Informație

Ce promotor este necesar pentru exprimarea unei proteine ​​umane Y în bacterii?


Aceasta este întrebarea reală. Este dintr-un test de admitere pentru un institut de cercetare:

Un om de știință dorește să exprime proteina umană Y în bacterii. Pentru exprimarea eficientă a acestei proteine, el ar trebui să folosească (A) promotor al genei umane Y. (Cred că acesta este cel corect) (B) promotor al genei bacteriene. (C) operator al oricărei gene umane. (D) operator al oricărei gene bacteriene.

Cred că răspunsul meu este corect, deși nu sunt sigur dacă gândirea mea este complet corectă.


Canadianer mi-a permis foarte abil să ajung la răspuns cu cunoștințe pe care le aveam deja. Încerc să explic același lucru aici.

Știm că eucariotele și procariotele au enzime ARN polimerază (enzimă responsabilă de transcripție) diferite. Eucariotele au trei ARN polimeraze diferite, fiecare responsabil pentru sinteza celor trei tipuri diferite de ARN. ARN Polimeraza II este responsabil pentru sinteza ARNm în eucariote. Recunoaște promotorul eucariot (sau, să zicem, uman) prezent într-o celulă eucariotă. Pe de altă parte, în procariote, există doar o singură ARN polimerază responsabilă pentru sinteza tuturor tipurilor de ARN.

Venind la întrebare, folosirea unui promotor uman este probabil logică, deoarece ar fi ideală pentru inițierea transcrierii genei umane menționate Y. Dar acest lucru nu este adevărat, deoarece un promotor este responsabil doar de recunoașterea de către ARN polimeraza și permițându-i să se deplaseze mai departe. și transcrie secvența ADN, adică nu contează ce vine după un promotor. De asemenea, ARN polimeraza procariotă este puțin probabil să recunoască secvența unui promotor uman. Este mult mai probabil să recunoaștem un promotor bacterian. Deoarece funcția unui promotor este limitată pentru a permite recunoașterea, nu contează că este un promotor bacterian atâta timp cât poate fi recunoscut.

Cele două opțiuni despre operatori nu au fost o confuzie pentru mine, deoarece știu deja că nu au prea mult de-a face cu expresia genei la fel de mult ca să o regleze. În plus, orice operator utilizat ar necesita, de asemenea, un promotor în orice caz, deoarece așa se inițiază transcrierea.

Astfel, omul de știință ar trebui să folosească un promotor bacterian.


Expresia proteinelor

Producția recombinantă de proteine ​​este una dintre cele mai puternice tehnici utilizate în științele vieții. Capacitatea de a produce și purifica o abundență de proteine ​​recombinante dorite poate permite o gamă largă de posibilități, inclusiv utilizarea sa în procese industriale sau utilizarea sa pentru diagnosticarea sau tratarea bolii.

La prima vedere, expresia recombinantă a proteinelor poate părea simplă. În esență, ADN-ul care codifică o proteină țintă este donat în aval de un promotor într-un vector de expresie. Acest vector este apoi introdus într-o celulă gazdă, iar aparatul de sinteză a proteinelor celulare și rsquos produce proteina dorită. În practică, totuși, exprimarea proteinelor poate fi foarte dificilă, deoarece atât de mulți factori pot influența procesul. De exemplu, fiecare proteină se pliază în modul său unic, un proces care poate fi influențat de alegerea gazdei de expresie. În mod similar, unele proteine ​​necesită modificări post-translaționale sau inserarea adecvată într-o membrană biologică. În cele din urmă, unele proteine ​​pot avea o activitate care dăunează gazdei. Astfel, nu există o singură soluție pentru producerea cu succes a tuturor proteinelor recombinante. În schimb, este benefic să aveți acces la o gamă largă de instrumente de expresie și dorința de a explora mai multe abordări pentru a obține șanse mai bune de succes. Expresia proteinelor la NEB.

Alegeți tipul:

Articole Feature

Citiți cum să evitați obstacolele obișnuite în expresia proteinelor care împiedică interacțiunile cu mașinile celulare.

Sinteza de proteine ​​fără celule are potențialul de a deveni una dintre cele mai importante tehnologii de mare randament pentru genomica funcțională și proteomică.

Treceți în revistă avantajele kitului de expresie a proteinei K. lactis pentru o expresie rapidă, cu randament ridicat, a proteinelor în drojdie.

Acest articol oferă o privire de ansamblu asupra progreselor în metodologia de exprimare și purificare a proteinelor în ultimii 40 de ani.

Broșuri

Instrumente Web

Instrumente de selecție

Afise

Acest produs este acoperit de unul sau mai multe brevete, mărci comerciale și / sau drepturi de autor deținute sau controlate de New England Biolabs, Inc (NEB).

În timp ce NEB își dezvoltă și își validează produsele pentru diverse aplicații, utilizarea acestui produs poate solicita cumpărătorului să obțină drepturi de proprietate intelectuală terță parte suplimentare pentru anumite aplicații.

Pentru mai multe informații despre drepturile comerciale, vă rugăm să contactați echipa Global Business Development NEB la adresa [email protected]

Acest produs este destinat numai cercetării. Acest produs nu este destinat utilizării în scopuri terapeutice sau diagnostice la oameni sau animale.

Videoclipuri

Introducere în NEBExpress & reg Sistem de sinteză a proteinelor fără celule

Urmăriți acest tutorial care explică fluxul de lucru simplificat pentru noul nostru sistem de sinteză a proteinelor NEBExpress & reg fără celule pentru a afla cum vă puteți sintetiza cu ușurință proteinele în doar 2 până la 4 ore.

Soluții pentru exprimarea proteinelor dificile

NEB are o istorie îndelungată în expresia recombinantă a proteinelor și a dezvoltat o gamă largă de soluții pentru proteine ​​greu de exprimat.


Abstract

Utilizarea Bacillus subtilis în biologia sintetică și ingineria metabolică este foarte de dorit să profitați de căile metabolice unice prezente în acest organism. Pentru a face acest lucru, o evaluare a B. subtilis'Părțile biologice intrinseci sunt necesare pentru a determina cele mai bune strategii pentru a regla cu precizie circuitele metabolice și expresia proteinelor țintă. Punctele tari ale candidaților promotori au fost evaluate prin măsurarea unităților relative de fluorescență ale unui reporter de proteine ​​fluorescente verzi, integrate în B. subtilis ' cromozom. Au fost testate un total de 84 de secvențe de promotori prezise situate în amonte de diferite clase de proteine, inclusiv proteine ​​de șoc termic, proteine ​​din anvelopa celulară și proteine ​​rezistente împotriva metalelor toxice (bazate pe similaritate) și alte tipuri de gene. Nivelurile de expresie măsurate au variat de la 0,0023 până la 4,53 ori din activitatea promotorului puternic bine caracterizat P43. Nu s-au observat schimbări semnificative atunci când tulpinile, purtătoare de candidați promotori diferiți, au fost cultivate la temperatură ridicată sau în mediu cu etanol, dar unele tulpini au prezentat o activitate crescută atunci când au fost cultivate sub presiune osmotică ridicată. Candidații promotori selectați aleatoriu au fost testați și s-a constatat că activează transcrierea β-galactozidazei termostabile (bgaB) la un nivel similar, ceea ce implică capacitatea acestor secvențe de a funcționa ca elemente promotor în contexte genetice multiple. În plus, promotorii selectați au ridicat producția finală atât a bgaB citoplasmatică, cât și a proteinei secretate α-amilază la aproximativ de patru ori respectiv dublu. Datele generate permit o înțelegere mai profundă a B. subtilis ' metabolismul și va facilita munca viitoare pentru dezvoltarea acestui organism pentru biologia sintetică.

Citare: Song Y, Nikoloff JM, Fu G, Chen J, Li Q, Xie N și colab. (2016) Screening pentru promotori de la Bacillus subtilis în diverse condiții de vânătoare pentru biologie sintetică și aplicații industriale. PLoS ONE 11 (7): e0158447. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158447

Editor: Mark Isalan, Imperial College London, REGATUL UNIT

Primit: 27 februarie 2016 Admis: 16 iunie 2016 Publicat: 5 iulie 2016

Drepturi de autor: © 2016 Song și colab. Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit în condițiile Licenței de atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originale să fie creditate.

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională pentru Știința Naturii din China (31370089 la DZ, 21506244 la GF, 31400079 la NX http://www.nsfc.gov.cn/), Programul de dezvoltare cheie de stat 973 pentru cercetarea de bază din China (2013CB733601 la DZ, http://www.most.gov.cn/), Nature Science Foundation din Tianjin City (CN) (16JCYBJC23500 to DZ, 15JCQNJC09500 to DZ http://www.tstc.gov.cn/) și Guangxi Science și Proiect de dezvoltare tehnologică (14125008-2-22 la NX http://www.gxsti.net.cn/). Finanțatorii nu au avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.


Componentele Lac-Operon

Un operon constă în principal din două elemente sau gene:

Elemente de reglementare

Include următoarele regiuni:

  • Regiunea promotorului: Codifică Gena Lac-P. Se află între regulator și operator. ARN-polimeraza se leagă de acest site, pe măsură ce o regiune promotor inițiază transcrierea. Are o lungime de 100 de perechi de baze. Se compune din secvențe palindromice. Acest site promovează și controlează transcrierea genelor structurale sau ARN-m. Genele reglatoare ale represorului reglementează funcționarea regiunii promotorului.
  • Regiunea operatorului: Codifică Gena Lac-O. Se află între un promotor și gena structurală (Lac-Z). Acesta conține un comutator de operator, care decide dacă transcrierea ar trebui să aibă loc sau nu. Gena reglatoare se leagă de operator.
  • Regiunea de reglementare: Codifică gena regulatoare (Lac-I) care controlează activitatea promotorului și a genei operator. Această genă reglatoare produce proteine ​​reglatoare cunoscute sub numele de „Proteine ​​represoare”Care se poate lega de promotor și operator.

Elemente structurale

Acestea sunt regiunile ADN-ului, care conțin gene pentru sinteza proteinelor și sunt de trei feluri:

  • Lac-Z: Codifică enzima beta-galactozidază.
    Funcție: Beta-galactozidaza determină hidroliza lactozei în subunități de galactoză și glucoză.
  • De dantelă: Codifică enzima lactoză permeabilă.
    Funcție: permeata lactozei aduce lactoză în celulă.
  • Lac-A: Codifică enzima tiogalactozid transacetilază.
    Funcția: funcția transacetilazei tiogalactozide nu este foarte clară, dar ajută activitatea unei enzime beta-galactozidază.

Aceste trei gene, adică genele Lac Z, Y și A, sunt prezente una lângă alta. Prin urmare, toate elementele precum promotorul, operatorul, represorul și genele structurale formează împreună o unitate numită Operon.

Controlul expresiei genelor în procariote

La procariote, sistemul Lac-operon este controlat în două moduri:

Controlul pozitiv al Lac-Operon

Se mai numește Sistem inductibil pozitiv și include pașii următori:

  1. În primul rând, o genă reglatoare exprimă proteina represor.
  2. După aceea, proteinele represoare sunt produse prin exprimarea unei gene reglatoare.
  3. O proteină represoare are situsuri de legare pentru operator și inductor (lactoză).
  4. Când lactoza este prezentă ca inductor, se leagă de proteina represor și formează complexul R + I.
  5. După legarea inductorului la represor, complexul blochează legarea represorului la operator.
  6. Deoarece proteina represor nu blochează operatorul, ARN polimeraza se leagă de promotor și se deplasează mai departe pentru a transcrie ARNm.

Acest concept este cunoscut sub numele de comută de lac-operon (prin prezența unui inductor).

Controlul negativ al Lac-Operon

Se mai numește Controlul negativ al sistemului represor. Acesta include următorii pași:

  1. În primul rând, gena reglatoare este exprimată de represor.
  2. O proteină represor este produsă după expresia unei gene reglatoare.
  3. În absența inductorului sau lactozei, proteina represor se leagă direct de un operator.
  4. Acest lucru blochează mișcarea ARN polimerazei și atașarea acesteia la promotor.
  5. În cele din urmă, transcrierea ARNm nu va avea loc.

Acest concept este cunoscut sub numele de opriți-vă de Lac-operon (prin absența unui inductor).


Blakeborough, P., Salter, D.N. și Gurr, M.I. (1983) Legarea zincului în laptele de vacă și laptele uman. Biochimie. J. 209, 505-12.

Brantl, V. (1984) Peptidă opioidă nouă derivată din · -cazină umană. Euro. J. Pharmacol. 106, 2113-2114.

Dickson, I.R. și Perkins, D.J. (1971) Studii privind interacțiunea dintre cazeina bovină purificată și ionii de metale alcalino-pământoase. Biochimie. J. 124, 235-40.

Dower, W.J., Miller, J.F. și Ragsdale, C.W. (1988) Transformare de înaltă eficiență a E coliprin electroforeză de înaltă tensiune. Nucl. Acid. Rez. 16, 6127.

Escher, A., O'Kane, D.J., Lee, J. și Szalay, A.A. (1989) Luciferaza bacteriană ·· proteina de fuziune este pe deplin activă ca monomer și foarte sensibilă in vivola temperatura ridicata. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 86, 6528-32.

Greenberg, R., Groves, M.L. și Dower, H.J. (1984) Human-casein: secvența de aminoacizi și identificarea sitului de fosforilare. J. Biol. Chem. 259, 1016-8.

Hansson, L., Bergstrom, S., Hernell, O., Lönnerdal, B., Nilsson, A.K. și Strömqvist, M. (1993) Expresia laptelui uman · -cazină în Escherchia coli: compararea proteinelor recombinante cu izoformele native. Prot. Expr. Purif. 4, 373-81.

Jiang, C., Escher, A. și Szalay, A.A. (1992) Alterarea vectorului de transformare a plantelor de legare pe bază de luciferază pentru exprimarea simultană a produsului genetic dorit și a luciferazei bacteriene în plantele transgenice. Raport privind starea bioluminiscenței și chemiluminescenței. p. 127-131.

Kohmura, M., Nio, N., Kubo, K., Minoshima, Y., Munrkana, E. și Ariyoshi, Y. (1989) Inhibarea enzimelor de conversie a angiotensinei de către peptidele sintetice ale · cazinei umane. Agric. Biol. Chem. 53, 2107-14.

Koncz, C., Olsson, O., Langridge, W.H.R., Schell, J. și Szalay, A.A. (1987) Exprimarea și asamblarea luciferazei funcționale în plante. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 84, 131-5.

Kunz, C. și Lönnerdal, B. (1989) Proteine ​​din laptele uman: separarea proteinelor din zer și analiza lor prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă, cromatografie rapidă pe lichide cu proteine. A.m. J. Clin. Nutr. 117, 1385-95.

Kunz, C. și Lönnerdal, B. (1990) Caseină și subunități de cazeină în laptele prematur, colostru și laptele matur. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutri. 10, 456-61.

Lahov, E. și Regelson, W. (1996) Substanțe derivate din cazeină antibacteriene și imuno-stimulante din lapte: casecidină, peptide de izracidină. Food Chem. Toxic. 34, 131-45.

Langridge, W.H.R., Fitzgerald, K.L., Koncz, C., Schell, J. și Szalay, A.A. (1989) Dual promotor al Agrobacterium tumefaciensgena manopină sintază este reglată de hormonii de creștere a plantelor. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 86, 3219-23.

Langridge, W.H.R., Escher, A. și Szalay, A.A. (1991) Măsurarea luciferazei bacteriene ca enzimă reporter in vivoîn bacterii transformate, drojdie, celule vegetale și în plante transgenice. Tehnică 3, 99-108.

Lifschitz, C.H., Hawkins, H.K., Guerra, C. și Byrd, N. (1988) Șoc anafilactic datorat hipersensibilității proteinelor din laptele de vacă la un sugar alăptat. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 7, 141-4.

Linebaugh, B.E. și Rillema, J.A. (1984) Cerință de poliamină pentru acțiunea proteinelor asupra sintezei macromoleculare în linia de celule epiteliale mamare umane MCF-7. Biochimie. Biofizi. Acta. 804, 384-55.

Menon, R.S. și Ham, R.G. (1989) Human · -cazină: secvență parțială de ADNc și polimorfism aparent. Nucl. Acid Res. 17, 2869.

Migliori-Samour, D. și Jolles, P. (1988) Casein. un prohormon cu rol imunomodulator pentru nou-născut. Experientia 44, 188-93.

Miller, M.J.S., Witherly, S.A. și Clark, D.A. (1990) Caseina: o proteină din lapte cu diverse consecințe biologice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 195, 143-59.

Mykkanen, H.W. și Wasserman, R.H. (1980) Absorbție sporită a calciului de către fosfopeptidele · -cazină la puii rahitici și normali. J. Nutr. 10, 2141-8.

Naito, H. și Suzuki, H. (1974) Alte dovezi ale formării in vivoa fosfolipidelor din lumenul intestinal din dietetica · -cazina. Agric. Biol. Chem. 38, 1543-5.

Pennington, J.A.T. (1993) Valorile alimentare ale Bowers și Church ale proteinelor utilizate în mod obișnuit. Ediția a 16-a. Philadelphia, SUA: Compania J B Lippincott.

Rasmussen, L.K., Due, H.A. și Petersen, T.E. (1995) Human · s1-cazeină: purificare și caracterizare. Comp. Biochimie. Fiziol. 111B, 75-81.

Salvilathi, E. și Kuitunen, M. (1992) Alergenicitatea proteinelor din laptele de vacă. J. Pediatr. 121, S12-20.

Schlossmann, A. și Moro, E. (1903) Zur kenntnis der Arteigenheit der verschiedenen Eiweissköper der Milch. Munchen Med. Wochenschr 14, 597-8.

Southern, E.M. (1975) Detectarea secvențelor specifice printre fragmentele de ADN separate prin electroforeză pe gel. J. Mol. Biol. 98, 503-17.

Spychalla, J.P., Scheffler, B.E., Sowoknos, J.R. și Bevan, M.W. (1994) Clonarea, inhibarea ARN antisens și expresia coordonată a pirofosforilazei UDP-glucoză cu gene biosintetice de amidon în tuberculii de cartofi. J. Plantă. Fiziol. 144, 444-53.

Velten, J., Velten, L., Hain, R. și Shell, J. (1984) Izolarea unui fragment promotor de plante duale din plasmida Ti a Agrobacterium tumefaciens. EMBO J. 3, 2723-30.


Ce promotor este necesar pentru exprimarea unei proteine ​​umane Y în bacterii? - Biologie

Acest articol prezintă o revizuire a sistemelor vector-gazdă utilizate în mod obișnuit pentru exprimarea proteinelor, pe baza bazei de date PDB cu informații despre expresia proteinelor din peste 30.000 de publicații și un sondaj Labome al publicațiilor selectate aleatoriu. Expresia proteinelor toxice este discutată în detaliu și sistemele de expresie utilizate în producția de produse farmaceutice sunt sintetizate pe scurt.

Figura 1 prezintă două fluxuri de lucru tipice de exprimare a proteinelor. Un flux de lucru duce la generarea unei proteine ​​purificate. Celălalt duce la generarea unei linii celulare care exprimă o proteină recombinantă. În viața reală, aceste două fluxuri de lucru se pot suprapune dacă, de exemplu, se folosește o linie celulară stabilă de mamifer ca material sursă din care se purifică o proteină recombinantă.

Avantajele, dezavantajele și aplicațiile potențiale ale unui număr de sisteme de expresie recombinante utilizate în mod obișnuit sunt enumerate în Tabelul 1.O serie de publicații oferă informații detaliate despre aceste sisteme: Escherichia coli [1-6] Saccharomyces cerevisiae [4, 7-10] Pichia pastoris [5, 8, 9, 11, 12] baculovirus / celule de insecte [1, 5, 13 , 14] linii celulare de mamifere [5, 15] și sisteme de producție de proteine ​​fără celule / in vitro [16]. Tabelul 1 rezumă proprietățile fundamentale ale acestor sisteme de expresie. Cercetătorii lucrează activ pentru a îmbunătăți aceste proprietăți fundamentale (a se vedea [17] pentru o revizuire). Mai multe tulpini de E. coli sunt acum disponibile în comerț și au scopul de a depăși problemele de polarizare a codonilor (Rossetta 2 [18], CodonPlus ril / rp), formarea ineficientă a legăturii disulfidice (SHuffle, Origami [19, 20]) și expresia slabă a membranei proteine ​​(C41 și C43). În mod similar, vectorii de expresie E. coli care utilizează etichete precum SUMO, proteina de legare a maltozei [21] și tioredoxina [21] concepute pentru a promova expresia solubilă sunt disponibile comercial. Preexprimarea sulfhidril oxidazei poate favoriza în mod semnificativ formarea de legături disulfidice [22]. Aceste abordări funcționează foarte bine pentru unele proteine, dar pentru altele, încă nu este posibil să se obțină o expresie recombinantă funcțională solubilă în E. coli [20, 23]. Proteinele exprimate în bacterii sunt contaminate cu endotoxine, care pot fi îndepărtate prin, de exemplu, trusa de eliminare a endotoxinelor Toxineraser din GeneScript [24] înainte de a fi utilizate in vivo. Tulpinile de E. coli au fost chiar proiectate pentru a efectua N-glicozilarea proteinelor, deși eficiența este scăzută [17, 25] sau optimizată pentru expresia proteinei marcate cu His (tulpina LOBSTR) [26, 27]. De asemenea, se dezvoltă abordări pentru a exprima proteinele cu glicozilare mai asemănătoare mamiferelor în sistemul celulelor baculovirus / insecte și, prin urmare, își extind utilitatea [28]. Se dezvoltă, de asemenea, variante de baculovirus care promovează o secreție mai mare de proteine ​​[17]. Staus DP și colab. Au minimizat numărul de reziduuri de cisteină dintr-o genă beta-arestină 1 trunchiată de șobolan pentru a-și crește expresia și stabilitatea în bacteriile BL21 / DE3 [29].

Problema critică cu care se confruntă cercetătorul este că încă nu este posibil să se prevadă ce sistem de expresie va funcționa cel mai bine pentru o anumită proteină și o anumită utilizare finală. Un sistem de expresie universal aplicabil nu există încă [30]. Atunci când selectează un sistem de expresie, cercetătorul trebuie să țină cont de proprietățile fundamentale ale fiecărui sistem, de avantajele și dezavantajele acestora și de modul în care pot fi depășite orice limitări specifice ale sistemului respectiv. Deciziile ar trebui să fie informate prin cunoașterea expresiei țintă / a membrilor familiei și a utilizării finale a proteinei recombinate. Dacă resursele permit acest lucru, poate fi prudent să explorați două (sau mai multe) sisteme de expresie în paralel.

Sistem de expresie Avantaje Dezavantaje Aplicații Furnizori
Escherichia coli Niveluri de expresie potențial foarte ridicate
Cost scăzut
Condiții simple de cultură
Crestere rapida
Scalabil
Protocoale simple de transformare
Mulți parametri pot fi modificați pentru a optimiza expresia
Formarea ineficientă a legăturii disulfurice
Pliere slabă a proteinelor în citoplasmă (inclusiv proteine ​​bacteriene)
Formarea corpului de incluziune
Protocoalele de repliere in vitro sunt ineficiente - pot anula avantaje
Utilizarea codonilor diferită de eucariote
Modificări minime post-traducere
Endotoxină
Este posibil să nu poată exprima proteine ​​mari
* tulpinile proiectate pot ajuta la atenuarea problemelor legate de formarea legăturii disulfidice (Shuffle și Origami), de polarizarea codonilor (Rosetta și CodonPlus ril / rp) sau de secreția de proteine ​​[31]
Proteine ​​purificate (structură, enzimologie, descoperirea medicamentelor)
Terapie proteică
Invitrogen / Life Technologies
EMD Millipore
New England Biolabs
Promega
Clontech
Avidis
Saccharomyces cerevisiae Nivele bune de exprimare
Alegerea expresiei secretate sau celulare
Cost scăzut
Condiții simple de cultură
Scalabil
Capabil să efectueze majoritatea modificărilor eucariote post-traducere
Plierea eficientă a proteinelor
Fără endotoxine
Expresie probabil mai scăzută decât în ​​cazul Pichia pastoris
Secreție probabil mai mică decât cu Pichia pastoris
Glicozilarea este încă diferită de celulele mamiferelor
O tendință de hiperglicozilare a proteinelor
Structuri de N-glican considerate alergenice
Proteine ​​purificate (structură, enzimologie, descoperirea medicamentelor)
Terapie proteică
Invitrogen / Life Technologies
Pichia pastoris Niveluri ridicate de expresie
Cost scăzut
Condiții simple de cultură
Creștere relativ rapidă
Scalabil
Alegerea expresiei secretate sau intracelulare
Secreția de proteine ​​este eficientă și permite purificarea simplă
Modificare extensivă post-translațională a proteinelor
Plierea eficientă a proteinelor
N-glicozilarea seamănă mai mult cu eucariotele superioare decât cu Saccharomyces cerevisiae
Fără endotoxine
Utilizarea metanolului ca inductor este un pericol de siguranță (incendiu) la scară
Glicozilarea este încă diferită de celulele mamiferelor
Proteine ​​purificate (structură, enzimologie, descoperirea medicamentelor) Invitrogen / Tehnologii de viață
Celule de insecte infectate cu baculovirus Nivele bune de expresie (în special pentru proteinele intracelulare)
Creștere relativ rapidă
Plierea eficientă a proteinelor
Moderabil scalabil
Modificare extensivă post-translațională a proteinelor
Glicozilarea seamănă mai mult cu celulele mamiferelor

Interesant este că un efort de genomică structurală, Inițiativa RIKEN Structural Genomics din Japonia, s-a concentrat pe utilizarea fără celule (transcriere / traducere in vitro) pentru a genera proteine ​​pentru eforturile sale de determinare a structurii [3, 36], ceea ce demonstrează capacitatea sintetică a sistemelor moderne de exprimare a proteinelor fără celule. Cu toate acestea, sistemele fără celule tind să aibă o eficiență scăzută pentru o pliere adecvată.

Aspectele cheie ale expresiei proteinelor pentru biologia structurală au fost recent revizuite într-o ediție specială a Opiniei curente în biologie structurală în 2013.

Acest articol s-a axat pe cele mai frecvent utilizate sisteme de expresie vector-gazdă. Acestea sunt sistemele care ar putea fi primul port de escală atunci când intenționează să exprime o proteină recombinantă. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că sunt disponibile multe alte sisteme de expresie mai esoterice. Acestea pot fi de interes pentru acei cercetători cu experiență în exprimarea proteinelor sau în acele situații în care sistemele de expresie mai „mainstream” nu satisfac nevoile unui anumit studiu. De exemplu, au fost descrise următoarele sisteme gazdă de celule microbiene / vegetale: drojdie (Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe [8]) bacterii (Bacillus brevis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis și Caulobacterent [2], Corynebacterium [37], sulfolobus islandicus hipertermofil [38]) și alge [39]. Pentru o recenzie recentă a sistemelor de expresie alternative / mai puțin frecvente utilizate pentru biologia structurală, a se vedea [40]. Mycobacterium smegmatis nepatogen a fost utilizat pentru exprimarea solubilă a proteinelor din Mycobacterium tuberculosis patogen. Acest lucru este de remarcat, deoarece se raportează că exprimarea proteinelor micobacteriene în E. coli poate fi problematică [41].

Următorii vectori de expresie virală sunt disponibili pentru expresia recombinantă a proteinelor în celule de mamifere: semliki forest virus [42] lentivirus [43] adenovirus [44] virus adeno-asociat. Virusul forestier Semliki s-a dovedit popular pentru expresia proteinelor de membrană pentru descoperirea medicamentelor și genomica structurală [42]. Vectorii lentivirali și adenovirali sunt în prezent de mare interes în domeniul terapiei genice [45, 46]. Există, de asemenea, un interes considerabil în exprimarea proteinelor recombinante terapeutice în laptele animalelor transgenice [47]. Sistemele bazate pe transpozază câștigă, de asemenea, popularitate pentru expresia constitutivă hiperactivă, cum ar fi vectorul frumuseții dormitoare [48].

A existat un interes substanțial recent în dezvoltarea sistemelor pentru exprimarea recombinantă a complexelor multi-proteice atât pentru biologia structurală, cât și pentru descoperirea / dezvoltarea medicamentelor [49-52].

Worldwide Protein Data Bank (wwPDB: http://www.wwpdb.org/) este o colaborare internațională a patru organizații: RCSB PDB (SUA: http://www.rcsb.org/) MSD-EBI (Europa: http : //www.ebi.ac.uk/pdbe/) PDBj (Japonia: http://www.pdbj.org/) și BMRB (SUA). WwPDB este un depozit de date structurale macromoleculare a căror „misiune este să mențină o arhivă unică PDB de date structurale macromoleculare care este disponibilă în mod liber și public comunității globale” [53, 54]. Marea majoritate a structurilor din wwPDB sunt proteine.

Pentru a înțelege practica noastră actuală privind expresia proteinelor, selectăm intrările PDB cu publicații în ultimii 10 ani (din 2009 încoace), rezultând 27096 articole, care corespund 64713 înregistrări.

Majoritatea intrărilor wwPDB au citat Escherichia coli ca expresie gazdă, 23041 din 27096 publicații (85%) raportând utilizarea sa. Tulpina obișnuită este BL21 (11628 articole).

Tabelul 2 listează primele 5 gazde de expresie și primii 2 sau 3 vectori de expresie pentru fiecare dintre aceste organisme gazdă.

Gazda expresieiVectorii de expresie utilizați cel mai frecventPublicații
Escherichia coli 23041
pET28 și derivați (Novagen / EMD Millipore) 2679
pET15 (Novagen / EMD Millipore) 863
pET21 (Novagen / EMD Millipore) 735
Spodoptera frugiperda 1493
pFastBac (Invitrogen / Life Tech) 228
pVL1392 / 3 (BD ​​Bioscience) 27
pFB-LIC-Bse 16
Homo sapiens 1181
pHL-sec 92
pVRC8400 42
pTT5 17
Trichoplusia ni 532
pFastBac 76
pAcGP67 15
Cricetulus griseus (CHO) 245
seria pEE 12
PGS 8

Este de remarcat faptul că Escherichia coli este cea mai comună gazdă de expresie din setul de date wwPDB cu o marjă foarte substanțială. Escherichia coli este o bacterie Gram-negativă, în formă de tijă. Este unul dintre organismele model cheie în cercetarea științelor vieții și a fost exploatat pe scară largă atât în ​​mediul academic, cât și în cel industrial. Trebuie remarcat faptul că lipopolizaharidele din membrana exterioară sunt sursa endotoxinei, care poate provoca răspunsuri inflamatorii severe în modele experimentale celulare și in vivo. Celulele spodoptera frugiperda utilizate pentru exprimarea proteinelor sunt linii celulare (Sf 9 și Sf 21) derivate din țesuturile ovariene ale viermelui armatei de toamnă. Novavax a exprimat proteina modificată SARS-CoV-2 modificată în celulele Sf 9 pentru a produce un vaccin COVID 19 [55]. Celulele Trichoplusia ni (disponibile comercial sub numele de High Five) sunt derivate din celulele ovarelor de varză. Se raportează că Trichoplusia ni este mai bună decât celulele Sf9 pentru producerea proteinelor secretate utilizând sistemul de celule baculovirus / insecte [56]. Celulele Trichoplusia ni sunt, de asemenea, superioare celulelor Sf9 ca gazdă pentru producerea de particule asemănătoare virusului pentru producerea vaccinului recombinant [57]. Pichia pastoris este drojdie respiratorie, metilotrofă, care poate utiliza metanolul ca singură sursă de carbon și energie. De exemplu, Kitchen P și colab au exprimat proteina AQP4 de lungime completă în Pichia pastoris [58] și D Wrapp și colab au exprimat VHH bivalente în vectorul pKai61 în Pichia pastoris [59]. Liniile celulare Cricetulus griseus sunt derivate din celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO). Această linie celulară utilizată pe scară largă poate fi adaptată la creșterea suspensiei. Majoritatea anticorpilor recombinați sunt produși în liniile celulare CHO. Maun HR și colab., De exemplu, au exprimat gene umane alfa și beta-triptază în linia celulară CHO DKO [60].

Pentru fiecare gazdă de expresie, primii 2 sau 3 vectori de expresie citați cel mai frecvent reprezintă doar o proporție relativ mică din totalul publicațiilor (Tabelul 2). Aceasta reflectă gama largă de vectori de expresie diferiți care au fost utilizați pentru fiecare gazdă de expresie. Figurile 1 și 2 arată hărți plasmidice pentru pET28 și pcDNA3.3 (cea mai recentă versiune a pcDNA3), respectiv. Aceste plasmide sunt vectorii de expresie arhetipali pentru E. coli și, respectiv, celule de mamifere.

Cu vectori pET, promotorul ARN polimerazei T7 conduce expresia genei recombinante. Plasmida pET28 codifică o secvență N-terminală His-tag / trombină de scindare / secvență T7-tag și o secvență opțională C-terminal His-Tag. Acești vectori sunt folosiți cu tulpini de lizogen DE3 de E. coli. În aceste tulpini, expresia unei copii genomice a ARN polimerazei T7 este sub controlul represorului lac. Exprimarea proteinei recombinante este indusă de adăugarea izopropil-b-D-tio-galactozidei (IPTG) la mediul de cultură. În mod interesant, vectorii în care expresia este indusă de alte molecule (de exemplu, arabinoza) nu apar în mod evident în setul de date wwPDB.

Cu seria de plasmide pcDNA3, expresia este condusă de promotorul timpuriu imediat al citomegalovirusului uman (CMV). Acesta este un promotor puternic, activ constitutiv în celulele mamiferelor. pcDNA3 este versiunea originală a seriei de vectori pcDNA3 și nu mai este disponibilă comercial. Cea mai recentă dezvoltare a acestei serii de vectori este pcDNA3.3. Trebuie remarcat faptul că pcDNA3 a fost, de asemenea, identificat ca unul dintre cei mai frecvent utilizați vectori de expresie a mamiferelor într-un sondaj al publicațiilor formale (cum ar fi pcDNA3.1 [61, 62] sau pcDNA3.3 din Invitrogen (K8300-01) [63]) .

Vectorii celulelor baculovirusului / celulei de insecte cel mai frecvent utilizate utilizează toate promotorul puternic de poliedrină pentru a conduce expresia constitutivă a proteinei recombinante. Plasmidele (vectori de transfer de baculovirus) nu conduc ele însele direct expresia proteinelor. Acestea sunt utilizate pentru a genera baculovirus recombinant care conține gena de interes sub controlul promotorului poliedrinului. pFastBac este o generație mai nouă de plasmide care utilizează transpunerea specifică site-ului pentru a genera baculovirus recombinant. Acest lucru reduce timpul necesar pentru a genera baculovirus recombinant la aproximativ 2 săptămâni, comparativ cu cele 4-6 săptămâni necesare pentru plasmidele de generație mai veche, cum ar fi pVL1392 / 3 și pAcGP67.

Vectorii Pichia pastoris utilizează ambele promotor puternic AOX1. Expresia este indusă de metanol. În ciuda faptului că Pichia pastoris este un sistem excelent pentru producerea de proteine ​​secretate (a se vedea mai jos), cei mai utilizați doi vectori de expresie Pichia pastoris din setul de date wwPDB sunt ambii concepuți pentru exprimarea citoplasmatică.

Datele din Tabelul 2 corespund gazdelor de expresie și vectorilor de expresie care au fost folosiți în mod specific pentru producerea proteinelor pentru studii structurale. În consecință, acest set de date este orientat spre acei vectori de expresie / gazde care sunt capabili să genereze cantități mari de proteine ​​purificate care sunt necesare pentru studii de determinare a structurii tridimensionale. Incapacitatea Escherichia coli de a proteina glicozilat și ușurința relativă cu care N-glicozilarea celulei de insecte poate fi îndepărtată enzimatic (vezi Tabelul 1) poate contribui, de asemenea, la utilizarea frecventă a acestor sisteme în setul de date wwPDB. Proteinele glicozilate sunt în general preferate pentru studii structurale, cu excepția cazului în care moleculele de zahăr sunt esențiale pentru funcționare.

Pentru alte aplicații (cum ar fi teste enzimatice, teste celulare, producerea de antigen pentru generarea de anticorpi, supraexprimare pentru studierea funcției celulare sau localizare) este posibil să nu fie necesară exprimarea și purificarea unor astfel de cantități substanțiale de proteine. Într-adevăr, pentru studiile bazate pe celule, este puțin probabil ca purificarea proteinei exprimate recombinant să fie o considerație. Cu toate acestea, datele despre vectorii / gazdele de expresie obținute de la wwPDB sunt o resursă prețioasă. Datele pot ajuta la ghidarea proiectelor de exprimare a proteinelor pentru multe aplicații.

Pentru a evita prejudecata potențială a setului de date wwPDB, Labome a studiat un set selectat aleatoriu de publicații formale care au citat plasmide. Topul celor mai frecvent utilizate 3 grupuri de vectori de expresie sunt prezentate în Tabelul 3. După cum s-a observat pentru setul de date wwPDB, cei mai frecvent citați vectori de expresie reprezintă doar o proporție mică din totalul publicațiilor. Din nou, acest lucru reflectă diversitatea vectorilor de expresie pe care cercetătorii îi folosesc pentru orice gazdă de expresie dată. Vectorul pcDNA3.1 conduce expresia în celulele de mamifere prin intermediul promotorului constitutiv CMV (vezi mai sus). Plasmida pGL3 este un vector reporter de luciferază conceput pentru studiul cantitativ al reglării expresiei genelor mamiferelor. Popularitatea crescândă a acestui vector reflectă probabil o dorință tot mai mare a cercetătorilor de a studia funcția genomului uman atât la nivel transcripțional, cât și proteomic.

În mod similar, pEGFP este un vector de expresie la mamifere în care expresia este condusă constitutiv de promotorul CMV. Proteina fluorescentă verde îmbunătățită (EGFP) este exprimată fie ca o fuziune N-terminală (pEGFP-C1), fie ca o fuziune C-terminală (pEGFP-N1) cu proteina de interes. Acești vectori pEGFP pot fi utilizați pentru a studia localizarea subcelulară sau traficul de proteine ​​prin monitorizarea fluorescenței EGFP [64, 65]. Sunt utilizați și alți vectori, cum ar fi vectorul de expresie pRK5 [66].

VectorPMIDGazdăVarianta comună Referinţă
pcDNA3.1 (Invitrogen) 83 Linii celulare de mamifere pcDNA 3.1 His
pcDNA 3.1 V5
[67, 68]
pGL3 (Promega) 44 Linii celulare de mamifere [68]
pEGFP (Clontech) 40 Linii celulare de mamifere pEGFP-C1
pEGFP-N1
[69]

Este de remarcat faptul că cei mai frecvent utilizați vectori de expresie a mamiferelor, atât în ​​studiul de publicație, cât și în setul de date wwPDB, conduc la expresia constitutivă. Acest lucru se întâmplă în ciuda disponibilității comerciale a vectorilor de expresie a mamiferelor inductibile, cum ar fi sistemul T-Rex, cum ar fi celulele Thermo Fisher Flp-In T-REx 293 utilizate în producția de proteine ​​ApoE3 [70] sau alte proteine ​​[67], vectori pGEX din GE Healthcare [71] sau sistemul pF12 RM Flexi. Deși nu apare foarte mult în publicațiile academice, sistemul BacMam s-a dovedit popular în industria farmaceutică pentru exprimarea proteinelor atât pentru studii celulare, cât și pentru purificare [72-74] și este acum disponibil comercial. BacMam utilizează un baculovirus modificat în care promotorul obișnuit este înlocuit cu promotorul CMV activ cu celule de mamifere. Virusul BacMam conduce expresia non-replicativă, non-litică într-o gamă largă de tipuri de celule de mamifere.

Spre deosebire de setările de cercetare, producția de proteine ​​farmaceutice nou aprobate este adesea în sistemele de expresie a mamiferelor. Gary Walsh a rezumat sistemele de expresie utilizate în producția de produse farmaceutice proteice aprobate de autoritățile de reglementare SUA / UE din ianuarie 2014 până în decembrie 2018 [79]. Cincizeci și două din 62 de produse farmaceutice noi proteice recombinante sunt exprimate în linii celulare de mamifere, una (Sebelipase alfa) într-un sistem transgenic de mamifer, 5 în E. coli și 4 în S. cerevisiae. Sistemele bazate pe celule CHO sunt cea mai comună gazdă de expresie a mamiferelor. Dintre cele 68 de medicamente anticorp monoclonale (noi sau biosimilare) aprobate în aceeași perioadă, 57 sunt produse în linii celulare CHO, 9 în celule NS0 și 2 în celule Sp2 / 0.

O problemă frecvent întâlnită este expresia proteinelor recombinate care sunt toxice pentru celulele gazdă în care sunt exprimate. Există mai multe strategii disponibile pentru a depăși această problemă. Cercetătorul trebuie, în general, să determine empiric ce soluție potențială funcționează cel mai bine pentru proteinele lor specifice. Precedentele literaturii, cunoștințele clasei țintă și experiența „internă” a proteinei țintă pot fi toate folosite pentru a ghida alegerea strategiei.

  • Sistemele de expresie bine reglementate (adică fără scurgeri), cum ar fi sistemul pBAD care utilizează promotorul araBAD (Invitrogen / Life Sciences) pot fi utilizate pentru a minimiza expresia bazală [80].
  • Cu plasmidele bazate pe promotor T7, expresia preinducției poate fi redusă prin utilizarea celulelor gazdă pLysS / pLysE / pLysY care exprimă lizozima T7 care inhibă ARN polimeraza T7 și astfel reduce activitatea promotorului înainte de inducerea IPTG. În mod similar, glucoza poate fi utilizată pentru a reprima activitatea promotorului înainte de inducerea cu IPTG [80].
  • Sistemul pETcocoTM (EMD Millipore) permite menținerea numărului de copii plasmidice la un nivel foarte scăzut în timpul creșterii celulare, minimizând astfel expresia bazală și maximizând stabilitatea plasmidei înainte de inducție. Numărul de copii plasmidice este reglat în mod semnificativ și expresia genei țintă indusă de IPTG [80].
  • O altă abordare este utilizarea tulpinilor gazdă, cum ar fi C41 (DE3) și C43 (DE3), selectate empiric pentru capacitatea lor de a exprima proteinele toxice mai eficient decât tulpina parentală BL21 (DE3) (Avidis, Lucigen) [80].
  • Evaluarea empirică a etichetelor de fuziune precum proteina de legare a maltozei, GST, tioredoxina sau SUMO poate identifica un partener de fuziune care depășește toxicitatea proteinei țintă (Invitrogen / Life Sciences, New England Biolabs, LifeSensors) [80].
  • Direcționarea expresiei către periplasmă poate depăși toxicitatea asociată cu acumularea de citosoli [80].
  • Cultura alimentată în lot poate fi, de asemenea, o abordare utilă pentru exprimarea proteinelor toxice [81].

Multe sisteme de exprimare a mamiferelor utilizează un promotor CMV activ constitutiv. Acest lucru este problematic pentru exprimarea proteinelor toxice pentru celulele gazdă. Cu toate acestea, cercetătorii doresc frecvent să studieze funcția celulară a unor astfel de proteine ​​sau doresc să exprime și să purifice astfel de proteine ​​care poartă modificări post-translaționale ale celulelor mamifere complete. Mai multe sisteme de expresie inductibile de mamifere, care utilizează puternicul promotor CMV, sunt acum disponibile comercial în care expresia este indusă de tetraciclină (T-RexTM Invitrogen / Life Sciences, Tet-On 3G Clontech), ecdisonă (Agilent Technologies / Stratagene) și IPTG (pTUNE Origene). Aceste sisteme facilitează creșterea unui număr suficient de celule înainte de inducerea proteinei țintă. Nakagawa T a exprimat o plasmidă DualTetONGluA2-FLAG / CNIH3-1D4 în celula HEKTetON (CLONTECH) pentru a atenua toxicitatea prin activarea canalului ionic GluA2 [82].

Dacă un anumit sistem de expresie nu reușește, poate fi avantajos să treceți la un sistem diferit (de exemplu, drojdie, insectă, bacterie, mamifer) dacă alte considerații permit (de exemplu, utilizarea finală, modificări post-translaționale). O proteină care este toxică într-un sistem poate să nu fie toxică în altul [80].

Dacă sunt necesare cantități relativ mici de proteine ​​(purificate), atunci producția de proteine ​​fără celule este o opțiune atractivă pentru a ocoli problemele de toxicitate celulară [80].


Publicat de Royal Society în condițiile Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, care permite utilizarea nerestricționată, cu condiția ca autorul original și sursa să fie creditate.

Referințe

. 2006 Biologie de mare viteză în era postgenomică. J. Vasc. Interv. Radiol . 17, 1077–1085. (doi: 10.1097 / 01.rvi.0000228840.12260.ff) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ

. 2014 O scurtă istorie a biologiei sintetice. Nat. Pr. Microbiol . 12, 381-390. (doi: 10.1038 / nrmicro3239) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Microscopie cu fluorescență de mare viteză pentru biologia sistemelor. Nat. Pr. Mol. Cell Biol . 7, 690-696. (doi: 10.1038 / nrm1979) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Strategii pentru producerea de proteine ​​eucariote active în sistemul de expresie bacteriană. Pac asiatic. J. Trop. Biomed. 2, 159–162. (doi: 10.1016 / S2221-1691 (11) 60213-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Expresia proteinei recombinante în Escherichia coli: avansuri și provocări. Față. Microbiol . 5, 172. (doi: 10.3389 / fmicb.2014.00172) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2001 Proteomică de mare viteză: exprimarea și purificarea proteinelor în lumea postgenomică. Proteine ​​Expr. Purif . 22, 159–164. (doi: 10.1006 / prep.2001.1465) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Proiectarea metodelor de producție de proteine ​​de mare viteză pentru biologia structurală. Structura 8, R177 – R185. (doi: 10.1016 / S0969-2126 (00) 00193-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Vincentelli R, Cimino A, Geerlof A, Kubo A, Satou Y, Cambillau C

. 2011 Screeningul și purificarea expresiei proteinelor de mare viteză în Escherichia coli . Metode 55, 65-72. (doi: 10.1016 / j.ymeth.2011.08.010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 Construcție de mare viteză și screening de expresie la scară mică a vectorilor multi-tag din Escherichia coli . Metode 55, 29–37. (doi: 10.1016 / j.ymeth.2011.08.002) Crossref, PubMed, Google Scholar

Mlynek G, Lehner A, Neuhold J, Leeb S, Kostan J, Charnagalov A, Stolt-Bergner P, Djinovic-Carugo K, Pinotsis N

. 2014 Centrul pentru platforma de studii structurale optimizate (COSS) pentru automatizarea clonării, exprimării și purificării proteinelor unice și a complexelor proteină-proteină. Aminoacizi 46, 1565–1582. (doi: 10.1007 / s00726-014-1699-x) Crossref, PubMed, Google Scholar

Dieckman L, Gu M, Stols L, Donnelly MI, Collart FR

. 2002 Metode de mare randament pentru clonarea și exprimarea genelor. Proteine ​​Expr. Purif. 25, 1-7. (doi: 10.1006 / prep.2001.1602) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Fabrica de ARN polimerază și transcripția arhaeală. Chem. Rev. . 113, 8350–8376. (doi: 10.1021 / cr400148k) Crossref, PubMed, Google Scholar

Jia B, Li Z, Liu J, Sun Y, Jia X, Xuan YH, Zhang J, Jeon CO

. 2015 O protează AMZ-tk dependentă de zinc dintr-un arheon termofil este un nou membru al familiei de proteine ​​archaemetzincin. Față. Microbiol. 6, 1380. (doi: 10.3389 / fmicb.2015.01380) Crossref, PubMed, Google Scholar

Jia B, Liu J, Van Duyet L, Sun Y, Xuan YH, Cheong GW

. 2015 Profilarea proteică a răspunsurilor la căldură, oxidativ și stres în Thermococcus kodakarensis KOD1. Față. Microbiol. 6, 605. (doi: 10.3389 / fmicb.2015.00605) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Enzime multifuncționale în arhee: promiscuitate și lumina lunii. Extremofili 17, 193–203. (doi: 10.1007 / s00792-012-0509-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Holz C, Lueking A, Bovekamp L, Gutjahr C, Bolotina N, Lehrach H, Cahill DJ

. 2001 O bibliotecă de expresie ADNc umană în drojdie îmbogățită pentru cadre deschise de citire. Genomul Res . 11, 1730–1735. (doi: 10.1101 / gr.181501) Crossref, PubMed, Google Scholar

Büssow K, Nordhoff E, Lubbert C, Lehrach H, Walter G

. 2000 O bibliotecă de ADNc uman pentru screening-ul expresiei proteinelor de mare viteză. Genomică 65, 1-8. (doi: 10.1006 / geno.2000.6141) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2004 Multe căi către multe clone: ​​o privire comparativă asupra metodelor de clonare de mare viteză. Genomul Res . 14, 2020–2028. (doi: 10.1101 / gr.2528804) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cao Y, Sun J, Zhu J, Li L, Liu G

. 2010 PrimerCE: proiectarea primerilor pentru clonare și expresia genelor. Mol. Biotehnologie . 46, 113-117. (doi: 10.1007 / s12033-010-9276-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Camilo CM, Lima GM, Maluf FV, Guido RV, Polikarpov I

. 2015 HTP-OligoDesigner: un instrument on-line de proiectare a grundului pentru clonarea genelor cu randament ridicat și mutageneza direcționată către sit. J. Comput. Biol . 23, 27-29. (doi: 10.1089 / cmb.2015.0148) Crossref, PubMed, Google Scholar

Otto P, Larson B, Krueger S

. 2002 Purificare automată de mare capacitate a produselor PCR utilizând particule paramagnetice Wizard® MagneSil ™. J. Lab. Autom . 7, 120-124. (doi: 10.1016 / s1535-5535-04-00232-1) Google Scholar

Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Duan H, Li X, Fan HQ, Cheng ZM, Li Y

. 2006 sinteza precisă bazată pe PCR a secvențelor lungi de ADN. Nat. Protoc . 1, 791–797. (doi: 10.1038 / nprot.2006.103) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yehezkel TB, Linshiz G, Buaron H, Kaplan S, Shabi U, Shapiro E

. 2008 De novo Sinteza ADN utilizând o singură moleculă PCR. Acizi nucleici Res. 36, e107. (doi: 10.1093 / nar / gkn457) Crossref, PubMed, Google Scholar

Klein JC, Lajoie MJ, Schwartz JJ, Strauch EM, Nelson J, Baker D, Shendure J

. 2016 Asamblare pereche multiplexă a oligonucleotidelor ADN derivate din matrice. Acizi nucleici Res . 44, e43. (doi: 10.1093 / nar / gkv1177) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 La scară largă de novo Sinteza ADN-ului: tehnologii și aplicații. Nat. Metode 11, 499-507. (doi: 10.1038 / nmeth.2918) Crossref, PubMed, Google Scholar

Quan J, Saaem I, Tang N, Ma S, Negre N, Gong H, White KP, Tian J

. 2011 Sinteza genetică paralelă pe cip și aplicarea la optimizarea expresiei proteinelor. Nat. Biotehnologie . 29, 449-452. (doi: 10.1038 / nbt.1847) Crossref, PubMed, Google Scholar

Optimitatea codonului 2015 este un factor determinant major al stabilității ARNm. Celula 160, 1111-1124. (doi: 10.1016 / j.cell.2015.02.029) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Festa F, Steel J, Bian X, Labaer J

. 2013 Clonarea cu randament ridicat și crearea de biblioteci de expresie pentru proteomică funcțională. Proteomica 13, 1381–1399. (doi: 10.1002 / pmic.201200456) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2009 Producția de proteine ​​de mare capacitate (HTPP): o revizuire a tehnologiilor care permit accelerarea producției de proteine. Metode Mol. Biol. 498, 1-18. (doi: 10.1007 / 978-1-59745-196-3_1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Blommel PG, Martin PA, Wrobel RL, Steffen E, Fox BG

. 2006 Producție cu eficiență ridicată, într-o singură etapă, a plasmidelor de expresie din clone ADNc folosind sistemul de clonare Flexi Vector. Proteine ​​Expr. Purif . 47, 562-570. (doi: 10.1016 / j.pep.2005.11.007) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Explorarea ORFeome umană: prepararea cu randament ridicat a clonelor ORF și caracterizarea eficientă a produselor proteice ale acestora. ADN Res . 15, 137-149. (doi: 10.1093 / dnares / dsn004) Crossref, PubMed, Google Scholar

Engler C, Kandzia R, Marillonnet S

. 2008 O metodă de clonare de precizie cu un singur pot, cu un singur pas, cu capacitate de transfer ridicată. Plus unu 3, e3647. (doi: 10.1371 / journal.pone.0003647) Crossref, PubMed, Google Scholar

Whitman L, Gore M, Ness J, Theodorou E, Gustafsson C, Minshull J

. 2013 Clonarea rapidă și fără cicatrici a fragmentelor genetice utilizând sistemul electra vector. Genet. Eng. Biotehnologie . 33, 42. (doi: 10.1089 / gen.33.11.20) Google Scholar

Chen WH, Qin ZJ, Wang J, Zhao GP

. 2013 Metoda de legare MASTER (metilare asistată cu capete adaptabile raționale) pentru asamblarea ADN-ului fără sudură. Acizi nucleici Res. 41, e93. (doi: 10.1093 / nar / gkt122) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Progrese recente în tehnologiile de asamblare a ADN-ului. Rezolvarea drojdiei FEMS . 15, 1-9. (doi: 10.1111 / 1567-1364.12171) PubMed, Google Scholar

Esposito D, Garvey LA, Chakiath CS

. 2009 Clonarea Gateway pentru exprimarea proteinelor. Metode Mol. Biol. 498, 31-54. (doi: 10.1007 / 978-1-59745-196-3_3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cheo DL, Titus SA, Byrd DRN, Hartley JL, Temple GF, Brasch MA

. 2004 Asamblarea concertată și clonarea mai multor segmente de ADN folosind in vitro recombinare specifică site-ului: analiză funcțională a clonelor de expresie cu mai multe segmente. Genomul Res . 14, 2111–2120. (doi: 10.1101 / gr.2512204) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zhang Y, Werling U, Edelmann W

. 2012 SLiCE: o nouă metodă de clonare a ADN-ului pe bază de extract de celule bacteriene. Acizi nucleici Res. 40, e55. (doi: 10.1093 / nar / gkr1288) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 O metodă simplă și eficientă de clonare a ADN-ului fără sudură folosind SLiCE din Escherichia coli tulpinile de laborator și aplicarea acesteia la mutageneza dirijată la locul SLiP. BMC Biotechnol . 15, 47. (doi: 10.1186 / s12896-015-0162-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Evaluarea metodelor de preparare a extractului de clonare a ligaturii fără sudură dintr-un Escherichia coli tulpina de laborator. Anal. Biochimie . 486, 51-53. (doi: 10.1016 / j.ab.2015.06.031) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Un extract de clonare de ligare fără sudură (SLiCE) de casă simplu și extrem de scăzut, ca alternativă la un kit de clonare ADN fără sudură disponibil în comerț. Biochimie. Biofizi. Reprezentant. 4, 148–151. (doi: 10.1016 / j.bbrep.2015.09.005) PubMed, Google Scholar

. 1990 Clonarea independentă de ligare a produselor PCR (LIC-PCR). Acizi nucleici Res. 18, 6069-6074. (doi: 10.1093 / nar / 18.20.6069) Crossref, PubMed, Google Scholar

Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO

. 2009 Asamblarea enzimatică a moleculelor de ADN până la câteva sute de kilobaze. Nat. Metode 6, 343-345. (doi: 10.1038 / nmeth.1318) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Irwin CR, Farmer A, Willer DO, Evans DH

. 2012 Clonarea In-fusion® cu ADN polimeraza virusului vaccinia. Metode Mol. Biol . 890, 23-35. (doi: 10.1007 / 978-1-61779-876-4_2) Crossref, PubMed, Google Scholar

Klock HE, Koesema EJ, Knuth MW, Lesley SA

. 2008 Combinarea metodei de extindere a primerului incompletă a polimerazei pentru clonare și mutageneză cu microscreening pentru a accelera eforturile de genomică structurală. Proteine 71, 982–994. (doi: 10.1002 / prot.21786) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2007 Exploatarea recombinării omoloage in vitro pentru a genera ADN recombinant prin SLIC. Nat. Metode 4, 251-256. (doi: 10.1038 / nmeth1010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Clonarea PCR cu extensie Overlap: o modalitate simplă și fiabilă de a crea plasmide recombinate. BioTechniques 48, 463-465. (doi: 10.2144 / 000113418) Crossref, PubMed, Google Scholar

Stevenson J, Krycer JR, Phan L, Brown AJ

. 2013 O comparație practică a tehnicilor de clonare independente de ligare. Plus unu 8, e83888. (doi: 10.1371 / journal.pone.0083888) Crossref, PubMed, Google Scholar

Thomas S, Maynard ND, Gill J.

. 2015 Construcția bibliotecii ADN utilizând Gibson Assembly®. Nat. Metode 12, 11. (doi: 10.1038 / nmeth.f.384) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Clonarea, exprimarea și purificarea cu randament ridicat a hidrolazelor glicozidice utilizând clonarea independentă de ligare (LIC). Proteine ​​Expr. Purif. 99, 35-42. (doi: 10.1016 / j.pep.2014.03.008) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schmid-Burgk JL, Schmidt T, Kaiser V, Honing K, Hornung V

. 2013 O tehnică de clonare independentă de ligatură pentru asamblarea de mare viteză a genelor efectoare asemănătoare activatorului de transcripție. Nat. Biotehnologie . 31, 76–81. (doi: 10.1038 / nbt.2460) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yuan H, Peng L, Han Z, Xie JJ, Liu XP

. 2015 Biblioteca de expresie recombinantă a Pyrococcus furiosus construit prin clonare cu randament ridicat: un instrument util pentru genomica funcțională și structurală. Față. Microbiol. 6, 943. (doi: 10.3389 / fmicb.2015.00943) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lee N, Francklyn C, Hamilton EP

. 1987 Legarea indusă de arabinoză a proteinei AraC la araI2 activează promotorul de operon araBAD. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 84, 8814-8818. (doi: 10.1073 / pnas.84.24.8814) Crossref, PubMed, Google Scholar

Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J.

. 1995 Reglarea strânsă, modularea și expresia la nivel înalt de vectori care conțin promotorul arabinoză PBAD. J. Bacteriol . 177, 4121-4130. Crossref, PubMed, Google Scholar

Otto CM, Niagro F, Su X, Rawlings CA.

. 1995 Expresia factorului de necroză a tumorii recombinante feline este toxică pentru Escherichia coli . Clin. Diagnostic. Laborator. Immunol . 2, 740-746. PubMed, Google Scholar

. 2010 Strategii de optimizare a expresiei proteinelor în E coli . Curr. Protoc. Protein Sci. 5, 21-29. (doi: 10.1002 / 0471140864.ps0524s61) Google Scholar

2008 Producerea și purificarea proteinelor. Nat. Metode 5, 135-146. (doi: 10.1038 / nmeth.f.202) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1986 Utilizarea ARN polimerazei bacteriofage T7 pentru a direcționa expresia selectivă la nivel înalt a genelor clonate. J. Mol. Biol . 189, 113-130. (doi: 10.1016 / 0022-2836 (86) 90385-2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Reducerea expresiei de fond și îmbunătățirea stabilității plasmidei cu vectori pET în BL21 (DE3). BioTechniques 29, 1234–1238. Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2004 T7 lizozima reprimă transcripția ARN polimerazei T7 prin destabilizarea complexului deschis în timpul inițierii. J. Biol. Chem . 279, 16 136–16 143. (doi: 10.1074 / jbc.M400139200) Crossref, Google Scholar

. 1996 Supraproducerea proteinelor în Escherichia coli: gazde mutante care permit sinteza unor proteine ​​de membrană și proteine ​​globulare la niveluri ridicate. J. Mol. Biol . 260, 289–298. (doi: 10.1006 / jmbi.1996.0399) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Tuning Escherichia coli pentru supraexprimarea proteinelor de membrană. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 105, 14 371-14 376. (doi: 10.1073 / pnas.0804090105) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1983 Comparația inițierii sintezei proteinelor în procariote, eucariote și organite. Microbiol. Rev. . 47, 1–45. PubMed, Google Scholar

Cheong DE, Ko KC, Han Y, Jeon HG, Sung BH, Kim GJ, Choi JH, Song JJ

. 2015 Îmbunătățirea expresiei funcționale a proteinelor heteroloage prin substituirea aleatorie a codurilor genetice în regiunea de codare 5 '. Biotehnologie. Bioeng . 112, 822–826. (doi: 10.1002 / bit.25478) Crossref, PubMed, Google Scholar

2013 Expresie genică precisă și fiabilă prin elemente standard de transcriere și inițiere a traducerii. Nat. Metode 10, 354-360. (doi: 10.1038 / nmeth.2404) Crossref, PubMed, Google Scholar

Liebeton K, Lengefeld J, Eck J.

. 2014 Compoziția nucleotidică a secvenței distanțier influențează randamentul expresiei genelor exprimate heterologic în Bacillus subtilis . J. Biotehnologie . 191, 214–220. (doi: 10.1016 / j.jbiotec.2014.06.027) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Reglarea fină a rețelelor genetice utilizând repetări de secvențe simple. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 109, 16 817–16 822. (doi: 10.1073 / pnas.1205693109) Crossref, Google Scholar

Mirzadeh K, Martinez V, Toddo S, Guntur S, Herrgard MJ, Elofsson A, Norholm MH, Daley DO

. 2015 Producție sporită de proteine ​​în Escherichia coli prin optimizarea cicatricilor de clonare la joncțiunea secvenței de codare vectorială. ACS Synth. Biol . 4, 959–965. (doi: 10.1021 / acssynbio.5b00033) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Reglarea traducerii prin structura ARNm în procariote și eucariote. Gene 361, 13-37. (doi: 10.1016 / j.gene.2005.06.037) Crossref, PubMed, Google Scholar

Goltermann L, Borch Jensen M, Bentin T.

. 2011 Reglarea expresiei proteinei utilizând biblioteci de codoni sinonimi direcționați către regiunea de codare ARNm de 5 ′. Protein Eng. Des. Sel . 24, 123-129. (doi: 10.1093 / protein / gzq086) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bentele K, Saffert P, Rauscher R, Ignatova Z, Bluthgen N

. 2013 Inițierea eficientă a traducerii dictează utilizarea codonilor la începutul genei. Mol. Syst. Biol . 9, 675.(doi: 10.1038 / msb.2013.32) Crossref, PubMed, Google Scholar

Goodman DB, Church GM, Kosuri S

. 2013 Cauze și efecte ale polarizării codonului N-terminal la gene bacteriene. Ştiinţă 342, 475–479. (doi: 10.1126 / science.1241934) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2010 Un mecanism conservat evolutiv pentru controlul eficienței traducerii proteinelor. Celula 141, 344-354. (doi: 10.1016 / j.cell.2010.03.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Influența codonilor asupra expresiei proteinelor în E coli se corelează cu nivelurile de ARNm. Natură 529, 358-363. (doi: 10.1038 / nature16509) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castillo-Mendez MA, Jacinto-Loeza E, Olivares-Trejo JJ, Guarneros-Pena G, Hernandez-Sanchez J

. 2012 Codonii care conțin adenină îmbunătățesc sinteza proteinelor prin promovarea legării ARNm la subunitățile 30S ribozomale, cu condiția ca ARNt specific să nu fie epuizat. Biochimie 94, 662-672. (doi: 10.1016 / j.biochi.2011.09.019) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Metoda pentru îmbunătățirea expresiei proteinelor legate de redoxul plantelor și aplicarea acesteia pentru in vitro reducerea tioredoxinelor cloroplastice. Proteine ​​Expr. Purif . 101, 152–156. (doi: 10.1016 / j.pep.2014.07.001) Crossref, PubMed, Google Scholar

Krishna Rao DV, Rao JV, Narasu ML, Bhujanga Rao AK

. 2008 Optimizarea conținutului AT al codonilor imediat în aval de codonul de inițiere și evaluarea condițiilor de cultură pentru exprimarea la nivel înalt a G-CSF uman recombinant în Escherichia coli . Mol. Biotehnologie . 38, 221-232. (doi: 10.1007 / s12033-007-9018-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Care S, Bignon C, Pelissier MC, Blanc E, Canard B, Coutard B

. 2008 Traducerea proteinelor recombinate în E coli poate fi îmbunătățit prin in Silicon generarea și screening-ul bibliotecilor aleatorii ale unei regiuni de ARNm −70 / + 96 în raport cu codonul de inițiere a traducerii. Acizi nucleici Res . 36, e6. (doi: 10.1093 / nar / gkm1097) Crossref, PubMed, Google Scholar

Salis HM, Mirsky EA, Voigt CA

. 2009 Proiectare automată a siturilor de legare a ribozomilor sintetici pentru a controla expresia proteinelor. Nat. Biotehnologie . 27, 946-950. (doi: 10.1038 / nbt.1568) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010 RBSDesigner: software pentru proiectarea site-urilor sintetice de legare a ribozomilor care oferă un nivel dorit de exprimare a proteinelor. Bioinformatica 26, 2633–2634. (doi: 10.1093 / bioinformatics / btq458) Crossref, PubMed, Google Scholar

Seo SW, Yang JS, Kim I, Yang J, Min BE, Kim S, Jung GY

. 2013 Proiectarea predictivă a regiunii de inițiere a traducerii ARNm pentru a controla eficiența traducerii procariote. Metab. Eng . 15, 67-74. (doi: 10.1016 / j.ymben.2012.10.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bonde MT, Pedersen M, Klausen MS, Jensen SI, Wulff T, Harrison S, Nielsen AT, Herrgard MJ, Sommer MOA

. 2016 Reglarea previzibilă a expresiei proteinelor în bacterii. Nat. Metode 13, 233–236. (doi: 10.1038 / nmeth.3727) Crossref, PubMed, Google Scholar

Reeve B, Hargest T, Gilbert C, Ellis T

. 2014 Prezicerea ratelor de inițiere a traducerii pentru proiectarea biologiei sintetice. Față. Bioeng. Biotehnologie . 2, 1. (doi: 10.3389 / fbioe.2014.00001) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1989 Clonarea moleculară: un manual de laborator , Al 2-lea edn. New York, NY: Cold Spring Laboratory Press. Google Scholar

. 2004 Prezentare generală a etichetelor de afinitate pentru purificarea proteinelor. Curr. Protoc. Protein Sci. 9, 9. (doi: 10.1002 / 0471140864.ps0909s36) PubMed, Google Scholar

Costa S, Almeida A, Castro A, Domingues L

. 2014 Etichete de fuziune pentru solubilitatea, purificarea și imunogenitatea proteinelor în Escherichia coli: noul sistem Fh8. Față. Microbiol. 5, 63. (doi: 10.3389 / fmicb.2014.00063) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Mai multe etichete de afinitate utilizate în mod obișnuit în purificarea cromatografică. J. Anal. Metode Chem . 2013, 581093. (doi: 10.1155 / 2013/581093) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2001 Perspective ale cromatografiei de afinitate a metalului imobilizat. J. Biochem. Biofizi. Metode 49, 335-360. (doi: 10.1016 / S0165-022X (01) 00207-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schmidt PM, Sparrow LG, Attwood RM, Xiao X, Adams TE, McKimm-Breschkin JL

. 2012 Demontarea DRAPELULUI! Modul în care exprimarea celulelor insectelor provoacă un sistem de etichete stabilit. Plus unu 7, e37779. (doi: 10.1371 / journal.pone.0037779) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2007 Sistemul Strep-tag pentru purificarea într-un singur pas și detectarea sau captarea cu afinitate ridicată a proteinelor. Nat. Protoc . 2, 1528–1535. (doi: 10.1038 / nprot.2007.209) Crossref, PubMed, Google Scholar

Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J

. 2004 Producția de proteine ​​solubile de mamifer în Escherichia coli: identificarea caracteristicilor proteinelor care se corelează cu exprimarea reușită. BMC Biotechnol . 4, 32. (doi: 10.1186 / 1472-6750-4-32) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zuo X, Li S, Sala J, Mattern MR, Tran H, Shoo J, Tan R, Weiss SR, Butt TR

. 2005 Îmbunătățirea expresiei și purificării proteinelor de membrană prin fuziunea SUMO în Escherichia coli . J. Struct. Funct. Genomică 6, 103-111. (doi: 10.1007 / s10969-005-2664-4) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hammon J, Palanivelu DV, Chen J, Patel C, Minor DL

. 2009 Un ecran de proteine ​​fluorescente verzi pentru identificarea proteinelor de membrană bine exprimate dintr-o cohortă de organisme extremofile. Protein Sci . 18, 121–133. (doi: 10.1002 / pro.18) PubMed, Google Scholar

Lilius G, Persson M, Bulow L, Mosbach K

. 1991 Precipitarea prin afinitate metalică a proteinelor care poartă cozi de afinitate din polihistidină atașate genetic. Euro. J. Biochem . 198, 499-504. (doi: 10.1111 / j.1432-1033.1991.tb16042.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2003 Expresie la nivel înalt și purificare rapidă a genelor de codoni rari din arheele hipertermofile de către sistemul de fuziune a genei GST. J. Chromatogr. B Analitic. Tehnologie. Biomed. Life Science . 786, 177–185. (doi: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00810-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Coleman MA, Lao VH, Segelke BW, Beernink PT

. 2004 Screening bazat pe fluorescență, de mare viteză, pentru exprimarea proteinelor solubile. J. Proteome Res . 3, 1024–1032. (doi: 10.1021 / pr049912g) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hewitt SN, Choi R, Kelley A, Crowther GJ, Napuli AJ, Van Voorhis WC

. 2011 Exprimarea proteinelor în Escherichia coli ca fuziuni cu proteina care leagă maltoza pentru a salva ținte neexprimate într-o conductă de expresie și purificare a proteinelor cu un randament ridicat. Acta Crystallogr. Sectă. F Struct. Biol. Strigă. Comun . 67, 1006–1009. (doi: 10.1107 / s1744309111022159) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Îmbunătățirea exprimării proteinelor solubile prin utilizarea etichetelor de fuziune. Curr. Opin. Biotehnologie . 17, 353–358. (doi: 10.1016 / j.copbio.2006.06.003) Crossref, PubMed, Google Scholar

Costa SJ, Coelho E, Franco L, Almeida A, Castro A, Domingues L

. 2013 Eticheta Fh8: un partener de fuziune pentru purificarea proteinelor simplă și rentabilă în Escherichia coli . Proteine ​​Expr. Purif. 92, 163–170. (doi: 10.1016 / j.pep.2013.09.013) Crossref, PubMed, Google Scholar

McCluskey AJ, Poon GM, Gariepy J

. 2007 O strategie rapidă și universală de purificare în tandem pentru proteinele recombinate. Protein Sci . 16, 2726-2732. (doi: 10.1110 / ps.072894407) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Combinații de etichete utilizate în mod obișnuit pentru purificarea afinității tandem. Biotehnologie. Aplic. Biochimie . 55, 73-83. (doi: 10.1042 / ba20090273) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Topologia membranei și inserția proteinelor de membrană: căutarea semnalelor topogene. Microbiol. Mol. Biol. Rev. . 64, 13–33. (doi: 10.1128 / mmbr.64.1.13-33.2000) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2005 O conductă scalabilă, bazată pe GFP, pentru screeningul și purificarea supraexprimării proteinelor de membrană. Protein Sci. 14, 2011–2017. (doi: 10.1110 / ps.051466205) Crossref, PubMed, Google Scholar

Drew D, Lerch M, Kunji E, Slotboom DJ, de Gier JW

. 2006 Optimizarea supraexprimării și purificării proteinelor de membrană folosind fuziuni GFP. Nat. Metode 3, 303-313. (doi: 10.1038 / nmeth0406-303) Crossref, PubMed, Google Scholar

Drew D, Newstead S, Sonoda Y, Kim H, von Heijne G, Iwata S

. 2008 Schema de optimizare bazată pe GFP pentru supraexprimarea și purificarea proteinelor de membrană eucariotă din Saccharomyces cerevisiae . Nat. Protoc. 3, 784–798. (doi: 10.1038 / nprot.2008.44) Crossref, PubMed, Google Scholar

Backmark AE, Olivier N, Snijder A, Gordon E, Dekker N, Ferguson AD

. 2013 Sondă fluorescentă pentru screeningul de mare viteză al expresiei proteinelor de membrană. Protein Sci . 22, 1124–1132. (doi: 10.1002 / pro.2297) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zhang YB, Howitt J, McCorkle S, Lawrence P, Springer K, Freimuth P

. 2004 Agregarea proteinelor în timpul supraexprimării limitată de extensiile peptidice cu sarcină negativă netă mare. Proteine ​​Expr. Purif. 36, 207-216. (doi: 10.1016 / j.pep.2004.04.020) Crossref, PubMed, Google Scholar

Roosild TP, Greenwald J, Vega M, Castronovo S, Riek R, Choe S

. 2005 Structura RMN a Mistic, o proteină integratoare de membrană pentru exprimarea proteinelor de membrană. Ştiinţă 307, 1317–1321. (doi: 10.1126 / science.1106392) Crossref, PubMed, Google Scholar

Leviatan S, Sawada K, Moriyama Y, Nelson N

. 2010 Metoda combinatorie pentru supraexprimarea proteinelor de membrană în Escherichia coli . J. Biol. Chem . 285, 23 548–23 556. (doi: 10.1074 / jbc.M110.125492) Crossref, Google Scholar

. 2001 Screening pentru exprimarea solubilă a proteinelor recombinante într-un format cu 96 de godeuri. Anal. Biochimie . 297, 79-85. (doi: 10.1006 / abio.2001.5331) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Cuantificare instantanee de mare viteză a expresiei și purității proteinelor bazată pe proteina galbenă fotoactivă oprită / pe etichetă. Protein Sci. 22, 1109–1117. (doi: 10.1002 / pro.2286) Crossref, PubMed, Google Scholar

2016 Proiectarea automată a proteinelor pe bază de structură și secvență pentru o expresie și stabilitate bacteriană ridicată. Mol. Celula 63, 337-346. (doi: 10.1016 / j.molcel.2016.06.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

2015 Reînfășurarea proteinelor din agregate și corpuri de incluziune mediată de stres. Chembiochem 16, 393–396. (doi: 10.1002 / cbic.201402427) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 O prezentare generală a reactivilor enzimatici pentru îndepărtarea etichetelor de afinitate. Proteine ​​Expr. Purif. 80, 283-293. (doi: 10.1016 / j.pep.2011.08.005) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 Sensibilitatea variabilă la detergenți a proteazei care este utilizată pentru eliminarea recombinantă a afinității proteinelor. Proteine ​​Expr. Purif. 78, 139-142. (doi: 10.1016 / j.pep.2011.04.011) Crossref, PubMed, Google Scholar

Davis GJ, Wang QM, Cox GA, Johnson RB, Wakulchik M, Dotson CA, Villarreal EC

. 1997 Exprimarea și purificarea rinovirusului recombinant 14 3CD proteinază și compararea acestuia cu proteinaza 3C. Arc. Biochimie. Biofizi . 346, 125-130. (doi: 10.1006 / abbi.1997.0291) Crossref, PubMed, Google Scholar

Joseph BC, Pichaimuthu S, Srimeenakshi S, Murthy M, Selvakumar K, Ganesan M, Manjunath SR

. 2015 O prezentare generală a parametrilor pentru exprimarea proteinei recombinate în Escherichia coli . J. Cell Sci. Ther . 6, 5. (doi: 10.4172 / 2157-7013.1000221) Crossref, Google Scholar

Wu X, Jörnvall H, Berndt KD, Oppermann U

. 2004 Optimizarea codonilor relevă factori critici pentru exprimarea la nivel înalt a două gene rare de codoni în Escherichia coli: Stabilitatea ARN și structura secundară, dar nu abundența ARNt. Biochimie. Biofizi. Rez. Comun . 313, 89-96. (doi: 10.1016 / j.bbrc.2003.11.091) Crossref, PubMed, Google Scholar

Prinz WA, Aslund F, Holmgren A, Beckwith J.

. 1997 Rolul căilor tioredoxinei și glutaredoxinei în reducerea legăturilor disulfidice proteice din Escherichia coli citoplasma. J. Biol. Chem. 272, 15 661–15 667. (doi: 10.1074 / jbc.272.25.15661) Crossref, Google Scholar

Zhang HC, Cisneros RJ, Dunlap RB, Johnson LF

. 1989 Sinteza eficientă a timidilat sintazei de șoarece în Escherichia coli . Gene 84, 487–491. (doi: 10.1016 / 0378-1119 (89) 90525-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

Weiner M, Anderson C, Jerpseth B, Wells S, Johnson-Browne B, Vaillancourt P

. 1994 Vectorii și gazdele sistemului StudET pET. Strateg. Mol. Biol . 7, 41-43. Google Scholar

2003 Exprimarea unui IRP recombinant Plasmodium falciparum proteină care leagă în mod specific IRE-urile plasmodiale putative. Mol. Biochimie. Parazitol . 126, 231–238. (doi: 10.1016 / S0166-6851 (02) 00278-5) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schlegel S, Lofblom J, Lee C, Hjelm A, Klepsch M, Strous M, Drew D, Slotboom DJ, de Gier JW

. 2012 Optimizarea supraexprimării proteinelor de membrană în Escherichia coli tulpina Lemo21 (DE3). J. Mol. Biol . 423, 648-659. (doi: 10.1016 / j.jmb.2012.07.019) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lopez PJ, Marchand I, Joyce SA, Dreyfus M

. 1999 Jumătatea C-terminală a RNase E, care organizează Escherichia coli degradante, participă la degradarea ARNm, dar nu la procesarea ARNr in vivo . Mol. Microbiol . 33, 188-199. (doi: 10.1046 / j.1365-2958.1999.01465.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Extinderea peisajului producției de proteine ​​recombinate în Escherichia coli . Biotehnologie. Lett . 35, 1971–1981. (doi: 10.1007 / s10529-013-1396-y) Crossref, PubMed, Google Scholar

Murata T, Shinozuka Y, Obata Y, Yokoyama KK

. 2008 Fosforilarea a doi factori de transcripție eucariotă, proteina de dimerizare Jun 2 și factorul de transcriere de activare 2, în Escherichia coli de Jun kinază N-terminală 1. Anal. Biochimie . 376, 115-121. (doi: 10.1016 / j.ab.2008.01.038) Crossref, PubMed, Google Scholar

2002 glicozilarea N-legată în Campylobacter jejuni și transferul său funcțional în E coli . Ştiinţă 298, 1790–1793. (doi: 10.1126 / science.298.5599.1790) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ihssen J, Kowarik M, Dilettoso S, Tanner C, Wacker M, Thony-Meyer L

. 2010 Producerea de vaccinuri glicoproteice în Escherichia coli . Microb. Fapt celular . 9, 61. (doi: 10.1186 / 1475-2859-9-61) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lizak C, Fan YY, Weber TC, Aebi M

. 2011 Glicozilarea N-legată a fragmentelor de anticorpi în Escherichia coli . Bioconjug. Chem . 22, 488–496. (doi: 10.1021 / bc100511k) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Reconstituirea funcțională a unei căi de sumoiolare reglabilă E3-dependent în Escherichia coli . Plus unu 7, e38671. (doi: 10.1371 / journal.pone.0038671) Crossref, PubMed, Google Scholar

Magnani R, Chaffin B, Dick E, Bricken ML, Houtz RL, Bradley LH

. 2012 Utilizarea unui sistem de coexpresie calmodulină lizină metiltransferază pentru generarea unei biblioteci combinatorii de proteine ​​modificate post-translațional. Proteine ​​Expr. Purif. 86, 83-88. (doi: 10.1016 / j.pep.2012.09.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

Duronio RJ, Jackson-Machelski E, Heuckeroth RO, Olins PO, Devine CS, Yonemoto W, Slice LW, Taylor SS, Gordon JI

. 1990 N-miristoilarea proteinelor în Escherichia coli: reconstituirea unei modificări proteice eucariote la bacterii. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 87, 1506–1510. (doi: 10.1073 / pnas.87.4.1506) Crossref, PubMed, Google Scholar

Ren Y, Yao X, Dai H, Li S, Fang H, Chen H, Zhou C

. 2011 Producția de timozină Nα-acetilată α1 în Escherichia coli . Microb. Fapt celular . 10, 26. (doi: 10.1186 / 1475-2859-10-26) Crossref, PubMed, Google Scholar

Gubellini F, Verdon G, Karpowich NK, Luff JD, Boel G, Gauthier N, Handelman SK, Ades SE, Hunt JF

. 2011 Răspunsul fiziologic la supraexprimarea proteinelor de membrană în E. coli. Mol. Proteomica celulară 10, M111.007930. (doi: 10.1074 / mcp.M111.007930) Crossref, PubMed, Google Scholar

2011 Depășirea barierelor din calea determinării structurii proteinelor de membrană. Nat. Biotehnologie . 29, 335-340. (doi: 10.1038 / nbt.1833) Crossref, PubMed, Google Scholar

Marreddy RKR, Geertsma ER, Poolman B.

. 2011 Producția de proteine ​​recombinante de membrană: trecut, prezent și viitor. În Structura și funcția supramoleculară 10 (ed

Brnjas-Kraljević J, Pifat-Mrzljak G

), pp. 41-74. Dordrecht, Olanda: Springer. Crossref, Google Scholar

Luirink J, Yu Z, Wagner S, de Gier JW

. 2012 Biogeneza proteinelor membranei interne din Escherichia coli . Biochim. Biofizi. Acta . 1817, 965–976. (doi: 10.1016 / j.bbabio.2011.12.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Kwon SK, Kim SK, Lee DH, Kim JF

. 2015 Genomică comparativă și evoluție experimentală a Escherichia coli Tulpinile BL21 (DE3) dezvăluie peisajul de evacuare a toxicității din supraproducția de proteine ​​din membrană. Știință. reprezentant . 5, 16076. (doi: 10.1038 / srep16076) Crossref, PubMed, Google Scholar

Wagner S, Baars L, Ytterberg AJ, Klussmeier A, Wagner CS, Nord O, Nygren PÅ, van Wijk KJ, de Gier JW

. 2007 Consecințele supraexprimării proteinelor de membrană în Escherichia coli . Mol. Cel. Proteomica 6, 1527–1550. (doi: 10.1074 / mcp.M600431-MCP200) Crossref, Google Scholar

Chen Y, Song J, Sui SF, Wang DN

. 2003 DnaK și DnaJ au facilitat procesul de pliere și au redus formarea corpului de incluziune a transportatorului de magneziu CorA supraexprimat în Escherichia coli . Proteine ​​Expr. Purif. 32, 221-231. (doi: 10.1016 / S1046-5928 (03) 00233-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

Link AJ, Skretas G, Strauch EM, Chari NS, Georgiou G

. 2008 Producție eficientă de receptori cuplați cu proteine ​​G cu membrană integrată și solubili cu detergenți Escherichia coli . Protein Sci . 17, 1857–1863. (doi: 10.1110 / ps.035980.108) Crossref, PubMed, Google Scholar

Skretas G, Makino T, Varadarajan N, Pogson M, Georgiou G

. 2012 Gene multi-copiate care sporesc randamentul receptorilor cuplați la proteina G de mamifere din Escherichia coli . Metab. Eng . 14, 591-602. (doi: 10.1016 / j.ymben.2012.05.001) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2009 Analiza genetică a expresiei receptorului cuplat cu proteina G în Escherichia coli: Rolul inhibitor al DnaJ asupra integrării cu membrană a receptorului central cannabinoid uman. Biotehnologie. Bioeng . 102, 357–367. (doi: 10.1002 / bit.22097) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schlegel S, Hjelm A, Baumgarten T, Vikstrom D, de Gier JW

. 2014 Producția de proteine ​​de membrană pe bază de bacterii. Biochim. Biofizi. Acta . 1843, 1739–1749. (doi: 10.1016 / j.bbamcr.2013.10.023) Crossref, PubMed, Google Scholar

Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R

. 2007 Escherichia coli fiziologie în bulionul Luria-Bertani. J. Bacteriol . 189, 8746–8749. (doi: 10.1128 / jb.01368-07) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Producția de proteine ​​prin autoinducție în culturi de agitare cu densitate mare. Proteine ​​Expr. Purif. 41, 207–234. (doi: 10.1016 / j.pep.2005.01.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Losen M, Frölich B, Pohl M, Büchs J

. 2004 Efectul limitării oxigenului și al compoziției medii asupra Escherichia coli fermentarea în culturi cu baloane de agitare. Biotehnologie. Prog . 20, 1062-1068. (doi: 10.1021 / bp034282t) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Producerea proteinelor recombinante prin cultura cu densitate celulară ridicată a Escherichia coli . Chem. Eng. Tehnologie . 61, 876–885. (doi: 10.1016 / j.ces.2005.03.031) Crossref, Google Scholar

Song JM, An YJ, Kang MH, Lee YH, Cha SS

. 2012 Cultivarea la 6-10 ° C este o strategie eficientă pentru a depăși insolubilitatea proteinelor recombinate în Escherichia coli . Proteine ​​Expr. Purif. 82, 297-301. (doi: 10.1016 / j.pep.2012.01.020) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castellanos-Mendoza A, Castro-Acosta RM, Olvera A, Zavala G, Mendoza-Vera M, García-Hernández E, Alagón A, Trujillo-Roldán MA, Valdez-Cruz NA

. 2014 Influența controlului pH-ului în formarea corpurilor de incluziune în timpul producției de sfingomielinază-D recombinantă în Escherichia coli . Microb. Fapt celular. 13, 1-14. (doi: 10.1186 / s12934-014-0137-9) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yang Q, Xu J, Li M, Lei X, An L

. 2003 Expresie la nivel înalt a unei enzime solubile de venin de șarpe, gloshedobin, în E coli în prezența ionilor metalici. Biotehnologie. Lett . 25, 607–610. (doi: 10.1023 / A: 1023067626846) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Expresia solubilă a proteinelor recombinante în citoplasma din Escherichia coli . Microb. Fapt celular. 4, 1-8. (doi: 10.1186 / 1475-2859-4-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Triton X-100 îmbunătățește raportul de solubilitate și secreție al pullulanazei predispuse la agregare produse în Escherichia coli . Bioresour. Tehnologie . 194, 137-143. (doi: 10.1016 / j.biortech.2015.07.024) Crossref, PubMed, Google Scholar

Mondal S, Shet D, Prasanna C, Atreya HS

. 2013 Expresie cu randament ridicat a proteinelor în E coli pentru studii RMN. Adv. Biosci. Biotehnologie . 4, 751-767. (doi: 10.4236 / abb.2013.46099) Crossref, Google Scholar

. 2015 Depășirea problemei solubilității în E coli: abordări disponibile pentru producția de proteine ​​recombinante. Metode Mol. Biol. 1258, 27-44. (doi: 10.1007 / 978-1-4939-2205-5_2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 Reglarea diferiților parametri de expresie pentru a obține proteine ​​recombinate solubile în E coli: avantaje ale screeningului de mare viteză. Biotehnologie. J . 6, 715–730. (doi: 10.1002 / biot.201100025) Crossref, PubMed, Google Scholar

Ukkonen K, Mayer S, Vasala A, Neubauer P

. 2013 Utilizarea hranei lente cu glucoză ca sursă de susținere a carbonului în mediu de autoinducție a lactozei îmbunătățește robustețea expresiei proteinelor în diferite condiții de aerare. Proteine ​​Expr. Purif. 91, 147–154. (doi: 10.1016 / j.pep.2013.07.016) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Expresie în Escherichia coli: devenind mai rapid și mai complex. Curr. Opin. Struct. Biol . 23, 326–334. (doi: 10.1016 / j.sbi.2013.01.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Rohe P, Venkanna D, Kleine B, Freudl R, Oldiges M

. 2012 Un flux de lucru automatizat pentru îmbunătățirea optimizării bioprocesului microbian pe o nouă platformă de microbioreactori. Microb. Fapt celular. 11, 1-14. (doi: 10.1186 / 1475-2859-11-144) Crossref, PubMed, Google Scholar

Long Q, Liu X, Yang Y, Li L, Harvey L, McNeil B, Bai Z

. 2014 Dezvoltarea și aplicarea tehnologiei de cultivare cu randament ridicat în dezvoltarea bioproceselor. J. Biotehnologie . 192, 323–338. (doi: 10.1016 / j.jbiotec.2014.03.028) Crossref, PubMed, Google Scholar

Grunzel P, Pilarek M, Steinbruck D, Neubauer A, Brand E, Kumke MU, Neubauer P, Krause M

. 2014 Metoda de cultivare la scară mică permite producția rapidă de plasmide în Escherichia coli . Biotehnologie. J . 9, 128-136. (doi: 10.1002 / biot.201300177) Crossref, PubMed, Google Scholar

Kong F, Yuan L, Zheng YF, Chen W

. 2012 Manipularea automată a lichidelor pentru știința vieții: o revizuire critică a stadiului actual al tehnicii. J. Lab. Auto . 17, 169–185. (doi: 10.1177 / 2211068211435302) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hughes SR, Butt TR, Bartolett S, Riedmuller SB, Farrelly P

. 2011 Proiectarea și construcția unei platforme de biologie moleculară robotică integrată de primă generație, de mare viteză, pentru aplicații de bioenergie. J. Lab. Auto . 16, 292-307. (doi: 10.1016 / j.jala.2011.04.004) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Purificare robotică cu randament ridicat a proteinelor recombinate marcate cu afinitate. Metode Mol. Biol. 1286, 97–106. (doi: 10.1007 / 978-1-4939-2447-9_9) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2016 Pregătirea automată a probelor. Ştiinţă 351, 300–302. (doi: 10.1126 / science.351.6270.300) Crossref, Google Scholar

. 2013 Producția de polipeptide recombinante în E coli: spre o abordare rațională pentru îmbunătățirea randamentelor proteinelor funcționale. Microb. Fapt celular . 12, 101. (doi: 10.1186 / 1475-2859-12-101) Crossref, PubMed, Google Scholar


Discuții

În acest studiu, a fost dezvoltat un sistem de raportare-genă dual bazat pe citometrie în flux (Fig. 1), care a fost confirmat cu un promotor inductibil Ptet utilizând diferite abordări ale qPCR, citometrie în flux și Western blot (Fig. 2), și apoi aplicate pentru a cuantifica părți biologice, cum ar fi promotori și RBS prezise de abordări bioinformatice cu corelații bune (Fig. 3, 4, 5). Corelația ridicată dintre diferitele concentrații ale inductorului tetraciclinelor și raporturile EGFP / opmCherry au sugerat capacitatea acestui sistem dual-reporter-genă de a caracteriza punctele tari ale diferitelor elemente genetice și corelațiile relativ ridicate dintre candidații preziși și rezultatele experimentale pentru promotori și RBS. indică faptul că este practic să se prezică punctele tari ale elementelor genetice pe baza seturilor de date omice și a instrumentelor bioinformatice și, prin urmare, pot fi utilizate pentru a ghida selecția promotorilor cu diferite forțe la nivel transcripțional în alte sisteme microbiene.

În plus, rezultatul nostru a indicat faptul că EGFP optimizat pentru codoni a avut de fapt o fluorescență scăzută, în timp ce mCherry optimizat pentru codoni a avut intensitate de fluorescență crescută (Fig. 1b). Prin urmare, acest sistem poate fi aplicat pentru a selecta și testa genele reporter cu fluorescența dorită prin abordări de inginerie proteică, cum ar fi optimizarea codonilor, proiectarea rațională și evoluția dirijată.

În plus, această abordare este simplă, cu o reproductibilitate ridicată, iar intensitatea fluorescenței atât a EGFP, cât și a opmCherry, precum și corelația corespunzătoare dintre rezultatele diferiților cercetători din grupul nostru la diferite perioade de funcționare este mare, cu o R 2 valoare de 0,92 (fișier suplimentar 2: Figura S3). Cu toate acestea, sunt necesare lucrări viitoare pentru a dezvolta în continuare acest sistem dual-reporter-genă pentru aplicații largi, cum ar fi includerea genelor reporter cu durată scurtă de viață și tehnici avansate de imagistică pentru a monitoriza schimbările de expresie dinamică ale diverselor elemente genetice, inclusiv promotori și RBS investigate în acest funcționează, precum și alte elemente genetice care urmează să fie explorate, cum ar fi UTR-uri, terminatori și ARNr.


Proteine ​​recombinante


Proteinele recombinante sunt o nouă combinație de gene care formează ADN. Tehnologia ADN-ului recombinant permite producerea de proteine ​​de tip sălbatic și modificate umane și de mamifere în cantități mari. Proteinele recombinante sunt fabricate din secvențe de ADN clonate care codifică de obicei o enzimă sau o proteină cu funcție cunoscută

Proteinele recombinante sunt fabricate prin inginerie genetică, numită și tehnologia de splicing genetic sau tehnologia ADN-ului recombinant. Prin introducerea genelor umane, animale sau vegetale în materialul genetic al bacteriilor, celulelor de mamifere sau drojdie, aceste microorganisme pot fi utilizate ca fabrici sau producători pentru a produce proteine ​​pentru utilizări medicale, academice și de cercetare.

Un vector este pur și simplu un instrument pentru manipularea ADN-ului și poate fi privit ca un „vehicul de transport” pentru producerea proteinelor din secvențe specifice de ADN clonate în ele. Purificarea și exprimarea unei proteine ​​pot fi uneori destul de complicate și consumă mult timp, de aceea se folosește o etichetă suplimentară în plus față de secvența specifică de ADN care va facilita purificarea și expresia amplificatoare a proteinei recombinante.

Proteinele recombinate sunt proteine ​​ale căror ADN-uri au fost create artificial. ADN din 2 sau mai multe surse care este încorporat într-o singură moleculă recombinantă. ADN-ul este tratat mai întâi cu o enzimă de restricție endonuclează, pe care capetele tăieturii au o bucată de ADN monocatenar. Acestea sunt numite „capete lipicioase” deoarece sunt capabile să se bazeze pe perechi cu orice moleculă de ADN care conține capătul lipicios complementar. ADN ligaza leagă covalent cele două catene într-o moleculă de ADN recombinant.

Molecula de ADN recombinant trebuie să fie reprodusă de multe ori pentru a oferi material pentru analiză și secvențierea amplificatorului. Producerea multor copii identice ale aceleiași molecule de ADN recombinant se numește clonare. Clonarea se face in vitro, printr-un proces numit reacție în lanț a polimerazei (PCR). Clonarea in vivo se poate face în microbii unicelulari precum E. coli, eucariote unicelulare precum drojdia și în celulele de mamifere crescute în cultura țesuturilor.

ADN-ul recombinant trebuie preluat de celulă într-o formă în care poate fi reprodus și exprimat. Acest lucru se realizează prin încorporarea ADN-ului într-un vector. Un număr de viruși (atât bacterieni, cât și ai celulelor de mamifere) pot servi drept vectori.

ADN-ul recombinant este denumit uneori și himeră. Atunci când combinați două sau mai multe fire diferite de ADN. Există 3 metode diferite prin care se realizează ADN-ul recombinant. 1. Transformare, 2. Fag-Transfecție 3. Drojdie, plantă și amp Mamifere transformare. Atunci când se utilizează metoda de transformare, trebuie să selectați o bucată de ADN pentru a fi inserată într-un vector, tăiați o bucată de ADN cu o enzimă de restricție și legați inserția de ADN în vector cu ADN Ligază. Insertul conține un marker selectabil care permite identificarea moleculelor recombinante. Un marker antibiotic este utilizat pentru a provoca moartea unei celule gazdă care nu conține vectorul atunci când este expus unui anumit antibiotic.
Trasnformarea este inserarea vectorului în celula gazdă. Celulele gazdă sunt pregătite să preia ADN-ul străin. Markerii selectabili sunt utilizați pentru rezistența la antibiotice, schimbările de culoare sau orice altă caracteristică care poate distinge gazdele transformate de gazdele netransformate. Transformarea mamiferelor de drojdie, plante și amp se face prin micro-injectarea ADN-ului în nucleul celulei transformate. Procesul de fag-transfecție este echivalent cu transformarea, cu excepția faptului că fagul lambda sau MI3 este utilizat în locul bacteriilor.
Acești fagi produc plăci care conțin proteine ​​recombinante care pot fi ușor distinse de proteinele nerecombinante prin diferite metode de selecție.

Cantități semnificative de proteine ​​recombinante sunt produse de gazdă numai atunci când se adaugă gene de expresie. Expresia Proteine ​​& rsquos depinde de genele care înconjoară ADN-ul de interes, această colecție de gene acționează ca semnale care oferă instrucțiuni pentru transcrierea și traducerea ADN-ului de interes de către celulă. Aceste semnale includ promotorul, situsul de legare a ribozomilor și terminatorul.

ADN-ul recombinant este inserat în vectori de expresie care conțin promotorul, situsul de legare a ribozomului și terminatorul.
În sistemele procariote, promotorul, situsul de legare a ribozomilor și terminatorul trebuie să provină de la aceeași gazdă, deoarece este puțin probabil ca bacteriile să înțeleagă semnalele promotorilor și terminatorilor umani. Gena desemnată nu trebuie să conțină introni umani, deoarece bacteriile nu o recunosc și acest lucru are ca rezultat terminarea prematură, iar proteina recombinantă nu poate fi procesată corect, pliată corect sau chiar poate fi degradată.

Secvența peptidică poate fi adăugată ca o extensie la N-terminal. Cercetătorii pot selecta sistemul de purificare specific pe care ar dori să-l folosească. Vectorii unici disponibili conțin mai multe caracteristici necesare pentru producerea de cantități în vrac de proteină țintă. Secvența peptidică este plasată de obicei în vector, astfel încât să fie concepută pentru a fi un punct de atac pentru o protează specifică. Astfel, după ce proteina recombinantă este exprimată și extrasă din bacterii, extensia peptidică specifică poate fi utilizată pentru purificarea proteinei și ulterior îndepărtată din proteina țintă pentru a genera o secvență aproape naturală pe produsul final.

6 sau mai multe resturi consistente de histidină acționează ca un situs de legare a metalelor pentru purificarea și exprimarea proteinelor recombinante. Secvența hexa-His se numește secvență His-Tag care poate fi plasată pe N-terminal al unei proteine ​​țintă prin utilizarea vectorilor de la diferite companii comerciale de biologie moleculară. Eticheta His conține un site de decolteare pentru o protează specifică. Proteinele recombinante His-Tag sunt purificate prin cromatografie de afinitate cu chelat metalic, cum ar fi coloanele de ioni de nichel care sunt utilizate ca ion de metal greu, iar proteina His-Tag este eluată din coloana de chelat de metal cu Histidină sau imidazol. Apoi proteina His-Tag purificată este tratată cu proteaza specifică pentru a scăpa de His-Tag sau nu dacă eticheta nu afectează locul activ al proteinei.

Proteinele au situsuri de legare a metalelor care pot fi utilizate pentru purificarea proteinelor recombinante și naturale. Acest tip de purificare este destul de simplu atunci când se utilizează o margelă de gel care este modificată covalent astfel încât să afișeze un grup de chelator pentru legarea unui ion de metal greu precum Ni2 + sau Zn2 +. Grupul de chelare de pe talonul de gel conține o cantitate mică de liganzi necesari pentru a reține ionul metalic. Deci, atunci când site-ul de legare a metalelor proteine ​​și rsquos găsește metalul greu, acesta se va lega prin furnizarea liganzilor de la site-ul său de legare a metalului pentru a se atașa la ionul metalic afișat pe locația chelatorului gelului. Această metodă de purificare este destul de identică cu cromatografia de afinitate la purificarea clasei de proteine ​​care leagă metalul.


Mulțumim membrilor laboratorului Wang pentru comentarii și discuții cu privire la manuscris și experimente, în special S. S. Yim și N. Johns pentru sfaturi și discuții cu privire la experimentele de bibliotecă promotor inductibil. H.H.W. recunoaște sprijinul financiar specific acordat de NSF (MCB-1453219), NIH (1U01GM110714, 1DP5OD009172), DoD ONR (N00014-15-1-2704) și Fundația Sloan (FR2015-65795) pentru această lucrare.

H-IH și HHW au dezvoltat conceptul inițial H-IH, JRF și JC. a efectuat experimente și a analizat rezultatele și HHW a supravegheat munca pe tot parcursul. H-IH și HHW au scris manuscrisul cu contribuții de la toți autorii.


Priveste filmarea: Procesul de detoxifiere: ce te poate ajuta și cât este de necesar (Ianuarie 2022).