Informație

Proteinele purtătoare de acil și conenzima A au o reactivitate similară?


În ceea ce privește reacțiile pe care le suferă, sunt grupuri aproximativ echivalente?


Grupările acil ligate la CoA și la proteinele purtătoare de acil sunt de fapt atașate la același grup (o grupare fosfopanteteină) așa cum se arată mai jos și, prin urmare, au reactivități foarte similare (adică potențiale de transfer de grup).


Capacitatea de Streptomyces spp. proteine ​​purtătoare de arii și analogi ai coenzimei A pentru a servi ca substraturi in vitro pentru E coli holo-ACP sintază

Introducere: Produsele naturale polichidice sunt asamblate printr-o serie de reacții de decarboxilare / condensare ale acizilor carboxilici simpli catalizați de complexele polichid sintetaza (PKS). Lanțul de creștere este asamblat pe proteina purtător de acil (ACP), o componentă esențială a PKS. ACP necesită o modificare posttranslațională a unui reziduu de serină conservat prin atașarea covalentă a unui cofactor 4'-fosfopanteteină (P-pant) pentru a produce holo-ACP activ. Când ACP-urile din Streptomyces PKS aromatice de tip II sunt supraproduse în E colicu toate acestea, în mod obișnuit se produce puțin sau deloc holo-ACP activ, iar ACP rămâne în forma apoasă inactivă.

Rezultate: Demonstrăm asta E coli holo-ACP sintaza (ACPS), o enzimă de biosinteză a acizilor grași, poate cataliza transferul P-pant in vitro la Streptomyces PKS ACP necesare pentru biosinteza antibioticelor polichidice granaticină, frenolicină, oxitetraciclină și tetracenomicină. Eficiența catalitică a acestei reacții de transfer P-pant se corelează cu sarcina negativă globală a substratului ACP. Mai mulți analogi ai coenzimei A, modificați în porțiunea P-pant a moleculei, sunt de asemenea capabili să servească drept substraturi in vitro pentru ACPS.

Concluzii:E coli ACPS poate servi ca un reactiv util pentru prepararea holo-formelor de Streptomyces ACP, precum și holo-ACP cu porțiuni de fosfopanteteină modificate. Astfel de ACP modificate ar trebui să se dovedească utile pentru studierea rolului anumitor ACP și al cofactorului fosfopanteteinei în reacțiile ulterioare ale biosintezei polichidelor și acizilor grași.


Denumirea sistematică a acestei clase de enzime este malonil-CoA: [proteină acil-purtătoare] S-maloniltransferază. Alte denumiri utilizate în mod obișnuit includ malonil coenzima A-acil purtător proteină transacilază,

  • [proteină purtătoare de acil] maloniltransferază,
  • FabD,
  • malonil transacilaza,
  • malonil transferaza,
  • proteină transacilază malonil-CoA-acil purtător,
  • malonil-CoA: transacilaza ACP,
  • malonil-CoA: AcpM transacilaza,
  • malonil-CoA: proteină transacilază acil purtătoare,
  • MAT și
  • MCAT.

Structuri de cristal ale FabD din E coli [1] și Streptomyces coelicolor [2] sunt cunoscute și oferă o perspectivă excelentă asupra mecanismului catalitic al FabD. În E coli, FabD implicat în principal în calea FAS. Cu toate acestea, în Streptomyces coelicolor, FabD este implicat în căile FAS și polichetid sintază. În ambele cazuri, structurile și siturile active sunt foarte asemănătoare.

Proteina are o arhitectură de tip α / β, dar pliul este unic. situl activ dedus din localizarea catalitică Ser92 conține un cot nucleofil tipic așa cum se observă în hidrolazele α / β. [1] Serina 92 ​​este legată de hidrogen la His 201 într-un mod similar cu diferitele hidrolaze ale serinei. cu toate acestea, în locul acidului carboxilic care se găsește în mod obișnuit în triade catalitice, lanțul principal carbonil al Gln 250 servește ca acceptor de legătură de hidrogen într-o interacțiune cu His 201. [1] Alte două reziduuri, Arg-117 și Glu-11 sunt, de asemenea, situate pe site-ul activ, dar funcția lor nu este clară.

Calea sintetică a acizilor grași este calea principală pentru producerea lanțurilor de acil fosfolipidic membranar în bacterii și plante. [3] Secvența de reacție este realizată de o serie de proteine ​​solubile individuale care sunt fiecare codificate de o genă discretă, iar intermediarii căii sunt transferate între enzime. [3] Malony-CoA: ACP transacilaza (FabD) este o astfel de proteină solubilă individuală și catalizează următoarea reacție:

malonil-CoA + acil proteină purtătoare ⇌ CoA + malonil- [acil-purtător-proteină]

Transferul malonatului în proteina acil-purtătoare (ACP) transformă grupările acil în forme tioester care sunt caracteristice intermediarilor acil în sinteza acizilor grași și care sunt strict necesare pentru reacțiile de condensare catalizate de β-cetoacil-ACP sintetaza. [4]

Editarea mecanismului

Malonil-CoA: ACP Transacilaza utilizează un mecanism cinetic de ping-pong cu un ester de maloni legat ca intermediar acil atașat la un reziduu de serină care se află într-o pentapeptidă GHSLG. [5] FabD leagă mai întâi malonil-CoA, porțiunea malonil este apoi transferată la site-ul activSer 92 și CoA este eliberat din enzimă. ACP se leagă apoi și fragmentul malonil este transferat la sulfhidrul terminal al grupării protetice ACP. Această reacție este ușor reversibilă. [3] [6]

Dintre toate căile metabolice cunoscute din sistemele vii, biosinteza acizilor grași produce cele mai dense produse energetice. [7] Ca rezultat, derivații de acizi grași microbieni apar ca o alternativă promițătoare de energie regenerabilă la combustibilii de transport derivați din combustibili fosili. Recent, Khosla și colab. [7] au conceput o procedură pentru reconstituirea E.Coli Fatty Acid Synthase utilizând componente proteice purificate (inclusiv FabD) și au raportat o analiză cinetică detaliată a acestui sistem reconstituit in vitro. [8] Constatarea lor oferă o nouă bază pentru evaluarea scopului și limitărilor utilizării E.Coli ca biocatalizator pentru producția de combustibili diesel.

FabD ca țintă pentru descoperirea medicamentelor antibacteriene: un viitor câmp Edit

Biosinteza acizilor grași este realizată de omniprezentul sintază a acidului gras. [9] Căile sintazei acizilor grași sunt împărțite în două forme moleculare distincte: tipul I și tipul II. [10] În tipul I, Sintaza acizilor grași (întâlnită la om și la alte mamifere) este o singură polipeptidă mare compusă din mai multe domenii distincte. [11] Pe de altă parte, fiecare activitate enzimatică (reacție de condensare, reacție de reducere, reacție de deshidratare) se găsește ca o proteină discretă în sistemele de tip II. [12] Diferența în organizarea activă a sitului și predominanța sistemelor FAS de tip II la bacterii fac ca enzimele acestei căi să fie ținte atractive pentru antibacteriene. [9] [12]

FabD (Acil-Carrier-Protein S-Malonyltransferase) este o țintă rezonabilă, având în vedere că este disponibilă o structură cristalină de înaltă rezoluție. [9] Cu toate acestea, în literatura de specialitate nu au fost raportați inhibitori FabD și articole de revizuire pe această temă. [9] Structura simplă și aciditatea malonatului par să permită puține abordări ale sintetizării derivaților (care acționează ca potențiali inhibitori) care păstrează caracterul moleculei.

O a doua abordare pentru utilizarea FabD ca țintă de medicament este frecvent identificată în literatură: FabD poate oferi o etichetă utilă pentru localizarea genelor fab, deoarece gena FabD este de obicei adiacentă cel puțin unei alte gene fab. [13] Cu toate acestea (începând cu 2015), niciun medicament potențial nu a încercat să exploateze această caracteristică.


Biosinteza acizilor grași

Autorul: Dr. Peter Reilly, Departamentul de Inginerie Chimică și Biologică, Universitatea de Stat din Iowa, Ames, Iowa 50011, S.U.A.

Reacțiile ciclului de sinteză a acizilor grași

Modul standard pentru celule de a sintetiza acizi grași este prin ciclul de sinteză a acizilor grași (Figura 1). Acest ciclu de opt enzime (acil-CoA sintază, acil-CoA carboxilază, aciltransferază, cetoacil sintază, cetoacil reductază, hidroxiacil dehidratază, enoil reductază și tioesterază) și proteină acil purtătoare) este inițiat cu acid acetic, CoA și ATP pentru a produce acetil-CoA utilizând acil-CoA sintază ca catalizator. O a doua etapă, folosind un alt ion ATP și bicarbonat catalizat de acil-CoA carboxilază, produce malonil-CoA. Cu cataliza cetoacil sintază și aciltransferază, malonil-CoA este adăugat la un lanț acilic, de obicei activat cu proteină purtătoare acil, pentru a face un lanț acil două grupări metilen mai lungi. Reducerea suplimentară, deshidratarea și reducerea cu cetoacil sintază, hidroxiacil dehidratază și, respectiv, cataliză cu enoil reductază, duce la un lanț acilic saturat și nehidroxilat activat cu proteină purtător de acil. Dacă lanțul are o lungime adecvată, este atacat de tioesterază pentru a elibera proteina purtătoare de acil, producând acidul gras terminat.

Figura 1. Ciclul de sinteză a acizilor grași și grupurile de enzime care fac parte din acesta. ACC: acetil-CoA carboxilază ACS: acil-CoA sintază AT: aciltransferază ER: enil reductază HD: hidroxiacil dehidratază KR: cetoacil reductază KS: cetoacil sintază TE: tioesterază. SX: Coenzima A sau proteina purtătoare de acil. Reprodus în formă modificată cu permisiunea ref. 1. Copyright 2011, Oxford University Press.

Definiții ale familiilor și clanurilor de enzime

Poate că nu este pe deplin apreciat faptul că aceste opt grupe enzimatice și o proteină purtătoare sunt, de fapt, de obicei asamblări în cadrul fiecărui grup de mai multe (sau multe) proteine ​​diferite, care nu sunt neapărat legate între ele prin secvența de aminoacizi (structura primară) sau chiar prin structura tridimensională (structura terțiară). În schimb, proteinele fără legătură pot fi modelate prin evoluție convergentă pentru a cataliza aceeași reacție generală. În schimb, proteinele structurilor primare și terțiare înrudite produse de diferite organisme, dar care catalizează aceeași reacție, pot face parte din familii ai căror membri sunt, în general, considerați că au același strămoș comun. Membrii acestor familii pot fi identificați prin interogarea automată a bazelor de date care dețin structuri primare enzimatice, unde membrii familiei trebuie să treacă un test de probabilitate a similitudinii urmat de o aliniere multiplă a secvențelor multiple și compararea structurilor terțiare (dacă sunt disponibile). Într-un pas suplimentar, diferite familii care au structuri primare fără legătură (sau doar ușor legate), dar structuri terțiare similare și care catalizează aceeași reacție generală prin același mecanism, pot fi adunate în clanuri în cadrul aceluiași grup. Acest lucru este confirmat prin suprapunerea computațională a structurilor terțiare ale membrilor diferitelor familii pentru a confirma deviațiile pătrate ale rădăcinii medii reduse ale reziduurilor de aminoacizi adiacente. Membrii diferitelor familii din același clan sunt considerați a avea strămoși comuni mai îndepărtați decât cei din aceeași familie. O a treia diversificare, care nu trebuie acoperită aici, este cea a membrilor familiei în subfamilii, guvernată de formulări statistice aplicate structurilor primare.

Baza de date Thyme

Familiile de enzime care catalizează reacțiile care conduc la sinteza acizilor grași au fost tabelate în baza de date Thym (Thioester-active enzymme) [1]. În prezent, această bază de date este formată din cinci familii de acil-CoA sintaze, patru familii de subgrupuri de acil-CoA carboxilază (una dintre biotin carboxilaze, una dintre proteinele purtătoare de biotină carboxil și două dintre carboxil transferaze) [2], una dintre aciltransferaze, cinci de cetoacil sintaze [3], patru de cetoacil reductaze [4], opt de hidroxiacil dehidrataze [4], cinci de enoil reductaze [4], 25 de tioesteraze [5] și 16 de proteine ​​purtătoare de acil [6] (Tabelul 1 ). Deși nu au fost analizate toate grupurile enzimatice, un clan de cetoacil sintaze cuprinde patru din cele cinci familii ale sale [3], un clan de cetoacil reductaze acoperă trei dintre cele patru familii ale sale [7], un clan de hidroxiacil dehidrataze ia două din cele opt familiile [7] și patru clanuri de tioesteraze acoperă patru, trei, trei și două dintre cele 25 de familii ale sale [5].

Cele mai multe intrări ThYme au rezultat din studii genomice și nu au fost supuse unor proiecte experimentale. Prin urmare, de obicei nu au titluri ferm stabilite, adesea fiind caracterizate ca proteine ​​caracterizate & rdquo, proteine ​​ldquohipotetice & rdquo, sau prin alți termeni nedefiniti sau chiar incorect. Bazele de date, cum ar fi Thyme, au fost utile, prin utilizarea structurilor primare pentru clasificarea proteinelor, în direcționarea acestor proteine ​​mai puțin caracterizate în familii care conțin alte proteine ​​mai studiate și descrise în mod clar.

Să analizăm acum mai atent fiecare grup de enzime ale ciclului de sinteză al acizilor grași.

Acil-CoA sintaze

Acil-CoA sintaze catalizează primul pas în calea de sinteză a acizilor grași, activând acidul acetic cu CoA și cu cheltuirea unei molecule de ATP, ducând la formarea de AMP, pirofosfat și apă. (Figura 1). Acestea sunt clasificate în cinci familii (Tabelul 1), unele cu mult mai multe structuri primare decât altele. Membrii a trei familii au structuri terțiare similare (pliuri), în timp ce doi încă nu au cunoscut pliuri. Așa cum se întâmplă în diferite grupuri ale ciclului, diferitele familii au nume principale diferite și numere diferite ale Comisiei enzimatice (CE) [8]. În unele familii numeroase, ca și în familia ACS1 aici, există atât de multe funcții enzimatice percepute diferite, încât nu poate fi atribuit un singur număr EC. Această divergență a familiilor sortate după similaritatea structurii primare, pe de o parte, și numerele EC bazate pe substraturi și produse enzimatice și, prin urmare, pe reacțiile pe care le catalizează, pe de altă parte, ilustrează în continuare fenomenul evoluției convergente a structurilor proteice pentru a servi aceleași scop.

Archaea produce membri din patru din cele cinci familii, bacterii toate cinci și eucariote două din cinci (cu câțiva membri într-o a treia familie). Majoritatea membrilor eucariote sunt produse de o combinație de ciuperci, animale și plante, precum și uneori de alge și ocazional de alte forme de viață simple.

Acil-CoA carboxilaze

Reacția catalizată de acil-CoA carboxilaza este superficial una simplă: acetil-CoA fiind carboxilat cu CO2 (HCO3 & ndash în condiții fiziologice) și ATP pentru a forma malonil-CoA, ADP și fosfat anorganic fiind eliberați (Figura 1). Cu toate acestea, reacția este de fapt mult mai complexă, biotina atașată la o proteină purtătoare de biotină carboxil fiind carboxilată de un domeniu de biotină carboxilază. Gruparea carboxil este apoi transferată la o moleculă de acetil-CoA, catalizată de un domeniu carboxil transferază (Figura 2). Întregul complex de biotină carboxilază, proteină purtătoare de biotină carboxil și carboxil transferază alcătuiește acil-CoA carboxilaza. O recenzie recentă și foarte completă a acestui sistem enzimatic a fost publicată de Lombard și Moreira [9].

Figura 2. Schema unei reacții catalizate de acetil-CoA carboxilază care produce malonil-CoA. Reprodus cu permisiunea ref. 2. Drepturi de autor 2012, Springer Science + Business Media B.V.

O comparație a structurilor primare arată că toate biotin carboxilazele și proteinele purtătoare ale biotinei carboxil alcătuiesc două familii unice, BC1 și BCCP1, în timp ce carboxil transferazele fac parte din două familii, CT1 și CT2 [2] (Tabelul 1).

Amplasarea domeniilor biotin carboxilazei, proteinei purtătoare de biotină carboxil și domeniilor carboxil transferazei este foarte complexă. În majoritatea eucariotelor, acetil-CoA carboxilazele apar ca biotin carboxilază-biotin carboxil purtător carboxil transferază fuzionată cu lanțuri. Cu toate acestea, în carboxilazele acil-CoA bacteriene și eucariote mai active pe propionil-CoA, 3-metilcro și shtontonil-CoA și geranil-CoA, domeniile proteinei purtătoare de biotină carboxil și biotină carboxil sunt atașate unele de altele, dar sunt separate de cele condensate domenii carboxil transferază. În carboxilazele archaeale dependente de biotină specifice pentru acetil-CoA și propionil-CoA, proteina purtătoare a biotinei carboxil este separată de domeniile biotin carboxilazei și carboxil transferazei condensate [9].

Aciltransferaze

Aciltransferazele sunt alcătuite dintr-o familie foarte numeroasă (Tabelul 1) ai cărei membri sunt produși de bacterii, eucariote și câteva arhee. Sarcina specifică a aciltransferazelor este schimbul fragmentului CoA pe malonil-CoA care intră în ciclul de sinteză al acidului gras cu o proteină purtătoare de acil (Figura 1).

Cetoacil sintaze

Rolul general al cetoacil sintaze, împreună cu aciltransferazele, este de a adăuga malonil-CoA la un lanț proteic purtător de acil-acil, cu pierderea de dioxid de carbon și CoA și cu lanțul acil crescând în lungime cu două grupări metilen [3] ( Figura 1). Există cinci familii de cetoacil sintaze, dintre care trei membri au structuri terțiare similare (Figura 3). Împreună cu membrii unei a patra familii oarecum legate de ei prin structura primară și prin mecanism catalitic (membrii tuturor celor patru familii au o triadă catalitică de Cys, His și Asn sau His), formează un singur clan [3] (Tabel 1). Aceste patru familii au funcții foarte diferite, membrii uneia dintre ele fiind implicați în sinteza calconei și stilbenei. A cincea familie, fără o structură terțiară cunoscută, este alcătuită numai din enzime eucariote implicate în alungirea lanțurilor de acizi grași deja foarte lungi.

Figura 3. Structuri cristaline suprapuse de cetoacil sintază (KS). KS1 Escherichia coli & beta-cetoacil-ACP sintaza III (galben), KS3 Saccharopolyspora erythraea DEBS 2 (cian) și KS4 Arachis hypogaea stilbene sintaza (roz). Reprodus cu permisiunea ref. 3. Copyright 2011, The Protein Society.

Calea & beta-oxidare

Trei enzime, cetoacil reductaza, hidroxiacil dehidrataza și enoil reductaza, sunt necesare pentru a elimina gruparea 3-ceto adăugată lanțului acil în creștere prin cetoacil sintază (Figura 1). Toate cele trei enzime sunt, de asemenea, implicate în calea & beta-oxidare, unde acizii grași sunt descompuși în loc să fie acumulați. În această cale, etapele catalizate de cetoacil reductază, hidroxiacil dehidratază și enoil reductază funcționează invers, astfel încât aceste enzime primesc nume caracteristice reacțiilor inverse. Oxidarea acil-CoA catalizată de acil-CoA dehidrogenază (echivalentă cu enoil reductaza) cu o grupă protetică flavină adenină dinucleotidă (FAD) dă 2-enoil-CoA. Hidratarea 2-enoil-CoA care produce 3-hidroxiacil-CoA este catalizată de 2-enoil hidratază (echivalent cu hidroxiacil dehidratază). A treia etapă, oxidarea 3-hidroxiacil-CoA pentru a da 3-cetoacil-CoA prin cataliză cu L-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenază (echivalent cu cetoacil reductază) folosind nicotinamidă adenină dinucleotidă (NAD +). O etapă finală, cu adăugarea de CoA, elimină o moleculă de acetil-CoA și lasă o moleculă de acil-CoA cu doi atomi de carbon mai scurți decât înainte. Este catalizat de 3-cetoacil-CoA tiolaza, care nu este un membru al ciclului standard de sinteză a acizilor grași.

Sinteza polichidelor

Un paragraf scurt poate servi pentru a descrie diferența dintre sinteza acizilor grași și sinteza polichidelor. În acesta din urmă, etapele catalizate de cetoacil reductază, hidroxiacil dehidratază și enoil reductază nu apar neapărat în timpul fiecărei rotații în jurul ciclului, astfel încât grupările ceto și hidroxi și legăturile duble pot rămâne în lanțul de alungire. Mai mult, lanțul poate fi alungit de alte substanțe decât malonil-CoA, conducând, prin urmare, la lanțuri cu un număr impar de atomi de carbon sau diferite grupări funcționale. În cele din urmă, dacă creșterea lanțului este terminată nu de apă, ci de o grupare hidroxi, poate apărea ciclizarea lanțului.

Cetoacil reductaze

Cetoacil reductazele sunt împărțite în patru familii (Tabelul 1), familia KR1 având cel mai mare număr de structuri primare tabulate în baza de date Thym (Tabelul 1). Această familie include multe reductaze și dehidrogenaze care nu catalizează reacțiile asociate cu sinteza acizilor grași sau ciclurile de sinteză a polichetidelor sau calea & beta-oxidare [4]. De asemenea, include fosta familie ER1, deoarece toate secvențele de aminoacizi ale acestor enoil reductaze au fost găsite și în familia KR1. Membrii familiilor KR1, KR3 și KR4 au falduri Rossmann care leagă NAD (P) și reziduuri catalitice de serină, tirozină și lizină și fac parte din clanul KR-A [4,7]. Cei din familia KR2 au reziduuri catalitice de histidină și glutamat, dar și pliuri Rossmann care leagă NAD (P) împreună cu pliuri C-terminale 6-fosfogluconat dehidrogenază. Pliul Rossmann este compus din până la șapte fire în principal paralele și beta, cu o helică & alfa între primele două catene & beta. Membrii familiilor KR1 și KR2 sunt independenți, în timp ce cei din familiile KR3 și KR4 sunt părți ale lanțurilor multi-enzimatice care efectuează sinteza acizilor grași și a polichetidelor.

Hidroxiacil dehidrataze

Hidroxiacil dehidratazele se găsesc în opt familii, dintre care familiile HD1 și HD3 până la HD6 au membri cu structuri terțiare HotDog, în timp ce membrii familiei HD2 au pliuri ClpP / crotonază [4] (Tabelul 1). Pliul HotDog este compus din una sau ocazional două helice & alfa încadrate într-o foaie & beta formată din mai multe fire & beta, un bun exemplu fiind prezentat în Figura 4. Nu sunt cunoscute încă structuri terțiare pentru membrii familiilor HD7 și HD8. Deși structurile terțiare ale membrilor familiilor HD1, HD5 și HD6 pot fi suprapuse îndeaproape unul pe celălalt, resturile de aspartat catalitic și histidină ale HD1 nu se află în aceeași locație cu resturile de aspartat catalitic și histidină ale HD5 sau ale reziduurilor de glutamat și histidină din HD6 [7]. Ultimele perechi de reziduuri, pe de altă parte, se suprapun foarte strâns și, prin urmare, permit HD5 și HD6 să formeze clanul HD-A (Figura 4). În mod separat, membrii HD3 și HD4 fac parte din sintazele cu acizi grași multi-enzimi și polichide.

Figura 4. A) Structuri terțiare reprezentative suprapuse ale hidroxiacil dehidratazei (HD) ale clanului HD-A: HD5 și beta-hidroxidecanoil tiol ester-ACP dehidrază din Escherichia coli (verde) și HD6 ((3R) -hidroxiacil-ACP dehidratază (FabZ) din Helicobacter pylori (cian). B) Lanțuri laterale suprapuse la locul activ al aceluiași reprezentant al familiei HD, cu culori ca în A. Reprodus cu permisiunea ref. 7. Copyright 2014, Springer Science + Business Media Dordrecht.

Enoyl reductaze

După cum sa menționat anterior, familia ER1 a fost fuzionată cu familia KR1, deoarece toate intrările sale se găsesc și acolo. Mai mult, toți membrii fiecărei familii catalizează aceleași tipuri de reacții reductive. Restul enoil reductazelor se încadrează în cinci familii, dintre care cele din familiile ER3 și ER4 fac parte din complexele mai mari de acizi grași și polichid sintetaza [4] (Tabelul 1). Familiile ER2 și ER4 au falduri Rossmann care leagă NAD (P), în timp ce membrii familiei ER5 au structuri asemănătoare GrosES, iar cei din familia ER6 au falduri TIM (& beta, & alfa).

O suprapunere a unei structuri terțiare ER2 asupra structurilor KR1, KR3 și KR4, membri ai clanului KR-A, este extrem de apropiată, sugerând că membrii ER2 și membrii celor trei familii de cetoacil reductază au un strămoș comun îndepărtat [7].

Tioesteraze

Tiesteresterazele sunt cele mai variate dintre cele opt grupe de enzime care alcătuiesc ciclul de sinteză a acizilor grași. Acestea sunt aranjate în 25 de familii [5] (Tabelul 1), dintre care majoritatea au membri cu structuri terțiare & alpha / & beta-hidrolază sau HotDog (Figura 5). Doisprezece dintre aceste familii pot fi adunate în clanuri. Familiile TE5, TE9, TE10 și TE12 cu falduri HotDog fac parte din clanul TE-A, în timp ce familiile TE8, TE11 și TE13 cu diferite structuri terțiare HotDog alcătuiesc clanul TE-B. Între timp, familiile TE16, TE17 și TE18 cu pliuri & alfa / și beta-hidrolază fac parte din clanul TE-C, iar familiile TE20 și TE21 cu structuri terțiare diferite & alfa / și beta-hidrolază alcătuiesc clanul TE-D. Mecanismul tioesterazelor cu structuri terțiare alfa / și beta-hidrolază este, în general, acceptat ca fiind bazat pe triade catalitice Ser / His / Asp care se găsesc de obicei cu astfel de pliuri. Mecanismele acelor tioesteraze cu structuri terțiare HotDog sunt mult mai puțin cunoscute [5]. Ei pot avea mecanisme diferite între ele, deoarece reziduurile lor catalitice identificate experimental variază.

Figura 5. Structuri terțiare reprezentative suprapuse tioesterazei (TE) ale clanului A) TE-A: hidrolaze acil-CoA din TE5 Escherichia coli (verde), TE9 Helicobacter pylori (roșu), TE10 Pseudomonas sp. (galben) și TE12 Prochlorococcus marinus (albastru) B) clan TE-B: acil-CoA hidrolaze din TE8 Homo sapiens (albastru), TE11 Arthrobacter sp. (roșu) și TE13 Escherichia coli (galben) C) clan TE-C: acil-ACP hidrolaze din TE16 Homo sapiens (albastru), TE17 Saccharopolyspora erythraea (roșu) și TE18 Amycolatopsis mediterranei (galben) D) clan TE-D: proteine-acil hidrolaze din TE20 Bos taurus (albastru) și TE21 Homo sapiens (galben).

Proteine ​​purtătoare de acil

Proteinele purtătoare de acil au structuri primare foarte variabile și, prin urmare, pot fi clasificate în familiile ACP1 la ACP17 (Figura 6), familia ACP14 fiind ștearsă [6] (Tabelul 1). Majoritatea proteinelor purtătoare de acil au 70 până la 100 de reziduuri de aminoacizi, dar membrii familiei ACP2 au lanțuri mai lungi. În mod obișnuit se găsesc trei helice paralele și alfa, de obicei, dar nu întotdeauna însoțite de o helică transversală și alfa (Figura 7). Membrii unor familii sunt independenți, în timp ce alții fac parte din lanțuri mai lungi de acizi grași sintază și polichid sintază (Tabelul 1). Membrii familiilor individuale de proteine ​​acil purtătoare sunt mai probabil decât membrii celor opt grupe enzimatice care fac parte din ciclul de sinteză a acizilor grași să fie formați de membrii regatelor cu viață unică, de obicei bacteriene, dar uneori eucariote.

Figura 6. Structuri terțiare ale membrilor unici ai familiilor de proteine ​​acil purtătoare (ACP). ACP1 Thermus thermophilus, ACP2 Saccharomyces cerevisiae, ACP3 Homo sapiens, ACP5 Streptomyces roseofulvus, ACP8 Aspergillus parasiticus, ACP10 Brevibacillus parabrevis, ACP12 Escherichia coli, ACP13 E coliși ACP17 Lactobacillus casei. Reprodus cu permisiunea ref. 6. Copyright 2012, The Protein Society.

Figura 7. Arborele filogenetic al familiilor de proteine ​​purtătoare de acil. Reprodus cu permisiunea ref. 6. Copyright 2012, The Protein Society.

Calculul a stabilit că membrii ACP4 au pliuri similare cu cele ale altor familii de proteine ​​purtătoare de acil ale căror pliuri au fost determinate experimental [6]. Cu toate acestea, membrii familiilor ACP15 și ACP16 par a avea structuri terțiare diferite, în acord cu faptul că au structuri primare mai divergente (Figura 6) și roluri diferite (sunt asociate cu enzime care scad mai degrabă decât cresc dimensiunile substraturilor și nu utilizați aceeași grupă protetică 4 & rsquo-fosfopanteteină prezentă în alte proteine ​​acil purtătoare).

Complexe de sinteză cu acizi grași și polichide

S-a observat mai sus și în Tabelul 1 că membrii unor familii de enzime de sinteză a acizilor grași sunt părți legate covalent de complexe de sinteză a acidului gras și polichide. Mai precis, acești complexe, găsite în unele bacterii, ciuperci, animale și mucegaiuri de nămol, permit ca lanțurile de acizi grași în creștere, activate de proteina purtătoare de acil, să fie trecute secvențial de la o enzimă de sinteză a acizilor grași la următoarea, fără a difuza aleatoriu între ele.

Dintre cele șaisprezece familii de proteine ​​purtătoare de acil, membrii ACP1, ACP4, ACP5, ACP15, ACP16 și ACP17 sunt independenți (Tabelul 1) și se angajează în ceea ce este cunoscut sub numele de sinteză de tip II. Proteinele ACP1 sunt produse de bacterii, ciuperci, animale și plante și se angajează cu multe enzime de sinteză a acizilor grași. Membrii ACP4 și ACP5 sunt produși de diverse bacterii și sunt implicați în sinteza polichetidelor. Membrii ACP15 și ACP16 sunt, de asemenea, produși de diverse bacterii și sunt asociați cu malonat decarboxilază și, respectiv, citrat liasă. ACP17 este compus din proteine ​​purtătoare de D-alanil.

Restul de proteine ​​purtătoare de acil legate covalent de enzime participă la sinteza acizilor grași de tip I și la alte activități conexe (Tabelul 1). Proteinele ACP2 și ACP3 ajută la producerea acizilor grași și sunt produse de ciuperci și respectiv de animale. Membrii ACP6 până la ACP11 sunt implicați în sinteza polichidelor și sunt produși de micobacterii (ACP6), ciuperci (ACP7, ACP8 și ACP11) și mucegaiuri de mucus (ACP9). Numărul foarte mare de proteine ​​ACP10 sunt produse de diverse bacterii, precum și de ciuperci. Membrii ACP12 și ACP13 sunt formați de diverse bacterii și sunt legați de izocoromataze, peptide sintetaze, feniloxazolin sintaze (ACP12), enterobactin sintaze și cromofore liază (ACP13)

Dintre cele opt grupe enzimatice de sinteză a acizilor grași, șase (aciltransferaze, cetoacil sintaze, cetoacil reductaze, hidroxiacil dehidrataze, enoil reductaze și tioesteraze) au familii ale căror membri fac parte din acizi grași cu mai multe enzime și polichetide sintaze (tabelul 1). O familie de aciltransferaze (AT1) are domenii în diferite sintaze produse de bacterii, ciuperci și animale, precum și de membri independenți. Membrii familiei foarte mari KS3 sunt independenți și sunt părți ale sintetizelor polichidice și ale acizilor grași produse de bacterii, animale, ciuperci și mucegaiuri. Dintre cetoacil reductazele, formele bacteriene și fungice ale KR3 se găsesc în sintazele acizilor grași, în timp ce formele bacteriene, fungice și animale ale KR4 sunt în polichid și sintazele acizilor grași. Hidroxiacil dehidratazele din HD3 fac parte din sintazele acizilor grași produse de bacterii, ciuperci și animale, iar cele din HD4 sunt din polichidele și sintazele acizilor grași produse de bacterii și animale. ER3 are domenii de enoil reductază în sintazele acizilor grași produse de bacterii și ciuperci, în timp ce domeniile de enoil reductază din ER4 sunt situate în sintetizele polichidice bacteriene, fungice, animale și de mucegai. În cele din urmă, familiile TE16, TE17 și TE18 din cele 25 de familii tioesterază contribuie cu domenii la sintaze multi-enzimatice. Membrii TE16 fac parte din proteinele de adenilare a aminoacizilor, polichetide, acizi grași și peptide sintase nonrib și shiozomale și din componenta F a enterobactinei sintază fabricată de bacterii, ciuperci și animale. Sintazele polichidice bacteriene au domenii TE17. Domeniile TE18 se găsesc în proteinele de adenilare a aminoacizilor bacterieni și în peptidele sintagene nonrib & shyosomal și în sintazele de acizi grași S-acil animale.

O notă în treacăt

Membranele arhaeale conțin fosfolipide care au lanțuri hidrofobe legate de L-glicerol cu ​​legături eterice mai degrabă decât lanțurile găsite în bacterii și eucariote legate de D-glicerol prin legături esterice. Mai mult, lanțurile arhaeale sunt ramificate cu grupări metil la intervale regulate, pe baza chimiei izoprenoide, în timp ce organismele bacteriene și eucariote au lanțuri arii cu acizi grași cu lanț drept. În ciuda acestui fapt, multe arhee au una sau mai multe dintre enzimele (sau proteina purtătoare de acil) găsite în ciclul de sinteză a acizilor grași. Chen a folosit baza de date Thyme în 2011 pentru a găsi că din cele 155 de specii arhaeale tabelate atunci, 33 aveau un membru al ciclului, 28 aveau doi, 22 aveau trei, 17 aveau patru, 26 aveau cinci, 27 aveau șase, unul avea opt și unul a avut toate cele nouă [10].


Mulțumiri

Această lucrare este susținută parțial de granturile Institutului Național de Științe Medicale Generale Protein Structure Initiative Initiative GM094585 (A.J.) și GM098248 (G.N.P.) și National Institutes of Health Grant GM109456 (G.N.P.) și GM114353 (BS). Utilizarea liniilor de fascicul ale Centrului de biologie structurală la sursa fotonică avansată a fost susținută de grantul DE-AC02-06CH11357 (A.J.) al Departamentului SUA pentru Energie, Biroul de Cercetări Biologice și de Mediu. N.W. este susținut parțial de Institutul de Ecologie Aplicată, Academia Chineză de Științe și o bursă de la Consiliul de Burse din China (201504910034). J.D.R. este susținut parțial de o bursă postdoctorală Arnold O. Beckman. C.-Y.C. este susținut parțial de Fellowship of Academia Sinica – The Scripps Research Institute Postdoctoral Talent Development Program. Acesta este manuscrisul nr. 29600 de la The Scripps Research Institute.


PROCEDURI EXPERIMENTALE

Tulpina și condițiile de cultură

Phaeodactylum tricornutum Tulpina Pt4 (UTEX 646) a fost cultivat în apă de mare artificială (Instant Ocean, Spectrum Brands, Blacksburg, VA, SUA) suplimentat cu nutrienți F / 2. Culturile au fost cultivate la 20 ° C sub iluminare constantă (100 µmol m −2 sec -1, 4000 K alb și 660 nm iluminare cu LED) și s-au agitat continuu la 70 rpm. Creșterea a fost monitorizată de OD750nm calibrat la densitatea celulei măsurat cu un contor automat de celule (Cellometer T4, Nexcelom, Lawrence, MA, SUA). Liniile au fost menținute pe plăci de agar F / 4 crescute la 20 ° C sub 50 umol m -2 sec -1 (3500 K tuburi fluorescente).

Construction of acyl-ACP Δ9-desaturase overexpression cassette and transformation

The PAD (Phatr3_J9316) gene was chemically synthesized (Genscript) and codon optimized to remove conflicting restriction sites. The PAD gene was inserted into position 1 in the two-gene cassette transformation vector pPhOS2 (Hamilton și colab., 2014 ) behind the EF2 promoter (Seo și colab., 2015 ) generating pPhOS2_PAD construct. Construction of the transformation cassette pPhOS2_PAD is described in detail in Data S1. Transformation of P. tricornutum Pt4 via biolistic transformation and screening was carried out as described previously (Hamilton și colab., 2014 ).

Generation of acyl-ACP Δ9-desaturase KO lines

A universal KO CRISPR/Cas9 vector was constructed with a dual sgRNA design (Aslan și colab., 2015 ) using dual reporter gene selection system (designed by Mark Youles, personal communication). Type IIS LOOP DNA assembly was used for Level 1 and 2 vector constructions, following the method described in Pollak și colab. (2019). The design of KO cassettes is explained in detail in Data S1. Transformation of P. tricornutum Pt4 via biolistic transformation and screening was carried as described previously (Hamilton și colab., 2014 ).

Cloning of acyl-ACP Δ9-desaturase (Phatr3_J9316) into Synechocystis expression vector and functional characterization in Synechocystis

To generate the Syn_PAD strain, the Synechocystis PCC6803 glucose-tolerant WT (Syn_WT, Himadri Pakrasi, Department of Biology, Washington University, St. Louis, MO, USA) was transformed with the self-replicative vector pUR (Kim și colab., 2016 ) expressing the acyl-ACP Δ9-desaturase gene lacking the 5′ putative signal peptide sequence (as predicted by SignalP online software). Generation of the vector, transformation and functional characterization of the Phatr3_J9316 gene is described in detail in Data S1.

RNA extraction and quantitative reverse transcription-PCR

For RNA extraction, 1–1.5 × 10 8 exponential phase cells were pelleted, flash frozen in liquid nitrogen and stored at −80°C. RNA extraction was carried out using the method described in Rengel și colab. ( 2018 ). cDNA was synthesized and quantitative PCR analysis was carried out as described detail in Data S1.

Lipid analysis

Whole biomass FAME analysis was carried out as previously reported (Hamilton și colab., 2014 ), using pentadecanoic acid and tricosanoic acid internal standards. Further details are described in Data S1.

Glycerolipids were extracted following a method adapted from Bryant și colab. ( 2016 ), further details are described in Data S1.

For positional analysis, lipids were fractionated by 1D and 2D TLC (described in detail in Data S1), and then purified classes were characterized by preferential loss analysis under low-energy collision-induced dissociation as described previously (Abida și colab., 2015 ). After species characterization, quantification of each species was carried out by liquid chromatography-MS/MS as previously described (Jouhet și colab., 2017 ).

Transmission electron microscopy

Transmission electron microscopy imaging was carried out by Rothamsted Bioimaging (Harpenden, Herts, UK). Processing of P. tricornutum cells for transmission electron microscopy imaging is described in detail in the Data S1.

Statistici

One-way analysis of variance was applied to data on specific growth, FA, lipid class and lipid species data. Data were transformed by natural log (quantitative data) or logit (relative %). Post-hoc comparison of the means was carried out using LSD at 5%, 1% and 0.1% level of significance. A two-tailed Student’s t-test was carried out in cases where only two strains are compared. Microsoft Excel was used for these analyses.


Acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase modulates the generation of the amyloid β-peptide

The pathogenic event common to all forms of Alzheimer's disease is the abnormal accumulation of the amyloid β-peptide (Aβ). Here we provide strong evidence that intracellular cholesterol compartmentation modulates the generation of Aβ. Using genetic, biochemical and metabolic approaches, we found that cholesteryl-ester levels are directly correlated with Aβ production. Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT), the enzyme that catalyses the formation of cholesteryl esters, modulates the generation of Aβ through the tight control of the equilibrium between free cholesterol and cholesteryl esters. We also show that pharmacological inhibitors of ACAT, developed for the treatment of atherosclerosis, are potent modulators of Aβ generation, indicating their potential for use in the treatment of Alzheimer's disease.


Identification of a chloroplast coenzyme A-binding protein related to the peroxisomal thiolases.

A 30-kD coenzyme A (CoA)-binding protein was isolated from spinach (Spinacea oleracea) chloroplast soluble extracts using affinity chromatography under conditions in which 95% of the total protein was excluded. The 30-kD protein contains an eight-amino-acid sequence, DVRLYYGA, that is identical to a region in a 36-kD protein of unknown function that is encoded by a kiwifruit (Actinidia deliciosa) cDNA. Southern blotting also detected a spinach gene that is related to the kiwifruit cDNA. The kiwifruit 36-kD protein that was synthesized in Escherichia coli was imported into chloroplasts and cleaved to a 30-kD form it was processed to the same size in an organelle-free assay. Furthermore, the kiwifruit protein specifically bound to CoA. The kiwifruit protein contains a single cysteine within a domain that is related to the peroxisomal beta-ketoacyl-CoA thiolases, which catalyze the CoA-dependent degradative step of fatty acid beta-oxidation. Within 50 amino acids surrounding the cysteine, considered to be part of the thiolase active site, the kiwifruit protein shows approximately 26% sequence identity with the mango, cucumber, and rat peroxisomal thiolases. N-terminal alignment with these enzymes, relative to the cysteine, indicates that the 36-kD protein is cleaved after serine-58 during import, agreeing with the estimated size (approximately 6 kD) of a transit peptide. The 30-kD protein is also related to the E. coli and mitochondrial thiolases, as well as to the acetoacetyl-CoA thiolases of prokaryotes. Features distinguish it from members of the thiolase family, suggesting that it carries out a related but novel function. The protein is more distantly related to chloroplast beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III, the initial condensing enzyme of fatty acid synthetase that utilizes acetyl-CoA.


Metode

Cloning

Genomic DNA from the haploid protease deficient S. cerevisiae BJ2168 plasmid (MATa leu2 trp1 ura3–52 prb1-1122 pep4-3 prc1-407 gal2) was obtained by phenol/chloroform extraction. FAS1 și FAS2 genes were amplified from genomic DNA using primers containing overlaps with the vector backbone for cloning with NEBuilder HiFi DNA Assembly (NEB) (Supplementary Table 1). FAS1 was cloned into NcoI-digested pET-28a(+) with a C-terminal His6 tag (JWL02). FAS2 was cloned into NcoI-digested pET-15b(+) (JWL03). The sequences of the FAS1 și FAS2 genes were verified (Supplemantary Data 1) via whole plasmid sequencing of JWL02 and JWL03 at the Center for Computational & Integrative Biology DNA core facility in Massachusetts General Hospital.

Point mutations were generated by the overlap extension method 24 using a forward primer containing the mutation and a reverse primer 200–2000 bp downstream (Supplementary Table 1). PCR fragments were purified using spin columns and used as megaprimers to amplify the entire plasmid and introduce the point mutation. Mutations were verified by Sanger sequencing using custom sequencing primers (Supplementary Table 1).

Transformation, expression, and protein purification

The JWL02 and JWL03 plasmids were co-transformed into Escherichia coli BL21 cells by electroporation, plated on LB agar plates containing 50 μg/mL kanamycin and 100 μg/mL ampicillin, and grown overnight at 37 °C. One colony was inoculated into 50 mL LB media containing kanamycin and ampicillin and grown overnight at 37 °C, 250 RPM. In all, 10 mL of this starter culture was transferred to 1 L LB media containing kanamycin and ampicillin in a 4-L flask and grown at 37 °C, 180 RPM in an Innova 42 shaker (New Brunswick) until the OD600 nm reached 0.6. The culture was cooled to 15 °C and expression was induced with 0.5 mM IPTG. Expression occurred at 15 °C, 180 RPM overnight.

Cells were harvested by centrifugation at 4000 × g for 15 min and resuspended in lysis buffer (200 mM potassium phosphate pH 7.4, 300 mM KCl, 10 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoethanol, 0.5 mM PMSF, 1 mM benzamidine, and 5 mM aminocaproic acid). Resuspended cells were incubated with DNAse I and lysozyme for 10 min. Cells were lysed by sonication (Branson Analog Sonifier S-450A) in an ice-water bath with five cycles of

15 W pulses every 0.5 s for 1 min followed by 2 min rest. The lysate was cleared by centrifugation at 40,000 × g for 1 h. The cleared lysate was filtered using a 0.22-μm filter and loaded onto a pre-equilibrated 5 mL HisTrap column (GE Healthcare). The column was washed with 10 column volumes of wash buffer (200 mM potassium phosphate pH 7.4, 300 mM KCl, 20 mM imidazole, and 5 mM β-mercaptoethanol) before elution with a linear gradient of 0–100% elution buffer (200 mM potassium phosphate pH 7.4, 150 mM KCl, 300 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoethanol) over 20 column volumes. Fractions were pooled and concentrated to 1 mL and injected into a Superose6 10/300 GL column (GE Healthcare) pre-equilibrated with TBS (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl). Gel filtration fractions were pooled and concentrated to 2 mg/mL, flash frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C. For cryoEM samples, proteins were used fresh on the day of purification.

Activity assays

Activity assays of purified recombinant FAS were performed as described 14 . Briefly, 20 μg FAS was mixed with 0.2 mM acetyl-CoA, 0.7 mM NADPH, 1 mM DTT, and 100 mM potassium phosphate pH 7.4 in a 100-μL reaction. The level of NADPH was monitored at 340 nm for 3 min and the reaction was started by adding 30 nM malonyl-CoA and monitored for 1 h. The specific activity of wild type recombinant FAS was measured from three independent protein preparations to be 78 ± 32 mU/mg, where one unit is defined as consumption of 1 μmol of malonyl-CoA per minute. Only linear part of the curve (i.e. 2 min post malonyl-CoA addition) was used for calculation of the specific activity 25 .

CryoEM sample preparation and image collection

To prepare samples for CryoEM imaging, 3 μl of freshly purified protein complexes were added at a concentration of 1–2 mg/ml to glow-discharged (25 s in air) holey gold grids 26 mounted in a Vitrobot Mark IV. Blotting was done for 3 s at 4 °C and 100% humidity before plunge freezing in liquid ethane. A total of three grids were prepared per condition reported in Supplementary Table 2 and Supplementary Table 3 from the same purifications. Data reported in Supplementary Table 2 were collected from one grid and data reported in Supplementary Table 3 were collected from three grids.

Electron micrographs were collected with a FEI Tecnai F20 field emission electron microscope equipped with a Gatan K2 summit direct detector device (DDD) camera. Micrographs were acquired as movies in counting mode using DigitalMicrograph® software with 1.45 Å/pixel, 2 frames/s for 15 s, and an exposure rate of 1.2 e − /Å 2 /frame (Supplementary Table 2 and Supplemantary Table 3). Images were converted to mrc format using dm2mrc 27 .

Stock solutions of acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH were prepared at a concentration of 10 mM in TBS buffer. For the AT and MPT double mutant FAS construct (S274A - S1808A), 1 μL of either acetyl-CoA or malonyl-CoA stock solutions were diluted with TBS to 5 μL before addition to 10 μg (at 2 mg/ml) of purified FAS, before application onto cryoEM grids.

For KR (Y839A), DH (H1564A), and ER (H740A) mutants, 100 nmol NADPH and 50 nmol malonyl-CoA were added to the pooled and concentrated HisTrap fractions (final volume 0.5 ml) and incubated for 1 h at room temperature. Substrates were removed by gel filtration as described above. In total, 10 μg (at 2 mg/ml) of purified FAS was mixed with a 5-μL solution containing 10 nmol acetyl-CoA, 25 nmol NADPH, and 15 nmol malonyl-CoA. Samples were kept on ice for 30 min before application onto cryo-EM grids.

For the WT FAS, 10 μg of purified FAS at 2 mg/ml was mixed with solutions containing either 5 μL of TBS (for the apo sample), or 5 μL of TBS containing 10 nmol acetyl-CoA, 25 nmol NADPH, and 15 nmol malonyl-CoA (for turn-over conditions) on ice, respectively. Samples were applied onto the cryoEM grids immediately after the addition of TBS plus substrates.

Image processing

Data presented in Supplementary Table 2 were processed with cryoSPARC 2.0 28 . Movies were aligned by alignframe_lmbfgs implemented in cryoSPARC 2.0 29 . CTF estimation was done with CTFFIND4 30 . Particle motion correction was performed with alignpart_lmbfgs implemented in cryoSPARC 2.0 29 . High resolution refinement was done with the homogenous refinement algorithm using particles selected from reference free 2D classification. A 30-Å low-pass filtered cryoEM map was generated from PDB: 2UV8 7 with ACP atoms deleted from the model. This map was used as the initial reference in the homogenous refinement. Model to map conversion was carried out in UCSF Chimera 31 . Low-pass filtering of refined maps was carried out using the ‘relion_image_handler’ command. All one-voxel-thin slices were generated using XIMDISP 32 .

Data presented in Supplementary Table 3 were processed in Relion 3.0 33 . Movies were aligned with the Relion implementation of MotionCor2 and CTF estimation was performed using CTFFIND4. Following 2D classification, all 3D classification was done with C1 symmetry using a 30-Å low-pass filtered cryoEM map generated from PDB 2UV8 with ACP atoms deleted as the initial reference. Particle images were selected from 3D classes and refinement was done with C1 symmetry. The refined maps were aligned to the D3 symmetry axis and a second refinement was carried out with D3 symmetry imposed. The reference was aligned to the symmetry axis using the ‘relion_align_symmetry’ command.

Focused classification

A mask for focused classification was made by rigid body docking of a model of a β-chain protomer and the ACP domain from an α-chain protomer from the FAS crystal structure (PDB: 2UV8) to an asymmetric unit of the D3 refined map of the DH-stalled FAS. Residues from the ER and DH domains of the β-chain were selected based on proximity to the observed ACP density in the DH-stalled state and the domain boundaries identified in a previous crystallographic study of S. cerevisiae FAS 7,8 . The residues were 601–704 (ER domain, encompassing the ACP binding sites observed in C. albicans și T. thermophilum) and residues 1236–1658 (DH pseudo-dimer). ACP residues 140–302 from the α-chain of FAS (PDB: 2UV8) were rigid body docked into the D3 refined map of DH-stalled FAS in the asymmetric unit with the docked β-chain fragments. This model comprising partial segments of ER and DH domains plus the whole ACP domain docked at the observed ACP density in the DH-stalled state was used to generate the initial reference and was low-pass filtered to 15 Å for the focused classifications described below. To create a mask that covered the partial model and the position of the ACP in the ER binding mode, we expanded the aforementioned partial model of ER-DH -ACP DH by including a second model of the ACP domain docked at the ER binding site based on homology to previously observed ACP bound to ER in fungal FAS (PDB: 6U5V) 14 . A 15-Å resolution mask (i.e. focused mask) comprising the residues mentioned above was generated with UCSF chimera and Relion 3.0. The focused mask was extended by 3 pixels (1.45 Å/pixel) with 3 pixel padding. This mask was subtracted from a mask generated from the D3 refined map of DH-stalled FAS to produce a subtracted mask. The subtracted mask was then multiplied by the map and the ‘modified map’ containing all regions of FAS except for the region defined by the focused mask, was used for subsequent steps.

The rotation matrix for each asymmetric unit of FAS (i.e. α-,β-chain heterodimer) was computed using the original particle images with alignment information from the D3 symmetry refinement (done in Relion 3.0) via the ‘relion_particle_symmetry_expand’ command 20,34 . Different projections from the ‘modified map’ were then generated based on orientation information from the D3 symmetry refinement. These projections were subtracted from the symmetry expanded particle images. Subtracted images were used for focused 3D classification without orientation search in Relion 3.0 with an optimized regularization parameter of 500. The focused refinement was done in cryoSPARC 2.0 by importing the subtracted particle data set from Relion 3.0 belonging to the ACP containing 3D class in Fig. 3 (i.e. Class 1 in Supplementary Fig. 5) low-pass filtered to 20 Å as the initial reference. The mask for the cryoSPARC focused refinement was generated using the initial reference map in Relion 3.0 and low-pass filtered to 15 Å and expanded by 3 pixels with 3 pixels padding. A B factor of 344 was estimated using Guinier plot analysis implemented in cryoSPARC and used for map sharpening. A local resolution estimate of the focused refined map was done using cryoSPARC 2.0.

Model fitting and visualization

Model fitting was done by rigid body docking of the selected regions of ER, DH, and ACP domains, as described in the manuscript text, into the cryoEM maps of the stalled complexes. An atomic model of FAS (PDB: 2UV8 7 ) was used for docking. Maps and models were visualized with UCSF chimera 31 and PyMol 35 . Flexible fitting was done for Fig. 4b and Supplementary Fig. 6d using PHENIX real space refinement with the resolution limited to 6 Å. The Ramachandran statistics were: 83.8% favored, 15.85% allowed, and 0.35% outlier. For the distance measurements reported in Figs. 4b and 5, side chain conformations for residues H740, D1559, and H1564 were from PDB: 2UV8.

Alinierea secvenței

Non-redundant protein sequences corresponding to the subphylum Saccharomycotina (i.e. true yeast, taxonomy id: 147537) were chosen for alignment using BLASTp 36 . The β-chain sequence of S. cerevisiae FAS was chosen as the search template. A maximum number of 100 sequences was chosen for initial display. Sequences belonging to different strains of S. cerevisiae were excluded from the analysis. The remainder encompassed 58 sequences from other species of Saccharomycotina (Supplementary Data 2). Multiple sequence alignment was done with Clustal Omega 37 . LOGO plots were generated via the WebLogo server 38 with the y-axis set to represent frequency of amino acids plotted against amino acid number (based on S. cerevisiae sequence) on the x-axis.

Rezumatul raportării

Mai multe informații despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul raportării cercetărilor în natură, legat de acest articol.


22.4.7. Citratul transportă grupuri acetil de la mitocondrii la citosol pentru sinteza acizilor grași

The synthesis of palmitate requires the input of 8 molecules of acetyl CoA, 14 molecules of NADPH, and 7 molecules of ATP. Fatty acids are synthesized in the cytosol, whereas acetyl CoA is formed from pyruvate in mitochondria. Hence, acetyl CoA must be transferred from mitochondria to the cytosol. Mitochondria, however, are not readily permeable to acetyl CoA. Recall that carnitine carries only long-chain fatty acids. The barrier to acetyl CoA is bypassed by citrate, which carries acetyl groups across the inner mitochondrial membrane. Citrate is formed in the mitochondrial matrix by the condensation of acetyl CoA with oxaloacetate (Figure 22.25). When present at high levels, citrate is transported to the cytosol, where it is cleaved by ATP-citrate lyase.

Lyases-

Enzymes catalyzing the cleavage of C-C, C-O, or C-N bonds by elimination. A double bond is formed in these reactions.

Figure 22.25

Transfer of Acetyl CoA to the Cytosol. Acetyl CoA is transferred from mitochondria to the cytosol, and the reducing potential NADH is concomitantly converted into that of NADPH by this series of reactions.

Thus, acetyl CoA and oxaloacetate are transferred from mitochondria to the cytosol at the expense of the hydrolysis of a molecule of ATP.


Concluzie

Type II PKSs manufacture many structurally complex and bioactive organic molecules that serve as important antibiotics and anticancer agents. ACPs play a pivotal role in these biosynthetic processes by interacting with virtually all building blocks, intermediates, and enzymes throughout the manufacturing of polyketide products. Engineering strategies, such as hybrid synthase production, precursor-directed biosynthesis, mutagenesis, metabolic engineering, and combinatorial biosynthesis, all rely in some way on the ability of the ACP to function with noncognate enzyme partners and/or molecular substrates. Therefore, understanding the molecular-level structure and function relationships of type II PKS ACPs will be crucial to harnessing the power of nature’s molecular assembly lines. A fully integrated approach to studying type II PKS ACP mechanisms and structures will be important, and we envision that the needle of the field will be moved by merging MD simulations with bioinformatics, mutagenesis work, probe applications, structural characterization techniques, and biochemical assays. With routes to access KSCLF samples that were previously difficult to obtain and recent advances in protein structure prediction software, it is an exciting time to uncover the molecular underpinnings of these remarkable systems.


Priveste filmarea: Официальная трансляция EA Russia 0112 (Ianuarie 2022).