Informație

Ce poate provoca ligarea capetelor lipicioase incompatibile?


Întrebare actuală

Am motive să cred (detalii vezi mai jos) că într-o ligatură pe care am efectuat-o, un capăt lipicios EcoRI (EcoRI: G'AATT_C) și un capăt lipicios XmaI (XmaI: C'CCGG_G) au fost cumva ligate împreună, proces în timpul căruia cel puțin situsul EcoRI s-a pierdut: plasmida avea un situs BamHI foarte aproape de situsul XmaI și un digest BamHI / EcoRI a produs o singură bandă în comparație cu trei benzi din controlul nedigerat (trei conformații ale plasmidei circulare).

Cum ar putea fi ligate capete la fel de incompatibile ca EcoRI și XmaI?

Context detaliat sau: De ce cred că au fost legate site-urile incompatibile

Aceasta este cronologic în continuare: Care sunt cauzele frecvente ale produselor de ligare neașteptate ?. Pe scurt: am digerat două plasmide, una cu EcoRI și XmaI (p1), cealaltă cu EcoRI și AgeI (p2) [XmaI și AgeI produc capete lipicioase compatibile], apoi am efectuat o ligătură între o inserție de 1,4kb izolată de p2 (structură EcoRI-1.4kb-AgeI) în coloana vertebrală de 3.4kb izolată din p1 (structura XmaI-20bp-BamHI-3.4kb-EcoRI). După transformare, am testat produsul de ligare prin digest cu EcoRI și BamHI, care ar trebui să producă din nou 3.4kb + 1.4kb. Gelul a fost de calitate slabă, dar a permis concluzia că există diferite produse de ligare.

Repetarea digestului și gelului EcoRI / BamHI a arătat mai atent că există doar două variante: Varianta A (8 colonii) a produs cele două benzi așteptate 3.4kb și 1.4kb. Varianta B (4 colonii) a produs doar o bandă clară de 3,4 kb, nimic altceva vizibil pe bandă: cu alte cuvinte, purta doar un site EcoRI sau un sit BamHI și era în total mai mică decât varianta A (confirmată de controale nedigerate). Astfel, concluzionez că B a fost pur și simplu aceeași coloană vertebrală de 3,4 kb, re-ligată fără insertul de 1,4 kb. Deoarece situl BamHI a fost neatins în coloana vertebrală în timpul digestiei pregătitoare EcoRI / XmaI, presupun că situl EcoRI nu a fost recuperat în timpul ligării variantei B.

(Ligatura a fost efectuată peste noapte la 16 grade C, folosind ADN ligază și tampon Promega T4 și un raport molar de 3: 1 insert: vector la un volum total de 20 uL. E. colii pentru transformare au fost Invitrogen OneShot Stbl3 și au fost utilizat în mod obișnuit și cu succes în laborator pentru o lungă perioadă de timp. Digestia analitică a folosit Promega EcoRI și BamHI în Buffer Multi-Core, despre care Promega susține că oferă o eficiență de 75-100% pentru ambele enzime. Incubația a fost de 1,5 ore la 37 ° C.)


Răspunsul de la @ Armat m-a determinat să mă uit din nou la activitățile vedetelor. EcoRI este predispus să prezinte activitate stelară în tampoane non-optime. În cazul acestei enzime, aceasta tinde să fie o relaxare a specificității sitului, astfel încât HAATTC și GAATTD ar fi posibile situri tăiate. Scindarea la astfel de situri produce capătul lipicios standard.

Deci, ce se întâmplă dacă există un site stelă aproape de site-ul XmaI astfel încât un rezumat la adevăratul site EcoRI și, de asemenea, la site-ul stea îndepărtează site-ul XmaI și astfel permite recircularizarea. Dacă configurația a fost, de exemplu:

… GAATTC… [XmnI] .GAATTD… GGATCC…

produsul ligat nu ar avea nici site-uri EcoRI, nici XmnI.


Cea mai bună presupunere a mea pentru a explica acest fenomen a fost degradarea spontană a capetelor lipicioase, urmată de o ligatură extremă.

Alternativ, activitatea de exonuclează monocatenară fie dintr-o enzimă contaminantă, fie din EcoRI / XmaI / AgeI ar putea fi imaginabilă. De exemplu, utilizarea tamponului Multi-Core este descurajată pentru EcoRI din cauza activității STAR potențiale - poate că a dezvoltat activitate de exonuclează și unele plasmide au sfârșit direct înainte de ligare.


Vreau să adaug o explicație suplimentară. Prin experiența personală, pot spune că capetele lipicioase incompatibile se pot lega în anumite condiții. Eficiența va fi mai mică decât utilizarea capetelor compatibile, dar totuși, o anumită moleculă se va lega dacă capetele monocatenare se pot recoace suficient cât ligaza să se alăture coloanei vertebrale a ADN-ului. Acest lucru se poate întâmpla în special la temperaturi mai scăzute, în cazul în care recoacerea greșită a capetelor lipicioase este mai stabilă decât la temperaturi mai ridicate.

PO afirmă:

Ligatura a fost efectuată peste noapte la 16 grade C.

Această condiție este suficientă pentru a permite capetelor lipicioase incompatibile să se recoacă suficient de des pentru a fi legat. Propun PO pentru a rula un experiment comparativ pentru a verifica eficiența ligaturii cu capete incompatibile, executând o ligare la 37 ° C timp de 15 minute și una la 16 ° C peste noapte. Mă aștept să nu apară aproape nici o ligatură de fond în primul caz.


XRCC4: ADN ligaza IV poate lega capete de ADN incompatibile și poate lega peste goluri

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Adresa actuală: Divizia de Genetică Medicală, Departamentul de Pediatrie, Institutul de Cercetări Biomedice din Los Angeles, Centrul Medical Harbour-UCLA, 1124 W Carson Street, Torrance, CA 90502, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Adresa actuală: Divizia de Genetică Medicală, Departamentul de Pediatrie, Institutul de Cercetări Biomedice din Los Angeles, Centrul Medical Harbour-UCLA, 1124 W Carson Street, Torrance, CA 90502, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

Departamente de Patologie, Biochimie și Biologie Moleculară, Microbiologie Moleculară și Imunologie și Științe Biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA

Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

  • Jiafeng Gu 1, 2,
  • Haihui Lu 1,
  • Brigette Tippin 2,
  • Noriko Shimazaki 1,
  • Myron F Goodman 2 și
  • Michael R Lieber 1, 2
  • 1 Departamente de patologie, biochimie și biologie moleculară, microbiologie moleculară și imunologie și științe biologice, USC Norris Comprehensive Cancer Center, Universitatea din California de Sud Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, SUA
  • 2 Departamentul de Științe Biologice, Los Angeles, CA, SUA

*Autorul corespunzator. Norris Cancer Ctr., Rm. 5428, Universitatea din California de Sud, 1441 Eastlake Ave., MC 9176, Los Angeles, CA 90033, SUA. Tel .: +1 323 865 0568 Fax: + 1323 865 3019 E-mail: [email & # 160protejat]

XRCC4: ADN ligaza IV poate lega capete de ADN incompatibile și poate lega peste goluri

XRCC4 și ADN ligaza IV formează un complex care este esențial pentru repararea tuturor rupturilor de ADN cu dublă catenă prin calea de aderare a capătului ADN neomolog în eucariote. Găsim aici că XRCC4 umană: ADN ligaza IV poate lega două capete de ADN cu dublă catenă care au configurații de incompatibilitate scurte 3 ′ complet incompatibile, fără potențial de asociere a bazelor. Mai mult, la capetele ADN care împărtășesc 1-4 perechi de baze recoapte, XRCC4: ADN ligaza IV se poate lega prin goluri de 1 nt. Ku poate stimula îmbinarea, dar nu este esențial atunci când există o anumită recoacere terminală. Polimeraza mu poate adăuga nucleotide într-un mod independent de șablon în condiții fiziologice și subsetul de capete care astfel câștigă o oarecare microhomologie terminală poate fi apoi ligat. Prin urmare, recoacerea la locurile microhomologiei este foarte importantă, dar flexibilitatea complexului ligazei este primordială în îmbinarea finală a ADN-ului neomolog. Aceste observații oferă o explicație pentru mai multe in vivo observații care erau greu de înțeles anterior.


Inginerie genetică: istorie, instrumente moleculare și altele

Ingineria genetică implică în primul rând manipularea materialului genetic (ADN) pentru a atinge obiectivul dorit într-un mod predeterminat.

Unii alți termeni sunt, de asemenea, în uz comun pentru a descrie ingineria genetică. eu. Manipularea genelor ii. Tehnologia ADN-ului recombinant (ADNr) iii. Clonarea genelor (clonarea moleculară) iv. Modificări genetice v. Genetică nouă.

Scurt istoric al tehnologiei ADN-ului recombinant:

Actuala tehnologie ADN își are rădăcinile în experimentele efectuate de Boyer și Cohen în 1973. În experimentele lor, au recombinat cu succes două plasmide (pSC 101 și pSC 102) și au clonat noua plasmidă în E.coli. Plasmida pSC 101 posedă o genă rezistentă la antibioticul tetraciclină, în timp ce plasmida pSC 102 conține o genă rezistentă la un alt antibiotic kanamicină. Plasmida recombinată recent dezvoltată, atunci când este încorporată în bacterii, a prezentat rezistență atât la antibiotice-tetraciclină, cât și la kanamicină.

Al doilea set de experimente ale lui Boyer și Cohen au fost mai organizate. O genă care codifică o proteină (necesară pentru a forma ARNr) a fost izolată din celulele broastei africane cu gheare Xenophs laevis, prin utilizarea unei enzime endonucleaze de restricție (ECoRI). Aceeași enzimă a fost folosită pentru a tăia ADN-ul plasmidei pSC 101. Fragmentele de ADN de broască și fragmentele de ADN de plasmidă au fost amestecate, iar împerecherea a avut loc între perechile de baze complementare.

Prin adăugarea enzimei ADN ligază, s-a dezvoltat un ADN plasmidic recombinat. Aceste noi plasmide, introduse în E.coli și crescute pe un mediu nutritiv au dus la producerea unei proteine ​​suplimentare (adică a proteinei broaște). Astfel, genele unei broaște ar putea fi transplantate cu succes și exprimate în E.coli. Acest lucru a făcut adevăratul început al tehnologiei moderne ADNr și a pus bazele pentru biotehnologia moleculară actuală.

Unii biotehnologi care admiră experimentele Boyer-Cohen împart subiectul în două categorii cronologice:

1. BBC-biotehnologie Înainte de Boyer și Cohen.

2. ABC-biotehnologie După Boyer și Cohen.

Mai multe informații despre evoluțiile istorice ale ingineriei genetice și biotehnologiei sunt oferite în domeniul biotehnologiei.

O schiță a tehnologiei ADN recombinant:

Există multe tehnici diverse și complexe implicate în manipularea genelor. Cu toate acestea, principiile de bază ale tehnologiei ADN-ului recombinant sunt rezonabile de simple și implică în general etapele următoare (Fig. 6.1).

1. Generarea fragmentelor de ADN și selectarea piesei de ADN dorite (de exemplu, o genă umană).

2. Introducerea ADN-ului selectat într-un vector de clonare (de exemplu, o plasmidă) pentru a crea un ADN recombinant sau ADN himeric (Chimera este un monstru din mitologia greacă care are un cap de leu și un capră, un corp de capră și un șarpe și un șarpe coada. Acest lucru poate fi comparabil cu Narasimha în mitologia indiană).

3. Introducerea vectorilor recombinați în celulele gazdă (de exemplu, bacterii).

4. Multiplicarea și selecția clonelor care conțin moleculele recombinante.

5. Exprimarea genei pentru a produce produsul dorit.

Tehnologia ADN-ului recombinant cu referire specială la următoarele aspecte este descrisă mai jos:

1. Instrumente moleculare de inginerie genetică.

2. Celulele gazdă - fabricile de clonare.

3. Vectori-vehiculele de clonare.

4. Metode de transfer genic.

5. Strategii de clonare genică.

6. Linii directoare de inginerie genetică.

7. Viitorul ingineriei genetice.

Instrumente moleculare de inginerie genetică:

Un inginer este o persoană care proiectează, construiește (de exemplu, poduri, canale și căi ferate) și manipulează conform unui plan stabilit. Termenul de inginer genetic poate fi adecvat pentru o persoană care este implicată în manipulări genetice. Setul de instrumente inginer genetic și instrumentele moleculare # 8217s și anume enzimele cele mai frecvent utilizate în experimentele ADN recombinante sunt descrise pe scurt.

Endonucleaze de restricție - enzime de tăiere a ADN-ului:

Endonucleazele de restricție sunt unul dintre cele mai importante grupe de enzime pentru manipularea ADN-ului. Acestea sunt enzimele bacteriene care pot tăia / diviza ADN-ul (din orice sursă) la anumite situri. Au fost descoperiți pentru prima dată în E.coli restricționând replicarea bacteriofagilor, prin tăierea ADN-ului viral (ADN-ul E.coli gazdă este protejat de scindare prin adăugarea de grupări metil). Astfel, enzimele care restricționează replicarea virală sunt cunoscute sub numele de enzime de restricție sau endonucleaze de restricție.

Sute de endonucleaze de restricție au fost izolate de bacterii, iar unele dintre ele sunt disponibile comercial. Progresul și creșterea biotehnologiei sunt inimaginabile fără disponibilitatea enzimelor de restricție.

Endonucleazele de restricție sunt denumite printr-o procedură standard, cu referire specială la bacteriile din care sunt izolate. Prima literă (în italice) a enzimelor indică numele genului, urmată de primele două litere (și în italice) ale speciei, apoi apare tulpina organismului și în cele din urmă un număr roman care indică ordinea descoperirii. Câteva exemple sunt date mai jos.

EcoRI provine din Escherichia (E) coli (co), tulpina Ry13 (R) și prima endonuclează (I) care trebuie descoperită. Hindlll provine de la gripa Haemophilus (H) (in), tulpina Rd (d) și a treia endonuclează (III) care urmează să fie descoperită.

Tipuri de endonucleaze:

Cel puțin 4 tipuri diferite de endonucleaze de restricție sunt cunoscute de tip 1 (de exemplu Ecok12), de tip II (de exemplu EcoRI), de tip III (de exemplu EcoPI) și de tip II. Trăsăturile lor caracteristice sunt date în Tabelul 6.1. Dintre acestea, endonucleazele de restricție de tip II sunt cele mai frecvent utilizate în clonarea genelor.

Secvențe de recunoaștere:

Secvența de recunoaștere este locul în care ADN-ul este tăiat de o endonuclează de restricție. Endonucleazele de restricție pot recunoaște în mod specific ADN-ul cu o anumită secvență de 4-8 nucleotide și se scindează. Fiecare secvență de recunoaștere are două simetrii rotaționale, adică aceeași secvență nucleotidică are loc pe ambele fire de ADN care rulează în direcție opusă (Tabelul 6.2). Astfel de secvențe sunt denumite palindromi, deoarece citesc similar în ambele direcții (înainte și înapoi).

Modele de decolteare:

Majoritatea endonucleazelor de restricție (în special tipul II) taie ADN-ul la siturile definite în secvența de recunoaștere. O listă selectată de enzime, secvențe de recunoaștere și produsele lor formate este prezentată în Tabelul 6.2. Fragmentele de ADN tăiate prin endonucleaze de restricție pot avea în mare parte capete lipicioase (capete coezive) sau capete contondente, așa cum este dat în tabelul 6.2. Fragmentele de ADN cu capete lipicioase sunt deosebit de utile pentru experimentele de ADN recombinant. Acest lucru se datorează faptului că capetele de ADN lipicios monocatenare se pot împerechea cu ușurință cu orice alt fragment de ADN care are capete lipicioase complementare.

DNA Ligases — ADN Joining Enzymes:

Fragmentele de ADN tăiate sunt unite covalent între ele prin ligazele ADN. Aceste enzime au fost inițial izolate de viruși. Ele apar și în E.coli și celulele eucariote. Ligazele ADN au participat activ la procesul de reparare a ADN-ului celular.

Acțiunea ligazelor ADN este absolut necesară pentru a ține permanent bucăți de ADN. Acest lucru se întâmplă întrucât legăturile de hidrogen formate între bazele complementare (ale catenelor de ADN) nu sunt suficient de puternice pentru a menține catenele împreună. ADN ligaza unește (sigilează) fragmentele ADN prin formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea fosfat a 5 & # 8242-carbon al unei dezoxiriboze cu gruparea hidroxil 3 & # 8242-carbon a altei dezoxiriboze (Fig. 6.2).

ADN ligaza fagului T4 necesită ATP ca cofactor, în timp ce ADN ligaza E.coli este dependentă de NAD +. În fiecare caz, cofactorul (ATP sau NAD +) este divizat pentru a forma un complex enzimă-AMP care determină formarea unei legături fosfodiesterice. Acțiunea ADN ligazei este pasul final în formarea unei molecule de ADN recombinant.

Coada homo-polimerică:

Catenele ADN complementare pot fi unite între ele prin recoacere. Acest principiu este utilizat în coada homo-polimerică. Tehnica implică adăugarea de oligo (dA) la capetele 3 și # 8242 ale unor molecule de ADN și adăugarea oligo (dT) la capetele 3 și # 8242 ale altor molecule. Extensiile homo-polimerice (prin adăugarea a 10-40 de reziduuri) pot fi sintetizate folosind deoxinucleotidiltransferaza terminală (a timusului vițelului). Coada homo-polimerică, realizată prin recoacere este ilustrată în Fig. 6.3.

Linkere și adaptoare:

Link-urile și adaptoarele sunt molecule de ADN sintetizate chimic, scurte, dublu catenare. Linkerii au site-uri de scindare a enzimei de restricție. Ele pot fi ligate la capetele tocite ale oricărei molecule de ADN și tăiate cu enzime de restricție specifice pentru a produce fragmente de ADN cu capete lipicioase (Fig. 6.4). Adaptoarele conțin capete lipite sau coezive preformate. Sunt utile pentru a fi legați de fragmente de ADN cu capete contondente. Fragmentele de ADN ținute de linkeri sau adaptoare sunt în cele din urmă ligate la molecule de ADN vector (Fig 6.4).

Fosfataza alcalină:

Fosfataza alcalină este o enzimă implicată în îndepărtarea grupărilor fosfat. Această enzimă este utilă pentru a preveni ligarea nedorită a moleculelor de ADN, care este o problemă frecventă întâlnită în experimentele de clonare. Când ADN-ul plasmidic vector liniar este tratat cu fosfatază alcalină, fosfatul 5 & # 8242-terminal este îndepărtat (Fig 6.5). Acest lucru previne atât recircularizarea, cât și formarea dimerului ADN plasmidic. Acum este posibil să se introducă ADN-ul străin prin participarea ADN ligazei.

Enzime modificatoare ADN:

Unii autori preferă să utilizeze termenul larg enzime modificatoare ADN la toate enzimele implicate în tehnologia ADN recombinant. Aceste enzime reprezintă funcțiile de tăiere și îmbinare în manipularea ADN-ului. Acestea sunt, în linii mari, clasificate ca nucleaze, polimeraze și enzime care modifică capetele moleculelor de ADN și sunt descrise pe scurt mai jos și sunt ilustrate în Fig. 6.6.

Nucleazele sunt enzimele care rup legăturile fosfodiesterice (care țin nucleotidele împreună) ale ADN-ului. Endonucleazele acționează asupra legăturilor fosfodiester interne, în timp ce exonucleazele degradează ADN-ul de la capetele terminale (Fig 6.6A). Endonucleazele de restricție, descrise deja, sunt exemple bune de endonucleaze. Sunt enumerate alte câteva exemple de endo- și exonucleaze.

eu. Nuclease S1 acționează în mod specific asupra moleculelor de ADN sau ARN monocatenar.

ii. Deoxiribonucleaza I (DNază I) taie molecule de ADN monocatenare sau dublu catenare la situri aleatorii.

eu. Exonucleaza III taie ADN-ul și generează molecule cu capete 5 și # 8242 proeminente.

ii. Nuclease Bal 31 este un 3 & # 8242-exonuclease cu acțiune rapidă. Acțiunea sa este de obicei cuplată cu endonucleaze cu acțiune lentă.

O reprezentare schematică a acțiunii endo-și exonucleaze este dată în Fig. 6.7.

Pe lângă enzimele de tăiere a ADN-ului, există nucleaze specifice ARN, care sunt denumite ribonucleaze (RNaze).

Grupurile de enzime care catalizează sinteza moleculelor de acid nucleic sunt denumite colectiv polimeraze. Se obișnuiește să se utilizeze numele șablonului de acid nucleic asupra căruia acționează polimeraza (Fig. 6.6B). Cele trei polimeraze importante sunt prezentate mai jos.

A. ADN polimerază dependentă de ADN care copiază ADN-ul din ADN.

b. ADN polimerază dependentă de ARN (transcriptază inversă) care sintetizează ADN din ARN.

c. ARN polimerază dependentă de ADN care produce ARN din ADN.

Enzime care modifică capetele ADN-ului:

Există anumite enzime care acționează asupra capetelor terminale ale ADN-ului și modifică aceste molecule. Cele importante sunt enumerate.

A. Fosfataza alcalină care îndepărtează grupul fosfat terminal (vezi Fig. 6.5).

b. Polinucleotid kinaza implicată în adăugarea grupărilor fosfat.

c. Transferaza terminală (numită și deoxinucleotidil transferaza terminală) adaugă în mod repetat nucleotide la orice capete 3-# 8242-terminale disponibile, cele mai potrivite fiind capetele 3 și # 8242 proeminente. Această enzimă este deosebit de utilă pentru a adăuga cozi homo-polimerice înainte de construirea moleculelor de ADN recombinant.

d. Cele mai frecvent utilizate enzime în tehnologia ADN recombinant / inginerie genetică sunt enumerate în Tabelul 6.3.

Celulele gazdă - fabricile clonării:

Gazdele sunt sistemele sau celulele vii în care poate fi propagat purtătorul moleculei sau vectorului de ADN recombinant. Există diferite tipuri de celule gazdă - procariote (bacterii) și eucariote (ciuperci, animale și plante). Câteva exemple de celule gazdă utilizate în ingineria genetică sunt date în Tabelul 6.4.

Celulele gazdă, pe lângă încorporarea eficientă a materialului genetic vectorial, trebuie cultivate în mod convenabil în laborator pentru a colecta produsele. În general, microorganismele sunt preferate ca celule gazdă, deoarece se înmulțesc mai repede în comparație cu celulele organismului superior (plante sau animale).

Gazde procariote:

Escherichia coli:

Bacteria, Escherichia coli, a fost primul organism utilizat în experimentele tehnologice ADN și continuă să fie gazda preferată de mulți lucrători. Fără îndoială, E.coli, cea mai simplă bacterie Gram negativă (o bacterie comună a intestinului uman și animal), a jucat un rol cheie în dezvoltarea biotehnologiei actuale.

În condiții adecvate, E.coli poate dubla numărul la fiecare 20 de minute. Astfel, pe măsură ce bacteriile se înmulțesc, plasmidele lor (împreună cu ADN străin) se înmulțesc și pentru a produce milioane de copii, denumite colonie sau în clonă scurtă. Termenul de clonă este utilizat în general pentru o masă de celule, organisme sau gene care sunt produse prin multiplicarea unei singure celule, organisme sau gene.

Limitări ale E. coli:

Există anumite limitări în utilizarea E.coli ca gazdă. Acestea includ cauzarea diareei de către unele tulpini, formarea de endotoxine toxice și o capacitate scăzută de export a proteinelor din celulă. Un alt dezavantaj major este că E.coli (sau chiar și alte organisme procariote) nu pot efectua modificări post-translaționale.

Bacillus subtilis:

Bacillus subtilis este o bacterie nepatogenă în formă de tijă. A fost folosit ca gazdă în industrie pentru producerea de enzime, antibiotice, insecticide etc. Unii lucrători consideră B.subtilis ca o alternativă la E.coli.

Gazde eucariote:

Organismele eucariote sunt preferate pentru a produce proteine ​​umane, deoarece aceste gazde cu structură complexă (cu organite distincte) sunt mai potrivite pentru a sintetiza proteine ​​complexe. Cel mai frecvent utilizat organism eucariot este drojdia, Saccharomyces cerevisiae. Este un organism nepatogen utilizat în mod obișnuit în industria berii și a panificației. Anumite ciuperci au fost folosite și în experimentele de clonare genică.

Celule de mamifere:

În ciuda dificultăților practice de a lucra și a factorului de cost ridicat, celulele de mamifere (cum ar fi celulele de șoarece) sunt, de asemenea, utilizate ca gazde. Avantajul este că anumite proteine ​​complexe care nu pot fi sintetizate de bacterii pot fi produse de celule de mamifere de ex. activator plasminogen tisular. Acest lucru se datorează în principal faptului că celulele mamiferelor posedă utilaje pentru a modifica proteina până la forma sa finală (modificări post-translaționale).

Se poate observa aici că experimentele de manipulare a genelor la animale și plante superioare sunt de obicei efectuate pentru a modifica structura genetică a organismului pentru a crea animale transgenice și plante transgenice, mai degrabă decât pentru a izola gene pentru producerea proteinelor specifice.

Vectori - Vehiculele de clonare:

Vectorii sunt moleculele de ADN, care pot transporta un fragment de ADN străin pentru a fi clonat. Acestea se auto-replică într-o celulă gazdă adecvată. Cei mai importanți vectori sunt plasmidele, bacteriofagele, cosmidele și fazmidele.

Caracteristicile unui vector ideal:

Un vector ideal ar trebui să aibă dimensiuni reduse, cu un singur situs de endonuclează de restricție, o origine a replicării și 1-2 markeri genetici (pentru a identifica celulele primitoare purtătoare de vectori). Plasmidele care apar în mod natural posedă rareori toate aceste caracteristici.

Plasmide:

Plasmidele sunt molecule de ADN extra cromozomiale, dublu catenare, circulare, cu auto-replicare. Aproape toate bacteriile au plasmide care conțin un număr mic de copii (1-4 pe celulă) sau un număr mare de copii (10-100 pe celulă). Mărimea plasmidelor variază de la 1 la 500 kb. De obicei, plasmidele contribuie la aproximativ 0,5 până la 5,0% din ADN-ul total al bacteriilor (Notă: câteva bacterii conțin plasmide liniare, de exemplu Streptomyces sp, Borella burgdorferi).

Tipuri de plasmide:

Există multe modalități de grupare a plasmidelor. Acestea sunt clasificate ca conjugative dacă poartă un set de gene de transfer (gene) care facilitează conjugarea bacteriană și neconjugative, dacă nu posedă astfel de gene. O altă clasificare se bazează pe numărul exemplarului. Plasmidele stricte sunt prezente într-un număr limitat (1-2 pe celulă), în timp ce plasmidele relaxate apar în număr mare în fiecare celulă.

F-plasmidele posedă gene pentru propriul lor transfer de la o celulă la alta, în timp ce plasmidele R poartă rezistența genelor la antibiotice. În general, plasmidele conjugative sunt mari, prezintă un control strict al replicării ADN și sunt prezente în număr redus. Pe de altă parte, plasmidele neconjugative sunt mici, prezintă un control relaxat al replicării ADN și sunt prezente în număr mare.

Nomenclatura plasmidelor:

Este o practică obișnuită să se desemneze plasmida printr-o minusculă p, urmată de prima (literele) numelor cercetătorului (cercetătorilor) și de numărul numeric dat de lucrători. Astfel, pBR322 este o plasmidă descoperită de Bolivar și Rodriguez care l-au desemnat ca 322. Unele plasmide primesc nume ale locurilor unde sunt descoperite de ex. pUC este plasmidă de la Universitatea din California.

pBR322 - cel mai comun vector de plasmidă:

pBR322 de E.coli este cel mai popular și utilizat pe scară largă vector plasmid și este considerat în mod adecvat ca părintele sau bunicul altor câțiva alți vectori. pBR322 are o secvență de ADN de 4.361 pb. Poartă rezistența genelor pentru ampicilină (Amp r) și tetraciclină (TeI r) care servesc drept markeri pentru identificarea clonelor purtătoare de plasmide. Plasmida are site-uri de recunoaștere unice pentru acțiunea endonucleazei de restricție, cum ar fi EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail și Pstll (Fig. 6.8).

Alți vectori de donare a plasmidei:

Celelalte plasmide utilizate ca vectori de clonare includ pUC19 (2.686 pb, cu gena de rezistență la ampicilină) și derivați ai pBR322-pBR325, pBR328 și pBR329.

Bacteriofagii:

Bacteriofagii sau pur și simplu fagii sunt virusurile care se reproduc în bacterii. În cazul anumitor fagi, ADN-ul lor se încorporează în cromozomul bacterian și rămâne acolo permanent. Vectorii fagi pot accepta fragmente scurte de ADN străin în genomul lor. Avantajul cu fagii este că pot prelua segmente de ADN mai mari decât plasmidele. Prin urmare, vectorii de fagi sunt preferați pentru lucrul cu genomurile celulelor umane.

Bacteriofagul lambda (sau pur și simplu fagul λ), un virus al E.coli, a fost cel mai aprofundat studiat și dezvoltat ca vector. Pentru a înțelege cum funcționează bacteriofagul ca vector, este de dorit să îi cunoaștem structura și ciclul de viață (Fig. 6.9).

Fagul λ este format dintr-un cap și o coadă (ambele fiind proteine), iar forma sa este comparabilă cu o seringă hipodermică miniaturală. ADN-ul, situat în cap, este o moleculă liniară de aproximativ 50 kb. La fiecare capăt al ADN-ului, există extensii monocatenare de 12 lungimi de bază fiecare, care au capete coezive (cos).

La atașarea cu coada la E. coli, fagul X își injectează ADN-ul în celulă. În interiorul E.coli, ADN-ul liniar al fagului ciclizează și se leagă prin capetele cos pentru a forma un ADN circular. ADN-ul fagic are două cicluri destin-litic și ciclu lizogen.

ADN-ul circular se replică și direcționează, de asemenea, sinteza multor proteine ​​necesare capului, cozii etc., ale fagului. ADN-ul circular este apoi scindat (pentru a forma capete cos) și ambalat în capul fagului. Aproximativ 100 de particule de fagi sunt produse în decurs de 20 de minute de la intrarea fagului în E. coli.

Celula gazdă este apoi supusă lizei și fagii sunt eliberați. Fiecare particulă de fagi descendenți poate infecta o celulă bacteriană și poate produce câteva sute de fagi. Se estimează că, prin repetarea ciclului litic de patru ori, un singur fag poate provoca moartea a mai mult de un miliard de celule bacteriene.

Dacă un ADN străin este îmbinat în ADN-ul fagului, fără a provoca daune genelor fagice, fagul se va reproduce (va reproduce ADN-ul străin) atunci când infectează celula bacteriană. Acest lucru a fost exploatat în vectorii de fag utilizând tehnici de clonare.

În acest caz, ADN-ul fagului (în loc să se replice independent) devine integrat în cromozomul E.coli și se reproduce împreună cu genomul gazdă. Nu sunt sintetizate particule de fagi pe această cale.

Utilizarea fagului λ ca vector:

Doar aproximativ 50% din ADN-ul fagului λ este necesar pentru multiplicarea și alte funcții ale acestuia. Astfel, până la 50% (adică până la 25kb) din ADN-ul fagic poate fi înlocuit cu un ADN donator pentru utilizare în experimentele de clonare. Cu toate acestea, mai multe situri de restricție sunt prezente pe fagul λ care nu este în sine un vector adecvat. Vectorii de fag pe bază de λ sunt modificări ale fagului natural cu un număr mult mai redus de situsuri de restricție.

Au doar un singur site de scindare unic, care poate fi clivat, și un ADN străin ligat. Este esențial ca ADN-ul suficient (aproximativ 25%) să fie șters din vector pentru a face spațiu pentru ADN-ul străin (aproximativ 18kb).

Acești vectori au o pereche de site-uri de restricție pentru a elimina ADN neesențial (ADN de umplere) care va fi înlocuit cu un ADN străin. Vectorii de înlocuire pot găzdui până la 24kb și îi pot propaga. Multe derivări ale vectorilor de fagi (inserție / înlocuire) au fost produse de cercetători pentru utilizare în tehnologia ADN-ului recombinant.

Fagul M13 vectori:

Fagul M13 (bacteriofag M13) este un fag ADN monocatenar al E.coli. În interiorul celulei gazdă, M13 sintetizează catena complementară pentru a forma un ADN bicatenar (forma replicativă ADN ADN RF). Pentru utilizare ca vector, ADN-ul RF este izolat și un ADN străin poate fi inserat pe el. Aceasta este apoi returnată celulei gazdă sub formă de plasmidă. ADN-urile monocatenare sunt recuperate din particulele de fagi. Fagul M13 este util pentru secvențierea ADN-ului prin metoda Sanger & # 8217s

Cosmide:

Cosmidele sunt vectorii care posedă atât caracteristicile plasmidei, cât și ale bacteriofagului λ. Cosmidele pot fi construite prin adăugarea unui fragment de ADN al fagului λ incluzând situl cos, la plasmide. Un ADN străin (aproximativ 40 kb) poate fi inserat în ADN cosmid.

ADN-ul recombinant astfel format poate fi ambalat sub formă de fagi și injectat în E. coli (Fig. 6.10). Odată ajuns în celula gazdă, cosmidele se comportă la fel ca plasmidele și se reproduc. The advantage with cosmids is that they can carry larger fragments of foreign DNA compared to plasmids.

Phasids are the combination of plasmid and phage and can function as either one (i.e as plasmid or phage). Phasids possess functional origins of replication of both plasmid and phage λ, and therefore can be propagated (as plasmid or phage) in appropriate E.coli. The vectors phasids may be used in many ways in cloning experiments.

Artificial Chromosome Vectors:

Human artificial chromosome (HAC):

Developed in 1997 (by H. Willard), human artificial chromosome is a synthetically produced vector DNA, possessing the characteristics of human chromosome. HAC may be considered as a self-replicating micro-chromosome with a size ranging from 1/10th to 1/5th of a human chromosome. The advantage with HAC is that it can carry human genes that are too long. Further, HAC can carry genes to be introduced into the cells in gene therapy.

Yeast artificial chromosomes (YACs):

Introduced in 1987 (by M. Olson), yeast artificial chromosome (YAC) is a synthetic DNA that can accept large fragments of foreign DNA (particularly human DNA). It is thus possible to clone large DNA pieces by using YAC. YACs are the most sophisticated yeast vectors, and represent the largest capacity vectors available. They possess centromeric and telomeric regions, and therefore the recombinant DNA can be maintained like a yeast chromosome.

Bacterial artificial chromosomes (BACs):

The construction of BACs is based on one F-plasmid which is larger than the other plasmids used as cloning vectors. BACs can accept DNA inserts of around 300 kb. The advantage with bacterial artificial chromosome is that the instability problems of YACs can be avoided. In fact, a major part of the sequencing of human genome has been accomplished by using a library of BAC recombinant.

Shuttle Vectors:

The plasmid vectors that are specifically designed to replicate in two different hosts (say in E.coli and Streptomyces sp) are referred to as shuttle vectors. The origins of replication for two hosts are combined in one plasmid. Therefore, any foreign DNA fragment introduced into the vector can be expressed in either host. Further, shuttle vectors can be grown in one host and then shifted to another host (hence the name shuttle). A good number of eukaryotic vectors are shuttle vectors.

Choice of a Vector:

Among the several factors, the size of the foreign DNA is very important in the choice of vectors. The efficiency of this process in often crucial for determining the success of cloning. The size of DNA insert that can be accepted by different vectors is shown in Table 6.5.

Gene Cloning Strategies:

A clone refers to a group of organisms, cells, molecules or other objects, arising from a single individual. Clone and colony are almost synonymous. Gene cloning strategies in relation to recombinant DNA technology broadly involve the following aspects (Fig. 6.13).

A. Generation of desired DNA fragments.

b. Insertion of these fragments into a cloning vector.

c. Introduction of the vectors into host cells.

d. Selection or screening of the recipient cells for the recombinant DNA molecules.

Cloning From Genomic DNA or MRNA?

DNA represents the complete genetic material of an organism which is referred to as genome. Theoretically speaking, cloning from genomic DNA is supposed to be ideal. But the DNA contains non- coding sequences (introns), control regions and repetitive sequences. This complicates the cloning strategies hence DNA as a source material is not preferred, by many workers. However, if the objective of cloning is to elucidate the control of gene expression, then genomic DNA has to be invariably used in cloning.

The use of mRNA in cloning is preferred for the following reasons:

A. mRNA represents the actual genetic information being expressed.

b. Selection and isolation mRNA is easy.

c. As introns are removed during processing, mRNA reflects the coding sequence of the gene.

d. The synthesis of recombinant protein is easy with mRNA cloning.

Besides the direct use of genomic DNA or mRNA, it is possible to synthesize DNA in the laboratory and use it in cloning experiments. This approach is useful if the gene sequence is short and the complete sequence of amino acids is known.

The different strategies for the cloning of genomic DNA and mRNA are described under gene libraries

Genetic Engineering Guidelines:

With the success of Boyer-Cohen experiments (in 1973), it was realised that recombinant DNA technology could be used to create organisms with novel genes. This created worldwide commotion (among scientists, public and government officials) about the safety, ethics and unforeseen consequences of genetic manipulations. Some of the phrases quoted in media in those days are given.

d. The most threatening scientific research.

It was feared that some new organisms, created inadvertently or deliberately for warfare, would cause epidemics and environmental catastrophes. Due to the fears of the dangerous consequences, a cautious approach on recombinant DNA experiments was suggested.

In 1974, a group of ten scientists led by Paul Berg wrote a letter that simultaneously appeared in the prestigious journals-Nature, Science and Proceedings of the National Academy of Sciences.

The dangers of DNA technology were printed out in that letter (highlights given below):

“Recent advances in techniques for isolation and rejoining of segments of DNA now permit construction of biologically active recombinant DNA molecules in vitro. Although such experiments are likely to facilitate the solution of important theoretical and practical biological problems, they would also result in creation of novel types of DNA elements whose biological properties cannot be completely predicted. There is a serious concern that some of these DNA molecules could prove biologically hazardous”.

The letter also appealed to molecular biologists worldwide for a moratorium on many kinds of recombinant DNA research, particularly those involving pathogenic organisms.

Asilomar Recommendations:

In February 1975, a group of 139 scientists from 17 countries held a conference at Asilomar, a conference center in California, USA. They assured the uneasy public that the microorganisms used in DNA experiments were specifically bred and could not survive outside the laboratory. These scientists formulated guidelines and recommendations for conducting experiments in genetic engineering.

NIH Guidelines:

National Institute of Health (NIH), USA constituted the Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) which issued a set of stringent guidelines to conduct research on DNA. RAC was in fact overseeing the research projects involving gene splicing and recombinant DNA.

Some of the important original NIH recommendations on recombinant DNA research relate to the following aspects:

A. Physical (laboratory) containment levels for conducting experiments.

b. Biological containment-the host into which foreign DNA is inserted should not proliferate outside the laboratory or transfer its DNA into other organisms.

c. For research on pathogenic organisms, elaborate, controlled and self-contained rooms were recommended.

d. For research on less dangerous organisms, units equipped with high quality filter systems should be used.

e. No deliberate release of any organism containing recombinant DNA into the environment.

It may be noted here that although the NIH guidelines did not have the legal status, most institutions, companies and scientists voluntarily complied.

Relaxation of NIH guidelines:

It was in 1980, the original NIH guidelines were considerably relaxed by NIH-RAC, based on the experience and experimental data obtained from the NIH-sponsored studies on recombinant DNA research. It was almost agreed that the original apprehensions on recombinant DNA research were unfounded.

It is a fact that the genetic engineering research flourished and progressed rapidly after relaxation of NIH guidelines. It may however be noted that NIH- RAC continues to be a watchdog over the DNA technology experiments.

Pharmaceutical products of recombinant DNA:

As the recombinant DNA technology progressed, many pharmaceutical compounds of human health care are being produced through genetic manipulations. Most countries consider that the existing regulations for approval of pharmaceuticals of commercial use are adequate to ensure safety since the process by which the product manufactured is irrelevant. Thus, the recombinant DNA product (protein, vaccine, and drug) is evaluated for its safety and efficacy like any other pharmaceutical product.

Genetically engineered organisms (GEOs):

Recombinant DNA research has resulted in the creation of many genetically engineered organisms. These include microorganisms, animals and plants. The latter two respectively result in transgenic animals and transgenic plants

The Future of Genetic Engineering:

DNA technology has largely helped scientists to understand the structure, function and regulation of genes. The development of new/modern biotechnology is primarily based on the success of DNA technology. Thus, the present biotechnology (more appropriately molecular biotechnology) has its main roots in molecular biology.

Biotechnology is an interdisciplinary approach for applications to human health, agriculture, industry and environment. The major objective of biotechnology is to solve problems associated with human health, food production, energy production and environmental control.

The major contributions of genetic engineering through the new discipline biotechnology are given in this book.

It is an accepted fact that the recombinant DNA technology has entered the main stream of human life and has become one of the most significant applications of scientific research. Biotechnology is regarded as more an art than a science. After the successful sequencing of human genome, many breakthroughs in biotechnology are expected in future.


Which pair of enzymes produce compatible ends?

Cu toate acestea, unele produce blunt ends. DNA ligase is a DNA-joining enzimă. If two pieces of DNA have matching se termină, ligase can link them to form a single, unbroken molecule of DNA.

Similarly, what is the difference between sticky ends and blunt ends? Blunt și sticky ends areresult of restriction endonuclease action on double stranded DNA. Sticky Ends &ndash are staggered se termină on a DNA molecule with short, single-stranded overhangs. Blunt Ends are a straight cut, down through the DNA that results într-o flat pair of bases on the se termină of the DNA.

Additionally, what are cohesive ends?

Longer overhangs are called cohesive ends or sticky se termină. They are most often created by restriction endonucleases when they cut DNA. Very often they cut the two DNA strands four base pairs from each other, creating a four-base 5' overhang in one molecule and a complementary 5' overhang in the other.

5' overhang- Restriction enzymes that cleave the DNA asymmetrically leave several single stranded bases. If the single-stranded bases end with a 5' phosphate, the enzyme is said to leave a 5' overhang. If the single-stranded bases end with a 3' hydroxyl, the enzyme is said to leave a 3' overhang.


PCR cloning strategies

PCR cloning is a method in which double-stranded DNA fragments amplified by PCR are ligated directly into a vector. PCR cloning offers some advantages over traditional cloning which relies on digesting double-stranded DNA inserts with restriction enzymes to create compatible ends, purifying and isolating sufficient amounts, and ligating into a similarly treated vector of choice (see insert preparation).

With PCR amplification, this cloning technique requires much less starting template materials which include cDNA, genomic DNA, or another insert-carrying plasmid (see subcloning basics). Furthermore, PCR cloning provides a simpler workflow by circumventing the requirement of suitably-located restriction sites and their compatibility between the vector and insert. Nevertheless, there are a number of considerations related to: PCR primers and amplification conditions, the cloning method of choice and the cloning vectors used, and, finally, confirmation of successful cloning and transformation.

With respect to PCR amplification of a sequence of interest, primers must be designed and PCR conditions (components and cycling) optimized for efficient and specific amplification of the template. Primer design tools are available to bioinformatically evaluate and select suitable target-specific primer sequences for amplification. Ligation requires that either the insert or vector has 5′-phosphorylated termini therefore, if the cloning vector lacks 5′-phosphorylated ends, 5′-phosphate groups must be added to the PCR primers during synthesis or by T4 polynucleotide kinase for successful ligation. For PCR optimization, reaction component concentrations, annealing temperatures, and template amounts are of importance.

TA cloning and blunt-end cloning represent two of the simplest PCR cloning methods. Their choice depends upon the nature of the vector and the type of PCR enzymes used in cloning. TA cloning employs a thermostable Taq DNA polymerase capable of amplifying short DNA sequences. This enzyme lacks 3′→ 5′ proofreading activity and features a terminal transferase activity that adds an extra deoxyadenine at the 3′ end of the amplicons (3′ dA). The resulting PCR products with 3′ dA overhangs are readily cloned into a linearized TA cloning vector containing complementary 3′ deoxythymine (3′ dT) overhangs (Figure 1). While relatively straightforward, the limitations of this method include the length of insert (up to 5 kb), the inability to clone inserts directionally, and the high error rate associated with Taq ADN polimerază.

Blunt-end cloning involves the ligation of an insert into a linearized vector where both DNA fragments lack overhangs. Blunt-end inserts can be produced using high-fidelity DNA polymerases with 3′→5′ exonuclease or proofreading activity. Their proofreading activity improves the sequence accuracy of the amplified products however, limitations include lower ligation efficiencies when inserting into blunt-end cloning vectors and the inability to clone directionally. Ligation efficiency can be improved by incubating the amplicons with a Taq DNA polymerase and dATP in a procedure called “3′ dA tailing” (incubate 20–30 minutes at 72°C), then purifying the 3′ dA-tailed products (Figure 1).

Figure 1. Common PCR cloning strategies.

To further simplify and streamline the cloning workflow, specialized vectors have been developed to place an insert into vector, for example, without using a ligase. One such class of vectors includes the Invitrogen TOPO cloning vectors which contain covalently linked DNA topoisomerase I that functions as both a restriction enzyme and a ligase (learn more about TOPO cloning technology). Compared to conventional PCR cloning vectors, these vectors result in shorter ligation reaction times (e.g., 5 minutes) and greater cloning efficiencies (e.g., >95% positive clones) and with a much simpler protocol. Furthermore, directional cloning of the PCR products can be achieved with a specially designed TOPO vector using a specific primer design.

Regardless of the cloning method choice, cloning efficiencies are significantly improved by purification of PCR amplicons prior to the ligation reaction. PCR clean-up helps remove salts, nucleotides, nonspecific amplicons, and primer-dimers. After ligation and transformation into the appropriate competent cells, the resulting colonies need to be screened carefully for the correct insert, as well as its proper frame and orientation for subsequent studies to analyze gene fusions and/or protein expression.


Finding the Best Ligation Biology

Some recombinant proteins aren’t well tolerated by E. coli and can bring about poor transformation or little colonies. Many proteins have a certain affinity for unique phases of substance mobility. MMR proteins act to stop such recombination. Most enzymes arrive in glycerol solution for a storage buffer, but enzymes don’t do the job well in the existence of high glycerol concentration. Restriction enzymes have to be carefully chosen and may be used to verify the size and orientation of the insert. http://www.bleupiscine.fr/what-is-so-fascinating-about-biology-corner/ Hence, it’s essential to use the very same restriction enzyme for the two sources of DNA to create the matching ligating fragments.

1 method utilized for transfecting cells in cell culture is known as electroporation. Competent cells are commercially readily available for efficient and dependable transformation. All the cells within this colony are identical clones and carry exactly the same recombinant plasmid.

Generally speaking, a greater reaction temperature requires less time but might create a decrease yield. Moreover, there’s a gradient farther down the body, with a tall point at the head end. Viral vectors may More Bonuses also be utilized to transfect eukaryotic cells. As a consequence of cleavage by these enzymes, DNA fragments are made with various sorts of ends like sticky ends and blunt ends.

You don’t wish to be cutting your plasmid in necessary regions like the ORI. So every plasmid containing your intended gene won’t be killed by antibiotics. Restriction endonucleases have the ability to cleave dsDNA and produce DNA fragments with distinctive ends.

To cut DNA at known locations, researchers utilize restriction enzymes that were purified from several bacterial species, and that can be purchased from several industrial sources. Singlecell biology is thought to be a new approach to recognize and validate diseasespecific biomarkers. It’s exciting that singlecell biology could be a crucial approach to spot and validate diseasespecific biomarkers. Abstract Singlecell biology is regarded as a new approach to recognize and validate diseasespecific biomarkers. In the event the DNA that’s introduced comes from a different species, the host organism is currently deemed to be transgenic. RNA aussieessaywriter.com.au/ might also be ligated similarly. PCR may also be utilized to facilitate mutagenesis.

The perfect gas law is an superb illustration of a model, concerning both their usefulness and imperfections. If orientation of an insert is essential, two distinct ends increase the probability of the right orientation. Polarity is a moderately complicated notion. Polarity in the creation of the embryo might be illustrated by the early evolution of the nematode embryo. Thus, whatever results in the asymmetry of vacuole pH also has to be asymmetric between mother and daughter cells ahead of cytokinesis.

The DNA ligation kit comprises the reagents necessary to raise the consistency of ligations. For example, you can use PCR product with A end utilizing taq for ligation, and do the adaptor ligation. If it’s not feasible to use two unique websites, then the vector DNA may want to get dephosphorylated to steer clear of a high background of recircularized vector DNA free of insert. When it’s not feasible to use two unique websites, then the vector DNA may want to get dephosphorylated to steer clear of a high background of recircularized vector DNA free of insert. On both sides of the gene is an subject of DNA known as the sticky end. The MCS, if available, is frequently the first selection for insertion, since the region is made specifically for cloning. In addition, it comprises a colonies counter.

Colony number is nearly identical and low (around 100 per plate) whatever the presence or lack of oligos. It appears to be another illustration of asymmetry. A nice instance of polarity featuring all the necessary classical features is a easy organism, hydra. These ends are called sticky or overhanging ends. Both distinct ends can stop the religation of the vector with no insert, and in addition, it makes it possible for the fragment to be inserted in a directional way. The joined ends might be from a single DNA molecule or from various molecules. In the event the sticky ends on each side of the vector are compatible with one another, the vector is a lot more likely to ligate to itself rather than to the desired insert.

Many blunt-ended ligations are performed at 14-25 C overnight. The magnitude of polarization at any point is dependent on the job of the sun, so there’s a pattern of polarization of the sky for any specific position of the sun. Critical features of ligation reactions are discussed, including how the length of a sticky end overhang impacts the reaction temperature and the way the proportion of DNA insert to vector needs to be tailored to stop self-ligation.


CBSE Class 12 Biology Solved Question Paper 2018

Differentiate between Parthenocarpy and Parthenogenesis. Give one example of each.

In most plants, flowers need to be pollinated and fertilized to produce fruits. However, some plants can produce fruits before fertilization or without fertilization. Parthenocarpy is the process which produces fruits from unfertilized ovules in plants. Unfertilized ovules develop into fruits prior to fertilization. These fruits do not contain seeds.

Parthenogenesis is a type of reproduction commonly shown in organisms mainly by some invertebrates and lower plants. It can be described as a process in which unfertilized ovum develops into an individual (virgin birth) without fertilization. Therefore, it can be considered as a method of asexual reproduction.

It is seen in organisms like rotifers, honeybees and even some lizards and birds (turkey). The key difference between parthenogenesis and parthenocarpy is, parthenogenesis is shown by animals and plants while pathenocarpy is shown only by plants.

Give an example of a bacterium, a fungus and an insect that are used as biocontrol agents.

The bacterium, a fungus and insects that are used as biocontrol agents are:

Insects = Ladybird and Dragonflies.

Bacteria = Bacillus thuringiensis

Looking at the deteriorating air quality because of air pollution in many cities of the country, the citizens are very much worried and concerned about their health. The doctors have declared a health emergency in the cities where the air quality is very severely poor.

(a) Mention any two major causes of air pollution.

(b) Write the two harmful effects of air pollution on plants and humans.

(c) As a captain of your school Eco-club, suggest any two programmes you would plan to organise in the school so as to bring awareness among the students on how to check air pollution in and around the school

a)Two causes of air pollution

(1) The burning of fossil fuels.
(2) Smoke released from vehicles.
(3) Industrial effluents
(4) Smoke stacks of thermal power plants.

(b) Harmful effects of air pollution.
(1) It affects respiratory system of humans and of animals.
(2) It also reduces growth and yield of crops & causes premature death of plants.

(c)
(1) Encouraging public transport i.e. buses & using CNG instead of diesel.
(2) Planting more trees to curb pollution.

Medically it is advised to all young mothers that breastfeedings is the best for their newborn babies. Ești de acord? Spuneți motive în sprijinul răspunsului dvs.

Yes, i do agree with the fact that breastfeeding is the best for newborn babies.

Mammary glands start producing milk at the end of pregnancy. The milk produced during the initial few days and lactation is called COLOSTRUM which contains several antibodies.

It helps in developing resistance for a newborn baby. It helps the baby fight of viruses and bacteria. Thus breast milk is packed with a disease-fighting substance that protects your baby from illness.

Breast milk also naturally contains many of the vitamins and minerals that a newborn requires. Also, it is easily digested - no constipation, diarrhoea and upset stomach.

Name the most commonly used bioreactor and describe its working.

The most commonly used bioreactors are of stirring type. A stirred - tank reactors is usually cylindrical or with a curved base to facilitate the mixing of the reactor contents. The stirrer facilitates even mixing and oxygen availability throughout the bioreactor. The bioreactor has an agitator system, an oxygen delivery system and a foam control system, a temperature control system. pH control system and sampling ports so that small volumes of the culture can be withdrawn periodically.

How has the development of bioreactor helped in biotechnology?

Small volume cultures cannot yield appreciable quantities of products. To produce in large quantities, the development of bioreactors, where large volumes (100-100 litres) of culture can be processed, was required. Thus, bioreactors can be thought of as vessels in which raw material are biologically converted into specific products, individual enzymes, etc., using the microbial plant, animal or human cells.

Expand VNTR and describe its role in DNA fingerprinting.

VNTR stands for &ldquoVariable Number of Tandem Repeats&rdquo.
The VNTR belongs to a class of satellite DNA referred to as mini-satellite. A small DNA sequence is arranged tandemly in many copy numbers. The copy number varies from chromosome to chromosome in an individual. The numbers of repeat show very high degree of polymorphism. As a result th size of VNTR varies in size from 0.1 to 20 kb. Consequently, after hybridization with VNTR probe, the autoradiogram gives many bands of differing sizes. These bands give characteristic pattern for an individual DNA which is used to identify individuals.

Draw a diagram of a mature human sperm. Label any three parts and write their functions.

(1) Acrosome: It is a cap-like structure, filled with hydrolytic enzymes that help fertilisation of the ovum.

(2) Middle piece: Possesses numerous mitochondria, which produces energy for the movement of tail.

(3) Tail: Facilitate sperm motility essential for fertilisation.

Explain the roles of the following with the help of an example each in recombinant DNA technology:

  1. Restriction enzymes belong to the class of enzymes nucleases which breaks nucleic acids by cleaving their phosphodiester bonds.
  2. Since Restriction endonucleases cut DNA at specific recognition site, they are used to cut the donor DNA to isolate the desired gene.
  3. The desired gene has sticky ends which can be easily ligated to cloning vector cut by same restriction enzymes having complementary sticky ends to form recombinant DNA
  4. An example is EcoR1 which is obtained from E.coli bacteria &ldquoR&rdquo strain which cuts DNA at specific palindromic Recognition site.
    5&lsquo GAATTC 3&lsquo
    3&lsquo CTTAAG 5&lsquo
  1. Plasmids are autonomous, extrachromosomal circular double-stranded DNA of bacteria
  2. Since they are small and self replicating,they are used as cloning vectors in genetic engineering.
  3. Some plasmids have antibiotic resistance genes which can be used as marker genes to identify recombinant plasmids from non-recombinant ones.
  4. The plasmids are cut and ligated with desired genes and transformed into a host cell for amplification to obtain the desired products.
  5. An example of artificially modified plasmids is pBR322 ( constructed by Bolivar and Rodriguez) or pUC (constructed at university at California).

List any two applications of DNA fingerprinting technique.

Since DNA from every tissue (such as blood, hair - follicle , skin, bone, saliva, sperm etc.), from an individual, show the same degree of polymorphism, they become very useful identification tool in forensic
applications to identify criminals. Further, as the polymorphisms are inheritable from parents to children, DNA fingerprinting is the basic of paternity testing, in case of disputes.


Nonhomologous DNA end-joining (NHEJ) is the predominant double-strand break (DSB) repair pathway throughout the cell cycle and accounts for nearly all DSB repair outside of the S and G2 phases. NHEJ relies on Ku to thread onto DNA termini and thereby improve the affinity of the NHEJ enzymatic components consisting of polymerases (Pol μ and Pol λ), a nuclease (the Artemis·DNA-PKcs complex), and a ligase (XLF·XRCC4·Lig4 complex). Each of the enzymatic components is distinctive for its versatility in acting on diverse incompatible DNA end configurations coupled with a flexibility in loading order, resulting in many possible junctional outcomes from one DSB. DNA ends can either be directly ligated or, if the ends are incompatible, processed until a ligatable configuration is achieved that is often stabilized by up to 4 bp of terminal microhomology. Processing of DNA ends results in nucleotide loss or addition, explaining why DSBs repaired by NHEJ are rarely restored to their original DNA sequence. Thus, NHEJ is a single pathway with multiple enzymes at its disposal to repair DSBs, resulting in a diversity of repair outcomes.

This work was supported by National Institutes of Health grants (to M. R. L.). This is the second article in the Thematic Minireview series “DNA double-strand break repair and pathway choice.” The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.


Transfection

Transfection is same as transformation but here instead of plasmid, phage DNA is involved. Here also like plasmid DNA the purified phage DNA, or recombinant phage molecule is mixed with competent E.coli cells and DNA uptake is induced by a heat shock treatment.

V isualization of phage infection

Cell lysis is the final stage of phage infection. Immediately after transfection with phage DNA, when infected cells are spread on to a solid agar medium then cell lysis can be visualized as plaques on a lawn of bacteria (Figure-20). Each plaque is a zone of clearing produced as the phage lyse the cells and move on to infect and eventually lyse the neighbouring bacteria. Plaques are formed by both &lambda phage and M13 phage. True plaques are formed by &lambda whereas M13 does not form true plaques as &lambda phage, because it doesn't lyse the host cell. M13 instead causes a decrease in the growth rate of infected cells sufficient to produce a zone of relative clearing on a bacterial lawn.

Figure 20: Formation of plaques on a lawn of bacteria

The end result of a gene cloning experiment using a &lambda or M13 vector is therefore an agar plate covered in phage plaques. Each plaque is derived from a single transfected or infected cell and therefore contains identical phage particles.

M13 phage vectors

The filamentous phage partcles contain a 6.7kb circular single stranded DNA. After infection of a sensitive E coli host, the complementary strand is synthesized, and the double stranded DNA is known as replicative form(RF) with about 100 copies per cell. The cells are not lysed by M13, but continues to grow slowly, and single stranded forms are continuously packaged and released from the cells as new phage particles. The same single strand of the complementary pair is always present in the phage particle.

The useful properties of M13 as a vector are that the RF can be purified and manipulated exactly like a plasmid, but the same DNA may be isolated in a single-stranded form from phage particles in the medium.


Negative controls in cloning? - (Aug/16/2005 )

I use the double-digest method to cut the PCR product and the plasmid. Then I will do the ligation. So, what kinds of negative controls should be used in the ligation steps?

Somebody told me as the following, but I can not understand. so, waht kind of negative control do you usually uased?

Negative Controls:
Reaction without insert -> if colonies then backbone is not completely double
a tăia
Reaction without insert and ligase -> if colonies then backbone is not completely single
a tăia
Reaction without template and ligase -> if colonies then insert is contaminated with PCR
șablon

Those are the three major controls, but we usually only use the first one.

If it helps you understand, think about what's in your ligation reaction, where each component came from, and what the possible contaminants are. Positive colonies will arise from any plasmid containing a gene for drug resistance. These plasmids can be one of three things.

1) Your ligated construct - your insert ligates to your vector as you expect, giving rise to a drug resistant bacteria, and therefore a colony.

2) Self-ligated vector without insert - the cut vector ligates its two ends together without an insert. This can happen if you're working with blunt-end ligation, your sticky ends have partial overlap in sequence complementarity, or if there are trace amounts of contaminating nuclease that cause your vector's ends to become blunt. This type of potential contaminant is the reason the "no insert" control is run. The control also addresses the possibility that your vector wasn't fully cut - if you don't actually remove the small piece of DNA between your cloning sites, the vector will be a linear piece of DNA with complementary ends. You can minimize the problem by treating vector (NOT the insert) with phosphatase prior to gel extraction.

3) "Source" vectors - in a ligation reaction, you combine two different pieces of DNA with complementary ends. Each of those pieces of DNA came from somewhere - the vector from a full-length plasmid and the insert from either a full-length plasmid or a PCR amplification of genomic DNA or a plasmid. Whatever the case, those source materials are present until you remove them, which is usually accomplished by agarose gel extraction - you separate your components based on size and specifically extract the productive ligation material away from the source material. However, if your source DNA runs at similar positions to your ligation material, you may wind up co-purifying them, and they'll get included in your transformation. This is why the "no ligase" controls are done - to make sure that the purified ligation materials aren't carrying any source vectors.

so, what kind of negative controls do I really need in my experiment? please tell me the detail cocktail, thank you!

hi
i do this negative control : mix ligase bufer water and enzyme divide it in two and add in the first one plasmid + insert and in the second one plasmid + water.
fred

one tube with liagtion of insert and double-digest plasmid and another tube only with double-digest plasmid