Informație

Cât ARN total poate fi extras din creierul Drosophila


Mă întreb cât de mult ARN total ar putea fi extras dintr-un singur D. melanogaster creier. Nu am putut găsi aceste informații din literatură.

Cel mai apropiat rezultat a fost această lucrare, care susține că 16-21,9µg de ARN total pot fi extrase din 100 de creiere, ceea ce se traduce la cel puțin 160ng pentru un singur creier.

De asemenea, am găsit în materialul suplimentar al acestei lucrări că 1 µg de ARN total a fost extras din 5-10 creiere cu muște, ceea ce ar face, de asemenea,> 100ng pentru un singur creier.

Îmi pun întrebarea pentru că am în vedere să execut ARN-seq de single Drosophila creier. Protocolul standard de pregătire a bibliotecii Illumina TruSeq funcționează cu 100ng de ARN total. Astfel, mă întreb dacă acest lucru este realist sau dacă ar trebui să vizez mai degrabă protocoalele de pregătire a bibliotecii cu intrare redusă.


În opinia mea, ar trebui să încercați protocoale de pregătire a bibliotecii cu intrare redusă, deoarece, din experiența mea, chiar și cu o cantitate decentă de ARN, standardizarea secvențierii nu este o treabă ușoară. Manualul spune că acest kit funcționează cu 10-20ng de ARN; presupuneți întotdeauna că limita superioară este adevărată. Există și o șansă mai mare de pierdere (relativă) în timpul extracției. Încercați să faceți precipitații cu LiCl 5M și puțin glicogen împreună cu alcool; dar presupunând că randamentul dvs. este de 80ng, puteți rula în continuare replici pentru comparații statistice.


Sondaj al transcrierilor la adult Drosophila creier

Metodele clasice de identificare a genelor implicate în funcția neuronală includ procesul laborios al screening-ului comportamental al muștelor mutagenizate și apoi reecranarea liniilor candidate pentru efectele pleiotropice din cauza defectelor de dezvoltare. Pentru a accelera analiza moleculară a funcției creierului în Drosophila am construit o bibliotecă de ADNc exclusiv din creierele adulte. Scopul nostru a fost să începem să dezvoltăm un catalog de transcrieri exprimate în creier. Se așteaptă ca aceste transcrieri să conțină o proporție mai mare de clone care sunt implicate în funcția neuronală.

Rezultate

Biblioteca conține aproximativ 6,75 milioane de clone independente. Din caracterizarea noastră inițială a 271 de clone alese aleatoriu, ne așteptăm ca aproximativ 11% din clonele din această bibliotecă să identifice secvențele transcrise care nu se găsesc în bazele de date de etichete de secvență exprimate. Mai mult, 15% din aceste 271 de clone nu se numără printre cele 13.601 prezise Drosophila gene.

Concluzii

Analiza noastră a acestui unic Drosophila biblioteca cerebrală sugerează că numărul de gene poate fi subestimat în acest organism. Această lucrare completează Drosophila proiectul genomului prin furnizarea de informații care facilitează adnotarea mai completă a secvenței genomice. Această bibliotecă ar trebui să fie o resursă utilă care va ajuta la determinarea modului în care funcționează funcțiile creierului de bază la nivel molecular.


Fundal

Reglarea post-transcripțională a expresiei genice joacă un rol esențial în numeroase procese biologice într-o varietate de tipuri de celule. Un context în care mecanismele de reglare post-transcripțională sunt deosebit de importante sunt etapele timpurii ale embriogenezei, în timpul cărora genomul zigotic este transcripțional liniștit, iar dezvoltarea este direcționată de ARNm și proteine ​​care sunt produse din genomul mamei și încărcate în ovocit în timpul oogenezei. [1]. În embrionul timpuriu, expresia genelor este controlată post-transcripțional prin reglarea traducerii, stabilității și localizării ARNm prin trans-factori de acțiune, cum ar fi proteinele care leagă ARN (RBP) și microARN (miARN), care se leagă de cis- secvențe de acțiune prezente în transcrierile țintă. Trecerea controlului dezvoltării de la produsele genetice materne la cele zigotice, denumită tranziția maternă la zigot (MZT), implică degradarea pe scară largă a ARNm derivate matern, care este mediată de două tipuri diferite de mașini de degradare, un tip dependent exclusiv de factorii derivați maternal (denumiți aici ca mașini de decădere „materne” sau „timpurii”) și celălalt tip dependent de factori exprimați zigotic (denumiți aici ca mașini „zigotice” sau „tardive”) [1,2].

Drosophila Tumora cerebrală (BRAT) joacă un rol esențial în timpul Drosophila MZT prin reprimarea traducerii materne cocoşat (hb) ARNm în partea posterioară a embrionului [3]. BRAT este un membru al familiei de proteine ​​TRIM-NHL, care sunt conservate printre metazoane. Într-adevăr, reprimarea mediată de BRAT a hb a servit ca model pentru înțelegerea mecanismelor prin care proteinele TRIM-NHL funcționează ca regulatori post-transcripționali. BRAT reglează hb expresie în cooperare cu Nanos (NOS) și familia PUF RBP, Pumilio (PUM) [3]. La embrioni din pum, brat, sau nr mame mutante, proteina HB este exprimată ectopic în partea posterioară a embrionului, ducând la pierderea destinelor celulelor abdominale și letalitatea embrionară [3-8]. Un rol pentru proteinele TRIM-NHL ca regulatori post-transcripționali și determinanți ai destinului celulei nu se limitează la Drosophila (revizuit în [9,10]). De exemplu, proteina TRIM-NHL de mamifer, TRIM71, funcționează în reprogramarea celulelor diferențiate în celule stem pluripotente induse prin capacitatea sa de a se lega și de a inhiba traducerea mRNA EGR1 [11] și un studiu recent a arătat că TRIM71 poate ambii să reprime traducerea și inducerea degradării ARNm [12].

În Drosophila, reglementarea hb traducerea de către complexul BRAT-PUM-NOS este mediată de două elemente de răspuns Nanos (NRE) în hb 3’UTR al ARNm. Fiecare NRE conține două motive de secvență, cunoscute sub numele de Caseta A și Caseta B. Motivul Caseta B se potrivește cu site-ul de legare a consensului PUM, UGUANAUA unde N = A / C / G / U și este legat direct de terminalul C al PUM Domeniul de omologie PUF, care este un domeniu conservat de legare a ARN (RBD). Un model mai vechi de explicat hb Regulamentul a propus ca PUM și NOS să ia contact direct cu NRE și unul cu celălalt, în timp ce BRAT este recrutat prin interacțiunea sa cu proteinele PUM și NOS [3,5,13-16]. Cu toate acestea, lucrări recente au demonstrat că BRAT se asociază direct cu secvențe din și în jurul hbMotivele casetei A într-o manieră independentă de PUM prin domeniul său NHL C-terminal [17]. Că TRIM56 și TRIM71 de mamifere sunt legate încrucișat de poli (A) ARN după expunerea celulelor la iradiere UV [18,19] este în concordanță cu capacitatea BRAT de a se lega direct de ARN.

Pe lângă rolul lor în reprimare hb ARNm devreme Drosophila s-a demonstrat că embrionii, PUM, BRAT și NOS cooperează în reglarea altor mARN-uri în diferite tipuri de celule. De exemplu, un complex PUM-NOS-BRAT controlează excitabilitatea neuronului motor prin legare și reglare a paralitic (para) ARNm [20], iar aceste trei proteine ​​cooperează în reglarea morfogenezei dendritei în sistemul nervos periferic larvar [21].

PUM și BRAT funcționează, de asemenea, împreună, și probabil independent de NOS, pentru a reprima nebun și dMyc mARN-uri și astfel promovează diferențierea celulelor stem ale liniei germinale în timpul oogenezei [22]. În plus, PUM și NOS pot regla ARNm independent de BRAT. De exemplu, PUM și NOS acționează împreună și fără BRAT, pentru a reglementa ciclină B ARNm în celulele germinale primordiale [3,23,24].

Experimentele efectuate pe celule de cultură tisulară au demonstrat că PUM poate media represiunea mARN-urilor reporter independent de BRAT și NOS [25]. La fel, BRAT pare să exercite funcții independente de PUM. De exemplu, pe lângă defectele dezvoltării abdominale la embrioni din brat mame mutante, mutații în brat cauzează o proliferare excesivă a neuroblastelor în creierul larvelor, ceea ce duce la producerea de creștere excesivă tumorală [26-30] care se poate metastaza după transplantul în abdomenul muștelor adulte [31]. Muște mutant pentru pumtotuși, nu împărtășesc acest fenotip de creștere excesivă a neuroblastelor, sugerând că reprezintă o funcție pentru BRAT independent de PUM. Mai mult, BRAT poate reprima transcrierile reporterului într-o manieră independentă de PUM în teste bazate pe linia celulară [17], susținând noțiunea că BRAT poate funcționa independent de PUM.

În ciuda exemplelor menționate anterior, totuși, măsura în care PUM și BRAT cooperează versus acționează independent rămâne neclară și dacă BRAT are funcții independente de PUM în reglarea țintelor endogene in vivo este incert. Mai mult, spectrul secvențelor de ARN recunoscute de BRAT nu a fost definit și gama de mecanisme pe care BRAT le folosește pentru a-și regla țintele nu a fost explorată.

Pentru a aborda aceste întrebări și pentru a identifica potențiale funcții biologice noi pentru PUM și BRAT la embrioni timpurii, am efectuat identificarea la nivelul genomului a mARN-urilor asociate cu PUM și cu BRAT. Rezultatele noastre demonstrează că fiecare RBP este asociat cu sute de ARNm la embrioni timpurii, dintre care mai puțin de o treime sunt corelate de ambele RBP. În plus, atât prin analiza computațională a mARN-urilor asociate BRAT, cât și in vitro , am identificat un motiv de consens al ARN-ului legat de BRAT, a cărui semnificație funcțională a fost confirmată folosind teste de reporter luciferază în Drosophila celule de cultură tisulară. Analiza pe termen a ontologiei genice (GO) a funcțiilor ARNm-urilor asociate cu PUM și BRAT sugerează o serie de roluri biologice noi pentru PUM și BRAT la embrionii timpurii. Analiza stării tradiționale și a stabilității țintelor ARNm PUM și BRAT arată că: (1) țintele ambelor RBP sunt reprimate translațional (2) Țintele PUM sunt degradate în principal în faza târzie a MZT și (3) ARNm asociate BRAT sunt degradat atât în ​​fazele timpurii, cât și în cele tardive. În concordanță cu un rol pentru BRAT atât în ​​represiunea translațională, cât și în degradarea transcriptului, un ARNm-reporter luciferază care poartă site-uri de legare BRAT este supus ambelor forme de reglementare. Un in vivo rolul pentru BRAT în degradarea ARNm a fost verificat printr-o analiză a transcriptomului embrionilor lipsiți de proteina BRAT funcțională, care a relevat că BRAT mediază degradarea a sute de ARNm materni în timpul MZT, ca parte atât a decăderii „timpurii”, cât și „tardive” utilaje. Luate împreună, rezultatele noastre oferă primele informații despre rolul BRAT ca regulator global al degradării ARNm în timpul MZT prin legarea directă la un număr mare de transcrieri materne.


Metode

Disponibilitatea protocolului.

O instrucțiune detaliată pas cu pas este furnizată ca protocol suplimentar și este, de asemenea, accesibilă de la Protocol de schimb 21 .

Drosophila țesutul cerebral și pregătirea.

Linia de zbor Pdf-GAL4 era de la Renn și colab. 22 pJFRC4-3XUAS-IVS-mCD8 :: GFP, pJFRC5-5XUAS-IVS-mCD8 :: GFP și pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8 :: GFP au fost de la Pfeiffer și colab. 17. Mi1 (55C05-p65ADZp (attP40) 71D01-ZpGdbd (attP2)), Mi4 (48A07-p65ADZp (attP40) 79H02-ZpGdbd (attP2)) și Mi9 (48A07-p65ADZp (attP40) VT046779-ZpGdbd (attP2)) liniile de driver split-GAL4 sunt descrise în Strother și colab. 12. UAS-myr :: HaloTag era de la Kohl și colab. 13. Noi am folosit w 1118 muște care altfel erau de tip sălbatic sau atemporal experimente. Pentru a genera zborurile de titrare PDF-GFP, am traversat Pdf-GAL4 către stocuri care conțineau 3 ×, 5 × sau 10 × UAS-IVS-mCD8 :: GFP. Pentru linia dublă de inserție GFP, am realizat un stoc de pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8 :: GFP (attp18) :: pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8 :: GFP (attp2). Stocul a fost apoi trecut la Pdf-Gal4. Pentru a genera expresia selectivă a unui reporter HaloTag în neuroni specifici ai lobului optic, am traversat Mi1, Mi4, Mi9 către UAS-myr :: HaloTag. Muștele au fost crescute pe mediu standard de făină de porumb / agar suplimentat cu drojdie sub 12 ore de lumină / 12 ore de cicluri întunecate la 25 ° C. Muștele masculine au fost utilizate în experimentele circadiene, muștele femele altfel (vezi Tabelul suplimentar 1). Muștele adulte de 3 până la 5 zile au fost colectate, apoi disecate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și fixate în paraformaldehidă 2% timp de 55 min la 25 ° C sub iluminare normală. Pentru probele ZT14, țesuturile cerebrale au fost disecate sub iluminare cu LED roșu. Țesuturile cerebrale au suferit deshidratare înainte de a fi depozitate în EtOH 100% peste noapte. La compararea condițiilor, dimensiunile eșantionului au fost alese pentru a fi de cel puțin 3 creiere pe condiție. Analiza cantitativă a datelor a fost efectuată fără orbire sau randomizare.

Sondele oligonucleotidice 5 marcate cu amino (Biosearch Technologies) au fost marcate cu fluorofori ester NHS în conformitate cu liniile directoare ale producătorului. Pentru a efectua FISH, rehidratat Drosophila țesuturile cerebrale au fost expuse la 5% acid acetic la 4 ° C timp de 5 minute. După ce au fost fixate în paraformaldehidă 2% timp de 55 min la 25 ° C, țesuturile au fost incubate în 1 × PBS cu 1% NaBH4 la 4 ° C timp de 30 min și apoi în tampon de pre-hibridizare (15% formamidă, 2 × SSC, 0,1% Triton X-100) timp de 2 ore la 50 ° C. Țesuturile creierului au fost transferate la 50 μL de tampon de hibridizare (10% formamidă, 2 × SSC, 5 × soluție Denhardt, 1 mg / ml drojdie ARNt, 100 μg / ml, ADN de spermă de somon, 0,1% SDS) cu sonde FISH (50 –100 ng / μL per reacție, conținând seturi de sonde împotriva uneia sau mai multor gene) și incubate la 50 ° C timp de 10 h și apoi la 37 ° C pentru încă 10 h. După o serie de etape de spălare, țesuturile creierului au fost deshidratate și introduse în xilen pentru curățarea țesuturilor. O descriere detaliată a procedurilor FISH este furnizată ca protocol suplimentar.

Colorarea HaloTag și IHC.

Creierele muștelor care exprimă reporterul HaloTag au fost colorate cu HaloTag-JF646 în timpul fixării. După disecție, țesuturile cerebrale au fost transferate la 2% paraformaldehidă conținând 2 μM de HaloTag-JF646 (ref. 23). Au fost apoi incubate cu agitare timp de 55 min la 25 ° C, urmate de o serie de spălări 1 × PBS. Colorarea anticorpului a fost efectuată după etichetarea FISH. După o serie de pași de spălare, țesuturile cerebrale au fost blocate cu 10% ser normal de capră (NGS) în 1 × PBS cu 0,5% Triton X-100 (0,5% PBT) la temperatura camerei timp de 2 ore, urmată de colorarea peste noapte a anticorpului primar la 4 ° C. Soluțiile de anticorp primar și secundar conțineau 5% NGS în 0,5% PBT. Pentru colorarea anticorpului primar GFP, țesuturile au fost expuse la fracțiune policlonală anti-GFP 1: 1000 (Life Technologies A11122) pentru colorarea anticorpului primar PDF, țesuturile au fost expuse la 1: 1000 șoarece anti-PDF (Developmental Studies Hybridoma Bank, PDF C7) pentru colorarea primară nc82, țesuturile au fost expuse la 1:30 anti-bruchpilot de șoarece (Developmental Studies Hybridoma Bank, nc82). După spălarea anticorpului primar, țesuturile cerebrale au fost incubate în anticorp secundar peste noapte la 4 ° C. Pentru colorarea anticorpului secundar GFP, țesuturile au fost expuse la 1: 1000 AF488 capră anti-iepure (Invitrogen A11034). Pentru colorarea PDF și nc82 a anticorpilor secundari, țesuturile au fost expuse la 1: 1000 Cy3 AffiniPure Goat anti-mouse (Jackson ImmunoResearch 115-165-166). Țesuturile cerebrale au fost apoi fixate în paraformaldehidă 2% timp de 55 min la 25 ° C înainte de deshidratare și curățarea xilenului.

Imagine confocală.

Pentru imagistica confocală, toate țesuturile cerebrale au fost atașate la sticlă acoperită cu poli-L-lizină și montate în DPX (Janelia Adult Drosophila Protocol de montare CNS DPX). Am folosit un microscop confocal Zeiss LSM 880 (561 nm și 633 nm linii laser) imaginat printr-un obiectiv de ulei 25 × DIC NA 0.8 pentru a detecta transcripțiile GFP în constructele Pdf-Gal4JFRC5 și muștele de tip sălbatic (Fig. 1). Imaginile au fost achiziționate cu excitație secvențială sub formă de stive cu 1,5 μm z-spatiere. Câștigul detectorului și puterea laserului au fost menținute constante pentru toate probele. A detecta Gfp transcrieri în experimentele de titrare UAS, am folosit un microscop confocal Zeiss LSM 800 (linii laser de 561 nm și 633 nm) imaginat printr-un obiectiv petrolier 63 × DIC NA 1.4. Imaginile au fost achiziționate cu excitație secvențială sub formă de stive cu 1,0-μm z-spatiere. Câștigul detectorului și puterea laserului au fost menținute constante pentru toate probele. Pentru a detecta expresia suprapusă a neurotransmițătorului în liniile Gal4, am folosit un microscop confocal Zeiss LSM 880 (linii laser 488 nm, 561 nm și 633 nm) imaginat printr-un obiectiv de ulei 63 × DIC NA 1.4 cu scanare de detectare lambda hiperspectrală cu 1,00 μm z-spatiere. Imaginile de neurotransmițător multiplex au fost achiziționate pe un microscop confocal Zeiss LSM 880 (linii laser 488 nm, 561nm și 633 nm) fotografiate printr-un obiectiv de ulei 25 × DIC NA 0.8. Imaginile au fost achiziționate cu scanare de detectare lambda hiperspectrală ca stive cu 0,50 μm z-spatiere. Rezumatul parametrilor de imagine este în Tabelul 1 suplimentar.

Imaginea BB-SIM.

Imaginile BB-SIM au fost achiziționate pe un microscop personalizat, care este descris în continuare în Nota Suplimentară 1. Două obiective de excitație montate ortogonal sunt folosite pentru a forma grinzi Bessel, care sunt treptate pentru a crea o foaie de iluminare în dungi periodice X sau y, în timp ce un al treilea obiectiv (axa optică de-a lungul z direcție) detectează fluorescența (Fig. 2a). Obiectivele și eșantionul sunt scufundate în medii de imagistică (90% 1,2-diclorobenzen, 10% 1,2,4-triclorobenzen) cu indice de refracție = 1,5525, corelat cu țesutul curățat. Pentru a utiliza analiza structurată a iluminării, colectăm mai multe imagini cu modelul benzii de iluminare mutat pentru a acoperi planul X, și repetați procesul ortogonal pentru a țiglă planul y. Eșantionul este apoi mutat z, și imaginea repetată și așa mai departe pentru a imagina volumul 3D. În această lucrare, am colectat 11 imagini (faze) în X și y, setarea diafragmei inelare pentru a obține un FWHM al profilului intensității fasciculului de 350 nm în talie. Rezoluția după analiza SIM, măsurată pe margele fluorescente cu excitație de 560 nm, este de 200 × 200 × 290 nm (FWHM). Tratamentul probelor este identic cu cel pentru probele confocale prin etapa de curățare. După curățare, probele sunt montate pe lamele acoperite cu polilizină 1,5 × 3 mm și ținute în xilen până la realizarea imaginii.

Analiza imaginii.

Detaliile analizei imaginilor sunt discutate în nota suplimentară 3.

Disponibilitatea codului.

Disponibilitatea datelor.

Secvențele de sondă sunt enumerate în tabelul suplimentar 2. Toate celelalte date sunt disponibile de la autori la cerere rezonabilă.


Capitolul șaptesprezece - ARN-seq Profilarea numărului mic de Drosophila Neuroni

Drosophila melanogaster are un ceas circadian robust, care conduce un model de comportament ritmic: activitatea locomotorie crește dimineața cu puțin înainte de aprinderea luminilor (vârful M) și seara cu puțin înainte de aprinderea luminilor (vârful E). Acest model este controlat de

75 de perechi de neuroni circadieni în Drosophila creier. Un grup cheie de neuroni este celulele M (PDF + LN mari și micivs), care controlează vârful M. Un al doilea grup cheie este celulele E, formate din patru LNds și al cincilea LN micv, care controlează vârful E. Studii recente arată că celulele M au un al doilea rol, pe lângă controlul vârfului M, comunică cu celulele E (precum și DN1s) să le afecteze calendarul, probabil în funcție de condițiile de mediu (Guo, Cerullo, Chen și amp Rosbash, 2014).

Pentru a afla despre moleculele din celulele M importante pentru rolurile lor funcționale, am adaptat metode de sortare manuală a neuronilor de interes care exprimă proteine ​​fluorescente de la disociați Drosophila creier. Am izolat mARN și miARN de celule M sortate și am amplificat ADN-urile rezultate pentru a crea biblioteci de secvențare profundă. Inspecția vizuală a bibliotecilor ilustrează faptul că acestea sunt specifice unui anumit subgrup neuronal Bibliotecile de celule M conțin atemporale, iar bibliotecile de celule dopaminergice conțin ple / TH. Folosind aceste date, este posibilă identificarea transcrierilor ciclice, precum și a multor mARN și miARN specifice sau îmbogățite în anumite grupuri de neuroni.


Modificarea chimică a ARN-ului pentru funcție

Modificările chimice joacă un rol important în modificarea și reglarea funcției ADN-ului și ARN-ului. Delatte și colab. arată că, în musca fructelor, mulți ARN mesageri (ARNm) conțin baza modificată 5-hidroximetilcitozină (5hmC). Marcajul chimic este adăugat de aceeași enzimă care adaugă 5hmC ADN-ului. Deoarece mulți ARNm implicați în dezvoltarea neuronală conțin 5hmC, blocarea enzimei provoacă defecte cerebrale și este letală. In vivo, hidroximetilarea ARN promovează traducerea ARNm.


REZULTATE

Convergența neuronilor care exprimă DTK și a IPC-urilor

Antiser la gandac (Leucophaea maderae) se știe că peptida 1 legată de tahichinină (LemTRP-1) recunoaște DTK (Siviter și colab., 2000 Winther și colab., 2003). Imunomarcarea cu acest antiser a dezvăluit procese neuronale cu terminații varicoase adiacente dendritelor presupuse ale IPC, relevate de Dilp2-GFP condus de Gal4 (Fig. 1A, B). Terminările imunomarcate DTK nu fac multe contacte directe cu sucursalele IPC. Cu toate acestea, se știe că neuropeptidele semnalizează pe o anumită distanță în sistemul nervos, așa-numita transmisie a volumului sau semnalizarea paracrină (vezi Maywood și colab., 2011 Nässel, 2009 Zupanc, 1996). Nu am putut identifica neuronii individuali care dau naștere acestor procese de exprimare a DTK, dar un studiu anterior (Winther și colab., 2003) sugerează că neuronii candidați își au corpul celular în tritocerebrum. Imunocitochimia cu antiser la o secvență a receptorului DTK, desemnată DTKR, etichetează un set de corpuri celulare în pars intercerebralis care amintesc de IPC, atât la creierul adult (Fig. 1C), cât și la nivelul creierului larvelor (Fig. 1D). Din păcate, antiserul DTKR funcționează numai pe țesuturile fixate de Bouin, unde fluorescența GFP este stinsă și, de asemenea, GFP pare denaturată deoarece nici anti-GFP nu funcționează. Astfel, nu am putut efectua imunomarcarea DTKR a Dilp2-GFP bazat pe Gal4 pentru o identificare corectă. Specificitatea acestui antiser receptor a fost testată prin rularea imunocitochimiei pe creierele cu muște care exprimă DTKR în IPC prin intermediul încrucișării Dilp2-Gal4 / UAS-Dtkr-GFP. O imunomarcare puternică DTKR a fost observată în IPC-urile acestor muște (material suplimentar Fig. S1).

Nivele de Dilp transcrieri în creier după eliminarea DTKR pe IPC-uri

Deoarece procesele neuronale care exprimă DTK par să vizeze IPC-urile creierului, am testat dacă semnalizarea DTK afectează nivelurile de Dilp transcrieri în aceste celule. Eliminarea DTKR pe IPC-uri a fost realizată prin traversarea Dilp2-Gal4 driver către un UAS-DTKR-Linia ARNi. Eficacitatea UAS-DTKR-RNAi în eliminarea transcrierilor receptorilor a fost determinat anterior de PCR cantitativă în timp real (qPCR) după RNAi pan-neuronal (folosind un Elav-Gal4 driver) transcrierea DTKR a fost redusă cu aproximativ 40% (Ignell și colab., 2009). Am prelevat ARN din această cruce de muște la 0 h (muște hrănite) și 24 de ore de foame și am efectuat qPCR pentru a determina nivelurile de Dilp2, Dilp3 și Dilp5 transcrieri după eliminarea DTKR în IPC-uri.

În control zboară relativ Dilp2 și Dilp3 transcrierile nu au fost afectate în mod semnificativ de 24 de ore de foame (Fig. 2A, B), întrucât Dilp5 transcrierea a scăzut semnificativ (Fig. 2C). Knockdown-ul DTKR în IPC a afectat cele trei Dilp transcrieri diferențial, atât la muștele hrănite, cât și la cele înfometate (Fig. 2). Ambii Dilp2 și Dilp3 transcrierile au crescut semnificativ la muștele hrănite după eliminarea DTKR în IPC (Fig. 2A, B), în timp ce nivelurile de Dilp5 nu au fost afectate comparativ cu controalele (Fig. 2C). În plus, numai Dilp2 și Dilp3 nivelurile au fost afectate de înfometarea de 24 de ore la muștele knockdown DTKR. Dilp2 crește semnificativ în comparație cu muștele hrănite de același genotip și în comparație cu martorii (Fig. 2A) întrucât Dilp3 scade drastic după înfometare (Fig. 2B). Astfel, apare ca și cum ar fi transcrierea ambelor Dilp2 și Dilp3 crește după reducerea semnalizării DTK prin intermediul DTKR la muștele hrănite în mod normal și că foamea de 24 de ore scade drastic Dilp3 transcriere și crește Dilp2 când semnalizarea DTKR este redusă în IPC-uri.

Procese neuronale care exprimă Drosophila tahkininina, DTK, converg asupra celulelor producătoare de insulină (IPC) în pars intercerebralis ale creierului adult. (Ai) IPC-urile creierului sunt dezvăluite de Dilp2-Proteina fluorescentă verde condusă de Gal4 (GFP). Corpurile celulare IPC (cb) sunt localizate medial în pars intercerebralis. Presupuse dendrite (Dendr) s-au răspândit lateral în protocerebrul median dorsal. (Aii) Canalele combinate care prezintă IPC (verde) și imunomarcare DTK (magenta). În această proiecție a mai multor secțiuni optice, se vede o suprapunere între dendrite IPC și varicozități care exprimă DTK. (Aiii) Canal unic care afișează terminații axonice care exprimă DTK cu varicozități. Corpurile celulare care exprimă DTK văzute în această imagine nu sunt probabil cele care afectează IPC-urile [cele mai mici furnizează procese către complexul central (Kahsai și colab., 2010 Winther și colab., 2003)]. (Bi) Un alt specimen (un creier ușor înclinat comparativ cu A) care prezintă varicozități imunomarcate DTK (magenta) apropiate de dendritele IPC (Dendr). Această imagine este un teanc de secțiuni optice. (Bii) Secțiune optică unică a aceluiași IPC care arată unele dintre arborizările care par a fi vizate de terminații axon care exprimă DTK. (Biii) Secțiune optică unică a neuronilor care exprimă DTK care vizează IPC. Observați axonii (la săgeți) care urcă din porțiunile ventrale ale creierului (probabil din tritocerebrum) și formează terminații varicoase (Termen). (C) Antiser la receptorul DTK DTKR etichetează un set de celule neurosecretorii mediane în pars intercerebralis ale creierului adult (săgeată). Deoarece secțiunile de fixare și parafină ale lui Bouin au fost necesare pentru imunomarcarea DTKR, nu a fost posibil să se dezvăluie simultan Dilp2-GFP bazat pe Gal4. (D) Neuroni imunomarcați DTKR din creierul larvelor. Grupurile de celule indicate de săgeți pot corespunde IPC larvelor. Specificitatea antiserului DTKR este verificată în materialul suplimentar Fig. S1.

Procese neuronale care exprimă Drosophila tahkininina, DTK, converg asupra celulelor producătoare de insulină (IPC) în pars intercerebralis ale creierului adult. (Ai) IPC-urile creierului sunt dezvăluite de Dilp2-Proteina fluorescentă verde condusă de Gal4 (GFP). Corpurile celulare IPC (cb) sunt localizate medial în pars intercerebralis. Presupuse dendrite (Dendr) s-au răspândit lateral în protocerebrul median dorsal. (Aii) Canalele combinate care prezintă IPC (verde) și imunomarcare DTK (magenta). În această proiecție a mai multor secțiuni optice, se vede o suprapunere între dendrite IPC și varicozități care exprimă DTK. (Aiii) Canal unic care afișează terminații axonice care exprimă DTK cu varicozități. Corpurile celulare care exprimă DTK văzute în această imagine nu sunt probabil cele care afectează IPC-urile [cele mai mici furnizează procese către complexul central (Kahsai și colab., 2010 Winther și colab., 2003)]. (Bi) Un alt specimen (un creier ușor înclinat comparativ cu A) care prezintă varicozități imunomarcate DTK (magenta) apropiate de dendritele IPC (Dendr). Această imagine este un teanc de secțiuni optice. (Bii) Secțiune optică unică a aceluiași IPC care arată unele dintre arborizările care par a fi vizate de terminații axon care exprimă DTK. (Biii) Secțiune optică unică a neuronilor care exprimă DTK care vizează IPC. Observați axonii (la săgeți) care urcă din porțiunile ventrale ale creierului (probabil din tritocerebrum) și formează terminații varicoase (Termen). (C) Antiser la receptorul DTK DTKR etichetează un set de celule neurosecretorii mediane în pars intercerebralis ale creierului adult (săgeată). Deoarece secțiunile de fixare și parafină ale lui Bouin au fost necesare pentru imunomarcarea DTKR, nu a fost posibil să se dezvăluie simultan Dilp2-GFP bazat pe Gal4. (D) Neuroni imunomarcați DTKR din creierul larvelor. Grupurile de celule indicate de săgeți pot corespunde IPC larvelor. Specificitatea antiserului DTKR este verificată în materialul suplimentar Fig. S1.

De asemenea, am măsurat imunofluorescența relativă DILP2 în corpurile celulare ale IPC la muștele de control și muștele cu DTKR diminuată în IPC pentru a obține o estimare a nivelurilor de peptide, utilizând un protocol similar studiilor anterioare (Broughton și colab., 2010 Kaplan și colab., 2008 ). Există un nivel semnificativ mai ridicat de imunofluorescență DILP2 după eliminarea receptorului în IPC (Fig. 3).

Pentru a determina dacă semnalizarea DTK prin intermediul cei doi receptori ai săi sunt modulați de starea nutrițională pe care am testat-o NKD și DTKR transcrieri ale receptorilor prin qPCR la muștele de tip sălbatic care au fost hrănite normal sau au murit de foame timp de 24 de ore. Nu am găsit nicio modificare a nivelurilor relative ale celor două transcripții ale receptorilor din cauza foametei (material suplimentar Fig. S2). Astfel, este probabil ca puterea semnalizării DTK către IPC să fie determinată în principal de cantitatea de peptidă DTK eliberată în timpul foametei și nu de modificările nivelurilor de expresie ale receptorilor.

Knockdown DTKR în IPC scade supraviețuirea muștelor expuse la foame

Semnalizarea insulinei de la IPC-urile creierului afectează durata de viață a muștelor expuse înfometării și restricțiilor alimentare (Broughton și colab., 2005 Broughton și colab., 2010). Pentru a studia influența semnalizării DTK către IPC-uri asupra supraviețuirii în timpul foametei, muștelor experimentale li s-a permis accesul la apă, dar nu la hrană. Am determinat efectele foametei asupra duratei de viață totală și mediană (când 50% din muște au cedat) a diferitelor genotipuri.

Nivele de Dilp transcrieri la muște cu DTKR doborât în ​​celulele producătoare de insulină (IPC). Efectul DTKR knockdown în IPC-uri (Dilp2-Gal4 /DTKR-RNAi) pe Dilp expresia în creierul muștelor adulte a fost măsurată prin PCR cantitativă în timp real. Muștele hrănite (0 h) și muștele înfometate timp de 24 de ore au fost monitorizate. Datele sunt prezentate ca expresie relativă medie ± s.d. (N= 10) asteriscurile denotă o diferență semnificativă față de controale (n.s., nu semnificative, P& gt0.05 ***P& lt0.001). (A) Nivelurile relative ale Dilp2 creșterea transcrierii în muștele DTKR-knockdown comparativ cu controalele parentale, atât la muștele hrănite, cât și după 24 ore de foame (P& lt0.0001, ANOVA unidirecțional). Diferența dintre muștele DTKR hrănite și înfometate este semnificativă (P& lt0.001, ANOVA cu două căi, a lui Bonferroni post hoc Test). (B) Ruda Dilp3 abundența este mai mare la muștele care exprimă DTKR-RNAi în IPC-uri decât în ​​controale în stare alimentată (P& lt0.001, ANOVA unidirecțional). În plus, Dilp3 nivelurile de transcriere scad drastic după 24 de ore de foame la muște cu DTKR doborât. Această scădere Dilp3 este semnificativ (P& lt0.001, ANOVA cu două căi). (C) Ruda Dilp5 nivelurile de transcriere nu au diferit semnificativ de cele ale controalelor, nici la muștele hrănite, nici la cele înfometate (P& gt0.05, ANOVA cu două căi). Cu toate acestea, pentru fiecare genotip scade Dilp5 ARN după 24 de ore de foame este semnificativ (P& lt0.05 unidirecțional ANOVA). Prin urmare, Dilp5 pare a fi singurul transcript afectat semnificativ de foamete la muștele martor.

Nivele de Dilp transcrieri la muște cu DTKR doborât în ​​celulele producătoare de insulină (IPC). Efectul DTKR knockdown în IPC-uri (Dilp2-Gal4 /DTKR-RNAi) pe Dilp expresia în creierul muștelor adulte a fost măsurată prin PCR cantitativă în timp real. Muștele hrănite (0 h) și muștele înfometate timp de 24 de ore au fost monitorizate. Datele sunt prezentate ca expresie relativă medie ± s.d. (N= 10) asteriscurile denotă o diferență semnificativă față de controale (n.s., nesemnificativă, P& gt0.05 ***P& lt0.001). (A) Nivelurile relative ale Dilp2 creșterea transcrierii în muștele DTKR-knockdown comparativ cu controalele parentale, atât la muștele hrănite, cât și după 24 ore de foame (P& lt0.0001, ANOVA unidirecțional). Diferența dintre muștele DTKR hrănite și înfometate este semnificativă (P& lt0.001, ANOVA cu două căi, a lui Bonferroni post hoc Test). (B) Ruda Dilp3 abundența este mai mare la muștele care exprimă DTKR-RNAi în IPC-uri decât în ​​controale în stare alimentată (P& lt0.001, ANOVA unidirecțional). În plus, Dilp3 nivelurile de transcriere scad drastic după 24 de ore de foame la muște cu DTKR doborât. Această scădere Dilp3 este semnificativ (P& lt0.001, ANOVA cu două căi). (C) Ruda Dilp5 nivelurile de transcriere nu au diferit semnificativ de cele ale controalelor, nici la muștele hrănite, nici la cele înfometate (P& gt0.05, ANOVA cu două căi). Cu toate acestea, pentru fiecare genotip scade Dilp5 ARN după 24 de ore de foame este semnificativ (P& lt0.05 unidirecțional ANOVA). Prin urmare, Dilp5 pare a fi singurul transcript afectat semnificativ de foamete la muștele de control.

Eliminarea DTKR în IPC de către Dilp2-Gal4 /DTKR-RNAi leads to a shortening of total and median lifespan at starvation by approximately 20% compared with controls (P<0.001 log rank test, Fig. 4A). In contrast, overexpression of DTKR in the IPCs did not result in a significant change of lifespan (Fig. 4A).

To test whether the other DTK receptor NKD plays a role in IPCs at starvation, we monitored the effect of expressing UAS-NKD-RNAi or UAS-NKD cu Dilp2-Gal4 driver. Neither of these crosses led to a change in lifespan at starvation compared with controls (Fig. 4B). These results suggest that NKD is not expressed in the IPCs or at least it plays no role in the regulation of starvation responses.

DTKR knockdown in IPCs affects trehalose levels during starvation

Trehalose is a non-reducing disaccharide and is the major carbohydrate that is used as an energy source by most insects. Insulin signaling from the brain IPCs is known to regulate trehalose levels (Broughton et al., 2005 Rulifson et al., 2002). Specifically, knockdown of Dilp2 is known to increase the total trehalose content (Broughton et al., 2008). Thus, we tested total trehalose levels in flies with DTKR levels diminished in IPCs. Whole-body trehalose levels in flies of different genotypes were tested at 0 h, 5 h and 12 h of starvation. The wild-type response to starvation is a gradual decrease in trehalose levels over the 12 h starvation period. Here, the 0 h value is a measure of trehalose levels under normal fed conditions.

Knocking down DTKR in the IPCs did not affect trehalose levels in fed flies compared with controls (Fig. 5A). However, after 5 h of starvation the flies with diminished DTKR levels displayed a significantly larger drop in trehalose than controls (P<0.001, one-way ANOVA), but after 12 h levels were the same in all genotypes (Fig. 5A). Thus, the trehalose levels in DTKR-knockdown flies fell more rapidly at onset of starvation than in control flies. At starvation the trehalose is likely to be metabolized, partly due to hunger-induced hyperlocomotion, and with increased DILP signaling carbohydrates are depleted more rapidly.

DTKR knockdown in IPCs does not affect lipid content during starvation

Insects, including Drosophila, utilize lipids as fuel for prolonged exercise or in other situations of high-energy demands, as well as at times of restricted availability of nutrients (Baker and Thummel, 2007 Gäde et al., 1997 Van der Horst et al., 2001). Lipid levels in Drosophila are regulated in part by insulin signaling from brain IPCs (Broughton et al., 2005 Grönke et al., 2010), but also by AKH (Baker and Thummel, 2007 Grönke et al., 2007). Thus, we investigated whole-body lipid levels in flies with DTKR knockdown targeted to IPCs in fed conditions (0 h starvation) and after 24 h of starvation. In fed animals there is no significant difference in lipid levels between controls and DTKR-knockdown flies (Fig. 5B). After 24 h starvation there is a significant drop in lipids both in experimental and control flies (Fig. 5B). This suggests that DTK signaling to IPCs does not affect lipid levels in fed or starved flies or that such an action is masked by compensatory DILP or AKH signaling (see Grönke et al., 2010 Grönke et al., 2007).

DILP2 peptide levels in insulin-producing cells (IPCs) after DTKR knockdown in IPCs. Relative immunofluorescence was measured after DILP2 immunolabeling of IPCs in normally fed experimental flies. After DTKR knockdown (Dilp2/DTKR-RNAi) the relative fluorescence increased significantly compared with the control (P=0.004, Student's t-test N=8 brains of each genotype).

DILP2 peptide levels in insulin-producing cells (IPCs) after DTKR knockdown in IPCs. Relative immunofluorescence was measured after DILP2 immunolabeling of IPCs in normally fed experimental flies. After DTKR knockdown (Dilp2/DTKR-RNAi) the relative fluorescence increased significantly compared with the control (P=0.004, Student's t-test N=8 brains of each genotype).

DTKR knockdown in insulin-producing cells (IPCs) increases sensitivity to starvation. We tested the survival of flies with DTKR knocked down in IPCs (Dilp2/DTKR-RNAi) or with DTKR overexpressed in IPCs (Dilp2/UAS-DTKR), compared with parental controls, in a starvation assay where flies were kept on aqueous agarose. All experiments were run in triplicate. Dashed lines indicate 50% survival. (A) A significant decrease in survival was seen after knockdown of DTKR in IPCs. The median survival decreased by 20% (P<0.0001, log rank test, N=128–171 for each genotype). However, no significant difference in survival was observed in flies with DTKR ectopically expressed IPCs (P>0.05, N=128–137). (B) Neither knockdown (Dilp2/NKD-RNAi) nor ectopic expression (Dilp2/UAS-NKD) of the other tachykinin receptor, NKD, in IPCs had any effect on survival at starvation (P>0.05, log rank test, N=128–146).

DTKR knockdown in insulin-producing cells (IPCs) increases sensitivity to starvation. We tested the survival of flies with DTKR knocked down in IPCs (Dilp2/DTKR-RNAi) or with DTKR overexpressed in IPCs (Dilp2/UAS-DTKR), compared with parental controls, in a starvation assay where flies were kept on aqueous agarose. All experiments were run in triplicate. Dashed lines indicate 50% survival. (A) A significant decrease in survival was seen after knockdown of DTKR in IPCs. The median survival decreased by 20% (P<0.0001, log rank test, N=128–171 for each genotype). However, no significant difference in survival was observed in flies with DTKR ectopically expressed IPCs (P>0.05, N=128–137). (B) Neither knockdown (Dilp2/NKD-RNAi) nor ectopic expression (Dilp2/UAS-NKD) of the other tachykinin receptor, NKD, in IPCs had any effect on survival at starvation (P>0.05, log rank test, N=128–146).


Discuţie

We report here that, in adult Drosophila, ADAR edits its mRNA with 40% efficiency to encode a less active isoform. We propose that this own-transcript editing is a form of negative autoregulation. When this editing is prevented in vivo so that only the genome-encoded ADAR is expressed, then levels of total ADAR protein otherwise sufficient for phenotypic rescue become lethal. This early lethality is associated with hyperediting of sites in at least one target transcript.

Previously, it has been shown that mammalian ADAR2, which is the orthologue of Drosophila ADAR (J Brindle and LP Keegan, unpublished data), edits a 3′ splice site in its own pre-mRNA so that an additional 47 nucleotides are included in the mRNA ( Rueter și colab, 1999 ). This editing is also considered to be a negative autoregulatory mechanism due to frameshifts and inefficient translation initiation from internal methionines that lead to a reduction in protein levels from the edited transcript. Therefore, both Drosophila ADAR and ADAR2 appear to have evolved completely different own-transcript RNA editing sites to control ADAR activity. In another example of convergent evolution of RNA editing sites, the same codon change is introduced by editing at the same position in Drosophila and vertebrate voltage-gated potassium channels in different channel families ( Bhalla și colab, 2004 ).

ADAR editing requires only a short RNA duplex to target it nevertheless, the evolution of an RNA duplex within Drosophila Adar exon 7 is surprising and suggests that editing of the mature Adar mRNA may be required. Adar exon 7 probably folds into a very stable secondary structure, as editing of this minisubstrate in vitro to 70% is higher than for any other transcript so far tested in vitro. The Adar exon 7 structure that supports RNA editing is conserved in other Drosophila species but not in the mosquito (RA Reenan and MA O'Connell, unpublished data). If transient increases or decreases in ADAR activity occur in response to unknown regulatory signals in Drosophila, atunci Adar editing of mature Adar mRNA could respond immediately to restore the correct level of RNA editing. In vertebrates, modulation of ADAR2 activity in response to changes in neurotransmitter levels has been suggested ( Gurevich și colab, 2002a , 2002b ).

The conversion of serine to glycine has an unexplained dramatic effect on RNA editing activity and this requires further study. This amino acid is conserved in all ADAR2-type enzymes, whereas ADAR1-type enzymes have a conserved aspartic acid at the same position ( Keegan și colab, 2004 ) one possibility is that the serine is phosphorylated but we are unable to detect this. When the serine is mutated to aspartic acid to introduce a negative charge as found in ADAR1, dADAR is completely inactive (MA O'Connell, unpublished results). Defining the function of this serine residue in the deaminase domain awaits the crystallisation of ADAR.

As alternative splicing is critical for generating proteomic diversity, it will be important in the future to determine the functional differences between protein isoforms in an animal model. Here, we demonstrate that Drosophila is an excellent animal model to study proteomic diversity. We observe an excellent correlation between the activities of the different ADAR isoforms that have been overexpressed in yeast and assayed in vitro and their in vivo activities as tested in flies. Even though ADAR 3/4 S is very active in vitro, it is not intuitive that this would be toxic in Drosophila when it is ubiquitously expressed, considering that ADAR 3/4 G, which differs by one amino acid, has no toxic effects. It is improbable that many isoforms of other proteins will have such dramatic effects on activity in vivo however, some will. Drosophila may be the proteomics choice of model organism in future, considering the resource costs of generating equivalent numbers of transgenic mice. While the present work required a great deal of effort to overcome the variations due to position effects on transgene insertions, these limitations arising from the Drosophila transformation method may be relieved by using new genetic techniques that reduce position effects on transgene expression or that express variants from a common site in the chromosome ( Gloor, 2004 ).

În Drosophila, the number of transcripts known to be edited to cause recoding events is much greater than in vertebrates the list of vertebrate targets may now be nearly complete and includes a large amount of editing of Alu elements embedded in transcripts ( Kim și colab, 2004 Levanon și colab, 2004 ). The number of recoding sites per target transcript is also higher in Drosophila, suggesting that flies make considerable use of RNA editing as an easy and efficient method of generating proteomic diversity. RNA editing contributes to an enormous potential diversity of transcripts from the cacophony gene encoding the large, pore-forming alpha subunit of the main, non-L-type, voltage-gated calcium channel in the CNS. This protein has a critical role at synapses on axon termini where it responds to depolarising signals by allowing calcium entry to induce vesicle fusion and neurotransmitter release. Pairwise choices due to alternative splicing events identified in this study (data not shown), and previously ( Peixoto și colab, 1997 Gallo și colab, 2002 ), predict 2 5 splice forms. Pairwise choices of edited or unedited isoforms at each editing site where editing changes codon meaning could multiplex this with potentially 2 11 edited isoforms. Transcript diversity in cacophony and other RNA editing targets may not reach the full possible maximum level as is the case for the Adar transcript itself where the edited form of the Adar 3a transcript is not observed. It is not surprising that the misregulation of RNA editing that we have induced experimentally in this study, leading to this proteomic complexity being expressed at the wrong developmental stage, causes lethality.

The highest levels of editing are seen in adult flies, consistent with the Adar mutant phenotype that includes adult locomotion defects and age-dependent neurodegeneration ( Palladino și colab, 2000b Ma și colab, 2001 ). ADAR mutant phenotypes in mice and Caenorhabditis elegans also demonstrate that editing is essential for viability and for proper functioning of the nervous system ( Higuchi și colab, 2000 Palladino și colab, 2000b Tonkin și colab, 2002 Hartner și colab, 2004 Wang și colab, 2004 ). We show here that editing also normally occurs outside the nervous system in Drosophila. Loss of RNA editing in muscles may contribute to the locomotion defects in Adar mutant flies. RNA editing outside the nervous system is also necessary in vertebrates ADAR1 mutant mouse embryos undergo widespread apoptosis due to loss of editing in unknown target transcripts ( Hartner și colab, 2004 Wang și colab, 2004 ). The primary requirement for RNA editing in Drosophila may be in the abundant cholinergic neurons in the brain, consistent with efficient rescue using a Cha-GAL4 driver, with patterns of neurodegeneration seen in Adar mutants ( Palladino și colab, 2000b Ma și colab, 2001 ), and with electrophysiological measurements linking slow recovery from anoxic stupor to defects in brain interneurons ( Ma și colab, 2001 ). Also, several transcripts encoding acetylcholine receptor alpha and beta subunits are edited in Drosophila ( Grauso și colab, 2002 Hoopengardner și colab, 2003 ). Adar expression is much lower in muscle than in CNS in embryos and it is possible that toxicity arising from ADAR overexpression in embryos could be due to hyperediting of the Ca-alpha 1D transcript encoding an L-type voltage-gated calcium channel. In vertebrates, this channel class is found in muscles and has a critical role on the postsynaptic side of the neuro muscular junction where it responds to depolarisation by allowing calcium entry into muscle cells and subsequent release of calcium from intracellular stores for muscle contraction ( Catterall, 2000 ). We do not, however, know what the effects of editing on most of the channels are nor do we know which channels are critical for either rescue or hyperediting toxicity.

In this study, we describe some of the RNA editing events that we have found to be almost 100% efficient in adult flies. In mice, the GluR-B Q/R site is edited with virtually 100% efficiency. An edited GluR-B construct is able to rescue all the defects in a mouse ADAR2 mutant ( Higuchi și colab, 2000 ), and no functional requirement has been found for the unedited GluR-B isoform, which is not found even early in development. For the sites that are 100% edited in adult Drosophila, the situation is somewhat different, that is, the unedited transcripts are expressed significantly earlier in development and our results suggest that these forms are required at this stage. Lethality due to increased ADAR activity is associated with increasing editing at some sites in an embryonic ion channel transcript close to levels seen in adults. In contrast to the case of the GluR-B Q/R site, we suggest that flies require unedited and edited isoforms at different stages. It may be possible to rescue the Adar mutant phenotype in flies by expressing cDNA constructs encoding edited versions of target ion channel transcripts however, the corresponding unedited transcripts may also be required.

The fruit fly undergoes complete metamorphosis to build two very different-looking complex organisms using a gene set that is small and relatively nonredundant compared to that of vertebrates. Many fly genes show complex patterns of embryonic and adult expression, with different enhancers, promoters, RNA splicing patterns and, finally, different RNA editing patterns in adult transcripts. Customising fast neurotransmission to the requirements of the different life-cycle stages by RNA editing is the most baroque of the gene-sparing strategies so far described in Drosophila.


Mulțumiri

We wish to express our gratitude to B. Tannous for supplying the Gluc lentivirus construct, C. Maguire, M. Broekman, K. Miranda, L. Russo and O. Saydam for fruitful discussions. We also would like to thank Applied Biosystems for supplying the miRNA qRT–PCR primers and S. Idema (Neuro-oncology Research Group, Cancer Center Amsterdam) for supplying some of the serum/biopsy samples. This work was supported by the Wenner-Gren Foundation (J.S.) Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (J.S.), NCI CA86355 (X.O.B. and M.S.E.), NCI CA69246 (X.O.B., M.S.E. and B.S.C.), The Goldhirs Foundation (B.S.C.) the Brain Tumor Society (A.M.K.) and the American Brain Tumor Association (T.W.).


DISCUŢIE

Here, we have described a novel neural-specific lncRNA, CRG. CRG has important biological significance—it is involved in locomotor behavior in Drosophila—which is attributed to its regulation of the transcription of the adjacent protein-coding gene CASK.

Although the functions of the most lncRNAs are still unknown, many are expressed in nervous system in Drosophila embryos ( 21) or in mouse ( 17, 18). Our study traced the expression patterns of CRG from embryonic and larval stages to adult. The spatiotemporal expression pattern of CRG revealed that CRG was confined to specific regions of nervous system, which suggested that it could play important roles in neural functions of Drosophila. The next question is whether the functional site of CRG in CNS or peripherally at the neuromuscular junction (NMJ). To solve this question, electrophysiological experiments can be performed to analyse the excitatory junction potentials (EJPs) in third instar larval muscle in WT comparing with CRG nulls. If no differences were observed then it would suggest a central defect. Here, we performed the behavioral rescue experiments which CRG was over-expressed driven by motoneuron-specific OK6-Gal4 line or muscle-specific G7-Gal4 line, respectively, in the CRG null mutant background. The results showed that defective phenotype of CRG-deficiency line could be rescued by the pan-neuronal CRG restoration, not by the peripheral CRG restoration. Asa de CRG was suggested to play central effects in this study.

Most lncRNAs were located in intergenic or intragenic/intronic configurations with protein-coding genes ( 6, 8, 14). We validated the full-length transcript of CRG using 5′ and 3′ RACE and northern blotting. To check the phylogenetic conservation of CRG, we annotated the genomes of 12 Drosophila-related species. Strong conservation among all the annotated genomes of the Drosophila species suggested CRG may be a functional lncRNA. In addition, CRG partially overlaps with the 3′ UTR of the adjacent upstream protein-coding gene CASK, dar CRG does not belong to 3′ UTR-associated RNAs which are contiguous with the upstream protein-coding region in the same mRNA ( 42). Primul, CRG starts in but extends out of the 3′ UTR of CASK. Al doilea, CRG și CASK were transcribed separately. Third, the reduced CASK expression in CRG Δ1877 mutant could be rescued by over-expression of WT CRG. Prin urmare, CRG is independent of CASK and not a CASK 3′-UTR-derived ncRNA. As for mammal species, such as Homo sapiens, Mus musculus sau Cattle genus, despite also host the gene CASK, as homologues of CASK în D. melanogaster, they share poor sequence similarity. Moreover, no EST sequence similar to CRG was detected in Database of Expressed Sequence Tags (dbEST) in NCBI using blast. Thus, no similar phenomenon is detected in mammal species.

CASK belonging to a conservative protein family from Caenorhabditis elegans, Drosophila to mammal, is wildly distributed in nervous system ( 23, 24). As a scaffolding protein, CASK interacts with other proteins suggesting the diversity roles of CASK in neural activity, development and neurological disease ( 43). În Drosophila, CASK which is involved in locomotor behavior was considered as a susceptibility gene for movement disorder ( 27, 28). Both homozygous and heterozygous mutant of CASK caused behavior defects in Buridan’s paradigm ( 27) ( Supplementary Figure S8 ). From our observations, CRG mutants and CASK mutants share similar locomotion defects. CASK over-expression rescued the defective phenotype in the CRG-deficiency line, while CRG positively regulate CASK’s expression. Thus, it is highly possible that CRG is involved in locomotor behavior by regulating CASK expression, which provides a new insight into the pathogenesis of neurological diseases associated with movement disorders.

Increasing evidences suggested that lncRNA could display the biological function by mediating the nearby protein-coding genes in transcriptional regulation and epigenetic gene regulation ( 6, 11, 14). In our study, we found that CRG promoted the recruitment of RNA Pol (II) to the CASK promoter regions to enhance CASK transcription, and the detailed CRG functional regions responsible for the process were identified, but there are still several questions left open. For example, the details about the transcription initiation complex whether CRG recruit RNA Pol (II) by direct interaction, whether CRG is involved in epigenetic regulation, are all not clear. Further experiments are needed to explore the regulation mechanism of CRG. Interestingly, a previous study reported that a lncRNA could promote the dissociation of the transcription initiation complex from the neighboring DHFR promoter through the formation of a complex between the lncRNA, the DHFR promoter, and transcription factor IIB ( 44). The different mechanisms through which ncRNAs exert their regulatory effects highlight their functional diversity and complexity.

To determine whether the expression of any other genes is potentially regulated by CRG, we made a whole-body comparison of genome-wide expression profile between CRG Δ1877 mutants versus CRG WT flies using microarrays and identified 491 genes down-regulated and 329 genes up-regulated significantly in response to CRG mutants ( Supplementary Table S1 ). This has important implications for CRG which has wide-ranging effects on gene expression in Drosophila. In orice caz, CASK, which was experimentally identified to be essential target gene of CRG regulating in Drosophila CNS in our study, was not included in the down-regulated gene list ( Supplementary Table S2 ). The reason might be, in part, owing to the relative low amount of neural-specific CASK in the whole body of the two flies. It is worth noting tsl, about 1 kb downstream of CRG, was significantly down regulated in CRG Δ1877 mutanți. In orice caz, CRG Δ1877 did not show similar phenotypes as tsl mutants ( 45–47). It indicated that CRG might regulate tsl in response to other unknown function. The transcriptomic information of CRG regulating leads to new questions about the nature of CRG for further study in Drosophila.

In conclusion, our study suggests that the lncRNA CRG recruits Pol (II) to CASK promoter regions, which in turn promotes CASK expression and thereby influences Drosophila locomotor behavior. Further studies are needed to elucidate the detailed molecular mechanisms of CRG-mediated regulation of CASK expresie.