Informație

Tehnica de laborator pentru a distinge între ADN monocatenar și ADN dublu catenar?


Ce tehnici de laborator există pentru a face diferența între ADN monocatenar și ADN bicatenar?


ADN-ul monocatenar și dublu catenar are diferite mobilități electroforetice, ssDNA se va mișca mai repede pe un gel de agaroză, deci dacă știți lungimea ADN-ului dvs. și se deplasează mai departe decât vă așteptați în raport cu o scară dsDNA este probabil ADNs. Efectul hipercromic înseamnă că ssDNA absoarbe, de asemenea, mai puternic decât dsDNA, astfel încât să vă puteți încălzi ADN-ul și dacă se schimbă absorbanța, a fost dsDNA și dacă nu este atunci ADNs-ul său (ar trebui să luați o alicotă pentru aceasta, astfel încât să aveți restul de eșantionul dvs. în tact). De asemenea, ați putea lua o alicotă și adăugați o singură exonuclează catenară și ați rulat produsele pe un gel împreună cu ADN-ul înainte de digestie, dacă nu mai există nimic în fântâna digerată, atunci ați avut ADNs dacă există încă o bandă după ce ați avut dsDNA (nu cred că această metodă este folosită într-adevăr, deoarece ați putea să o rulați pe un gel care este mai simplu și pierdeți mai puțină probă, dar ar trebui să funcționeze în continuare).


Ce este ARN dublu catenar? (cu poze)

Acidul ribonucleic cu catenă dublă (ARN) este o formă unică de ARN care apare cu două catene complementare, în loc de o singură catenă izolat, așa cum este mai frecvent pentru acest material genetic. ARN conține codul pentru o serie de activități biologice și joacă un rol important în organismele vii. ARN dublu catenar, cunoscut și sub numele de dsARN, apare de obicei în viruși și este oarecum neobișnuit. La viruși, este o caracteristică unică și doar un număr mic de familii virale prezintă această trăsătură.

ARN-ul este format din lanțuri de acizi nucleici care se atașează între ele pentru a forma o catenă conectată. Formele monocatenare pot avea o structură foarte complexă, deoarece se pliază una pe alta și creează forme tridimensionale elaborate. ARN dublu catenar poate deveni și mai complex, deoarece cele două lanțuri de material genetic se vor plia și răsuci pentru a îndeplini diferite funcții. Imaginea ARN este o provocare din cauza dimensiunii extrem de mici. Sunt necesare sisteme de imagine foarte sensibile și puternice pentru a vedea ARN într-un cadru de laborator.

Cercetătorii interesați de ARN dublu catenar îl pot izola în laborator prin introducerea enzimelor de tăiere într-o probă de ARN. Enzimele vor viza orice șiruri de ARN pentru a le separa, lăsând în urmă șuvițele duble. Aceste enzime sunt disponibile de la furnizori științifici sau laboratoarele își pot face propriile cercetări specifice. De obicei, un mediu controlat este necesar pentru scindarea ARN-ului cu enzime, deoarece contaminanții pot întrerupe procesul.

O funcție a ARN-ului cu catenă dublă este interferența sau mutarea. Catenele pot schimba modul în care o genă exprimă sau o pot opri cu totul. Pentru virusurile dsRNA, acest lucru conferă un avantaj distinct. Virusul poate intra într-o celulă și poate dezactiva genele pentru a se proteja și poate deturna celula pentru a produce mai multe copii ale virusului. Virușii din acest grup pot fi dificil de tratat, deoarece pot deveni o țintă în mișcare în organism și pot lupta împotriva medicamentelor pe care un medic le-ar putea prescrie pentru a le trata.

La fel ca omologul său mai cunoscut, ADN-ul, ARN-ul poate fi secvențiat cu echipamente care vor identifica lanțul chimic din fiecare catena. Acizii nucleici din ARN vor forma perechi complementare și acest lucru poate face mai ușoară extrapolarea unui model. Secvențierea geneticii ARN-ului cu catenă dublă poate fi importantă pentru înțelegerea modului în care funcționează în organismele vii, ceea ce va permite cercetătorilor să dezvolte medicamente antivirale pentru a viza virușii care poartă această sarcină utilă genetică unică.

De când a început să contribuie la site-ul în urmă cu câțiva ani, Mary a îmbrățișat provocarea interesantă de a fi cercetătoare și scriitoare InfoBloom. Mary are o diplomă în arte liberale de la Goddard College și își petrece timpul liber citind, gătind și explorând în aer liber.

De când a început să contribuie la site-ul în urmă cu câțiva ani, Mary a îmbrățișat provocarea interesantă de a fi cercetătoare și scriitoare InfoBloom. Mary are o diplomă în arte liberale de la Goddard College și își petrece timpul liber citind, gătind și explorând în aer liber.


INTRODUCERE

La începutul studiului virușilor capabili să distrugă bacteriile (adică bacteriofagii sau fagii), primul fag ADN monocatenar (ssDNA) φX174 a fost izolat din canalele din Paris (Sertic și Bulgakov 1935). Deși natura genomului său nu a fost înțeleasă decât decenii mai târziu (Sinsheimer 1959), faptul că acest virus a menținut infecțiozitatea chiar și după ce a trecut prin cele mai mici filtre de dimensiuni ale porilor disponibile la momentul respectiv a indicat dimensiunea extrem de mică a acestui fag în comparație cu alte izolate. . La începutul anilor 1960, fagii Ff, un grup distinct de fagi filamentosi ssDNA care infectează conjugativ Escherichia coli tulpini (adică tulpini F-pilus pozitive), au fost, de asemenea, izolate de sistemele de canalizare din Europa și SUA (Loeb 1960 Hofschneider 1963 Marvin și Hoffmann-Berling 1963). Genomurile mici, circulare ssDNA ale lui 17X174 și ale fagilor Ff au condus la rolurile lor proeminente ca sisteme și instrumente model în creșterea și epoca de aur a biologiei moleculare. Printre multe alte repere, φX174 a fost primul genom ADN care a fost secvențiat (Sanger, Nicklen și Coulson 1977) și primul genom care a fost construit in vitro din oligonucleotide sintetizate (Smith și colab. 2003), în timp ce fagii Ff, în special M13, au fost folosiți pentru clonare (Messing și colab. 1977), afișarea fagilor (Smith 1985) și nanotehnologia (Finnigan și colab. 2004).

În cea mai mare parte a secolului trecut, descoperirea de fagi noi a rămas dependentă de tehnicile clasice de testare a plăcii folosind gazde bacteriene cultivate. Ca urmare, majoritatea fagilor din ultima versiune de taxonomie din partea Comitetului internațional pentru taxonomia virusurilor (ICTV) (Adams și colab. 2015), au fost izolate pe gazde bacteriene aparținând unor grupuri relativ ușor de cultivat. În plus, majoritatea fagilor recunoscuți de ICTV sunt fagi cu ADN dublu catenar (dsADN) aparținând ordinului Caudovirales (Fig. 1a). În ciuda importanței fagilor ssDNA în dezvoltarea biologiei moleculare și a exploatării lor grele în scopuri biotehnologice, fagii ssDNA reprezintă doar 11% din fagii din baza de date ICTV. Majoritatea acestora sunt fagi filamentoși care aparțin familiei Inoviridae, inclusiv fagii Ff descriși mai sus, în timp ce familia Microviridae, care include φX174, reprezintă doar 2% din baza de date. Pe baza bazei de date ICTV, analiza microscopică electronică a fagilor de cultură (Ackermann 2007) și analiza dimensiunii genomului genomilor virali de mediu (Wommack și colab. 1999), paradigma generală de mai mulți ani a fost aceea că marea majoritate a fagilor sunt fagi ADNc cu coadă.

Compoziția ierarhică taxonomică a (A) specii de fagi recunoscute de ICTV (b) și citiri de secvență identificate ca fagi în metaviromi depuși în Metavir (Roux și colab. 2014b). Pentru generația (b), au fost incluse doar metaviromii publicați anterior cu citiri neasamblate disponibile pentru a putea verifica metodele de generare a bibliotecii (total = 181 Tabel S1, Informații suport). Compoziția taxonomică a citirilor a fost calculată de Metavir prin efectuarea unei comparații BLASTx cu baza de date a secvenței de proteine ​​a genomului viral complet NCBI Refseq (versiunea din 2015-01-05). Citirile au fost lungimea genomului normalizată utilizând GAAS (Angly și colab. 2009) și au fost incluse doar citirile care au prezentat un hit semnificativ (prag de 50 pe BLAST bitscore).

Compoziția ierarhică taxonomică a (A) specii de fagi recunoscute de ICTV (b) și citiri de secvență identificate ca fagi în metaviromi depuși în Metavir (Roux și colab. 2014b). Pentru generația (b), au fost incluse doar metaviromii publicați anterior cu citiri neasamblate disponibile pentru a putea verifica metodele de generare a bibliotecii (total = 181 Tabelul S1, Informații suport). Compoziția taxonomică a citirilor a fost calculată de Metavir prin efectuarea unei comparații BLASTx cu baza de date a secvenței de proteine ​​a genomului viral complet NCBI Refseq (versiunea din 2015-01-05). Citirile au fost lungimea genomului normalizată utilizând GAAS (Angly și colab. 2009) și au fost incluse doar citirile care au prezentat un hit semnificativ (prag de 50 pe bitcore-ul BLAST).

Progresele în biologia moleculară au relevat marea diversitate a bacteriilor din mediul înconjurător care nu au putut fi cultivate folosind metode standard de laborator (Pace și colab. 1986) prefigurând subestimarea severă a diversității de fagi reprezentată de izolate cultivate (Breitbart, Miyake și Rohwer 2004). În mod ironic, deși tehnicile de biologie moleculară s-au dezvoltat prin utilizarea fagilor, lipsa genelor de fagi universali, cum ar fi genele de ARN ribozomal găsite în organismele celulare, limitează substanțial aplicarea tehnicilor moleculare pentru studierea diversității fagilor. Numeroase studii au utilizat amplificarea „genelor de semnătură”, care sunt conservate în rândul membrilor limitați ai unor grupe de fagi specifici pentru a studia diversitatea fagilor necultivați (Adriaenssens și Cowan 2014), cu toate acestea, introducerea metagenomiei virale în 2002 a arătat prima marea diversitate de viruși din mediu (Breitbart și colab. 2002). Progresele ulterioare în domeniul metagenomiei virale au permis recuperarea virusurilor ssDNA (Angly și colab. 2006) și virusuri ARN (Culley, Lang și Suttle 2006), de asemenea.

Studiile metagenomice virale au oferit o perspectivă semnificativă în ceea ce privește diversitatea, ecologia, conținutul genetic, distribuția în profunzime și biogeografia fagilor dsDNA (Rosario și Breitbart 2011). Mai puține cercetări au abordat prevalența și rolurile ecologice ale fagilor ssDNA sau au comparat distribuțiile acestor două tipuri de fagi ADN. Acest decalaj de cunoștințe este semnificativ, deoarece raportul fagilor ssDNA faței dsDNA între bibliotecile de metavirome publicate depuse în Metavir, un server web conceput pentru a adnota seturi de date metagenomice virale (Roux și colab. 2014b), este mai mult decât dublu față de raportul din baza de date ICTV (Fig. 1b). Mai mult, majoritatea fagilor ssDNA din metaviromi sunt legați de membrii familiei Microviridae, care este de obicei privit ca un grup de fagi specializați care infectează doar o gamă restrânsă de gazde (Enterobacterii și paraziți intracelulari precum Chlamydia) (Cherwa și Fane 2011). Cu toate acestea, generarea de seturi de date metagenomice virale are multe prejudecăți cunoscute (Kim și Bae 2011) și potențiale, ceea ce duce la incertitudini cu privire la adevărata abundență și importanța fagilor ssDNA. Prin urmare, scopul acestei revizuiri este de a prezenta următoarele aspecte în ceea ce privește relevanța lor pentru studiul fagilor ADNs în eșantioane de mediu: (i) principalele aspecte în care fagii ADND diferă de fagii ADNcCaudovirales) și (ii) prevalența fagilor ssDNA în studiile anterioare de mediu și limitările actuale ale studiului lor.


Acesta este unul dintre cele peste 2.400 de cursuri pe OCW. Explorați materialele pentru acest curs în paginile legate de stânga.

MIT OpenCourseWare este o publicație deschisă și gratuită de materiale de la mii de cursuri MIT, care acoperă întregul curriculum MIT.

Fără înscriere sau înregistrare. Răsfoiți liber și utilizați materialele OCW în ritmul dvs. Nu există înregistrare și nu există date de început sau de sfârșit.

Cunoașterea este recompensa ta. Utilizați OCW pentru a vă ghida propria învățare pe tot parcursul vieții sau pentru a-i învăța pe alții. Nu oferim credit sau certificare pentru utilizarea OCW.

Creat pentru partajare. Descărcați fișiere pentru mai târziu. Trimite prietenilor și colegilor. Modificați, remixați și refolosiți (nu uitați să menționați OCW ca sursă.)


Electroforeză cu gel

Deoarece acizii nucleici sunt ioni încărcați negativ la pH neutru sau alcalin într-un mediu apos, pot fi mișcați de un câmp electric. Electroforeza pe gel este o tehnică utilizată pentru separarea moleculelor încărcate pe baza mărimii și a încărcăturii. Acizii nucleici pot fi separați ca cromozomi întregi sau ca fragmente. Acizii nucleici sunt încărcați într-o fantă la un capăt al unei matrice de gel, se aplică un curent electric și moleculele încărcate negativ sunt trase spre capătul opus al gelului (capătul cu electrodul pozitiv). Moleculele mai mici se deplasează prin porii din gel mai repede decât moleculele mai mari, această diferență în rata de migrație separă fragmentele pe baza mărimii. Acizii nucleici dintr-o matrice de gel sunt invizibili până când sunt colorați cu un compus care le permite să fie văzuți, cum ar fi un colorant. Fragmente distincte de acizi nucleici apar ca benzi la distanțe specifice de partea superioară a gelului (capătul negativ al electrodului) care se bazează pe dimensiunea lor (Figura 10.3). Un amestec de multe fragmente de dimensiuni variate apare ca un frotiu lung, în timp ce ADN-ul genomic netăiat este de obicei prea mare pentru a trece prin gel și formează o singură bandă mare în partea superioară a gelului.

Figura 10.3 Sunt prezentate fragmente de ADN din șase probe rulate pe un gel, colorate cu un colorant fluorescent și vizualizate la lumina UV. (credit: modificare a lucrării de James Jacob, Tompkins Cortland Community College)


Concentrație de ADN monocatenar fără celule în LCR ca biomarker pentru diagnosticarea bolii Alzheimer

Neuropatologia bolii Alzheimer (AD) este bine cunoscută ca o degradare a conexiunilor neuronale din creier cauzată de depozitele multiple de plăci peptidice amiloide-beta, precum și de încurcăturile neurofibrilare ale proteinelor tau [1]. Din această cauză și a cercetărilor de succes, atât nivelurile de proteină Amyloid-beta 42, cât și tau în lichidul cefalorahidian servesc în prezent ca biomarkeri importanți pentru diagnosticul de AD, în conformitate cu noile criterii de cercetare pentru diagnosticul de AD furnizate de Grupul de lucru internațional (IWG) [ 2].

Înainte de adăugarea actuală a biomarkerilor, criteriile de diagnostic AD pentru starea de AD „probabilă” foloseau doar metode de excludere clinică a altor cauze posibile ale demenței, reducându-se la un diagnostic de AD prin deducție [2]. Cu toate acestea, aceste criterii au fost revizuite recent pentru a include atât biomarkeri amiloid-beta și tau, cât și scanări PET amiloide. De la aceste modificări, biomarkerii AD au diferențiat cu succes demența AD de pacienții care se potrivesc cognitiv cu o statistică de specificitate în unele studii, pentru a fi cuprinsă între 85 și 95% [3] [4]. Cu toate acestea, în ciuda corelației directe dintre biomarkerii AD de bază și patologia AD, precizia diagnosticului clinic variază foarte mult. Utilizarea AD Biomarkers la nivel mondial nu are standardizare și armonizare a intervalelor și datelor normale, ceea ce crește, de asemenea, marja de eroare umană în colectarea datelor. Din această cauză, există o nevoie de înțeles de biomarkeri suplimentari pentru a crește precizia diagnosticului [5] [6]. În acest studiu, căutăm ADN monocatenar fără celule (cfssDNA) ca un posibil biomarker AD suplimentar față de cel al biomarkerilor AD de bază în care metodele și datele sunt simple, ieftine și, în cea mai mare parte, standardizate. ADN fără celule: la un pacient sănătos și normal, ADN fără celule rezultă în principal din celule care au suferit apoptoză. Odată ajuns în sistemul circulator al corpului, ficatul disipează rapid ADN-ul fără celule în decurs de 10-15 minute [7]. ADN-ul fără celule este mai cunoscut și utilizat ca biomarker pentru diferite tipuri de cancer, deoarece cercetările au arătat diferențe notabile între ADN-ul fără celule al unui pacient cu cancer față de cel al unui pacient normal. Din această cauză, multe dintre metodele de extracție și analiza datelor ADN-ului fără celule au fost studiate și standardizate [8] [9]. Studii recente au fost efectuate pe ADN mitocondrial fără celule (ADNmt) pentru a testa viabilitatea acestuia ca biomarker AD. Concentrațiile scăzute de ADNmt s-au dovedit a fi foarte semnificative la nivelurile de AD într-un grup de 48 de pacienți cu AD comparativ cu cele din 36 de martori. Aceste concentrații scăzute păreau să distingă AD de alte boli cauzatoare de demență, cum ar fi demența frontotemporală și boala Creutzfeldt-Jakob [10]. Cu toate acestea, studiile de replicare au arătat că niveluri scăzute de ADNmt au fost găsite și la pacienții cu boala Parkinson, ceea ce face ADNmt neclar ca o trăsătură distinctivă în AD sau o caracteristică comună pentru numeroase boli neurodegenerative [11] [12]. Cu alte tipuri de ADN fără celule deja studiate ca posibili biomarkeri AD, studiul nostru își propune să evalueze viabilitatea ADN monocatenar fără celule ca biomarker suplimentar pentru diagnosticarea AD.

Metode:

Eșantioane umane: inițial, un total de 145 de probe de lichid cefalorahidian lombar au fost obținute de la pacienți cu insuficiență cognitivă din clinicile de memorie italiene și suedeze (suedez 1 și suedez 2). Pacienții au fost desemnați ca AD sau non-AD în funcție de nivelul biomarkerilor lichidului cefalorahidian (LCR) utilizând limite stabilite: tau total (T-tau) & gt400 ng / L, fosfor-tau (P-tau) & gt60 ng / L și amiloid beta 42 (Ab-42) & lt500 ng / L. Toate probele au fost depozitate la -80 grade Celsius Dintre ambele cohorte suedeze, vârsta medie este de 73 de ani, cu o abatere standard a vârstei pacienților de 10,26 și 11,68 ani. Raportul de sex feminin în cohortele suedeze este de 37% și respectiv 40%. Cohorta italiană reprezintă un procent mai mare de femei, reprezentând un procent de 53% dintre femei. În general, studiile noastre au avut 72 de cazuri cunoscute de diagnostic diagnosticat ca urmare a îndeplinirii limitelor stabilite de biomarkeri și 73 de controale, cu un raport de sex global fiind de 41% femei. pe probă. Extracția ADN-ului total din fluidul cefalorahidian: 200 μL de LCR au fost folosiți pentru extracția ADN-ului cu protocolul de purificare a ADN-ului QIAamp DNA Blood Mini Kit, cum ar fi protocolul, după cum a fost descris de fabricație. ADN-ul a fost eluat într-un volum final de 50 μL și stocat la -20 grade Celsius în așteptarea analizei. Urmărim practicile și protocoalele de laborator pentru a evita contaminarea încrucișată între probe. Screening și analiză ADN: Folosind tehnologia de testare Qubit și urmând protocoalele de fabricație, am folosit 5-10 μL ADN pentru cuantificare. Toate probele au fost examinate în trei momente independente și separate. Media acestor valori a fost utilizată pentru a determina concentrația ADN în fiecare probă. Toate măsurătorile au fost scalate pe ng / L. În plus, am selectat ADN bicatenar, ARN și ADN monocatenar. Analizele statistice au fost efectuate folosind un test T-pair pentru a determina diferența dintre cele două grupuri. Analiza de regresie nominală nonparametrică a fost utilizată pentru a determina dacă cfssDNA este o variabilă semnificativă pentru a determina starea AD pentru a determina acest lucru, am rulat modelul nostru cu cfssDNA ca variabilă unică și o analiză separată în care vârsta de debut și sexul au fost introduse ca co-variante. Mai mult, regresia nominală neparametrică a fost utilizată pentru a obține curba și aria caracteristicii de funcționare (ROC) și zona sub curba (ASC). Analiza multivarianței a fost făcută pentru a observa corelațiile cazurilor AD cu Ab-42 și P-tau.

Rezultate:

Protocolul de testare a hemocitometrului nu a reușit să detecteze celulele prezente în CFS. Testul Qubit a arătat concentrații detectabile numai pentru ADNs. Analiza testului T în perechi a determinat că ADN cfss în cazurile AD este semnificativ mai mic decât martorul non-AD, cu o valoare p de 2 cozi de 0,0007 și o diferență medie de 21,66 ng / L. În plus, intervalele de încredere de 95% ale mediei pentru cazurile de AD variază între 68,85ng / L și 86,4 ng / L, în timp ce în cazurile non-AD, acest interval oscilează între 90,57 ng / L și 108ng / L. Analiza de regresie nominală neparametrică a arătat că ADN cfss este o variabilă semnificativă pentru prezicerea stării AD, semnificația predicției crește atunci când vârsta de debut și sexul sunt introduse ca co-variante (valoarea X2 p 0,0273). În cele din urmă, curba ROC a avut o ASC de 0,82901. Aceste rezultate au fost consistente, indiferent dacă cohortele au fost analizate independent sau combinate.

Discuţie:

Măsurătorile hemocitometrului nu au reușit să detecteze celulele prezente în LCR. Acest lucru este în concordanță cu analizele anterioare din literatura de specialitate care indică faptul că numărul normal de celule din LCR nu depășește cinci celule pe ml [13]. Prin urmare, putem deduce că orice material nucleu extras din probele de CSF provine dintr-o sursă fără celule. Aceste rezultate demonstrează că cazurile de AD au o concentrație semnificativ mai scăzută de ADNc decât cele de control. Toate cele trei seturi de date au avut ASC mai mare de 0,80, acest lucru este comparabil cu ASC observat cu Ab42 și P-tau în alte rapoarte. Deoarece măsurarea concentrației ADNcss este ieftină, fiabilă și ușor de realizat, ADNcss poate reprezenta un biomarker semnificativ și rentabil pentru AD. Sunt necesare studii suplimentare ale sensibilității acestei măsurători pentru a stabili în continuare CFssDNA ca biomarker pentru AD și a-l compara cu alți potențiali biomarkeri pentru AD, cum ar fi Ab42 și pTau.

Tabelul 1. Descrierea demografică a suedezelor 1 și 2 și a cohortei italiene.

Tabelul 2. test t asociat, regresie nominală nonparametrică X2

Imaginea 1. A) Distribuția concentrației ADNc cfss (ng / L) după cazurile AD și cazurile non-AD. B) Curba caracteristică de funcționare a receptorului (ASC = 0,82901)

Lucrari citate:

1. Höglund, K., și colab., Alzheimer & # 8217s boala - Evoluții recente biomarker în raport cu criteriile de diagnostic actualizate. Clinica Chimica Acta, 2015. 449: p. 3-8.

2. Dubois, B., și colab., Criterii de cercetare pentru diagnosticarea bolii Alzheimer & # 8217: revizuirea criteriilor NINCDS-ADRDA. The Lancet Neurology, 2007. 6 (8): p. 734-746.

3. Johansson, P., și colab., Biomarcatori ai lichidului cefalorahidian pentru boala Alzheimer și # 8217: performanță diagnostică într-o populație monocentrică omogenă. Jurnalul bolii Alzheimer, 2011. 24 (3): p. 537-546.

4. Landau, S.M., și colab., Compararea predictorilor de conversie și declin al afectării cognitive ușoare. Neurologie, 2010. 75 (3): p. 230-238.

5. Fagan, A. și R. Perrin, viitorii biomarkeri ai lichidului cefalorahidian al bolii Alzheimer. Biomark Medical, 2013. 6 (4): p. 455-476.

6. G.M., S., și colab., Utilizarea clinică a biomarkerilor lichidului cefalorahidian pentru diagnosticarea bolii Alzheimer & # 8217s: Selfie-ul italian. Jurnalul bolii Alzheimer, 2017. 55 (4): p. 1659-1666.

7. Suzuki, N., și colab., Caracterizarea ADN-ului circulant în plasma umană sănătoasă. Clinica Chimica Acta, 2008. 387 (1-2): p. 55-58.

8. Alegre, E. și colab., Biomarkeri circulanți în melanom malign. Progrese în chimie clinică, 2015. 69: p. 47-89.

9. Diaz Jr., L.A. și A. Bardelli, Biopsii lichide: genotiparea ADN-ului tumorii circulante. Journal of Clinical Oncology, 2014. 32 (6): p. 579-586.

10. Podlesniy, P. și colab., Concentrație scăzută de lichid cefalorahidian al ADN-ului mitocondrial în boala Alzheimer preclinică. Annals of Neurology, 2013. 74 (5): p. 655-668.

11. Pyle, A. și colab., ADN-ul mitocondrial CSF redus este un biomarker pentru boala Parkinson & # 8217s în stadiu incipient. Annals of Neurology, 2015. 38: p. 216.e7-216.e10.

12. Cervera-Carles, L. și colab., ADN mitocondrial al lichidului cefalorahidian în continuumul bolii Alzheimer. Neruobiologia îmbătrânirii, 2015. 53: p. 192.e1-192.e4.

13. Sakka, L., G. Coll și J. Chazal, Anatomia și fiziologia lichidului cefalorahidian. Eur Ann Otorhinolaryngol Head Neck Dis, 2011. 128 (6): p. 309-16.


Reacția de deplasare a catenelor ADN: un instrument puternic pentru discriminarea variantelor de nucleotidă unică

Variantele mono-nucleotidice (SNV) care sunt puternic asociate cu multe boli genetice și tumori sunt importante atât biologic cât și clinic. Detectarea SNV-urilor deține un potențial mare pentru diagnosticul și prognosticul bolii. Progresele recente în nanotehnologia ADN-ului au oferit numeroase principii și strategii compatibile cu detectarea și cuantificarea SNV-urilor cu sensibilitate, specificitate și programabilitate ridicate. În această revizuire, ne vom concentra discuția asupra tehnicilor emergente care utilizează deplasarea firelor de ADN, un element de bază în nanotehnologia ADN-ului dinamic. Pe baza principiilor lor de funcționare, clasificăm metodele actuale de detectare a SNV în trei categorii principale, incluzând strategii care utilizează reacții de deplasare a șuviței mediată prin prindere, reacții de schimb de prindere și reacții de deplasare a șirului mediate de enzime. Aceste metode de detectare diferențiază SNV-urile de omologii lor de tip sălbatic prin diferențe subtile în termodinamică, cinetică sau răspuns la manipularea enzimatică. Programabilitatea remarcabilă a nanotehnologiei ADN dinamice permite, de asemenea, proiectarea previzibilă și funcționarea flexibilă a diverselor sonde de deplasare a catenelor și / sau primeri. Aici, oferim un studiu sistematic al strategiilor actuale, cu accent pe mecanismele moleculare și aplicabilitatea lor la diagnosticul in vitro.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Morfologie virală

Virușii de toate formele și dimensiunile constau dintr-un miez de acid nucleic, o acoperire proteică externă sau capsidă și, uneori, un înveliș exterior.

Obiective de invatare

Descrieți relația dintre genomul viral, capsidă și înveliș

Chei de luat masa

Puncte cheie

  • Virușii sunt clasificați în patru grupe în funcție de formă: filamentoase, izometrice (sau icosaedrice), învelite și cap și coadă.
  • Mulți viruși se atașează de celulele lor gazdă pentru a facilita penetrarea membranei celulare, permițând replicarea lor în interiorul celulei.
  • Virușii neînveliți pot fi mai rezistenți la schimbările de temperatură, pH și unii dezinfectanți decât virusurile învelite.
  • Nucleul virusului conține micul genom cu un singur sau dublu catenar care codifică proteinele pe care virusul nu le poate obține de la celula gazdă.

Termeni cheie

  • capsidă: învelișul proteic exterior al unui virus
  • plic: o structură sau un capac de închidere, cum ar fi o membrană
  • filamentos: Având forma unor fire sau filamente
  • izometric: de, sau fiind un sistem geometric de trei axe egale situate în unghi drept unul cu altul (în special în cristalografie)

Morfologie virală

Virușii sunt acelulari, adică sunt entități biologice care nu au o structură celulară. Prin urmare, le lipsește majoritatea componentelor celulelor, cum ar fi organele, ribozomii și membrana plasmatică. Un virion constă dintr-un miez de acid nucleic, o acoperire proteică externă sau capsidă și, uneori, un înveliș exterior realizat din membrane proteice și fosfolipidice derivate din celula gazdă. Capsidul este alcătuit din subunități proteice numite capsomere. Virușii pot conține, de asemenea, proteine ​​suplimentare, cum ar fi enzime. Cea mai evidentă diferență între membrii familiilor virale este morfologia lor, care este destul de diversă. O caracteristică interesantă a complexității virale este că complexitatea gazdei și a virionului sunt necorelate. Unele dintre cele mai complicate structuri de virion sunt observate la bacteriofagi, viruși care infectează cele mai simple organisme vii: bacteriile.

Morfologie

Virușii au mai multe forme și dimensiuni, dar acestea sunt consistente și distincte pentru fiecare familie virală. În general, formele virusurilor sunt clasificate în patru grupe: filamentoase, izometrice (sau icosaedrice), învelite și cap și coadă. Virușii filamentosi sunt lungi și cilindrici. Multe virusuri vegetale sunt filamentoase, inclusiv TMV (virusul mozaicului tutunului). Virușii izometrici au forme aproximativ sferice, cum ar fi poliovirusul sau herpesvirusurile. Virușii înveliți au membrane care înconjoară capsidele. Virusurile animale, cum ar fi HIV, sunt frecvent învăluite. Virusii capului și cozii infectează bacteriile. Au un cap asemănător cu virusurile icosaedrice și o formă de coadă ca virusurile filamentoase.

Mulți viruși folosesc un fel de glicoproteină pentru a se atașa de celulele lor gazdă prin intermediul moleculelor din celulă numite receptori virali. Pentru acești viruși, atașamentul este o cerință pentru pătrunderea ulterioară a membranei celulare, permițându-le să-și finalizeze replicarea în interiorul celulei. Receptorii utilizați de viruși sunt molecule care se găsesc în mod normal pe suprafețele celulare și au propriile funcții fiziologice. Virușii au evoluat pur și simplu pentru a utiliza aceste molecule pentru propria lor replicare.

Exemplu de atașare a virusului la celula gazdă: Virusul KSHV leagă receptorul xCT de pe suprafața celulelor umane. Acest atașament permite pătrunderea ulterioară a membranei celulare și replicarea în interiorul celulei.

În general, forma virionului și prezența sau absența unui plic ne spun puțin despre ce boală poate provoca virusul sau ce specii ar putea infecta, dar acestea sunt încă mijloace utile pentru a începe clasificarea virală. Printre cei mai complecși virioni cunoscuți, bacteriofagul T4, care infectează Escherichia coli bacterie, are o structură a cozii pe care virusul o folosește pentru a se atașa de celulele gazdă și o structură a capului care găzduiește ADN-ul acesteia. Adenovirusul, un virus animal neînvelit care cauzează boli respiratorii la om, folosește vârfuri de glicoproteină care ies din capsomere pentru a se atașa de celulele gazdă. Virușii neînveliți includ, de asemenea, pe cei care cauzează poliomielita (poliovirus), negi plantare (papilomavirus) și hepatita A (virusul hepatitei A).

Exemple de forme de virus: Virușii pot fi fie de formă complexă, fie relativ simpli. Această figură prezintă trei virioni relativ complexi: bacteriofagul T4, cu grupul său de cap care conține ADN și fibrele cozii care se atașează la celulele gazdă adenovirus, care folosește vârfuri din capsidă pentru a se lega de celulele gazdă și HIV, care folosește glicoproteine ​​încorporate în plic pentru a se lega de celulele gazdă.

Virionii înveliți, cum ar fi HIV, constau din proteine ​​de acid nucleic și capsidă înconjurate de un înveliș bistrat fosfolipidic și proteinele sale asociate. Glicoproteinele încorporate în anvelopa virală sunt utilizate pentru a se atașa de celulele gazdă. Alte proteine ​​din anvelopă includ proteinele matrice care stabilizează anvelopa și joacă adesea un rol în asamblarea virionilor descendenți. Varicela, gripa și oreionul sunt exemple de boli cauzate de viruși cu plicuri. Datorită fragilității plicului, virușii neînveliți sunt mai rezistenți la schimbările de temperatură, pH și unii dezinfectanți decât virusurile învelite.

Tipuri de acid nucleic

Spre deosebire de aproape toate organismele vii care utilizează ADN ca material genetic, virusurile pot folosi ADN sau ARN. Nucleul virusului conține genomul sau conținutul genetic total al virusului. Genomii virali tind să fie mici, conținând doar acele gene care codifică proteine ​​pe care virusul nu le poate obține de la celula gazdă. Acest material genetic poate fi monocatenar sau dublu catenar. Poate fi, de asemenea, liniar sau circular. În timp ce majoritatea virușilor conțin un singur acid nucleic, alții au genomi care au mai multe, numite segmente.

În virusurile ADN, ADN-ul viral direcționează proteinele de replicare ale celulei gazdă și # 8217 pentru a sintetiza noi copii ale genomului viral și pentru a transcrie și traduce acel genom în proteine ​​virale. Virușii ADN provoacă boli umane, cum ar fi varicela, hepatita B și unele boli venerice, cum ar fi herpesul și verucile genitale.

Virușii ARN conțin doar ARN ca material genetic. Pentru a replica genomul lor în celula gazdă, virusurile ARN codifică enzime care pot replica ARN în ADN, ceea ce nu poate fi realizat de celula gazdă. Aceste enzime ale ARN polimerazei sunt mai susceptibile de a face erori de copiere decât ADN polimeraze și, prin urmare, fac adesea greșeli în timpul transcrierii. Din acest motiv, mutațiile în virusurile ARN apar mai frecvent decât în ​​virusurile ADN. Acest lucru îi face să se schimbe și să se adapteze mai rapid la gazda lor. Bolile umane cauzate de virusurile ARN includ hepatita C, rujeola și rabia.


Tehnologia ADN-ului recombinant este posibilă datorită mai multor instrumente utile pentru manipularea moleculelor de ADN și transformarea celulelor - inclusiv plasmide, enzime de restricție și ADN ligază. Acest laborator vă prezintă plasmidele și enzimele de restricție, precum și tehnica de laborator a electroforezei pe gel. Experimentele ulterioare de laborator vă vor introduce în celelalte instrumente ale biotehnologiei.

Enzime de restricție (numit si endonucleaze de restricție) sunt proteine ​​fabricate de multe specii bacteriene, pentru apărarea împotriva infecțiilor virale. Fiecare enzimă de restricție se deplasează de-a lungul unei molecule de ADN până când găsește o anumită secvență de recunoaștere în ADN. Enzima taie ADN-ul dublu catenar, rezultând fragmente de ADN. Au fost descoperite peste 3000 de enzime de restricție care recunosc secvențe palindromice scurte (4-8 bp).

Figura 1. Secvența de recunoaștere pentru enzima Hind III

Figura 1 prezintă secvența de recunoaștere pentru enzima de restricție Hind III. Observați că secvența de recunoaștere este a palindrom, și citește același mers înainte și înapoi. Enzima Hind III produce o eșalonat tăiată a ADN-ului și produce fragmente care au zone cu catenă unică numite "capete ldquosticky" și "rdquo". Figura 2 prezintă secvența de recunoaștere a altor două enzime de restricție Sca 1 și Pst 1. Enzima Pst 1 realizează o tăiere eșalonată a ADN-ului la secvența sa de recunoaștere. Dar enzima de restricție Sca I face o bont tăiat la secvența de recunoaștere pentru a genera fragmente de ADN fără capete lipicioase.

Figura 2: Site-uri de recunoaștere a enzimelor de restricție.

Celulele bacteriene au toate genele (genomul) într-un singur cromozom circular. Dar celulele bacteriene pot transporta și piese neesențiale de ADN numite plasmide. O plasmidă este un mic ADN circular care este capabil să se replice și poate transporta câteva gene de la celulă la celulă. Oamenii de știință sunt capabili să proiecteze plasmide recombinate pentru a transporta gene specifice într-o celulă gazdă țintă.

Figura 3: Harta plasmidică a pUC19.

Harta genetică a unei plasmide & ldquopUC19 & rdquo este prezentată în Figura 3. Dimensiunea totală a plasmidei este de 2686 pb. Există un sit de recunoaștere Pst I la poziția 439, un site de recunoaștere Hind III la poziția 447 și un site de recunoaștere Sca I la 2179. Dacă se utilizează o enzimă de restricție pentru tăierea plasmidei pUC19, ce s-ar produce?

Determinați ce fragmente de ADN sunt produse atunci când sunt utilizate două enzime de restricție pentru a tăia ADN-ul plasmidei pUC19.

Tăiați cu enzime de restricție

Sca I and Pst I

Sca I and Hind III

Pst I and Hind III

Resulting DNA fragment sizes


Priveste filmarea: Ustensile de laborator. (Ianuarie 2022).