială a globulelor roșii deformabile (globule roșii deformabile) și a particulelor rigide sferice dispersate într-un capilar de 20 × 60 µm. Un profil de viteză parabolică este atribuit la secțiunea de intrare cu o viteză maximă de 100 µs -1. (b) Câmpul de curgere complex se formează în jurul particulelor, în vecinătatea globulelor roșii. Adaptat din [38]. (Versiune online color.)

Concentrația eritrocitelor se joacă, de asemenea, un rol important în acest proces. De exemplu, traiectoriile NP de 100 și 1000 nm într-un capilar cu hematocriți diferiți, și anume 0, 15 și 30%, sunt date în figurile 5 și 6. În mod clar, în absența eritrocitelor (0% hematocrit), NP urmează curenții fără o derivație laterală apreciabilă, indiferent de dimensiunea PN. Cu toate acestea, pentru cazul cu 15 și 30% hematocriți, se constată că mișcările laterale pentru NP se abat de la regiunea centrală și se deplasează spre linia mediană. Cele mai mari și mai rapide fluctuații de-a lungul direcției radiale a vasului au fost observate pentru NPs mici (100 nm în diametru), la hematocritul inferior (15%). Într-adevăr, cu o fracție de volum RBC mai mică, distanța de separare între celulele adiacente este mai mare și NP-urile se pot deplasa mai ușor prin celulele circulante, ducând astfel la o dinamică NP mai agitată. În ansamblu, aceste rezultate demonstrează în continuare că PN-urile mai mari, sub-micrometre și micrometre pot fi excluse mai eficient de miezul navei, împinse lateral de RBC-urile în mișcare rapidă, în timp ce cele mai mici PN ar beneficia mult mai puțin de acest mecanism de excludere și ar rămâneți închis cu miezul vasului pentru o perioadă mai lungă de timp.

Figura 5. Trajectorii pentru particule sferice cu diametrul de 100 nm într-un capilar cu hematocriți diferiți: (A) 0%, (b) 15% și (c) 30%.

Figura 6. Trajectorii pentru particule sferice cu diametrul de 1000 nm într-un capilar cu hematocriți diferiți: (A) 0%, (b) 15% și (c) 30%.

Pentru a cuantifica dispersia efectivă a NP în timpul microcirculației, introducem în continuare coeficientul efectiv de dispersie radială, definit ca Dr/DB, Unde DB este coeficientul de difuzie al NP indus de mișcarea browniană. Conform relației clasice Stokes – Einstein, avem

Unde kB și T sunt constanta Boltzmann și respectiv temperatura, d este diametrul particulelor și η este vâscozitatea fluidului. Apoi, coeficienții efectivi de dispersie radială pentru NP cu diametre de 100 și 1000 nm pot fi obținuți și sunt dați în figura 7A cu hematocriți de 15%. Raportul efectiv de dispersie Dr/DB este mai mare pentru NP-urile din miezul vasului și redusă pentru NP-uri în „stratul fără celule”. Comparativ cu NP-urile de 1000 nm, raportul de dispersie efectiv este întotdeauna mai mic pentru NP-urile de 100 nm, ceea ce indică faptul că NP-urile de dimensiuni mai mari sunt mai eficiente. Mai mult, contribuția RBC la dispersia NP mai mici este relativ mică. În cele din urmă, efectul de formă NP poate fi explorat prin aceeași metodă. După cum se arată în figura 7b, pot fi studiate diferitele PN formate, cum ar fi sfera, capsula și elipsoidul, iar viteza lor de deriva laterală este calculată. Se constată că NP în formă de elipsoid se îndepărtează mai eficient de regiunea centrală a navei. Vor fi urmărite studii suplimentare pentru a înțelege în detaliu efectul formei NP.

Figura 7. (A) Coeficienți de dispersie radială eficienți pentru particule cu diametrul de 100 și 1000 nm cu hematocrit de 15%. (b) Viteza de derivare a diferitelor particule de formă într-un capilar cu 30% hematocrit. (Versiune online color.)

4. Simulare moleculară privind internalizarea nanoparticulelor

4.1. Model și metodologie

Pentru a studia comportamentul de internalizare a NP-urilor, adoptăm metoda dinamicii disipative a particulelor (DPD) [107.108], care poate explica cu exactitate interacțiunile hidrodinamice considerând în mod explicit moleculele de apă. În metoda DPD, o singură margelă reprezintă un grup de atomi sau molecule. Astfel, DPD poate aborda scale temporale și spațiale mai mari în comparație cu simulările moleculare clasice. În plus, interacțiunile dintre diferite specii moleculare pot fi reproduse cu acuratețe de către forța conservatoare în simulările DPD [71.109]. Ca rezultat, metoda DPD este bine potrivită pentru a studia endocitoza NP ca diferite molecule implicate.

Așa cum este prezentat în figura 8, molecula lipidică este reprezentată de H3(T5)2 model. Fiecare moleculă lipidică este formată dintr-un cap lipidic cu două cozi, format din trei perle hidrofile (H) și respectiv cinci perle hidrofobe (T). Apoi, mărgelele învecinate sunt legate între ele printr-un arc elastic simplu. Pentru a asigura liniaritatea capetelor și cozilor lipidice, se aplică un potențial de îndoire armonic pe cele trei margele adiacente. Pentru a reprezenta proprietatea hidrofilă / hidrofobă a mărgelelor de cap și coadă, parametrii de interacțiune repulsivi pentru același tip de margele sunt aceiași în timp ce a fost mărit pentru margele diferite. Apoi, moleculele lipidice se pot autoasambla într-un strat strat lipidic stabil în mediul apei. Pentru configurarea detaliată a simulării DPD, cititorii sunt consultați studiile noastre anterioare [71.109]. Pentru modelul NP, considerăm că NP este format dintr-un miez rigid cu un polimer acoperit cu suprafață [110]. Un sistem tipic de model va fi PEGylated Au NPs, cu nucleul și carcasa reprezentând Au NP și respectiv polimerul PEG. În simularea DPD, poziția relativă a perlelor de miez pentru NP este fixată luând în considerare un miez rigid. Lanțurile polimerice legate sunt destul de flexibile și hidrofile, împiedicând gruparea NP-urilor în soluție. Fiecare pereche de margele de pe un lanț de polimer legat este conectată printr-o legătură armonică cu trei margele adiacente constrânse printr-un potențial de îndoire armonic, asigurându-se că lungimea persistentă a lanțurilor de polimer este realistă. Potențialele legăturii și ale unghiului sunt calibrate prin distribuțiile statistice ale legăturii și unghiului polimerului PEG scufundat în apă, care sunt obținute prin simulările atomice [109]. În acest fel, conformația polimerilor PEG legați poate fi reprezentată cu precizie în simulările noastre DPD. Toți parametrii potențiali pentru polimerii PEG altoiți și interacțiunile acestora cu moleculele de lipide sunt raportați în studiile noastre recente [71.109]. Modelele DPD reprezentative pentru NP PEGylated sunt prezentate în figura 8. Cu aceste modele la îndemână, internalizarea NP PEGylated poate fi studiată prin simulările noastre DPD.

Figura 8. (A) H3(T5)2 model pentru molecula lipidică și bistratul lipidic corespunzător în caseta de simulare. Capetele hidrofile și cozile hidroponice ale moleculelor lipidice sunt colorate de margele albastre și, respectiv, de liniile argintii. Pentru claritate, moleculele de solvent (apă) sunt invizibile. (b) Modele pentru NP PEGylated cu lungime lanț PEG altoit N = 18, corespunzător greutății moleculare de 815 Da. Diametrul miezului NP este de aproximativ 8 nm, colorat cu galben. Lanțurile PEG altoite și porțiunile de țintire legate de capetele lor libere sunt colorate cu cyan și, respectiv, cu albastru. Pentru claritate, moleculele solventului sunt făcute invizibile. (Versiune online color.)

Aici presupunem că PN-urile au atins deja celulele tumorale în simulări. Prin urmare, endocitoza acestor NP de către celulă poate indica în mod direct eficacitatea acestor purtători de medicamente în tratarea bolii. Pentru a imita endocitoza mediată de receptor în simulările noastre, se consideră că membrana celulară conține regimuri încorporate de receptor bogat, care este situația tipică pentru celulele tumorale. Apoi, capetele libere ale lanțurilor PEG legate sunt legate covalent cu liganzi specifici, care pot recunoaște și se pot lega cu acești receptori. În acest fel, modelul nostru de simulare ar putea reproduce bine calea endocitozei mediată de receptor [71.109].

4.2. Efectele funcționalității și formei suprafeței nanoparticulelor asupra comportamentului de internalizare

Cinetica endocitică a NP-urilor PEGilate cu miez sferic este dată în figura 9. Diametrul miezului este de aproximativ 8 nm și greutatea moleculară a lanțului legat este de aproximativ 838 Da, care se încadrează în intervalul relevant din punct de vedere experimental. Datorită densității diferite de altoire a PEG, putem observa comportamente diferite cantitativ ale acestor NP PEGilate. De exemplu, când densitatea altoirii este mică, de ex. 0,2 lanțuri nm −2, NP PEGilat poate fi absorbit la suprafața membranei celulare la început. Cu toate acestea, după un timp îndelungat de simulare (mai mult de 2000 ns), PEGylated NP este încă pe suprafața membranei și nu poate fi livrat în interiorul celulei. Când densitatea altoirii a fost mărită la 1,6 lanțuri nm -2, NP PEGilat va fi înfășurat de membrana celulară la început, care este așa-numita etapă de „îndoire a membranelor”. Aceasta este urmată de stadiul de „extrudare a membranei”, deoarece prospectul superior al membranei va extruda pentru a se înfășura în jurul suprafeței NP. În cele din urmă, NP va fi complet înfășurat de membrană și va forma un complex NP-membrană. În acest fel, NP PEGylated poate fi livrat în celula bolnavă pentru livrarea țintită a medicamentului.

Figura 9. Instantanee reprezentative de simulare DPD pentru procesul de internalizare a PEGylated NP cu densități de altoire de (A) 0,2 și (b) 1,6 lanțuri nm −2. Diametrul miezului este de aproximativ 8 nm. Lungimea lanțului PEG altoit este N = 18. Se utilizează aceeași schemă de culori ca în figura 8. (Versiune online color.)

Având în vedere aceste comportamente diferite ale NP PEGylated, ne putem întreba de ce diferitele densități de altoire ale polimerului PEG joacă un rol important. În studiile noastre recente [28,71,109], s-a dezvăluit că trei modificări majore de energie liberă sunt implicate în timpul endocitozei: (i) interacțiuni specifice ligand-receptor, (ii) energie de îndoire a membranei și (iii) schimbare nespecifică a entropiei de lanțuri legate. În aceste contribuții de energie liberă, interacțiunea ligand-receptor specifică oferă forța motrice pentru NP PEGilat pentru a fi înfășurat de bistratul lipidic și în cele din urmă livrat în celulă. Cu toate acestea, schimbarea energiei îndoite și pierderea entropiei lanțurilor legate creează bariere energetice, împiedicând internalizarea NP-urilor. În acest caz, dacă forța motrice furnizată de interacțiunea ligand-receptor nu este suficient de puternică pentru a depăși bariera energetică creată de îndoirea membranei și pierderea entropiei lanțurilor legate, NP nu poate fi interiorizat. Conform argumentului de mai sus, am dezvoltat o metodă teoretică (abordarea câmpului mediu) pentru a estima pierderea de entropie a lanțurilor legate [71.109]. Se constată că schimbarea gratuită pe lanț în timpul acestui proces este de aproximativ 1kBT, Unde kB și T sunt constanta Boltzmann și, respectiv, temperatura. Când densitatea altoirii este mică, adică 0,2 lanțuri nm −2, pierderea de entropie corespunzătoare este, de asemenea, mică.Cu toate acestea, interacțiunea ligand-receptor este, de asemenea, slabă, deoarece liganzii sunt conjugați la capetele libere ale lanțurilor legate. Astfel, NP-urile PEGilate nu pot fi internalizate. Dimpotrivă, NP-urile PEGilate cu densitate mare de altoire pot fi acceptate rapid de celulă, deoarece interacțiunea ligand-receptor specifică este suficient de puternică pentru a depăși barierele energetice. Aceste observații evidențiază rolul important jucat de funcționalizarea suprafeței NP în timpul endocitozei.

Rezultatele simulării au fost, de asemenea, comparate cu studii experimentale privind absorbția J774A.1 a PEGylated Au NPs în medii fără ser, realizate de Walkey și colab. [111], așa cum se arată în figura 10. Când densitatea de altoire a polimerului PEG este mare, interacțiunea dintre NP PEGilat și membrana celulară este foarte puternică, datorită interacțiunilor directe dintre gruparea metoxi distală la capetele libere ale PEG lanțurile și proteinele sau lipidele de la suprafața membranei [111]. Cu toate acestea, când densitatea altoirii este mică, interacțiunea dintre NP PEGylated și membrana celulară devine foarte slabă. Astfel, NP-urile PEGilate cu densități mari de altoire ar putea fi ușor acceptate de celulă, în timp ce cele cu densitate mică de altoire nu pot. Toate aceste fenomene au fost confirmate prin simulări moleculare și rezultate experimentale (cf. figura 10). Cu toate acestea, NP-urile PEGilate ar putea pătrunde în celulă prin alte căi, cum ar fi endocitoza mediată de clatrin, care depășește scopul acestui studiu [106].

Figura 10. Efectul densității altoirii asupra eficienței absorbției celulare, care este proporțională cu rata de internalizare a NP-urilor PEGilate. (A) Rezultate experimentale de Walkey și colab. [111] pentru absorbția J774A.1 a NP PEGylated Au sunt prezentate pentru comparație cu rezultatele noastre DPD. (b) Imagini reprezentative de microscopie electronică cu transmisie ale distribuției intracelulare a NP Au PEGilate cu densitate de altoire de 0,96 lanțuri nm −2 și diametrul miezului de 15 nm (B1: bară de scală, 1000 nm. B2 – B4: bară de scală, 100 nm). Imaginile B1 – B4 sunt reproduse cu permisiunea de la [111]. (Versiune online color.)

Forma NP este, de asemenea, un parametru important de proiectare pentru internalizare. Așa cum se demonstrează în figura 11, diferitele PN formate prezintă cinetică endocitară diferită, deși au aceeași interacțiune ligand-receptor cu cantitate egală de polimeri PEG altoiți. NP-urile sferice, de tip tijă, cubice și de disc sunt comparate cu aceleași suprafețe pentru nucleele lor. Sub o densitate fixă ​​de altoire, 0,6 lanțuri nm −2, NP sferic poate fi cel mai eficient acceptat de celulă, urmat de NP cubice și de tip tijă, în timp ce NP de tip disc poate fi găsit doar pe suprafața membranei celulare. Se constată că energiile legate de îndoire a membranei sunt de aproximativ 8πκ, [8,12)πκ, 12πκ și 27,33πκ pentru NP sferice, cubice, cu tijă și respectiv cu discuri [71]. κ este modulul de îndoire a membranei, de ordinul 10-20 kBT [71]. Prin urmare, diferitele energii de îndoire a membranelor pentru aceste NP determină eficiența lor în timpul endocitozei.

Figura 11. Instantanee reprezentative de simulare DPD pentru procesul de internalizare a NP-urilor PEGilate cu nuclee de diferite forme: sferă, tijă, cub și disc. Toate aceste miezuri au suprafață egală. Lungimea lanțului PEG altoit este N = 30. Se utilizează aceeași schemă de culori ca în figura 8. Adaptat din [71]. (Versiune online color.)

Ar trebui să subliniem că efectul formei NP este întotdeauna evaluat ambiguu în experimente datorită interacțiunii dintre forma NP și proprietățile sale de suprafață. De exemplu, diferitele PN formate au rapoarte diferite suprafață-volum, ceea ce face dificil efectul de dimensiune discernământ de la efectul suprafeței, mai ales atunci când sunt luate în considerare doar câteva forme diferite. În plus, NP-urile cu forme diferite au un număr diferit de liganzi per lanț altoit datorită curburilor lor diferite de suprafață [112]. Pentru a clarifica efectul de formă al NP-urilor, putem stabili mai întâi dimensiunea (diametrul) NP-urilor sferice și apoi să studiem NP-ul tijei sau discului sub raport egal suprafață-volum și raport ligand-lanț grefat. Astfel de condiții definite cu precizie ne vor permite să explorăm fără echivoc efectul de formă al NP-urilor în timpul endocitozei, care este realizabil doar prin simulări pe computer.

5. Observații finale și perspectivă

În această lucrare, am demonstrat că transportul NP-urilor în microvasculatura tumorii poate fi foarte influențat de parametrii lor 4S, cum ar fi dimensiunea, forma, funcționalitatea suprafeței și rigiditatea. Microcirculația NP-urilor și internalizarea lor ulterioară de către celulele bolii pot fi înțelese prin simulări IMFEM și, respectiv, DPD. Rolurile importante jucate de parametrii 4S pot fi elucidate prin aceste simulări. Astfel, prin combinația IMFEM cu simulări DPD, călătoria de viață a purtătorilor de medicamente bazate pe NP poate fi prezisă prin abordarea noastră de modelare pe mai multe scale.

Prin aceste simulări multi-scară, mecanismele fundamentale care stau la baza livrării de medicamente mediate de NP pot fi elucidate. Aceste informații fizice detaliate pot oferi îndrumări utile în proiectarea PN. De exemplu, se constată că PN-urile de dimensiuni mai mari pot migra în „stratul fără celule” prin simulări IMFEM, în timp ce PN-urile de dimensiuni mai mici ar putea fi preluate mai eficient de celulele bolnave prin analize teoretice și simulări pe computer. Pe baza acestor observații, o platformă de livrare în mai multe etape a fost proiectată de Ferrari și colegii săi [113]. În proiectarea acestei platforme, particulele mezoporice de siliciu biodegradabile și biocompatibile sunt utilizate pentru a transporta puncte cuantice de dimensiuni nano sau nanotuburi de carbon. În timpul procesului de microcirculație, aceste particule mezoporice de siliciu pot fi acumulate mai ușor la locurile tumorale datorită EPR și a efectelor de marginare. Apoi, NP-urile transportate pot fi eliberate treptat și difuzate în celulele tumorale. Prin endocitoza mediată de receptor și alte căi, aceste PN vor fi internalizate de celulele tumorale. Comparativ cu designul tradițional al NP-urilor, această platformă cu mai multe etape a luat în considerare diferite mecanisme fizice în timpul procesului de eliberare a medicamentelor mediat de NP. Rețineți că designul tradițional al NP se bazează pe abordările lente și ineficiente „edisoniene”. Un astfel de proces consumă mult timp și este ineficient din punct de vedere al costurilor. Conform abordării modelării pe mai multe scale, proiectarea NP-urilor poate fi realizată mai ușor prin intermediul acestor simulări pe computer. În viitorul apropiat, sperăm că paradigmele de proiectare bazate pe simulare pot ghida proiectarea experimentală a NP-urilor de nouă generație, cu direcționare activă îmbunătățită, toxicitate scăzută și efecte secundare limitate.


Introducere

Complicațiile patologice ale aterosclerozei, și anume atacurile de cord și accidentele vasculare cerebrale, rămân principala cauză a mortalității la nivel mondial [1]. Deoarece ateroscleroza este în esență o boală care implică inflamația endoteliului, monostratul de celule care acoperă interiorul vaselor de sânge, o idee deosebit de promițătoare este utilizarea nanoparticulelor ca vehicule de marfă pentru livrarea țintită a agenților antiinflamatori către celulele endoteliale arteriale. Studii recente au stabilit că internalizarea nanoparticulelor în celulele endoteliale depinde de o serie de factori, inclusiv dimensiunea nanoparticulelor și funcționalizarea suprafeței [2-4]. Elucidarea bazei acestor observații este de prim interes.

O componentă critică în dezvoltarea unui sistem eficient de eliberare a medicamentelor endovasculare pe bază de nanoparticule este interacțiunea dintre particule și suprafața celulei endoteliale. Pentru a viza în mod specific celulele endoteliale inflamate la o leziune aterosclerotică, nanoparticulele pot fi acoperite cu anticorpi împotriva moleculelor de adeziune a celulelor endoteliale, cum ar fi selectinele, VCAM-1, PECAM-1 sau ICAM-1 [5]. Dintre acești receptori diferiți, molecula de adeziune intercelulară-1 (ICAM-1) este o țintă deosebit de relevantă, deoarece nivelul său de expresie în celulele endoteliale vasculare este îmbunătățit semnificativ de stimuli patologici, cum ar fi oxidanți, citokine și tensiuni anormale de forfecare mecanică a fluidelor [ 3]. Mai exact, a fost raportată o creștere de 20 până la 100 de ori a expresiei ICAM-1 în celulele activate peste celulele în repaus [6]. Internalizarea nanoparticulelor mediate de ICAM-1 în celulele endoteliale a făcut obiectul unui număr de studii experimentale recente [3, 6-10]. Nanoparticulele acoperite cu anticorpi anti-ICAM-1 activează o cale specifică de endocitoză denumită endocitoză mediată de CAM [7]. Spre deosebire de endocitoza mediată de alți receptori de membrană, endocitoza mediată de CAM necesită legare multivalentă: un singur anticorp anti-ICAM-1 nu este interiorizat de o celulă endotelială, în timp ce o particulă care poartă mai mulți anticorpi poate fi internalizată. Endocitoza mediată de CAM este dependentă de actină, dar implică utilaje de proteine ​​diferite decât endocitoza mediată de clatrin, caveoli, macropinocitoză sau fagocitoză [3, 7].

În acest articol dezvoltăm un model matematic pentru a descrie internalizarea nanoparticulelor mediate de receptor, luând în considerare în special cazul endocitozei mediate de ICAM-1. Mai multe modele teoretice de internalizare a nanoparticulelor au fost propuse anterior. Un prim grup de modele teoretice descrie internalizarea mediată de receptor a particulelor sferice și non-sferice limitate de difuzia receptorilor în membrana celulară [11-13]. Aceste modele presupun ca densitatea ligandului particulelor să fie mult mai mare decât densitatea receptorului membranei celulare, făcând astfel difuzia receptorului către zona de înfășurare a particulelor un mecanism fizic limitativ. Această ipoteză nu pare aplicabilă endocitozei nanoparticulelor mediate de ICAM-1 în celule endoteliale inflamate, unde densitatea receptorilor și a ligandilor sunt ambele de ordinul a 1000 molecule /μm 2 [14], iar difuzia receptorilor devine astfel neglijabilă. Un alt grup de modele teoretice utilizează abordări energetice pentru a descrie înfășurarea cu membrană a unei nanoparticule (a se vedea recenzia recentă a lui Bahrami și colab. [15]). Aceste modele au investigat rolul formei și orientării nanoparticulelor [16, 17], deformabilității nanoparticulelor [18] și interacțiunilor dintre mai multe nanoparticule [19, 20], dar deseori lasă deoparte rigiditatea citoplasmatică a celulei și dinamica formării legăturilor, ca precum și cinetica procesului de ambalare. Progresele recente în modelarea înfășurării unei nanoparticule de către o membrană au încorporat fluctuații termice stocastice pentru a studia cinetica înfășurării [21] sau modificările conformaționale ale proteinelor de membrană, care sunt descrise prin simulări ale dinamicii particulelor [22].

Aici dezvoltăm un nou model teoretic pentru a studia cinetica internalizării nanoparticulelor sub următoarele premise: (i) considerăm cazul în care densitatea receptorilor și a ligandului sunt comparabile, deci neglijăm difuzia receptorului (ii) includem atât îndoirea membranei, cât și deformarea viscoelastică a citoscheletului (iii) ne explicăm dinamica formării legăturilor sub forță. Spre deosebire de majoritatea modelelor teoretice anterioare, care se bazează pe formulări de energie, ne dezvoltăm modelul în termeni de echilibru de forță. Formularea noastră este inspirată de cea propusă de Dembo și colab. pentru a studia cinetica detașării unei membrane de la o suprafață [23]. Modelul nostru ne permite să înțelegem modul în care internalizarea mediată de receptor este afectată de dimensiunea particulelor, caracteristicile legăturilor, proprietățile mecanice ale celulei și forțele externe exercitate asupra nanoparticulelor.


Concluzii

Toxicitatea potențială a NP este principala problemă a utilizării lor în medicină. Prin urmare, nu numai rezultatele pozitive ale utilizării NP-urilor, ci și posibilele consecințe negative imprevizibile ale acțiunii lor asupra corpului uman, ar trebui examinate. Toxicitatea NP-urilor este legată de distribuția lor în fluxul sanguin și în fluxul limfatic și capacitățile lor de a pătrunde în aproape toate celulele, țesuturile și organele și de a interacționa cu diverse macromolecule și de a modifica structura acestora, interferând astfel cu procesele intracelulare și cu funcționarea organelor întregi. . Toxicitatea NP depinde în mare măsură de proprietățile lor fizice și chimice, cum ar fi forma, dimensiunea, încărcătura electrică și compozițiile chimice ale miezului și carcasei. Multe tipuri de NP nu sunt recunoscute de sistemele de protecție ale celulelor și ale corpului, ceea ce scade rata degradării lor și poate duce la acumularea considerabilă de NP în organe și țesuturi, chiar și la concentrații foarte toxice și letale. Cu toate acestea, sunt deja disponibile o serie de abordări pentru proiectarea PN-urilor cu o toxicitate scăzută în comparație cu PN-urile tradiționale. Metodele avansate pentru studierea toxicității NP permit analiza diferitelor căi și mecanisme de toxicitate la nivel molecular, precum și prezicerea în mod fiabil a posibilului efect negativ la nivelul corpului.

Astfel, este evident că proiectarea NP-urilor care au efecte negative mici sau deloc este imposibilă, cu excepția cazului în care toate proprietățile fizice și chimice calitative și cantitative ale NP-urilor sunt luate în considerare sistematic și nu este disponibil un model experimental relevant pentru estimarea influenței acestora asupra sistemelor biologice.


Priveste filmarea: Atividade antimicrobiana e aplicações de nanopartículas de Prata. (Decembrie 2021).