Informație

5.12: Pirosequencing - Biologie


În laboratoarele din întreaga lume există o dorință intensă de a secvența mai mulți genomi.

  • cele ale unei largi varietăți de organisme pentru a ajuta la stabilirea relațiilor evolutive;
  • cele ale populațiilor grupate de microorganisme din, de exemplu, apa de mare, solul, intestinul gros;
  • alți oameni să caute gene care predispun la boli și tipare genetice în diferite grupuri etnice.

Toate genomurile secvențiate enumerate în dimensiunile genomului au fost determinate folosind metoda dideoxi inventată de Frederick Sanger și descrisă altfel. Cu toate acestea, acum se depune un mare efort pentru a găsi modalități de secvențiere a ADN-ului mai rapid (și mai ieftin).

Secvențierul genomului

Se dezvoltă mai multe metode noi și una este deja disponibilă comercial (sistemul Genome Sequencer 20). Metoda sa se numește piroseqüențierea sau secvențierea prin sinteză. Funcționează așa.

  • ADN-ul care trebuie secvențiat este divizat în fragmente de ~ 100 perechi de baze și denaturat pentru a forma ADN monocatenar (ADNs).
  • Fragmente ssDNA unice sunt atașate la margele microscopice, care sunt separate unele de altele.
  • Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este rulată pe fiecare margelă astfel încât fiecare să fie acoperită cu ~ 10 milioane de copii identice ale acelui fragment.
  • Margelele sunt plasate separat în puțuri microscopice separate (aproximativ 200.000 dintre ele).
  • Fiecare godeu primește un cocktail de reactivi:
    • ADN polimerază - pentru adăugarea deoxiribonucleotidelor la ADNs
    • fosfosulfat de adenozină (APS)
    • ATP sulfurilaza - o enzimă care formează ATP din adenozin fosfosulfat (APS) și pirofosfat (PPi)
    • luciferin
    • luciferază - o ATPază care catalizează conversia luciferinei în oxiluciferină cu eliberarea luminii

Executarea secvențierii:

  • Fiecare dintre mii de godeuri este inundată cu patru dezoxiribonucleotide, dTTP, dCTP și dGTP, dar în loc de dATP (care ar declanșa reacția luciferinei), se folosește în schimb deoxiadenozină alfa-tiotrifosfat (dATPαS). ADN polimeraza ignoră diferența și o folosește ori de câte ori se întâlnește un T pe șablonul ssDNA, dar luciferaza nu o recunoaște.
  • În orice sondă în care nucleotida complementară este prezentă la capătul 3 'al șablonului, nucleotida este adăugată și pirofosfatul este eliberat.
  • Cantitatea de lumină este proporțională cu numărul acelei nucleotide adăugate. Deci, dacă, de exemplu, nucleotida de intrare este dGTP și există un șir de 3 C pe șablon, lumina emisă va fi de 3 ori mai strălucitoare decât dacă este prezent doar un C.
  • Un detector preia lumina (dacă există) din fiecare puț și datele sunt înregistrate.
  • Apoi, fiecare dintre cele 3 nucleotide rămase este adăugată în ordine.
  • Apoi, secvența a 4 adaosuri se repetă până când sinteza este completă.

Diagrama de mai sus arată, de asemenea, tipul de date produse într-un singur puț. Înălțimea vârfului producției de lumină dă numărul de adăugiri care au avut loc atunci când s-a adăugat un anumit nucleotid (jos). Software-ul de computer afișează apoi secvența șablonului (sus) pentru fiecare dintre miile de fragmente diferite secvențiate. Cu această tehnologie, până la 20 de milioane de perechi de baze ale secvenței genomului pot fi învățate într-un instrument de mai puțin de 6 ore.


Secvențiator ADN

A Secvențiator ADN este un instrument științific utilizat pentru automatizarea procesului de secvențiere a ADN-ului. Având în vedere o probă de ADN, se utilizează un secvențiator de ADN pentru a determina ordinea celor patru baze: G (guanină), C (citozină), A (adenină) și T (timină). Acesta este apoi raportat ca un șir de text, numit citit. Unele secvențieri ADN pot fi, de asemenea, considerate instrumente optice, deoarece analizează semnale luminoase provenite din fluorocromi atașați nucleotidelor.

Primul secvențiator automat de ADN, inventat de Lloyd M. Smith, a fost introdus de Applied Biosystems în 1987. [1] A folosit metoda de secvențiere Sanger, o tehnologie care a stat la baza „primei generații” de secvențieri ADN [2] [ 3] și a permis finalizarea proiectului genomului uman în 2001. [4] Această primă generație de secvențieri ADN sunt în esență sisteme automatizate de electroforeză care detectează migrarea fragmentelor de ADN marcate. Prin urmare, acești secvențieri pot fi utilizați și în genotiparea markerilor genetici în care trebuie determinată doar lungimea unui fragment (fragmente) de ADN (de exemplu, microsateliți, AFLP).

Proiectul genomului uman a stimulat dezvoltarea unor platforme mai ieftine, cu un randament ridicat și mai precise, cunoscute sub numele de Next Generation Sequencers (NGS) pentru a secvența genomul uman. Acestea includ platformele de secvențiere ADN 454, SOLiD și Illumina. Mașinile de secvențiat de generația următoare au crescut substanțial viteza de secvențiere a ADN-ului, în comparație cu metodele anterioare Sanger. Probele de ADN pot fi preparate automat în doar 90 de minute, [5] în timp ce un genom uman poate fi secvențiat la o acoperire de 15 ori în câteva zile. [6]

Secvențieri de ADN de generație a treia mai recenți, cum ar fi SMRT și Oxford Nanopore măsoară adăugarea de nucleotide la o singură moleculă de ADN în timp real.

Din cauza limitărilor tehnologiei ADN-ului, aceste citiri sunt scurte în comparație cu lungimea unui genom, prin urmare citirile trebuie asamblate în contigs mai lungi. [7] Datele pot conține, de asemenea, erori, cauzate de limitări în tehnica secvențierii ADN sau de erori în timpul amplificării PCR. Producătorii de secvențieri ADN folosesc o serie de metode diferite pentru a detecta care baze ADN sunt prezente. Protocoalele specifice aplicate în diferite platforme de secvențiere au un impact asupra datelor finale care sunt generate. Prin urmare, compararea calității și costului datelor între diferite tehnologii poate fi o sarcină descurajantă. Fiecare producător oferă propriile modalități de a informa erorile de secvențiere și scorurile. Cu toate acestea, erorile și scorurile între diferite platforme nu pot fi întotdeauna comparate direct. Deoarece aceste sisteme se bazează pe diferite abordări de secvențiere a ADN-ului, alegerea celui mai bun secvențiator de ADN și a metodei depinde de obicei de obiectivele experimentului și de bugetul disponibil. [2]


Profilele de mutație somatică ale cancerului colorectal MSI și MSS identificate prin secvențierea generației următoare a întregului exom și analiza bioinformatică

Fundal: Cancerul colorectal (CRC) este cu aproximativ 1 milion de cazuri al treilea cel mai frecvent cancer la nivel mondial. Cercetări ample sunt în curs de desfășurare pentru a descifra modelele genetice care stau la baza cu speranța de a îmbunătăți diagnosticul și tratamentul precoce al cancerului. În această direcție, progresul recent în tehnologiile de secvențiere a următoarei generații a revoluționat domeniul genomicii cancerului. Cu toate acestea, o avertisment al acestor studii rămâne cantitatea mare de variații genetice identificate și interpretarea lor.

Metodologie / constatări principale: Aici vă prezentăm prima lucrare cu privire la întregul exome NGS al cancerelor de colon primare. Am efectuat 454 de exome piroza secvențierea întreagă a tumorii, precum și a țesutului adiacent al colonului normal neafectat de la pacienții cu cancer de colon stabil cu microsateliți (MSS) și instabili cu microsateliți (MSI) și am identificat mai mult de 50.000 de variații mici de nucleotide pentru fiecare țesut. Conform previziunilor bazate pe patomecanisme MSS și MSI, am identificat de opt ori mai multe variații somatice non-sinonime în cancerele MSI decât în ​​MSS și am putut reproduce rezultatul în patru CRC suplimentare. Abordarea noastră de filtrare a bioinformaticii a redus rata celor mai semnificative mutații la 359 pentru MSI și 45 pentru MSC CRC cu funcții proteice modificate prezise. În ambele CRC, MSI și MSS, am găsit mutații somatice în domeniul kinazei intracelulare a receptorului de proteine ​​morfogenetice osoase 1A, BMPR1A, o genă în care mutațiile germinale până acum sunt asociate cu sindromul de polipoză juvenilă și arată că mutațiile afectează funcțional funcția proteinei. .

Concluzii / semnificație: Concluzionăm că, prin secvențierea profundă a exomilor tumorali, se poate prevedea starea de microsateliți a CRC și, în plus, se pot identifica mutații potențial relevante clinic.

Declarație privind conflictul de interese

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.


Metode

Design de bază

Grundele aplicate în analiza conținutului intestinal al prădătorilor ar trebui să vizeze în mod ideal secvențe scurte de ADN-copie multiplă din cauza naturii degradate a secvențelor derivate din pradă [13, 16, 17, 36]. Prin urmare, ADN-ul ribozomal este adesea folosit ca țintă pentru amplificarea PCR în studiile de dietă, deoarece genele ADN-ului ribozomal (ADNr) se repetă simultan în număr mare de copii și sunt foarte conservate în cadrul speciilor [37]. Am proiectat primeri PCR „universali” care amplifică o regiune scurtă, dar destul de variabilă a rDNA 28S din toate eucariotele testate. De asemenea, am proiectat trei grunduri de blocare destinate legării la Euphausia superba secvență amplificată de primerii universali. Grundele utilizate în acest studiu sunt date în Tabelul 1 și sunt prezentate aliniate cu secvența de krill din Figura 2.

Grunduri. O regiune de 203 bp Euphausia superba Secvența 28S care arată locația diferiților primeri aplicați în acest studiu.

Grundul de blocare, 'Short28SR-blkKrill3'c3' s-a suprapus cu capătul 3 'al grundului universal invers, dar s-a extins în secvență specifică pentru krill și a fost modificat cu un distanțier C3 la capătul 3' (Figura 2). Aveam nevoie de o modificare care să fie 100% sintetizată (adică să nu lipsească oligo) și care să fie stabilă (adică fără degradare sau eliminare enzimatică a modificării după sinteză). Chiar dacă doar un mic procent din primerii de blocare ar trebui să primească amplificarea ADN-ului prădător ca urmare a neajutorării modificării 3 ', acest lucru ar face ca procedura să nu fie realizabilă. C3 spacer (3 hidrocarburi) CPG este o modificare standard a primerului disponibilă de la majoritatea furnizorilor de oligonucleotide personalizate. Adăugarea acestei modificări la capătul 3 'al unei oligonucleotide previne alungirea în timpul unei PCR fără a influența în mod vizibil proprietățile sale de recoacere. Deoarece oligos sunt sintetizați dintr-o direcție 3 'la 5', toate moleculele vor fi modificate cu modificarea 3 '. Modificarea capătului 3 'cu o grupare fosfat (așa cum este ales de Liles și colab. [35]), un ester fosfat sau utilizarea unei legături 3'-3' inversate ar preveni, de asemenea, alungirea. Cu toate acestea, reacțiile secundare în timpul deprotejării oligonucleotidelor sau impurităților enzimatice pot elibera gruparea 3'-hidroxil într-o mică măsură și aceste metode nu sunt atât de eficiente în blocare ca distanțierii C3 CPG [38, 39].

Deoarece găsirea unui site de legare adecvat pentru un primer specific speciei lângă un site de legare a unui primer universal este adesea dificilă, un primer de blocare specific krilului, Short28SF-DPO-blkKrill se suprapune cu capătul 3 'al primerului universal înainte și are un intern a fost de asemenea proiectată modificarea a cinci molecule de dezoxinozinină (dI) în plus față de modificarea distanțierului C3 (Figura 2). Oligonucleotidele convenționale foarte lungi de multe ori nu funcționează. În general, primerii mai lungi de 25 de baze sunt rareori folosiți, deoarece Tms-ul lor poate depăși 70 ° C, ceea ce este prea mare pentru ciclul PCR eficient [40]. Primerii lungi generează adesea multe benzi nespecifice rezultate din recoacerea nespecifică. O oligonucleotidă cu amorsare duală (DPO) [41] conține două regiuni de amorsare separate unite printr-un linker polideoxinozinic. DPO-urile nu suferă de limitările unui Tm ridicat, deoarece linkerul își asumă o structură asemănătoare bulei, rezultând două segmente de grund cu proprietăți distincte de recoacere. Mai mult, structura asemănătoare unei bule a linkerului previne în mod eficient formarea grundului-dimer și a acului de păr [41].

Grundurile de blocare Short28SR-blkKrill3'c3 și Short28SF-DPO-blkKrill au fost ambele concepute pentru a preveni recușirea versiunii nemodificate a grundului universal pe secvențe de krill. În continuare, a fost testat un al treilea grund de blocare specific krill situat între cei doi grunduri universali (Figura 2). Acesta a fost un primer de „oprire a alungirii” ([42] Figura 1) și, de asemenea, avea un distanțier C3 la capătul său 3 '.

Prelevarea de probe și extracția ADN-ului

ADN-ul genomic total a fost extras din specimene conservate cu etanol de nevertebrate pelagice din Antarctica sau specii de algă cultivate (Tabelul 2).

Krillul a fost colectat în timpul a două croaziere în apele estice ale Antarcticii cu RSV Aurora Australis. Prima croazieră a avut loc în toamna australă și a doua la sfârșitul iernii australe (Tabelul 2). Krilul a fost colectat folosind plasă Rectangular Midwater Trawl-8 prin remorci duble standard oblice de la suprafață până la 200 m sau prin remorcare țintă la adâncimi vizate de 100 m sau 16-60 m (Tabelul 2). Viteza navei în timpul remorcării nete a fost menținută la 2 noduri. Imediat după capturare, krilul a fost introdus în borcane care conțin 80% etanol, așa cum recomandă Passmore și colab. [26].

După 1-6 luni de depozitare, stomacurile de kril (anteproiecte) de kril clătit cu etanol au fost disecate la microscopul de disecție în cutii Petri sterile folosind pensă sterilizată cu flacără. S-a avut grijă, astfel încât stomacul să nu fie în contact cu părțile exterioare ale exoscheletului krilului. Stomacul a fost apoi clătit scurt în etanol proaspăt și introdus într-un tub Eppendorf fără ADN autoclav umplut cu tampon ATL (Qiagen). Proba a fost omogenizată utilizând un pistil de plastic steril înainte de extracția ADN-ului.

Tot ADN-ul a fost extras cu un kit DNeasy Blood & amp Tissue (Qiagen) în urma instrucțiunilor producătorului pentru țesutul animal și randamentul total al ADN-ului și calitatea extracțiilor finale (100 μL) a fost determinată folosind Picofluor 8000-004 (Turner Designs) și probe colorate cu Quant -iT PicoGreen ds reactiv ADN (sonde moleculare).

Testarea grundelor de blocare

Pentru a evalua eficiența diferitelor tipuri și cantități diferite de primeri de blocare, s-au creat amestecuri artificiale de rADN. Prima amplificare PCR a fost efectuată pe krill și Pyramimonas ADN cu primerii 28S rDNA universali Short28SF și Short28SR (Tabelul 1) ca reacții de 25 μL cu 0,25 μL din fiecare oligo (10 μM), 0,25 μL dNTP, 2,5 μL 10 ×, 0,1 μL Platină Taq ADN polimerază de înaltă fidelitate (Invitrogen) 5 U. μL -1, 1 μL Mg 2+ și 5 μL ADN (

Produsele PCR au fost apoi donate folosind celulele competente ale sistemului de clonare TOPO TA (Invitrogen). Transformanții au fost selectați folosind selecția albastru / alb pe LB-agar conținând X-Gal și 10 mg. mL -1 ampicilină sau kanamicină. Coloniile de culoare albă sau albastru deschis au fost alese pentru izolarea plasmidelor, reincubate peste noapte în mediu LB conținând antibiotice și plasmidele au fost apoi extrase folosind trusa de extracție ultracleană pentru miniplasmide (Mo Bio, Carlsbad, CA, SUA). Plasmidele au fost linearizate folosind Hind Enzima de restricție III și randamentul cuantificat utilizând Picofluor 8000-004 (Turner Designs) și probe colorate cu reactiv ADN Quant-iT PicoGreen ds (Molecular Probes).

Probele au fost astfel amestecate pentru a conține un exces de 100 de ori și de 1000 de ori de rADN-uri țintă (krill 28SrDNA) comparativ cu rADN-uri nedestinate (Pyramimonas sp.). O probă care conține doar ADN de kril a fost utilizată ca martor.

Amplificarea cu primeri de blocare a fost efectuată ca reacții de 25 μL cu 0,25 μL din fiecare dintre primerii universali 28S rDNA Short28SF (10 μM) și Short28SR (10 μM), 0,25 μL dNTP, 2,5 μL 10 ×, 0,1 μL Platină Taq ADN polimerază înaltă fidelitate (Invitrogen) 5 U. μL -1, 1 μL Mg 2+ și o cantitate variabilă de primer de blocare și ADNr. Condițiile de ciclare termică PCR au fost: 2 min la 94 ° C 40 de cicluri de 10 s la 94 ° C, 30 s la 59 ° C, 30 s la 68 ° C și în cele din urmă 5 min la 72 ° C.

Eficiența blocării a fost evaluată prin analiza fragmentelor a produselor PCR marcate fluorescent. Analiza fragmentelor separă un amestec de fragmente de ADN în funcție de dimensiunile lor și este mult mai sensibilă decât electroforeza pe gel standard. Analiza a fost efectuată pe un Analizor Genetic de Electroforeză Capilară (CE) Applied Biosystems 3130 xl și rezultatele au fost analizate cu Peak Scanner Software 1.0 (Applied Biosystems).

Amplificarea PCR a ADN-ului pradă din stomacurile de krill

După determinarea celui mai eficient amestec de primer de blocare, PCR a fost efectuată pe izolate de stomac de krill. PCR-urile au fost preparate folosind echipamente sterilizate cu UV și consumabile, iar controalele negative (fără șablon) au fost întotdeauna rulate alături de probe. Reacțiile PCR au fost efectuate pe un motor ADN MJ Research Gradient Cycler (ech. Chromo 4) și secvențierea a fost efectuată pe un analizor ADN 3730 xl (Applied Biosystems). Produsele PCR au fost verificate prin electroforeză pe un gel de agaroză 1,3% colorat cu colorare SYBR® Safe ADN gel (Invitrogen). Benzile vizibile au fost decupate și purificate cu coloane de centrifugare de extracție a gelului de ADN Bio-Rad Quantum Prep Freeze'N Squeeze.

Produsele PCR au fost apoi reincubate timp de 10 minute la 72 ° C cu 20 μL volum de reacție conținând 2 μL 10 ×, 1 μL Mg 2+, 0,2 μL Biotaq TM DNA Polimerază (Bioline) și 0,2 μL dNTP pentru a adăuga adenine 3 'și clonate folosind celulele competente ale sistemului de clonare TOPO TA (Invitrogen). Transformanții au fost selectați pentru PCR și amplificarea a fost efectuată cu primerii TOPO_F și TOPO_R ca reacții de 25 μL cu 0,25 μL din fiecare oligo (10 μM), 0,25 μL dNTP, 2,5 μL 10 ×, 0,1 μL Platină Taq ADN polimerază înaltă fidelitate (Invitrogen) 5 U. μL -1 și 1 μL Mg 2+. Condițiile de ciclare termică a PCR au fost: 2 min la 94 ° C 40 cicluri de 10 s la 94 ° C, 30 s la 65 ° C, 30 s la 68 ° C și în cele din urmă 5 min la 72 ° C.

Au fost generate secvențe din aceste produse PCR cu primerul M13 forward și reacțiile de secvențiere BigDye Terminator v3.1 (ABI).

Amplificarea pentru secvențierea speciilor care nu sunt încă disponibile în GenBank au fost efectuate ca reacții de 25 μL cu 0,25 μL din fiecare dintre primerii universali 28S rDNA Short28SseqF și Short28SseqR (10 μM) (Tabelul 1) concepute pentru a acoperi o zonă mai mare decât primerii Short28SF / Short28SR , inclusiv site-urile lor de legare a primerului, 0,25 μL dNTP, 2,5 μL 10 ×, 0,1 μL Platină Taq ADN polimerază de înaltă fidelitate (Invitrogen) 5 U. μL -1 și 1 μL Mg 2+. Condițiile de ciclare termică PCR au fost nemodificate, cu excepția creșterii etapei de alungire la 60 s.

Identificarea clonei

Clonele au fost identificate provizoriu prin găsirea celei mai apropiate potriviri în baza de date GenBank utilizând algoritmul BLASTN [43]. Toate secvențele (clonele și cele mai apropiate potriviri) au fost apoi aliniate în MEGA 4 [44] și s-a creat un arbore de asemănare folosind distanțele Tamura-Nei [45] și algoritmul de evoluție minimă cu gestionarea decalajului prin ștergere în perechi.


3. Discuție

Controlul epigenetic al KEAP1 expresia prin metilare a fost raportată pe scară largă în tumorile solide și reprezintă în multe contexte un marker de prognostic multifacetic pentru evoluția bolii [7]. La pacienții cu gliom, hipermetilarea concomitentă a KEAP1 și MGMT prezice un risc mai mic de progresie la pacienții tratați cu radioterapie și temozolomidă [28]. La pacienții cu cancer mamar triple-negativi cu KEAP1 metilare, a fost observat un risc mai mare de mortalitate decât la pacienții fără cancer mamar triplu negativ. Prin contrast, KEAP1 metilarea a fost asociată cu o supraviețuire mai bună fără progresie la pacienții tratați cu epirubicină / ciclofosfamidă și docetaxel ca chimioterapie secvențială [30]. Aberant KEAP1 metilarea a fost raportată și în cancerul colorectal și în țesuturile cancerului de cap și gât și a fost legată de cele mai slabe prognoze ale acestor tumori [32,36]. În carcinomul cu celule renale clare (ccRCC), analiza datelor TCGA a sugerat că tăcerea epigenetică prin metilare este capabilă să prezică puternic supraviețuirea pacientului [27].

În ciuda impactului bine documentat al KEAP1 și NFE2L2 mutații în NSCLC și LCNEC [34], rolul prognostic al KEAP1 metilarea în cancerul pulmonar nu a fost încă clarificată. Inhibarea selectivă a KEAP1 metilarea promotorului genei de către genisteină, observată în celulele A549, a sugerat o modalitate prin care KEAP1 demetilarea ar putea reprezenta un marker al efectelor radio-sensibilizante în cancerul pulmonar [37]. În țesuturile cancerului pulmonar, prezența anomaliilor epigenetice în KEAP1 gena plus mutațiile sale punctuale / LOH s-au potrivit cu prevalența acumulării nucleare de NRF2 în țesuturile NSCLC și a fost asociată cu un risc crescut de progresie a cancerului pulmonar la pacienții rezecați chirurgical [31]. Prin contrast, în țesuturile NSCLC, KEAP1 metilarea singură evaluată de QMSP nu pare a fi un marker de prognostic independent al evoluției bolii.

Munca noastră a vizat mai întâi să evalueze modelul de metilare a regiunii promotorului KEAP1 în diferite histotipuri ale liniilor celulare ale cancerului pulmonar, efectuând pentru prima dată o evaluare QMSP vs pirozecvență. KEAP1 hipermetilarea a fost detectată în 50% din liniile celulare NSCLC (atât ADC cât și SqCC), în carcinoizi atipici și descrisă pentru prima dată în 42% din liniile celulare SCLC. Ultimul rezultat nu a fost încă raportat și a fost surprinzător, deoarece oferă prima indicație a leziunilor epigenetice ale KEAP1 genă în SCLC. Chiar dacă puține indicații importante ale KEAP1 modificări genetice ale tumorilor pulmonare neuroendocrine de grad înalt (LCNEC) cu caracteristici adeno-similare au provenit din două lucrări recente [35,38], mutații punct SCLC ale KEAP1 și NFE2L2 genele rămân un fenomen rar, iar modulația epigenetică a KEAP1 expresia nu a fost încă elucidată.

Nivele foarte variabile de KEAP1 metilarea promotorului prin QMSP a fost observată până la nivelul limită în toată linia celulară pulmonară, independent de histologie, fără o corelație liniară între QMSP și valorile de pirosecvențiere.p = 0,19, pentru corelația Pearson). Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că eșantioanele care au fost metilate peste QMSP și limita de pirozecvenție s-au suprapus aproape complet și doar într-un caz (linia celulară H1581) rezultatul nu a fost concordant.

În prezent, nu există un consens cu privire la cea mai bună tehnică pentru KEAP1 evaluarea metilării și câte și ce site-uri CpG KEAP1 promotorii ar trebui analizați rămâne o problemă controversată într-un context de traducere [7]. Există mai multe instrumente de diagnosticare moleculară care pot fi utilizate pentru a evalua starea de metilare pentru a influența informațiile de rezoluție a unui singur nucleotid despre zonele metilate ale ADN după tratamentul cu bisulfit și pentru a traduce aceste constatări în cadru clinic [39]. QMSP amplifică ADN-ul metilat și cuantifică un nivel țintă de metilare în raport cu genele menajere (de exemplu, b-actină). Pe de altă parte, pirozecvența amplifică ADN-ul genomic transformat în bisulfit folosind grunduri independente de starea de metilare și cuantifică procentul de CpGs metilate cu rezoluție de bază unică. Ambele metode reprezintă tehnici simple, rapide și eficiente din punct de vedere al costurilor care pot fi ușor implementate în practica clinică, totuși, studierea metilării fiecărui CpG separat ar trebui să demasceze diferențele putative ale modelului de metilare în cancerul pulmonar cu histologii diferite care ar explica absența corelației între QMSP nivelurile și media metilării CpG a aceleiași regiuni a aceluiași statut al probelor prin pirozecvenție.

Cel mai interesant este analiza noastră a modelului și densității KEAP1 metilarea promotorului în liniile celulare ale cancerului pulmonar a arătat că primele șapte situri CpG unice (1 & # x020137, regiunea P1a) păreau a fi semnificativ mai metilate decât ultimele șase grupe CpG (8 & # x0201313, regiunea P1b) din regiunea promotorului P1. Pe baza acestor rezultate, un efect mai puternic și un impact asupra KEAP1 nivelul de expresie ar trebui să fie ipotezat de site-urile CpG 1-7 situate în subregiunea critică mai aproape de site-ul de început al transcripției (TSS) al genei (P1a). O posibilă explicație interesantă este că în regiunea P1a au fost mapate două site-uri de legare supuse pentru Sp1 și AP2 [29,40], doi factori de transcripție a degetelor de zinc care contribuie la activitatea transcripțională crucială a acestei gene [41]. În consecință, am presupus că hipermetilarea P1 KEAP1 promotorul ar putea duce la pierderea legării SP-1 și AP-2 prin inhibarea exprimării sale la primele două, 4 și 5 situri CpG din celulele canceroase pulmonare analizate, respectiv [29,40].

În acest studiu am confirmat, de asemenea, că tăcerea epigenetică a KEAP1 prin metilare promotor exercită un rol critic în modularea KEAP1 activitate de transcriere. O corelație inversă între KEAP1 Nivelurile de ARNm și nivelurile de metilare au fost demonstrate prin tratamentul in vitro 5 & # x02032-azacytidine pe celule carcinoide, SCLC și ADC, coroborând astfel ideea generală că secvențele consensuale ale mai multor situri de transcripție au fost marcate în controlul epigenetic al KEAP1.

Această analiză deschide dezbaterea cu privire la câte și ce site-uri CpG din KEAP1 promotorul trebuie analizat pentru a stabili o limită clinică la pacienții afectați de cancer pulmonar. Alte analize prospective în țesuturile cancerului pulmonar sunt în curs de desfășurare pentru a defini dacă anumite site-uri CpG specifice ale KEAP1, fie o combinație a acestora, chiar dacă nu consecutive, ar putea avea un rol predictiv sau prognostic mai bun la pacienții cu cancer pulmonar.


Rezultate si discutii

Scopul principal al acestui studiu a fost de a compara rezultatele obținute cu tehnici dependente de cultură și independente de cultură. Ne-am asigurat că probele testate au fost eterogene, prin colectarea strugurilor din trei sisteme de producție diferite pentru analiză cu aceste tehnici.

Biodiversitatea drojdiilor pe struguri

În total, am izolat 1.200 de colonii, dintre care 1.121 am putut identifica: izolatele s-au arătat că aparțin zece specii diferite prin metoda PCR-ITS-RFLP dependentă de cultură [14] (Tabelul 4). Cele mai frecvent identificate specii au fost H. uvarum / K. apiculata (66,5% din toate izolatele) și C. zemplinina (23,55% din toate izolatele). Celălalt non-Saccharomyces speciile prezente au fost Kluyveromyces thermotolerans, Cryptoccocus magnus, Sporobolomyces roseus, Aureobasidium pullulans, Bulleromyces albus, M. pulcherrima, și Rhodoturula nothofagi. Aceste specii sunt cele mai frecvent descrise în studiile publicate, dar au fost raportate că sunt prezente la frecvențe foarte diferite [10, 20]. Saccharomyces cerevisiae nu a fost izolat de niciunul din strugurii recoltați. Acest rezultat este în concordanță cu raritatea extremă raportată a S. cerevisiae pe struguri [24].

Profiluri PCR-DGGE ale ARNr 26S amplificat din probe colectate din ecofito (E), organic (O) și convențional (C) parcele de viță de vie înainte de fermentația alcoolică (T1), la jumătatea drumului (T2) și două treimi din parcurs (T3) fermentarea. Identificarea s-a bazat pe o comparație BLASTn a secvențelor obținute din benzile PCR-DGGE cu GenBank: Hanseniaspora uvarum (H.u) Candida zemplinina (C.z), Botryotinia fuckeliana (B.) Aureobasidium pullulans (A.p). Cladosporium sp. (Cl.). Saccharomyces cerevisiae (S.c) Alternaria sp (A.). Benzile comune tuturor izolatelor (ssDNA marcate) sunt artefacte ADN monocatenare

Profiluri PCR-DGGE ale ARNr 26S amplificat din probe colectate din ecofito (E), organic (O) și convențional (C) parcele de viță de vie înainte de fermentația alcoolică (T1), la jumătatea drumului (T2) și două treimi din parcurs (T3) fermentarea. Identificarea s-a bazat pe o comparație BLASTn a secvențelor obținute din benzile PCR-DGGE cu GenBank: Hanseniaspora uvarum (H.u) Candida zemplinina (C.z), Botryotinia fuckeliana (B.) Aureobasidium pullulans (A.p). Cladosporium sp. (Cl.). Saccharomyces cerevisiae (S.c) Alternaria sp (A.). Benzile comune tuturor izolatelor (ssDNA marcate) sunt artefacte ADN monocatenare

În total, 57.048 de citiri brute mai lungi de 250 bp au fost generate de 454 de analize de pirozecvenție. Citirile care nu îndeplineau criteriile de calitate au fost eliminate (a se vedea „Materiale și metode”) 32.527 de citiri de secvență de înaltă calitate au fost păstrate pentru analize ulterioare. S-au obținut între 1.582 și 9.404 citiri de secvență de înaltă calitate pe probă (Tabelul 3). Normalizarea a fost efectuată pentru a obține același număr de citiri pentru fiecare probă pentru estimarea cantitativă a diversității. Apoi am grupat citiri de înaltă calitate în funcție de similitudinea lor, oferind 87–387 OTU pe eșantion (Tabelul 3).

Rezumatul a 454 de date de pirosecvențiere, bogăția estimată a OTU, acoperirea eșantionului și indicii (Chao1, ACE și Shannon) pentru bibliotecile fungice 18S rDNA din probele de struguri Chardonnay

Sistemul agricol. Organice. Ecofito. Convențional.
Timp de prelevare. T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
Citește Raw 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
Citiri de înaltă calitate păstrate după pașii de filtrare 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
Citiri de înaltă calitate păstrate după etapa de omogenizare 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
Număr de OTU (3% nivel de distanță) - nivel de gen 330 124 102 387 146 87 285 90 95
Indicele diversității Shannon 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
Indicele de bogăție Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
Indicele de bogăție ACE 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
ESC 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58
Sistemul agricol. Organice. Ecofito. Convențional.
Timp de prelevare. T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
Citește Raw 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
Citiri de înaltă calitate păstrate după pașii de filtrare 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
Citiri de înaltă calitate păstrate după etapa de omogenizare 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
Număr de OTU (3% nivel de distanță) - nivel de gen 330 124 102 387 146 87 285 90 95
Indicele diversității Shannon 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
Indicele de bogăție Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
Indicele de bogăție ACE 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
ESC 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58

ESC: C X = 1 − (N X/n), Unde N X este numărul de citiri unice de înaltă calitate și n este numărul total de citiri de înaltă calitate

ESC acoperirea eșantionului estimată, OTU unitate taxonomică operațională

Rezumatul a 454 de date de piroseqüențiere, bogăția estimată a OTU, acoperirea eșantionului și indicii (Chao1, ACE și Shannon) pentru bibliotecile fungice 18S rDNA din probele de struguri Chardonnay

Sistemul agricol. Organice. Ecofito. Convențional.
Timp de prelevare. T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
Citește Raw 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
Citiri de înaltă calitate păstrate după pașii de filtrare 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
Citiri de înaltă calitate păstrate după etapa de omogenizare 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
Număr de OTU (3% nivel de distanță) - nivel de gen 330 124 102 387 146 87 285 90 95
Indicele diversității Shannon 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
Indicele de bogăție Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
Indicele de bogăție ACE 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
ESC 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58
Sistem agricol. Organice. Ecofito. Convențional.
Timp de prelevare. T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
Citește Raw 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
Citiri de înaltă calitate păstrate după pașii de filtrare 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
Citiri de înaltă calitate păstrate după etapa de omogenizare 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
Număr de OTU (3% nivel de distanță) - nivel de gen 330 124 102 387 146 87 285 90 95
Indicele diversității Shannon 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
Indicele de bogăție Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
Indicele de bogăție ACE 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
ESC 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58

ESC: C X = 1 − (N X/n), Unde N X este numărul de citiri unice de înaltă calitate și n este numărul total de citiri de înaltă calitate

ESC acoperirea eșantionului estimată, OTU unitate taxonomică operațională

Curbele de rarefiere pentru un ADNr 18S total de înaltă calitate se citesc din probe de struguri Chardonnay (organice O, ecofito E, și convențional C) la un nivel de distanță de 3% (A) și curbele de rarefacție normalizate în ceea ce privește dimensiunile de bibliotecă 18S rDNA de înaltă calitate la un nivel de distanță de 3% (b)

Curbele de rarefiere pentru rADN 18S total de înaltă calitate citite din probe de struguri Chardonnay (organice O, ecofito E, și convențional C) la un nivel de distanță de 3% (A) și curbele de rarefacție normalizate în ceea ce privește dimensiunile de bibliotecă 18S rDNA de înaltă calitate la un nivel de distanță de 3% (b)

Comparația diferitelor tehnici moleculare utilizate pentru a caracteriza diversitatea fungică a trei sisteme diferite de producere a strugurilor (organic, ecofito și convențional)

Sistem agricol. Organice. Ecofito. Convențional.
Timp de prelevare. T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
Tehnici. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE.
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
Candida zemplinina10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
Saccharomyces cerevisiae 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces albus 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
Cryptococcus magnus6.1 1.40 30.5 5
Sistemul agricol. Organice. Ecofito. Convențional.
Timp de prelevare. T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
Tehnici. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE. PYRO (%). PCR ITS (%). DGGE.
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
Candida zemplinina10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
Saccharomyces cerevisiae 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces albus 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
Cryptococcus magnus6.1 1.40 30.5 5

PYRO 454 piroseqüențierea genelor ARNr 18S, PCR ITS PCR-5.8S-ITS –RFLP, DGGE PCR- DGGE al genelor ARNr 26S

Comparison of the various molecular techniques used to characterize the fungal diversity of three different grape production systems (organic, ecophyto, and conventional)

Farming system . Organic . Ecophyto . Conventional .
Sampling time . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 .
Techniques . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE .
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
Candida zemplinina10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
Saccharomyces cerevisiae 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces albus 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
Cryptococcus magnus6.1 1.40 30.5 5
Farming system . Organic . Ecophyto . Conventional .
Sampling time . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 .
Techniques . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE .
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
Candida zemplinina10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
Saccharomyces cerevisiae 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces albus 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
Cryptococcus magnus6.1 1.40 30.5 5

PYRO 454 pyrosequencing of 18S rRNA genes, PCR ITS PCR-5.8S-ITS –RFLP, DGGE PCR- DGGE of 26S rRNA genes

Relative abundances, based on the taxonomic assignation of high-quality 18S rDNA reads of fungi from Chardonnay grape samples (organic O, ecophyto E, and conventional C), for the 16 major genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Relative abundances, based on the taxonomic assignation of high-quality 18S rDNA reads of fungi from Chardonnay grape samples (organic O, ecophyto E, and conventional C), for the 16 major genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Relative abundances, based on the taxonomic assignment of high-quality 18S rDNA reads for the fungi in Chardonnay grape samples (organic O, ecophyto E, and conventional C), for the first 17 minor genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Relative abundances, based on the taxonomic assignment of high-quality 18S rDNA reads for the fungi in Chardonnay grape samples (organic O, ecophyto E, and conventional C), for the first 17 minor genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Changes in biodiversity during alcoholic fermentation

Although results should be taken with cautious since no duplicate have been performed, all three methods showed a decrease in biodiversity during alcoholic fermentation, consistent with previous reports [ 28]. Indeed, as fermentation progresses, the biodiversity of the yeast community decreases as shown by the richness indices (Table 3), with the emergence of a dominant species [ 15, 33]. However, differences were observed in the results obtained with the different techniques (Table 4). For example, for all three sampling times, the culture-dependent method showed C. zemplinina to be the dominant species in conventional production system samples. High-throughput sequencing results indicated that, for this production system, H. uvarum accounted for 49.47 and 40.01 % of the total yeast population at T2 and T3, respectively (Table 4). DGGE also confirmed the presence of Hanseniaspora at T2 and T3. This suggests that culture-dependent identification approaches may lead to incorrect interpretation.

For the organic production system, we identified five species at T2, and only two at T3 (H. uvarum și C. zemplinina) by PCR-ITS-RFLP. The sequencing of amplified 18S rRNA gene fragments resulted in the identification of three species at T2 and five at T3. The two major species were identified by all three techniques, but pyrosequencing also identified minority species occurring at T3, such as S. cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, și M. pulcherrima, which were not detected by either PCR-ITS-RFLP or DGGE.

For the ecophyto production system, only two species were identified by PCR-ITS-RFLP at T2. One of these species, S. roseus, was not detected by DGGE or pyrosequencing. High-throughput sequencing revealed the presence of three minor species (C. zemplinina, S. cerevisiae, T. delbrueckii) two of which were undetectable with the two other techniques, the remaining species, S. cerevisiae, being detected by DGGE. At T3, S. cerevisiae was detected, but was present at low levels, with H. uvarum identified as the majority species by PCR-ITS-RFLP. Based on the sequencing results, Saccharomyces accounts for up to one-third of the total population, whereas Torulaspora accounts for 15 % of the total population. In orice caz, Torulaspora was not identified by the other two methods. For the conventional production system, no H. uvarum was detected by PCR-ITS-RFLP at T3, with C. zemplinina considered to account for 100 % of the population at this time point, in analyses carried out with this technique. By contrast, both DGGE and 454 pyrosequencing techniques revealed the presence of H. uvarum at this time point.

Grape samples from the three production systems considered differed in terms of yeast biodiversity, with potential effects on population dynamics during alcoholic fermentation, consistent with previous findings [ 11, 12, 25]. However, firm conclusions about the influence of production system on yeast biodiversity would require the analysis of a very large number of samples. Indeed, the trends observed may reflect sample variation rather than differences due to the production system [ 36], and it would be very difficult to draw any firm conclusions on the effect of production system from our data. Nevertheless, it would be of considerable interest to test this hypothesis in future studies.

The three methods gave different results. This was not unexpected, as such differences have already been reported for comparisons between DGGE and isolation by culture [ 30], and between culture-dependent methods and ARISA [ 36].

Our results demonstrate that culture-dependent identification methods detect fewer species than other methods. Indeed, the number of species identified by the ITS-RFLP analysis of isolates was similar to the number of species identified by DGGE, but far lower than that identified by the high-throughput sequencing of amplicons (Figs. 3, 4). The metagenomic approach based on the 454 pyrosequencing of amplified 18S rRNA genes revealed much greater fungal diversity than previously described, particularly for mold species, although some of the species identified were present at very low densities (Figs. 3, 4). This detection of greater community diversity than documented by other methods indicates the superiority of metagenomic approaches.

The findings of this study suggest that culture-dependent methods are not the most appropriate methods for studies of yeast biodiversity. Indeed, yeasts differ considerably in their ability to grow on standard media and this may lead to the unintentional selection of certain species. PCR-DGGE is not suitable for use in biodiversity studies either because it is not quantitative. Nevertheless, the profile of yeasts determined with this technique was very similar to that obtained by the high-throughput sequencing technique. Our results suggest that DGGE cannot detect yeast species present at a frequency of <8 % of the total population. The results of this study also demonstrate that metagenomic sequencing is a very powerful method for studies of the biodiversity of yeasts in musts and during alcoholic fermentation. Indeed, high-throughput sequencing makes it possible to analyze large numbers of samples rapidly and may therefore be a good approach for further investigations of the recently reported variability between vineyards [ 36].


Priveste filmarea: DNA Microarray synthesis (Ianuarie 2022).