Informație

Daphnis Nerii nu se mișcă


A trecut destul de mult timp de la mine Daphnis Nerii și-a trecut faza de mâncare, acum este doar un fel de recluse și este ghemuit într-un colț și doarme toată ziua. Acum are o culoare cam maronie. Deși atunci când îl verific, ridicând recipientul și mutându-l, începe să sară ciudat. Ca un salt, de fiecare dată când este provocat. Poate că este ultima fază a perioadei sale instar. Se pregătește să pupe? Sau nu este bine?


Wikipedia ne spune următoarele despre larva moliei de șoim oleander (Daphnis Nerii):

Chiar înainte de a se pupa, larva de oleand de șoim-molie devine de culoare mai maro. Pupa acestei specii măsoară în jur de 5,5-7,5 centimetri lungime și este maro deschis, cu pete negre și o linie neagră în mijloc

Etapa în care se află creatorul tău probabil seamănă cu Fig. 1. Probabil că este bine.


Fig. 1. Omidă chiar înainte de pupare. sursa: wikipedia


Cuprins

Antenele nu sunt în general foarte pene, chiar și la masculi. [2] Le lipsește organe timpanale, dar membrii grupului Choerocampini au organe auditive pe cap. [2] Au un frenulum și un retinaculum pentru a se uni cu aripile posterioare și cele anterioare. [2] Toracele, abdomenul și aripile sunt acoperite dens de solzi. Unele sfingide au o proboscidă rudimentară, dar majoritatea au una foarte lungă, [2] care este folosită pentru a se hrăni cu nectar din flori. Majoritatea sunt crepusculare sau nocturne, dar unele specii zboară în timpul zilei. [8] Atât bărbații, cât și femelele au o durată relativ lungă de viață (10 până la 30 de zile). [8] Înainte de zbor, majoritatea speciilor își freamătă mușchii zborului pentru a-i încălzi și, în timpul zborului, temperaturile corpului pot depăși 40 ° C (104 ° F). [8]

La unele specii, diferențele de formă între sexe sunt destul de accentuate. De exemplu, la speciile africane Agrius convolvuli (convolvulus sau molia șoimului de glorie matinală), antenele sunt mai groase, iar marcajele aripilor sunt mai pestrițe la mascul decât la femelă. Doar masculii au atât un cârlig frenular nedivizat, cât și un retinaculum. De asemenea, toți bărbații hawkmoths au un pieptene parțial de fire împreună cu antenele lor. [9] Femelele îi numesc masculi cu feromoni. Masculul poate învârti femela cu un feromon [8] înainte de împerechere.

Editare comportament

Unele specii zboară doar pentru perioade scurte fie în amurg, fie în zori, în timp ce alte specii apar doar mai târziu seara și altele în jurul miezului nopții, dar astfel de specii pot fi văzute ocazional hrănindu-se cu flori în timpul zilei. Câteva specii comune în Africa, cum ar fi șoimul de albină oriental (Cephonodes hylas virescens), Macroglossum hirundo, și Macroglossum trochilus, sunt diurne. [9]

Se știe că o serie de specii sunt migratoare, toate în Sphingini și Macroglossinae, în special în genuri Agrius, Cefonode, Macroglossum, Hipocotie și Theretra. [10]

Editare zbor

În studiile cu Manduca sexta, molii au capacități senzoriale dinamice de zbor datorită antenelor lor. Antenele sunt vibrate într-un plan, astfel încât atunci când corpul moliei se rotește în timpul manevrelor aeriene controlate, antenele sunt supuse forțelor inerțiale Coriolis care sunt liniar proporționale cu viteza unghiulară a corpului. [11] Forțele Coriolis provoacă deviații ale antenelor, care sunt detectate de organul Johnston la baza fiecărei antene, cu răspunsuri de frecvență puternice la frecvența de bătaie a antenelor (în jur de 25 Hz) și la frecvența de două ori mai mare decât cea a bătăii. Magnitudinea relativă a celor două răspunsuri de frecvență permite moliei să distingă rotația în jurul diferitelor axe principale, permițând controlul rapid al cursului în timpul manevrelor aeriene. [12]

Majoritatea speciilor sunt multivoltine, capabile să producă câteva generații pe an dacă condițiile meteorologice o permit. [8] Femelele depun ouă translucide, verzui, turtite, netede, de obicei singure pe plantele gazdă. Timpul de dezvoltare a ouălor variază foarte mult, de la trei la 21 de zile.

Omizele sfingide sunt de dimensiuni medii până la mari, cu corpuri puternice. Au cinci perechi de prolegi. [8] De obicei, corpurile lor nu au firele de păr sau tuberculii, dar majoritatea speciilor au un „corn” la capătul posterior, [2] care poate fi redus la un buton sau absent în ultimul instar. [8] Multe sunt verzi și maro criptice și au modele contracolorate pentru a le ascunde. Altele sunt mai vizibil colorate, de obicei cu pete albe pe un fundal negru sau galben de-a lungul lungimii corpului. Un model de obloane diagonale de-a lungul lateralului este o caracteristică comună. Când se odihnește, larva își ține de obicei picioarele de pe suprafață și își bagă capul dedesubt (poziție de rugăciune), ceea ce, asemănător Marelui Sfinx din Giza, dă naștere denumirii de „molie sfinx”. [8] Se crede că unele larve tropicale imită șerpii. [2] [13] Larvele își regurgitează rapid conținutul lipicios, adesea toxic, din atacuri, cum ar fi furnicile și parazitoizii. [8] Rata de dezvoltare depinde de temperatură și, pentru a accelera dezvoltarea, unele specii din nord și mare altitudine fac plajă. [8] Larvele se cufundă în sol pentru a pupa, unde rămân două-trei săptămâni înainte să apară ca adulți.

La unele Sphingidae, pupa are o proboscidă liberă, mai degrabă decât fuzionată cu cazul pupal, așa cum este cel mai frecvent la macrolepidoptere. [2] Au un cremaster la vârful abdomenului. [8] De obicei, ele pupează planta gazdă, într-o cameră subterană, printre roci sau într-un cocon liber. [8] La majoritatea speciilor, pupa este stadiul de iernare.

Editarea larvelor

Larvele sfingide tind să fie hranitoare specifice, mai degrabă decât generaliste. [8] Comparativ cu saturniidele de dimensiuni similare, sfingizii mănâncă frunze moi tinere ale plantelor gazdă cu molecule toxice mici și mestecă și zdrobesc mâncarea în bucăți foarte mici. [14] Unele specii pot tolera concentrații destul de mari de toxine specifice. Viermi din tutun (Manduca sexta) detoxifică și excretă rapid nicotină, la fel ca alte câteva molii de sfinx înrudite în subfamiliile Sphinginae și Macroglossinae, dar membrii Smerinthinae care au fost testați sunt sensibili. [15] Speciile care sunt capabile să tolereze toxina nu o sechestrează în țesuturile lor 98% a fost excretată. Cu toate acestea, alte specii, cum ar fi Hyles euphorbiae și Daphnis nerii, sechestrează toxinele de la gazdele lor, dar nu le transmite la stadiul adult. [8]

Editare pentru adulți

Cei mai mulți adulți se hrănesc cu nectar, deși câteva specii tropicale se hrănesc cu secreții oculare, iar hawkmoth-urile capului morții fură miere de la albine. [8] Sfingidele care zboară noaptea tind să prefere florile palide cu tuburi lungi de corolă și un miros dulce, un sindrom de polenizare cunoscut sub numele de „sfingofilie”. [3] Unele specii sunt destul de generale în timpul vizitelor, în timp ce altele sunt foarte specifice, planta fiind polenizată doar cu succes de o anumită specie de molie. [3] Orhideele au frecvent astfel de relații specifice cu molii de șoim și tuburile de corolă foarte lungi. Orhideea cometă (Angraecum sesquipedale), o floare rară malgașă cu nectarul său depozitat în partea de jos a unui tub de 30 cm lungime (12 in), a fost descrisă în 1822 de Louis-Marie Aubert du Petit-Thouars și mai târziu, Charles Darwin a prezis că ar trebui să existe unele molia specializată să se hrănească din ea:

[A. sesquipetale are] nectare de 11 cm și jumătate lungime [29 cm], cu doar inchul și jumătatea inferioară [3,8 cm] umplute cu nectar foarte dulce [. ] este, totuși, surprinzător faptul că orice insectă ar trebui să poată ajunge la nectar: ​​sfinxii noștri englezi au proboze atât cât corpul lor, dar în Madagascar trebuie să existe molii cu proboze capabile să se extindă la o lungime cuprinsă între 10 și 12 inci! [30 cm] [16]

Alfred Russel Wallace a publicat un fel de „afiș dorit” (corect, un desen dintr-o carte) [17] despre cum ar putea arăta acest lepidopter și, în acord cu colegul său, a adăugat:

[Proboscida unei molii de șoim] din Africa tropicală ([Xanthopan] morganii) are șapte inci și jumătate [19 cm]. O specie cu un proboscis mai lung de două sau trei inci [7,6 cm] ar putea ajunge la nectar în cele mai mari flori de Angraecum sesquipedale, ale căror nectare variază în lungime de la 36 cm la zece până la paisprezece inci. Faptul că o astfel de molie există în Madagascar poate fi prezis în siguranță, iar naturaliștii care vizitează acea insulă ar trebui să o caute cu atâta încredere pe cât astronomii au căutat planeta Neptun - și vor avea la fel de succes. [18]

Sfingida prezisă a fost descoperită 21 de ani mai târziu și descrisă ca o subspecie a uneia dintre speciile africane studiate de Wallace: Xanthopan morganii praedicta, [19] pentru care, denumirea subspecifică praedicta („cel prezis”) a fost dat. Indivizii din Madagascar aveau un sân și un abdomen roz, mai degrabă decât alb, și o linie apicală neagră pe aripă, mai largă decât la exemplarele continentului. Modelele de ceasuri moleculare care utilizează calibrări bazate pe rate sau fosile implică faptul că subspecii din Madagascar X. morgani praedicta și subspecii africane morgani a divergent de 7,4 ± 2,8 Mya (acum un milion de ani), care se suprapune divergenței de A. sesquipedale de la sora sa, A. sororium, și anume 7,5 ± 5,2 Mya. [20] Întrucât ambele orhidee au pinteni extrem de lungi, pintenii lungi probabil existau înainte și au fost exploatați de molii cu limbă lungă asemănătoare Xanthopan morganii praedicta. Lunga separare geologică a subspeciei morgani și praedicta se potrivește diferențelor lor morfologice în culoarea sânului și a abdomenului.


Faceți cunoștință cu hawkmoths

În ultima mea postare am descris una dintre sarcinile mele curatoriale aici, la muzeu: re-adăpostirea colecțiilor noastre extinse de hawkmoths, compuse din aproximativ 289.000 de exemplare.

Reinstalarea colecției extinse de muzeu și rsquos de hawkmoths mă va ține ocupat pentru următoarele câteva luni (am auzit pe cineva spunând ani?)

În această postare aș dori să întâlnești stelele propriu-zise ale acestui proiect, înșiși hawkmoths. Hawkmoths aparține familiei Lepidoptera numită Sphingidae, o familie relativ mică în comparație cu alte familii din ordinul Lepidoptera până în prezent. 208 genuri și 1.492 specii descris. Hawkmoths sunt insecte care aparțin familiei Sphingidae din ordinul Lepidoptera. Până în prezent au fost descrise 208 de genuri și 1492 de specii de hawkmoths. Rândul superior (L-R): Deilephila elpenor (Elephant hawkmoth), Agrius convolvuli(Convolvulus hawkmoth), Elibia dolichus. Rândul din mijloc (L-R): Cechenena sp., Hayesiana triopus, Agrius convolvuli(Convolvulus hawkmoth). Rândul inferior (L-R): Mimas tiliae (Lime hawkmoth), Hyles sp., Hyles lineata (Hawkmoth cu dungi), Akbesia davidi.

Speciile aparținând acestei familii au de obicei aripi falcate (curbate și agățate), iar corpul lor este în mod caracteristic raționalizat. Majoritatea speciilor au un zbor foarte rapid și agil și plutesc rapid în fața florilor care se hrănesc cu nectar cu limba lor, care este adesea foarte lungă.

Limba lungă a multor specii de hawkmoths este utilizată în principal pentru a se hrăni cu nectar din flori sau ocazional, ca în cazul acestui argentinian Xylophanes schreiteri, pe resturile dulci de mic dejun! Această fotografie a fost oferită cu amabilitate de Tony Pittaway. Verificați site-urile web interesante Tony & rsquos, Sphingidae din vestul paleearcticii și Sphingidae din Paleearctica de Est, pentru mai multe informații și imagini cu hawkmoths.

Omidele Hawkmoths sunt mari și au un corn curbat în partea din spate. Când sunt deranjați, se ridică de obicei cu segmentele anterioare arcuite, într-un mod care amintește de sfinxul egiptean. Aceste două caracteristici larvare explică de ce aceste molii sunt, de asemenea, cunoscute cu denumirile comune de viermi horn și de sfinx-molii, în timp ce denumirea comună hawkmoth se referă la zborul rapid și forma aripii falcate ale adultului.

Omizele sfingide au un corn de diferite forme pe ultimul segment abdominal. Din dreapta sus în sensul acelor de ceasornic: Cephonodes hylas, Dolbina inexacta, Eumorpha analis și Daphnis nerii (Oleander hawkmoth). Toate imaginile lui Tony Pittaway.

Frumusețea și eleganța hawkmoths au fost întotdeauna atractive atât pentru oamenii de știință, cât și pentru public, prin urmare aceste molii au devenit unul dintre cele mai larg colectate grupuri de insecte.

Frumusețea și eleganța hawkmoths au fost întotdeauna atractive atât pentru oamenii de știință, cât și pentru public.

Hawkmoths sunt, în general, bine reprezentate în fiecare colecție de insecte, mari sau mici, și sunt frecvent crescute din omizi, ceea ce a ajutat la furnizarea de o mulțime de informații despre biologia și istoria vieții lor. Majoritatea speciilor sunt, de asemenea ușor atras de sursele de lumină artificială și acest lucru ajută la supravegherea lor atunci când se realizează inventarii biodiversității dintr-o zonă, care, la rândul nostru, ne-a oferit o perspectivă considerabilă asupra modelelor și intervalelor lor de distribuție.

Multe specii de hawkmoths sunt atrase de sursele de lumină artificială.

Următoarele imagini, preluate din exemplare din colecțiile muzeului, arată variația amplă care există în mărime, formă, caracteristici și modele de aripi între diferitele specii din această familie de molii.

Verdele uimitor de smarald Euchloron maegera. Această specie este răspândită în mod obișnuit în toată Africa Subsahariană.

Oryba kadeni este un alt minunat verde hawkmoth. Este caracterizat de ochi foarte mari și antene relativ scurte. Această specie se găsește din Belize spre sud până în Brazilia.

Unelor sfingide le place să se îmbrace în roz, cum ar fi acest minunat elefant hawkmoth (Deilephila elpenor). Această specie este relativ comună și răspândită pe scară largă. Apare în toată Europa (cu excepția nordului Scandinaviei, a nordului Scoției și a unor părți ale Peninsulei Iberice), spre est, prin Rusia temperată până la coasta Pacificului, Coreea și Japonia. Se găsește și în China până în provinciile Sichuan și Guangdong. Este o specie comună în Marea Britanie.

Leucophlebia lineata este un alt drăguț hawkmoth care poartă o serie de dungi roz, galbene și albe pe aripile anterioare. Această specie se găsește din Pakistan prin India și Sri Lanka, până în estul și sudul Chinei, până în sud-estul Asiei.

Neococytius cluentius este una dintre cele mai mari hawkmoths cu o anvergură a aripilor care poate atinge 17cm și o limbă lungă de până la 22cm. Apare din Mexic până în Argentina și a fost, de asemenea, înregistrat ca un vagabond în nordul Illinois și sudul Michigan.

Recordul pentru cea mai lungă limbă aparține Xanthopan morganii subsp. praedicta, un hawkmoth relativ mare găsit în Madagascar renumit pentru lunga sa proboscidă folosită pentru sondarea florilor pentru a se hrăni cu nectar. Datorită proboscidei sale lungi, care poate atinge 25cm, această molie este bine adaptată pentru a se hrăni din florile orhideelor ​​stelare, în care nectarul este ținut la baza unui pinten foarte lung. Făcând acest lucru, Hawkoth asigură polenizarea orhideei.

Pe de altă parte, adultul hawkmoths din subfamilia Smerinthini, ca acesta Laothoe populi (plopul de plop), au piese bucale extrem de reduse și sunt incapabile să se hrănească. Această molie este bine distribuită în toată Europa, până în sudul Turciei și spre est prin Rusia și până la est până la Irkutsk. Este probabil cel mai comun hawkmoth din Marea Britanie unde adulții zboară între mai și iulie.

Sphingonaepiopsis gorgoniade cu aripa sa de 2-3 cm este cel mai mic hawkmoth. Apare în unele țări din Europa de Sud-Est, Turcia, Ucraina, Rusia de Sud, Kazahstan, Kârgâzstan și Afganistan. A fost înregistrat și în părți din Orientul Mijlociu.

Hawkmoth Euryglottis aper îmi amintește puțin de una dintre acele păpuși de jucărie moale. Este o specie foarte păroasă, deoarece zboară la o altitudine de până la 2800m în Venezuela, Columbia, Ecuador, Peru și Bolivia.

Colecția Muzeului conține exemplare reprezentative ale 207 de genuri și aproximativ 1.300 de specii de hawkmoths o acoperire globală de 85%. Din cele 289.000 de exemplare de Sphingidae deținute în colecțiile muzeului, 113.000 sunt fixate uscat și alte 176.000 sunt nedesfăcute și încă în plicurile lor originale. Colecția Muzeului & # 160 este cu siguranță cea mai mare și mai completă colecție de sfingide din lume.

În următoarea postare, voi prezenta mai multe imagini și informații despre alte specii de hawkmoths și voi oferi, de asemenea, un pic de istorie despre colecția originală de hawkmoths a Muzeului de Istorie Naturală. Sper că te vei întoarce atunci.

Mulțumesc pentru lectură și profit de această ocazie pentru a le ura tuturor cititorilor un Crăciun fericit și un An Nou fericit.

Un convolvulus prietenos hawkmoth l-am întâlnit într-o călătorie recentă în Bulgaria. Nu este drăguț?


Hrănirea larvei Daphnis nerii.

Buna! Sunt destul de nou în creșterea fluturilor. Am avut un mare succes mai devreme cu specii endemice în Norvegia, dar vreau să încerc ceva nou. Am cumpărat recent dapnis nerii pupae și vreau să le cresc atunci când va veni momentul. Am văzut postări pe acest forum (și alte forumuri) despre hrănirea plantelor pentru larvă, dar numai specii specifice din familia oleandrului. Toate plantele pe care le-am văzut enumerate sunt destul de greu de păstrat în Norvegia din cauza climatului de aici, așa că vreau să folosesc plante care sunt puțin mai dure decât cele pe care le-am văzut enumerate. Mă întreb dacă pot folosi vreo plantă din familia oleandrului sau dacă ar trebui să mă țin de plantele pe care le-am văzut pe forumuri.

(Studiez biologia la universitatea din Oslo, așa că nu vă fie teamă să mă tehnic )

Ligustrul (privet), periwinkle și caprifoi sunt toate presupuse plante alimentare. Nu am avut niciodată succes cu caprifoi, așa că probabil cel mai bine este să mă feresc de el. Ligustrum este foarte ușor de obținut și este, de asemenea, verde, care este la fel cu perwinkle. Le-am testat pe amândouă, dar cu perwinkle trebuie să vă asigurați că nu are pesticide.

Mulțumesc! Habar n-aveam că larva oleanderului se va hrăni cu plante din familia Privet.
Mulțumesc!

Dieta artificială în cazul dvs. este doar o alegere.

Sphingidae sunt cele mai bune molii din lume!

Ați putea să-mi spuneți de unde să cumpăr?

Fără probleme. @Serge cum este asta? Mi-aș imagina că ligustrul și periwinkle sunt destul de ușor de obținut. Îl pot obține și locuiesc în Scoția.


Gândacul de cartof Colorado

Gândacul de cartof Colorado (Leptinotarsa ​​decemlineata), cunoscut și sub numele de gandacul Colorado, lănciorul cu zece dungi, gândacul de cartofi cu zece căptușeli sau bugul cartofului, este un dăunător major al culturilor de cartofi. Are o lungime de aproximativ 10 milimetri (0,39 in), cu un corp galben / portocaliu strălucitor și cinci dungi maronii îndrăznețe de-a lungul fiecărei elitre.

Femelele din gândacul de cartof din Colorado sunt foarte prolifice și pot depune până la 700 de ouă. Ouăle sunt galbene până la portocalii și au o lungime de aproximativ 1 mm.Acestea sunt de obicei depuse în loturi de aproximativ 30 pe partea inferioară a frunzelor gazdei. Dezvoltarea tuturor etapelor vieții depinde de temperatură. După 5 & # x201315 zile, ouăle eclozează în larve de culoare maro-roșiatică, cu spatele cocosat și două rânduri de pete maro închis pe ambele părți. Se hrănesc cu frunzele. Un gândac consumă aproximativ 40 cm ^ 2 de frunze de cartof în stadiul larvelor și până la 9 cm ^ 2 suplimentar de frunziș pe zi ca adult.


Dovezi funcționale pentru mecanismele fiziologice de eludare a neurotoxicității cardenolidelor într-o specie adaptată și neadaptată de șoim-molie

Deoarece cardenolidele inhibă în mod specific Na + K + -ATPaza, insectele care se hrănesc cu plante care conțin cardenolide trebuie să ocolească acest efect toxic. Unele insecte, cum ar fi fluturele monarh, se bazează pe insensibilitatea locului țintă, dar alte lepidoptere adaptate cardenolide, cum ar fi molianul de șoim, Daphnis nerii, posedă Na + K + -ATPaze foarte sensibile. Cu toate acestea, larvele acestei specii și cele înrudite Manduca sexta sunt insensibile la cardenolidele injectate. Prin teste de legare radioactivă cu corzi nervoase ale ambelor specii, demonstrăm că perineurul care înconjoară țesutul nervos funcționează ca o barieră de difuzie pentru o cardenolidă polară (ouabain). În schimb, pentru cardenolidele nepolare, cum ar fi digoxina, un purtător de eflux activ limitează accesul la cordonul nervos. Această barieră poate fi abolită de inhibitori metabolici și de verapamil, un inhibitor specific al glicoproteinelor P (PGP). Acest lucru susține că un transportor de tip PGP este implicat în bariera cardenolidică activă a perineurului. RT-PCR specific pentru țesuturi a demonstrat expresia a trei gene asemănătoare PGP în corzile nervoase de vierme, iar imunohistochimia a coroborat în continuare expresia PGP în perineuri. Rezultatele noastre sugerează astfel că perineurul de lepidopter servește drept barieră de difuzie pentru cardenolide polare și oferă o barieră activă pentru cardenolide nepolare. Acest lucru poate explica marea in vivo rezistență la cardenolide observată la unele larve de lepidopteran, în ciuda Na + K + -ATPazelor foarte sensibile.

1. Introducere

Pe parcursul evoluției, plantele au dezvoltat o vastă diversitate de compuși secundari de plante, dintre care mulți acționează ca arme chimice împotriva erbivorelor. În schimb, erbivorele au dezvoltat strategii pentru a depăși apărarea plantelor. Mecanismele de rezistență la insecte sunt numeroase și includ detoxifierea toxinelor de către enzime, excreție, excludere (bariere intestinale) și insensibilitate la nivelul țintei [1,2].

În acest studiu, ne concentrăm asupra rezistenței insectelor la cardenolide produse de plante (alias glicozide cardiace), o clasă specifică de toxine vegetale [3,4]. Cardenolidele sunt inhibitori specifici ai Na + K + -ATPazei, o enzimă animală omniprezentă, esențială pentru multe procese fiziologice [5,6].

Mai multe insecte erbivore, inclusiv fluturele monarh (Danaus plexippus) nu numai că se hrănesc cu plante care conțin cardenolide, ci și sechestrează toxinele și obțin astfel protecție împotriva prădătorilor [7]. Na + K + -ATPaza de D. plexippus este modificat de substituții specifice de aminoacizi, care îi reduc semnificativ sensibilitatea la cardenolide (insensibilitatea sitului țintă [8,9]). Cu toate acestea, în studiile anterioare am descoperit că lepidopterii care sunt adaptați la cardenolide posedă uneori Na + K + -ATPaze sensibile la cardenolide [10,11]. Mai mult, printre lepidopterele adaptate cardenolidelor, fluturele monarh pare de fapt un caz excepțional [9,12,13].

În Lepidoptera, Na + K + -ATPaza este exprimată predominant în țesutul nervos. Apariția concomitentă de cardenolide dietetice în hemolimfa omidelor face ca interfața dintre sângele insectelor și țesutul nervos să fie deosebit de importantă [11]. Cordonul nervos ventral al insectelor este, la fel ca în alte organisme, înconjurat de perineuriu, un țesut care menține condițiile ionice necesare pentru excitabilitatea neuronilor, care pot fi diferite de compoziția hemolimfei (K + scăzut și Na + ridicat necesară în spațiul extracelular al cordonului nervos versus un raport aproximativ 1: 1 în hemolimfă [14]). În plus, se consideră că acest țesut funcționează ca o barieră hematoencefalică pentru compușii toxici din plante prezenți în hemolimfa erbivorelor [15]. Cu toate acestea, până în prezent există doar dovezi funcționale limitate pentru o astfel de funcție de protecție a perineurului.

În acest studiu, testăm dacă perineurul poate funcționa ca o barieră în calea cardenolidelor alimentare absorbite în hemolimfă și, astfel, poate contribui potențial la rezistența la aceste toxine. Am folosit oleander Hawk-Moth (Daphnis neriifigura 1A), un specialist în cardenolide care se hrănește în principal cu oleandru (Nerium oleander), o plantă bogată în aceste toxine [16]. Pentru comparație, am inclus Manduca sexta, o specie înrudită care nu este adaptată cardenolidelor.

Figura 1. Legarea de 3 H-ouabain la cordonul nervos izolat al D. nerii omizi: (A) omida moliei uliului (D. nerii). Principala plantă gazdă a acestei specii este N. oleander, a căror toxicitate marcată se bazează pe cardenolide. (b) Întreruperea barierei perineuriale cu uree în cordoanele nervoase izolate ale D. nerii (fiecare punct dat reprezintă media (± s.d.) a trei incubații independente, adică au fost utilizate în total 18 omizi). (Versiune online color.)

Daphnis nerii omizi au niveluri relativ scăzute de cardenolide de oleandru în corp (aproximativ 150-200 µg la maxim [16]). Cu toate acestea, datorită Na + K + -ATPazei extrem de sensibile, chiar și cantități mici de cardenolide din hemolimfă pot fi fatale [10]. Deoarece oleandru și alte plante care conțin cardenolide au cardenolide cu o gamă largă de polaritate, am speculat că diferite mecanisme pot fi importante în rezistența insectelor la diverse cardenolide. De exemplu, perineurul formează o barieră de difuzie pentru cardenolide polare așa cum s-a arătat pentru M. sexta [17]. Cu toate acestea, cardenolidele nepolare care sunt capabile să utilizeze calea transcelulară [18] ar putea necesita un mecanism activ de barieră (adică transportori de eflux). Ambele mecanisme sunt testate aici prin experimente fiziologice.

În creierul mamiferelor, glicoproteina P (PGP) este unul dintre cei mai importanți transportori de eflux [19] cu un spectru uimitor de substrat, inclusiv cardenolida digoxină [20]. Această proteină legată de membrană de 170 kDa, un membru al superfamiliei de transport ABC (casetă de legare ATP), extrudă compuși xenobiotici din celule antrenate de hidroliza ATP. În M. sexta, PGP a fost deja sugerat să fie implicat în rezistența la nicotină [15]. La alte insecte, se crede că mediază rezistența la insecticide sau xenobiotice [21,22]. Prin urmare, am testat dacă un transportor asemănător PGP poate fi implicat în bariera fiziologică hematoencefalică a cordonului nervos șoim-molie utilizând binecunoscuții inhibitori PGP chinidină și verapamil. Testele imunohistochimice cu anticorpi monoclonali au fost folosite în continuare pentru a vizualiza apariția PGP, precum și a apariției Na + K + -ATPazei în cordonul nervos. Mai mult, o analiză a M. sexta datele de secvență exprimate (EST), urmate de RT-PCR specifică țesutului, au confirmat apariția transportorilor de tip PGP în perineuriu.

În rezumat, investigațiile noastre abordează importanța relativă a mecanismelor pasive și active în protejarea sistemului nervos șoim-molie de toxinele puternice ale plantelor.

2. Material și metode

(a) Radiochimice și inhibitori

3 H-ouabain (12 Ci mmol -1, dizolvat în etanol 9: 1: toluen, sau 30 Ci mmol -1, dizolvat în etanol) a fost achiziționat de la GE Healthcare (Freiburg, Germania) și Perkin Elmer (Rodgau, Germania). 3 H-digoxină a fost achiziționată de la Perkin Elmer (40 Ci mmol -1, dizolvat în etanol). Atât ouabainul, cât și digoxina cel mai probabil nu apar la plantele gazdă larvare de D. nerii, dar au fost utilizate datorită disponibilității lor comerciale și polarității puternic diferite. 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP Fluka, Taufkirchen, Germania), cianură de carbonil 3-clorofenilhidrazonă (CCCP Sigma, Taufkirchen, Germania), clorhidrat de verapamil (Sigma) și chinidină (Sigma) au fost utilizate ca soluții stoc 0,05 M în etanol. În experimentele noastre de legare, am utilizat concentrații de 3 H-cardenolide de 0,35 și respectiv 0,7 µM. Am decis să folosim cantități atât de mici pentru că Rubin și colab. [17] a observat legarea nespecifică a 3 H-ouabainului la cordoanele nervoase native ale Manduca la concentrații peste 10 µM. Am decis să nu ne referim valorile dezintegrărilor pe minut (dpm) la conținutul de proteine ​​pe parcursul experimentelor, deoarece determinarea proteinelor s-a dovedit a fi dependentă de timpul de stocare (la -20 ° C) post-experiment. Referindu-se la corzile nervoase ca unități experimentale, pe de altă parte, s-a dovedit a fi extrem de fiabil, deoarece conținutul de proteine ​​(determinat simultan) din 18 D. nerii corzile nervoase (fiecare ganglion fiecare, vezi mai jos) au avut în medie 63,01 µg cu o abatere standard de 9,74. Abaterile standard mici ale grupurilor noastre de tratament pe parcursul experimentelor oferă dovezi suplimentare că această abordare oferă date fiabile, care nu sunt influențate de diferențele de mărime. Prin urmare, radioactivitatea măsurată în experimentele noastre este exprimată ca dpm per cordonul nervos. Toate datele utilizate în experimentele cu inhibitori sunt furnizate în materialul electronic suplimentar.

(b) Bariera de difuzie

Pentru a testa o barieră de difuzie a cardenolidelor polare, am urmat proiectul experimental descris de Rubin și colab. [17], care a perturbat perineuriul din M. sexta prin tratament cu uree. Omizi de D. nerii (Originea europeană) au fost crescute pe o pervință mai mare (Vinca major), care este lipsită de cardenolide, la 23 ° C (ciclu 16 L: 8 D). Înainte de disecție, omizele din ultima etapă au fost răcite pe gheață și decapitate. Cablurile nervoase ventrale au fost îndepărtate, plasate în tampon de incubație rece (125 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% albumină serică bovină (BSA) și 12,5 mM imidazol, pH 7,3), curățate de țesut aderent și tăiate într-un lanț de opt ganglioni plus conectori interveniți (ganglioni abdominali plus ganglion metatoracic [23]). Pentru fiecare dintre cele trei replici a fost utilizată o serie de șase omizi. Un cordon nervos dintr-o serie a fost utilizat ca martor și a fost ținut în tampon de incubație la temperatura camerei pe durata tratamentului cu uree. Cele cinci corzi nervoase suplimentare au fost scufundate în uree 3 M în tampon de incubare timp de 5, 10, 12, 15 sau 20 min, respectiv. Cordoanele au fost apoi spălate de două ori cu tampon de incubație timp de cel puțin 5 minute fiecare. După tratamentul cu uree, cordoanele (inclusiv cablul de control) au fost incubate individual în 100 ui tampon de incubare cu 0,7 uM 3 H-ouabain timp de 1 oră la 37 ° C. După incubare, corzile au fost spălate într-un volum în exces de 10 mM imidazol (pH 7,3) timp de 30 de minute pe gheață. Fiecare cordon a fost apoi transferat la 200 pl NaOH 0,2 M / 1% SDS și digerat peste noapte. La 150 pl din acest extract s-au adăugat 3 ml cocktail de scintilație lichidă (Ultima Gold, Perkin Elmer) și s-a determinat radioactivitatea într-un contor de scintilație lichidă (Wallac 1409, modul de numărare ușoară). Restul fiecărei probe a fost depozitat la -20 ° C pentru determinarea ulterioară a proteinelor cu testul acidului bicinchoninic (BCA) (Thermo Scientific) folosind BSA ca standard.

(c) Barieră activă

(i) Manduca sexta

Ouă de M. sexta au fost furnizate cu drag de Dr. Markus Huß (Universitatea din Osnabrück). Omizile au fost crescute pe dietă de molii țigănești (MP Biomedicals) suplimentate cu streptomicină, cloramfenicol, benzoat de metil și formalină (26 ° C 16 L: ciclu 8 D). Au fost folosite doar omizi de ultimă oră înainte de a ajunge la stadiul de rătăcire.

(ii) Daphnis nerii

Omizi de D. nerii (origine Thailanda) au fost crescute din ouă la 27 ° C la un ciclu de 13 L: 11 D. Omizile eclozionate au fost inițial hrănite cu V. major ulterior transferat (a doua etapă) la N. oleander și ridicat până la ultima etapă.

Cordoanele nervoase ale ambelor specii au fost disecate așa cum s-a descris mai sus și menținute până la incubarea pe gheață Manduca soluție salină: 5,0 mM K2HPO4, 10,0 mM MgCI2, 1,0 mM CaCI2, 10,0 mM NaCl, 10,0 mM KOH, 7,4 mM L-prolină, 7,7 mM citrat tripotasic, 2,8 mM succinat disodic, 2,0 mM glucoză, 175,0 mM zaharoză, 5,6 mM acid malic, 10,0 mM HEPES, pH 6,7 [24]. Din nou, s-au folosit opt ​​ganglioni posteriori. Pentru a testa ipoteza pe care corzile nervoase ale M. sexta și D. nerii posedă o barieră energetică care împiedică cardenolidele să ajungă la Na + K + -ATPaza, s-au aplicat inhibitori metabolici 2,4-DNP și CCCP. Pentru a testa dacă un transportor asemănător PGP este implicat în această barieră, am folosit verapamil și chinidină care sunt bine-cunoscuți inhibitori competitivi ai PGP [25]. Toți inhibitorii au fost dizolvați în etanol și aplicați la o concentrație finală de 1 mM. Controalele au fost incubate cu o cantitate echivalentă de etanol. Concentrația de 3H-digoxină în test a fost 0,35 uM (concentrația etanolului 3,36%). Fiecare cordon nervos a fost incubat într-un volum de 100 pl Manduca soluție salină la 37 ° C. După 30 de minute, tuburile au fost plasate pe gheață, soluția radioactivă a fost îndepărtată, s-au adăugat 1 ml de imidazol rece 10 mM (pH 7,3) și s-au amestecat prin agitare prin vortex. După înlocuirea tamponului de spălare o dată, tuburile au fost inversate și ținute pe gheață timp de 30 de minute. Etapa scurtă de spălare a fost efectuată pentru a elimina soluția radioactivă aderentă, în timp ce etapa lungă de spălare a fost efectuată pentru a îndepărta 3H-digoxina nelegată [17]. Într-un experiment suplimentar (datele neprezentate) am constatat că aproape toată radioactivitatea aderentă este îndepărtată din țesut după etapa de spălare de 30 de minute. După spălare, probele au fost lizate și radioactivitatea numărată așa cum s-a descris mai sus.

(d) Analiza statistică

Dacă este necesar, datele au fost pătrate sau transformate în log pentru a obține omogenitatea variațiilor (testul lui Levene) și distribuții aproximativ normale (Shapiro-Wilk). Datele au fost analizate de ANOVA utilizând un design aleatoriu al blocului, cu experimentul ca factor de blocare. Comparațiile post hoc se bazează pe testul diferenței semnificative (HSD) a lui Tukey. Toate testele statistice au fost efectuate cu SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, IBM).

(e) Compararea digoxinei cu permeabilitatea ouabain

Acest experiment a fost efectuat pentru a demonstra permeabilitatea diferită a perineurului de D. nerii omizi pentru ouabain și digoxină. Ca tampon de incubație, soluție salină fiziologică fără surse de energie (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, pH 7,4 [26]), în caz contrar testul a urmat procedurile descrise mai sus. Cordoanele nervoase de control au fost incubate în tampon numai cu 0,7 uM 3 H-digoxină sau 3 H-ouabain. În paralel, corzile nervoase au fost incubate cu compușii marcați plus CCCP (1 mM). CCCP a fost adăugat pentru a dezactiva procesele de transport activ și pentru a obține o estimare a cantității de cardenolide care se infiltrează în cordonul nervos prin difuzie.

(f) Imunohistochimie

(i) Transportor de tip P-glicoproteină

Corzile nervoase de răcire D. nerii omizile (ultima etapă) au fost disecate și imersate în PBS. Țesuturile au fost fixate timp de 1 oră la temperatura camerei în fixatorul Lana (15% acid picric, 4% paraformaldehidă (PFA) în tampon fosfat de sodiu 0,5 M, pH 7 [15]). După fixare, țesuturile au fost spălate de trei ori timp de 10 min fiecare în PBS și crioprotejate succesiv în 5, 10 și 15% zaharoză în PBS timp de 1 oră fiecare. După crioprotecție, țesuturile au fost încorporate într-un compus de temperatură optimă de tăiere (OCT) (Sakura, Alphen aan den Rijn, Olanda) congelat în izopentan în azot lichid și depozitat la -80 ° C până la secționare. Secțiuni de 16 pm au fost tăiate pe un criostat Leica CM 1950 și lăsate să se usuce la temperatura camerei. Diapozitivele au fost depozitate la -80 ° C până la utilizare. Anticorpul anti-PGP C-219 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie dizolvat în PBS) a fost aplicat la o concentrație de 10 pg ml -1. În secțiunile martor, anticorpul primar a fost omis. Anticorpul primar a fost detectat cu NOVADetect DAB (3,3'-diaminobenzidină) - Kit de substrat (Dianova, Hamburg, Germania). Secțiunile colorate au fost spălate la scurt timp cu apă deionizată, transferate în 80% etanol (prin etanol 60%) și montate în Euparal. Secțiuni de ganglioni au fost inspectate sub un Zeiss Axioskop 2 și fotografiate cu o cameră color Zeiss AxioCam.

(ii) Na + K + -ATPaza

Pentru a vizualiza locul țintă al cardenolidelor din ganglionii șoim-molii (M. sexta) am urmat metodele descrise în [27] și [11]. Pentru detectarea specifică a Na + / K + -ATPase în secțiuni de parafină, am folosit anticorpul monoclonal α5 (dezvoltat de D.M. Fambrough, menținut și distribuit de către Developmental Studies Hybridoma Bank, Universitatea din Iowa, SUA).

(g) Analize filogenetice moleculare

Secvențele de codificare a trei transportoare asemănătoare PGP ale Trichoplusia ni [28] au fost utilizate pentru a identifica omologi M. sexta secvențe dintr-o colecție de preasamblate M. sexta EST (H. Vogel 2011, date nepublicate). Secvențele corespunzătoare de aminoacizi sunt date în materialul suplimentar electronic, figura S1. Transportoarele similare PGP disponibile au fost descărcate de pe GenBank (data aderării: mai 2012), inclusiv cele trei transportoare similare PGP ale Drosophila melanogaster (MDR49, MDR50 și MDR65 [29,30]), precum și mai mulți transportori PGP-like de alte insecte și crustacee. O listă completă a secvențelor, incluzând numerele de acces, este dată în materialul suplimentar electronic, tabelul S1. Secvențele de aminoacizi au fost aliniate cu MAFFT folosind rutina G-INS-i [31], iar alinierea a fost procesată cu Gblocks v. 0.91b [32]. Setările blocurilor și alinierea finală sunt date în materialul electronic suplimentar, figura S2. Analizele filogenetice au fost efectuate cu M r B ayes v. 3.1 [33] folosind modelul WAG [34]. Eșantionarea cu lanț Markov cuplat la metropolă Monte Carlo a fost efectuată cu un lanț rece și trei lanțuri încălzite. Au fost efectuate două curse independente timp de 1 milion de generații. Arborii au fost prelevați la fiecare 100 de generație, iar probabilitățile posterioare au fost estimate pe ultimii 7500 de arbori (burnin = 2500). PGP de mamifere, despre care se știe că sunt omologi transportatorilor de tip PGP D. melanogaster [29,30] au fost utilizate pentru a înrădăcina filograma în scopul vizualizării.

(h) RT-PCR

ARN-ul total a fost extras din corzile nervoase (opt ganglioni din spate, țesuturi de la 2-3 indivizi grupați) și din mijlocul M. sexta omizi (ultima etapă) cu kitul RNeasy plus (Qiagen, Hilden, Germania). În ambele cazuri, s-au efectuat trei extracții independente de ARN (replici biologice). Cantitățile de ARN au fost evaluate prin citirea absorbției la 260 nm și ulterior confirmate prin electroforeză pe gel de denaturare.Cantități echivalente au fost transcrise în ADNc cu Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Germania) folosind o combinație de dT-17 și primeri hexameri aleatori. Amplificarea a fost efectuată utilizând un protocol standard (Invitrogen Taq Polymerase PCR: 95 ° C timp de 45 s, 52 ° C timp de 60 s și 72 ° C timp de 60 s 40 de cicluri). Primerii oligonucleotidici genici specifici au fost: 5'-TTGACGGCAGTGTGACGATAG-3 'și 5'-CCTTCAGGAGACGTTTGCATC-3' pentru M. sexta Transportor de tip PGP I, 5′-TCAAGATGTAGAGCCCGTGGT-3 ′ și 5′-CCAGCGGTAGTGAAGGTTGAG-3 ′ pentru M. sexta Transportor de tip PGP II și 5′-TTCGGTGGCGCAGTTTATAGT-3 ′ și 5′-TCTTGTGCCCATCTTCTTTGC-3 ′ pentru M. sexta Transportor asemănător PGP III. Specificitatea primerului a fost confirmată prin secvențierea produselor PCR corespunzătoare (GATC, Konstanz, Germania).

3. Rezultate

(a) Barieră de difuzie

În experimentul nostru cu D. nerii omizi, am găsit un rezultat corespunzător celui descris pentru M. sexta [17]: se leagă de izolat D. nerii cordonul nervos a crescut liniar cu timpul în primele 10 minute de incubație în uree de 3 M (figura 1b). După 10 minute, curba a atins un platou fie indicând că s-a atins o limită de permeabilizare, fie permeabilizarea completă a barierei de difuzie și saturația siturilor de legare ouabain.

(b) Barieră activă

Spre deosebire de ouabainul polar, se știe că digoxina mai lipofilă pătrunde membranele celulare [18]. Prin urmare, presupunem că cardenolidele nepolare necesită mecanisme active de barieră care le împiedică să intre în cordonul nervos.

Aplicarea inhibitorilor metabolici (ionofori) 2,4-DNP și CCCP pe cordonul nervos izolat al M. sexta legarea tisulară semnificativ îmbunătățită a 3 H-digoxinei (figura 2A) până la 1,7 ori respectiv 2,3 ori controlul netratat. Pentru D. nerii, am testat doar inhibitorul mai eficient CCCP (figura 2c). Aici, creșterea legării 3 H-digoxinei a fost chiar mai puternică decât cea din M. sexta (De 4,5 ori comparativ cu 2,3 ​​ori).

Figura 2. Influența inhibitorilor asupra legării 3 H-digoxinei în cordoanele nervoase izolate: (A) efectul inhibitorilor metabolici 2,4-DNP și CCCP asupra corzilor nervoase ale M. sexta (n = 5 medie ± s.d.). (b) Efectul inhibitorilor PGP chinidină și verapamil asupra cordoanelor nervoase ale M. sexta (n = 5 medie ± s.d.). (c) Influența inhibitorului metabolic CCCP și a inhibitorului PGP verapamil asupra legării 3 H-digoxinei în cordoanele nervoase izolate ale D. nerii (n = 6 medie ± s.d.). Asteriscurile de deasupra liniilor orizontale indică diferențe semnificative (p & lt 0,05, bloc randomizat ANOVA cu experiment ca factor de blocare, urmat de teste Tukey HSD). Fiecare punct de date reprezintă media a 5 corzi nervoase per tratament (b și c) sau 6 corzi nervoase pe tratament (c) ± s.d.

Pentru a evalua implicarea unui transportor asemănător cu PGP în bariera activă, inhibitorii de PGP utilizate pe scară largă verapamil și chinidină au fost testați pentru efectul lor asupra legării digoxinei la cordonul nervos. Pentru M. sextaVerapamilul a îmbunătățit legarea 3 H-digoxinei de cordonul nervos de 2,7 ori. Chinidina a produs o tendință similară (figura 2b) care nu a fost totuși semnificativ. Pentru D. neriis-a aplicat doar verapamil care a crescut din nou semnificativ legarea 3H-digoxinei. Interesant, la fel ca în cazul CCCP, acest efect a fost, de asemenea, mai puternic decât în M. sexta (3,4 ori comparativ cu 2,7 ori).

Pentru a exclude posibilitatea ca verapamilul să permeabilizeze pur și simplu perineurul, M. sexta corzile nervoase au fost incubate cu digoxină și digoxină plus verapamil sau cu ouabain și respectiv ouabain plus verapamil. Dacă verapamilul pur și simplu a întrerupt bariera de difuzie pasivă, se așteaptă ca ouabainul polar să aibă acces și să se lege la țesutul nervos într-o măsură mai mare la tratamentul cu verapamil. Totuși, acesta nu a fost cazul (a se vedea materialul suplimentar electronic, figura S3).

(c) Compararea digoxinei cu permeabilitatea ouabain

Când corzile nervoase ale D. nerii au fost incubate fie cu cardenolidă singură, fie în combinație cu CCCP, acesta din urmă a crescut semnificativ legarea digoxinei, dar nu legarea ouabain (figura 3). Acest lucru susține concluzia noastră că digoxina se poate infiltra în cordonul nervos prin difuzie atunci când purtătorii de eflux activi sunt dezactivați. Cu toate acestea, ouabainul polar este exclus de o barieră de difuzie și legarea sa nu este crescută atunci când se aplică CCCP otravă metabolică. Interesant este că bariera activă era încă funcțională în acest experiment (și exclude majoritatea digoxinei atunci când nu este blocată de CCCP), deși aici am folosit PBS în loc de Manduca ser fiziologic. Spre deosebire de acesta din urmă, primul nu are surse de energie, indicând astfel că nivelurile de energie intrinseci sunt suficiente pentru a menține funcționalitatea purtătorilor de eflux pe durata experimentului.

Figura 3. Difuzia digoxinei și ouabain în cordonul nervos al D. nerii. Deoarece cele două cardenolide au activități specifice diferite, valorile dpm nu sunt direct comparabile. Datele sunt, prin urmare, prezentate ca cardenolidă pmol / cord nervos (în loc de dpm per cord nervos) pentru a permite comparații cantitative. Cordoanele nervoase au fost incubate în concentrații egale de ouabain și, respectiv, digoxină (0,7 µM). Fiecare punct de date reprezintă media a trei corzi nervoase pe tratament (adică 12 omizi au fost utilizate în total).

(d) Detectarea imunohistochimică a unui transportor asemănător glicoproteinei P

Anticorpul C219 anti-PGP utilizat pe scară largă se leagă de un epitop conservat al proteinei [35]. Am aplicat acest anticorp la criosecții de ganglioni din D. nerii omizi și au găsit colorare specifică (precipitat maro) numai în periferia ganglionului respectiv (figura 5A).

(e) Identificarea transportoarelor asemănătoare glicoproteinelor P exprimate în corzile nervoase

Trei proteine ​​cu cel puțin 75% identitate la unul dintre transportatorii de tip PGP T. ni au fost identificate în EST-urile din M. sexta. Aici ne referim în mod arbitrar la aceste proteine ​​corespunzătoare ca transportori de tipul PGP I, II și III. Analiza filogenetică (figura 4A) arată că transportorii asemănători cu lepidopterii PGP cu care formez o cladă monofiletică D. melanogaster MDR50 și alte câteva proteine ​​de insecte (probabilitatea posterioară 1.0). Lepidopteran PGP-like transporters III form a monophyletic clade with D. melanogaster MDR65 (probabilitate posterioară 0,97), care se află într-o poziție de grup soră cu o cladă monofiletică care, printre alte proteine ​​de insecte, include D. melanogaster MDR49 (probabilitate posterioară 1.0). Lepidopteran PGP-like transporters II se află într-o poziție de grup soră față de o cladă monofiletică, care cuprinde atât D. melanogaster MDR49 și MDR65 (probabilitate posterioară 0,98). Analizele RT-PCR arată că toți transportorii asemănători cu lepidopterii PGP sunt exprimați în cordonul nervos al M. sexta, în timp ce în intestin o expresie puternică comparabilă pare să fie limitată la transportorul I de tip PGP (figura 4b).

Figura 4. Caracterizarea moleculară a M. sexta Transportoare de tip PGP: (A) relații filogenetice între transportoare asemănătoare PGP artropode. În afară de M. sexta, secvențele disponibile au fost preluate de la GenBank și una a fost aleasă în mod arbitrar dacă au existat mai multe secvențe pe gen. În conformitate cu studiile anterioare, transportatorii asemănători PGP ai D. melanogaster au fost denumite proteine ​​multi-rezistență la medicamente (MDR), iar PGP-urile de mamifere au fost utilizate pentru a înrădăcina filograma [29,30]. Nodurile cu probabilități Bayesiene posterioare mai mari de 0,95 sunt indicate de cercuri negre umplute, iar bara de scală este egală cu 0,1 substituții așteptate pe sit. (b) Detectarea transportorului de tip PGP care codifică ARNm în țesutul nervos și al intestinului mediu al M. sexta (triplicate biologice în condiții PCR identice).

(f) Detectarea imunohistochimică a Na + K + -ATPazei

Aplicarea anticorpului monoclonal anti-Na + K + -ATPase α5 a relevat un semnal puternic în corzile nervoase larvare ale M. sexta ganglioni (figura 5b). Apariția Na + K + -ATPazei este limitată la neuronii din ganglion și nu s-a putut observa un semnal specific în perineuri.

Figura 5. Detectarea imunohistochimică a unui transportor de tip PGP și Na + K + -ATPaza pe secțiuni ale ganglionilor larva lepidopteran: (A) Secțiunea înghețată a D. nerii ganglion tratat cu anticorpul anti-PGP C219. Marcarea specifică (precipitații maro, săgeată neagră) poate fi văzută în periferia ganglionului. Deasupra, tratamentul de mai jos, martor (anticorpul primar omis). (b) Secțiunea de parafină a unui ganglion al unui M. sexta omida. Portocaliu (asterisc alb): eticheta specifică a Na + K + -ATPazei de către anticorpul α5. Albastru (săgeată albă): nuclee colorate cu 4 ′, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroclorid (DAPI). (Versiune online color.)

4. Discutie

În studiul nostru ne-am concentrat asupra D. nerii și M. sexta, două specii strâns înrudite care diferă în ceea ce privește plantele gazdă și compușii secundari la care sunt de obicei expuși. Întrucât M. sexta în mod natural nu este expus cardenolidelor dietetice, D. nerii este un specialist în oleandru și întâlnește concentrații ridicate de cardenolide cu o gamă largă de polarități în dieta sa naturală, oleandru. Această specie nu sechestrează cardenolidele la fel ca și alți specialiști, cum ar fi fluturele monarh. Prezența în organism a unor cantități mici de cardenolide [16] ar putea fi realizată de o membrană intestinală relativ impermeabilă, așa cum sa observat la insectele generaliste, cum ar fi Schistocerca și Periplaneta [1]. O astfel de impermeabilitate nu este surprinzătoare în cazul cardenolidelor polare, care sunt incapabile să traverseze în mod pasiv membrana intestinală, totuși la aceste specii, intestinele sunt chiar impermeabile la digitoxina cardenolidă marcat nepolară. Ca Na + K + -ATPaza a D. nerii este extrem de susceptibil la cardenolide [10], sunt necesare mecanisme suplimentare pentru a evita pătrunderea chiar și a unor cantități mici în hemolimfă.

Un studiu anterior asupra omizilor adaptate la cardenolide a arătat că Na + K + -ATPaza este în mare parte limitată la țesutul nervos al omidelor [11]. În consecință, am constatat că D. nerii omizele pot tolera niveluri ridicate de ouabain dacă sunt injectate în cavitatea corpului larvelor [10]. Prin urmare, am postulat un mecanism care împiedică cardenolidele să ajungă la Na + K + -ATPaza în cadrul sistemului nervos și, prin urmare, ne-am concentrat aici pe interfața dintre hemolimfa care conține cardenolide și cordonul nervos ventral.

Datele noastre au arătat că ouabain câștigă acces la Na + K + -ATPaza numai atunci când cordonul nervos al D. nerii a fost tratat cu uree. Întrucât se crede că ureea perturbă perineurul lepidopterian [17], rezultatele noastre oferă dovezi că perineurul nativ, intact, nu este permeabil pentru ouabain și putem presupune că acest lucru se aplică și altor cardenolide relativ polare. Prin urmare, locul țintă al cardenolidelor, Na + K + -ATPaza, este protejat de cardenolidele polare prezente în hemolimfă. Am observat aici o creștere similară dependentă de timp a legării 3 H-ouabain la cordonul nervos tratat cu uree așa cum este descris de Rubin și colab. [17] pentru M. sexta la corzile nervoase ale D. nerii, o specie care trebuie să facă față cardenolidelor dietetice.

Bariera de difuzie este probabil constituită din celulele perineurului care formează joncțiuni strânse [14] care împiedică calea paracelulară pentru difuzarea compușilor. Această barieră nu este cel mai probabil selectivă pentru cardenolide, dar reprezintă o barieră de difuzie pentru orice compus polar. Compoziția ionică a hemolimfei nu ar fi adecvată funcției nervoase și, prin urmare, se presupune că perineurul este responsabil pentru menținerea concentrațiilor ionice necesare în spațiul extracelular al cordonului nervos [14]. Prin urmare, impermeabilitatea la perineuriu a D. nerii nu este probabil o specializare. Cu toate acestea, LD50 de ouabain injectat pt Schistocerca și Periplaneta este de 4,4 și respectiv 0,6 µg per individ, respectiv [36]. Acest lucru ar putea însemna că perineuria de Schistocerca și Periplaneta nu sunt la fel de strânși de a fi ca și cei de la șoim. Cu toate acestea, Na + K + -ATPaza la aceste insecte nu poate fi limitată la țesutul nervos, dar poate apărea și la alte țesuturi, de ex. în intestin și în tubulii malpighieni [37-39].

Cu toate acestea, gestionarea cardenolidelor alimentare implică, de asemenea, că formele nepolare trebuie excluse din cordonul nervos. Pentru a testa existența unei bariere active pentru cardenolide nepolare în perineuriu de șoim, am folosit digoxina cardenolidică relativ nepolară, despre care se știe că pătrunde pasiv celulele. Prin aplicarea ionoforilor CCCP și 2,4-DNP, am urmărit blocarea lanțului respirator în țesutul nostru de testare, întrerupând astfel furnizarea de ATP. În concordanță cu noțiunea de barieră activă care protejează Na + K + -ATPaza, am constatat o legare mai mare a digoxinei de cordoanele nervoase atunci când s-au aplicat inhibitori metabolici CCCP sau 2,4-DNP. Acest lucru se potrivește cu ipoteza unui mecanism activ de eflux: atunci când alimentarea cu energie este epuizată, digoxina nu mai poate fi îndepărtată activ din celule și ajunge la locul său țintă.

Purtătorii familiei PGP sunt candidați puternici pentru a media efectul observat: în creierul mamiferelor constituie cea mai importantă parte a barierei hematoencefalice prin extrudarea compușilor infiltranți [19]. Mai mult, Mayer și colab. [40] a demonstrat că PGP este responsabil pentru excluderea digoxinei din creierul șoarecilor de tip sălbatic. PGP sunt membri ai familiei genelor mdr din care cel puțin trei gene sunt prezente în Drosophila genomul ([41] și referințele din acesta). În M. sexta (acest studiu) și alte specii de lepidoptere [28] au fost identificați trei transportori de tip PGP, care sunt omologi cu cei din D. melanogaster. Toate acestea sunt exprimate în Manduca și astfel sunt potențiali candidați pentru purtătorii de eflux evidențiați aici.

Pentru a testa dacă transportorii de tip PGP sunt implicați în bariera digoxinei acționată de energie, am incubat corzile nervoase ale M. sexta și D. nerii cu doi dintre cei mai utilizați inhibitori PGP, chinidina și verapamilul. Se știe că acești compuși cresc nivelul plasmatic al digoxinei la om atunci când se administrează concomitent cu acest medicament, iar acest fenomen este atribuit în primul rând inhibării PGP ([40] și referințelor din acesta). Atât în D. nerii si in M. sexta, aplicarea verapamilului a crescut cantitatea de digoxină legată de țesutul nervos. Aceste observații sugerează că bariera de eflux pentru digoxină este mediată de un transportor de tip PGP. Când se compară datele celor două specii de șoim, este evident că legarea digoxinei în condiții de control este de aproximativ două ori mai mare în M. sexta ca în D. nerii. Cu toate acestea, în acest moment este dificil să se judece dacă această diferență se datorează diferențelor cantitative sau calitative în bariera perineurială a ambelor specii și pot exista, de asemenea, diferențe de dimensiune între ambele specii.

Prezența unui transportor de tip PGP este demonstrată în plus de datele noastre imunohistochimice care au relevat legarea specifică a anticorpului anti-PGP C219 în periferia D. nerii ganglioni. Prezența acestei proteine ​​în sistemul nervos al M. sexta a fost deja demonstrat [15], deși, în ansamblu, datele privind apariția transportoarelor de tip PGP la insecte sunt limitate. Cunoștințele noastre despre implicarea PGP în excluderea compușilor vegetali la insectele erbivore sunt încă insuficiente, totuși excreția nicotinei în tubulii malpighieni de Manduca omizi [42] a fost deja sugerat să se bazeze pe un omolog PGP [43]. În special, gama largă de substrat sugerează un potențial rol cheie pentru acești transportatori în rezistența insectelor erbivore la compușii toxici ai plantelor secundare. Transportorii asemănători PGP ar putea, în plus, să nu fie doar o parte a barierei hematoencefalice, ci și să fie responsabili pentru transformarea intestinelor de insecte impermeabile la unele toxine ale plantelor. În teorie, acestea ar putea permite speciilor generaliste să facă față unei game largi de compuși de plante secundare toxice diverse.

Cu toate acestea, mecanismele de excludere a cardenolidelor descrise aici pot să nu fie singurul mod de rezistență la cardenolide. Se știe că cardenolidele sunt modificate metabolic în corpul insectelor [16,44]. Dacă sunt afectate regiunile moleculei, care mediază interacțiunile biochimice, metabolismul are ca rezultat și detoxifiere. În plus, se poate aștepta ca excreția de către tubii malpighieni să reducă nivelul hemolimfei de cardenolide. Situația este complicată și mai mult de faptul că digoxina nu este doar substrat pentru PGP, ci și pentru anionii organici care transportă polipeptide (Oatps) și potențial chiar și purtători suplimentari [45].

Astfel, imaginea noastră despre modul în care specialiștii fac față cardenolidelor pare a fi o diversitate de strategii, cu mai multe folosite adesea împreună, dar potențial cu combinații distincte între diferiți erbivori.


Materiale și metode

Larvele a trei specii de muște-fierăstrău folosind plante gazoase cardiace ca gazdă (un specialist și doi generaliști) au fost testate pentru insensibilitatea sitului țintă a Na, K-ATPaze. Monophadnus latus (specialist) au fost colectate ca larve din Helleborus niger L. (Ranunculaceae), conținând bufadienolide (Glombitza și colab., 1989), de André Mégroz într-o grădină din orașul St. Gallen, Elveția, în mai 2014. Pachyprotasis rapae (L.) (Hymenoptera: Tenthredinidae) larve (generaliste) au fost colectate din Digitalis purpurea L. (Plantaginaceae), care conține cardenolide, de G. Petschenka lângă Waldkatzenbach, Baden-Württemberg, Germania, în august 2012 și Pachyprotasis variegata (Fallén) larve (generaliste) din Digitalis lutea L. sau Digitalis grandiflora Mill., Care conțin și cardenolide (Luckner & Wichtl, 2000), de G. Petschenka lângă Bad Urach, Baden-Württemberg, Germania, în iunie 2011. Ouă sau pupe de Daphnis nerii L. (Lepidoptera: Sphingidae) au fost obținute de la crescători prin intermediul internetului și provin din încrucișări între tulpini europene și thailandeze sau din exemplare egiptene. Pentru D. nerii și Empyreuma pugione L. (Lepidoptera: Arctiidae), care a fost inițial colectată în Cuba, a fost stabilită și întreținută o cultură de laborator pe Nerium oleander L. (Apocynaceae, conținând cardenolide) și pentru D. nerii în plus pe Vinca major L. Omizi de Manduca sexta (L.) (Lepidoptera: Sphingidae) au fost crescuți pe o dietă artificială (dieta de molii țigani MP Biomedicals, Heidelberg, Germania). Adulți din Leptinotarsa ​​decemlineata (Spuneți) (Coleoptera: Chrysomelidae) au fost obținute de la Max Planck Institute for Developmental Biology, Tübingen, Germania și menținute ca cultură pe frunze proaspete de cartof (Solanum tuberosum L.) (Solanaceae). Locusta migratoria (L.) (Orthoptera: Acrididae) au fost cumpărate într-un magazin de animale de companie și Periplaneta americana (L.) (Blattodea: Blattidae) au fost obținute dintr-o colonie întreținută la Universitatea din Hamburg (Germania).

ARN-ul a fost extras din țesutul insectelor folosind kitul RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania), urmând protocoalele producătorului: pentru E. pugione, țesutul nervos, mușchii și tubulii malpighieni au fost disecați din molii adulte și extrase separat, pentru D. nerii a fost utilizat țesutul nervos al unei omizi, în timp ce pentru P. rapae și P. variegata a fost extrasă capsula capului unei larve și pentru M. latus s-a folosit o larvă întreagă tânără. Amplificarea RT-PCR și secvențierea genelor Na, K-ATPase au urmat procedurile descrise în Dobler și colab. (2012) cu un primer suplimentar ca în Petschenka și colab. (2013a). Aceasta produce un fragment de Na, K-ATPaza de la aminoacidul 89 la 817, ajungând de la primul la al șaselea domeniu transmembranar și acoperind toate reziduurile importante ale buzunarului de legare a glicozidelor cardiace. Secvențele au fost depuse în Genbank sub numărul de aderare nr. LN736262 - LN736266. În plus, au fost generate secvențe de citocrom oxidază I (COI) pentru cele două Pachyprotasis specii și sunt accesibile sub Genbank nr. LN736267 și LN736268, deoarece aceste larve nu au putut fi identificate a priori. Căutările BLAST au returnat potriviri perfecte cu secvențele COI ale P. rapae și P. variegata depuse sub nr. de aderare. KC972733 și, respectiv, KC974970. Secvențele Na, K-ATPase au fost editate folosind Sequencher 5.1 (Genecodes, Ann Arbor, MI, SUA) și au fost aliniate și traduse în secvențe de aminoacizi cu MEGA 5.2.2 (Tamura și colab., 2011).

Pentru a testa apariția transportoarelor asemănătoare PGP în insecte, am efectuat un studiu imunohistochimic care a implicat cinci specii: D. nerii, M. sexta, L. decemlineata, P. americana, și L. migratoria. Midguts au fost disecate în tampon de disecție răcit [5 mM Tris, 250 mM zaharoză, pH 8 (pH 10 pentru L. migratoria)], fixat timp de 1 oră în paraformaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), spălat în PBS, crioprotejat prin imersie ulterioară în 10, 20 și 30% zaharoză fiecare, încorporat în Tissue-Tek (Sakura, Torrance, CA, SUA) și înghețat la -80 ° C. Secțiuni de țesut de 14 μm au fost tăiate pe un criostat Leica CM 1950, transferate pe lamele microscopice Polysine ™ (Roth, Karlsruhe, Germania), lăsate să se usuce la temperatura camerei și depozitate congelate la -80 ° C. După decongelare, secțiunile de țesut au fost spălate cu PBS, incubate cu 0,3% H2O2 în metanol timp de 30 de minute, spălat în PBS și blocat cu NOVADetect Block (Dianova, Hamburg, Germania). După clătirea din nou în PBS, anticorpul P-glicoproteină C219 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), a fost aplicat la 4 ° C peste noapte [1-1,45 μg ml -1 în 5% ser normal de capră (NGS), 1% ser albumină bovină (BSA), 0,3% Triton X-100 în PBS]. Controalele au fost tratate numai cu NGS / BSA în PBS. După spălare cu PBS, secțiunile au fost tratate cu amplificator de șoarece / iepure (Dianova) timp de 10 min, spălate cu PBS, incubate cu o etichetă polimerică de hrean peroxidază (HRP) (Dianova) timp de 10 min și apoi spălate cu PBS. Legarea HRP la secțiunile de țesut a fost vizualizată folosind un kit de substrat de 3,3'-diaminobenzidină (DAB) (Dianova). După 20 min, secțiunile au fost spălate cu H2O și deshidratat într-o serie crescândă de etanol urmat de izopropanol / xilol (1: 1) și 2 × 100% xilol. În cele din urmă, secțiunile au fost încorporate cu montant DPX (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania), vizualizate sub un microscop Axioskop 2 (Zeiss, Jena, Germania) și fotografiate cu o cameră color AxioCam (Zeiss). Controalele au fost tratate la fel ca tratamentele, dar anticorpul C219 a fost omis.


MATERIALE ȘI METODE

Creșterea moliei

Toate experimentele raportate aici au fost efectuate pe adulți de molii de șoim Oleander crescute în laborator, D. nerii (Linnaeus 1758). Larvele acestor molii au fost crescute pe frunzele a două tipuri de plante gazdă Nerium oleander și Tabernaemontana divaricata plasate în cutii cu plasă pentru a permite o aerisire ușoară. Pupele au fost încorporate în rumeguș și transferate în cuști cu plasă de sârmă. După apariție, molii adulți au fost expuși unui ciclu natural zi-noapte. Pentru reproducere, am menținut aproximativ 4-8 molii la un raport de sex 1: 1 într-o cameră de plexiglas de 1 m 3 cu plantele lor gazdă. După 2-3 zile, am colectat ouăle de la plantele gazdă și le-am plasat în condiții de temperatură și umiditate ambiantă până la eclozare și în timpul etapelor larvelor. În aceste condiții, ciclul de viață ou-la-ou al moliei a fost de aproximativ 45 de zile.

Microscopie prin scanare electronica

Pentru a obține imagini cu rezoluție fină a perilor lui Böhm, am folosit microscopie electronică de scanare pe antene excizate din molii de șoim proaspăt ucise (Fig. 1A, B). Probele de antene au fost deshidratate printr-o serie de alcool 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 90% și 100% și apoi plasate pe benzi de carbon pe butuci de aluminiu. Am așezat butucii într-un ultrasonicator timp de 1 min pentru a îndepărta particulele și un desicator timp de 30 s pentru a îndepărta umiditatea reziduală. Eșantionul a fost apoi acoperit cu pulverizare cu aur timp de ± 30 s și probele au fost realizate cu ajutorul microscopiei electronice de scanare (EVO LS10).

Procedura de legare

Toate experimentele comportamentale au fost efectuate pe un adult legat de 1-2 zile D. nerii molii. Pentru anestezierea la rece a moliilor, le-am plasat la –20 ° C până când acestea au devenit inactive. Molii anesteziați au fost apoi legați ventral de un stâlp de aluminiu (2 mm diametru, 5-6 cm lungime) la stern folosind un amestec de adeziv cianoacrilat și bicarbonat de sodiu (vezi Sane și Jacobson, 2006). Această procedură a asigurat că molii au rămas legați pe toată durata experimentelor.

Măsurarea comportamentului de poziționare antenală

Ablația mecanosenzorilor

Toate procedurile experimentale care implică ablația perilor lui Böhm au fost efectuate pe antena dreaptă, în timp ce antena stângă a fost lăsată nedeteriorată și a servit drept control intern. În molii cu părul ablat și tratate cu fals, am redus mai întâi activitatea moliilor plasându-le pe gheață și le-am ablat perii Böhm folosind un ac hipodermic de 30 de calibru.

Insectele experimentale au fost împărțite în șase grupe. În primul grup (martor), părul a fost lăsat neatins, dar molii au suferit o anestezie rece similară cu insectele experimentale. Moliile de control au fost lăsate să se recupereze după legare fără alte proceduri. În cel de-al doilea grup (fals), am periat un ac peste peri fără a le rupe, dar în caz contrar am manipulat molia similar cu cazurile experimentale. În al treilea grup (scapal și peri pedicelari ablați), am ablat atât scapalul, cât și perii pedicelari Böhm. În cel de-al patrulea grup (perii scapali ablați), numai perii scapali au fost ablați, în timp ce firele pedicelare au rămas intacte. În cel de-al cincilea grup (părul pedicelar ablat), firele pedicelare au fost ablate, dar nu și părul scapal. În cele din urmă, în cel de-al șaselea grup (articulație limitată pedicel – flagel), am folosit adeziv cianoacrilat pentru a lipi articulația pedicel – flagel. Acest tratament a eliminat sau a redus substanțial aportul la organele Johnston, care acoperă articulația pedicel-flagelară și sunt stimulate de distorsiuni mecanice ale acestei articulații (Sane și colab., 2007).

La sfârșitul fiecărui experiment, molii au fost plasate la –20 ° C. Le-am examinat îndeaproape post-mortem folosind microscopie cu lumină pentru a ne asigura că manipulările experimentale au fost curate și limitate la cele destinate experimentului.

Perturbarea electromagnetică a antenelor insectelor

Pentru a perturba poziția antenei la o distanță în timpul zborului legat, am atașat o mică bucată de fier (& lt10% din masa antenei) la antena dreaptă a moliei legate și am folosit un electromagnet (36 V, 2 A alimentare DC) dincolo de lungimea antenei pentru a muta antena din poziția stabilită (Fig. 1C). Un protocol LabVIEW personalizat (National Instruments, Austin, TX, SUA) a livrat trenuri de impulsuri (lățimea impulsului de 300 ms la intervale de 700 ms în unele experimente anterioare, lățimea impulsului a fost de 1 s cu un interval de 1 s) la electromagnet prin intermediul un convertor AD (National Instruments, USB 6229). Un LED roșu conectat în paralel cu electromagnetul indicat când electromagnetul era pornit în înregistrările noastre video. Am înregistrat între 8 și 10 impulsuri sau perturbări pentru fiecare molie. Pentru digitalizare, am selectat numai acele studii în care debutul stimulului a dus la o mișcare clar detectabilă (& gt5 grade 5-20 grade) a antenei (Fig. 1F, inserție). Deoarece nu a fost întotdeauna posibil să poziționăm cu precizie electromagnetul în raport cu antena moliei vii, unghiul maxim perturbat al poziției antenei a variat de la încercare la încercare. Pentru a compara cinematica recuperării, am normalizat, prin urmare, fiecare urmă de unghi interantenă în raport cu valoarea sa maximă.

Achiziționarea, digitalizarea și analiza videoclipurilor de mare viteză

După fiecare tratament, am permis moliilor legați să se recupereze timp de 2 ore și le-am filmat zborul folosind două camere Phantom v7.3 sincronizate de mare viteză (Vision Research, Wayne, NJ, SUA) la 1000 de cadre s –1 (100 μs timp de expunere ). Această rată de cadre a asigurat aproximativ 30-33 de cadre pe aripă, oferind astfel o rezoluție temporală suficient de detaliată a mișcării antene. O cameră a fost poziționată deasupra moliei pentru a oferi o perspectivă dorsală și o altă cameră a fost poziționată frontal. Două pete negre marcate pe antenă la aproximativ 0,5 cm de vârful lor au facilitat digitalizarea. Zborul a fost provocat folosind stimuli tactili sau suflând ușor aer pe animal. Am calibrat camerele fixe înainte și după fiecare experiment. Un cod Matlab scris personalizat (Mathworks, Natick, MA, SUA) pentru calibrare și digitalizare (Hedrick, 2008) a fost folosit pentru a converti coordonatele carteziene ale antenelor în coordonate sferice pentru a calcula unghiurile interantenale (Sane și colab., 2007). Eroarea de digitalizare a fost estimată prin măsurarea constanței lungimii antenei în funcție de timp pe un eșantion de videoclipuri digitalizate. Estimările erorilor au fost cuprinse între 0,5% și 3,2%, în limitele acceptabile ale erorii de măsurare.

(A) Micrografie electronică de scanare a bazei antenei care arată scapalul și perii pedicelari ai lui Böhm. (B) Primul plan al unui câmp de peri pedicelari, care arată câteva peri deviați de marginea cuticulară a peisajului (săgețile albe vezi și materialul suplimentar Film 1), așa cum s-ar întâmpla în timpul mișcărilor antene. (C) Diagrama schematică a experimentului pentru a studia poziționarea antenală prin perturbarea antenei cu un electromagnet. (D) O urmă brută reprezentativă care arată recuperarea unghiului inter-antenal la valoarea inițială (urma albastră) în urma perturbațiilor succesive cu electromagnetul. Urma roșie reprezintă starea electromagnetului (pornit / oprit) măsurată cu ajutorul unui LED roșu. (E) Coordonatele reprezentative ale unghiului theta (azimutal) reprezentativ ale antenei stângi neperturbate (sus) și ale antenei drepte perturbate (jos) care arată ipsilateralitatea poziționării antene. Fiecare urmă albastră este o medie a șapte încercări de la aceeași molie, în timp ce liniile roșii reprezintă abateri standard. Fiecare urmă a fost normalizată la vârful său. Zonele gri umbrite din D și E reprezintă durata când stimulul este pornit. (F) Decalajele de stimul decupate din seturile de date arată stereotipie în recuperarea poziției antene. Urmele albastre reprezintă un complot mediu pentru fiecare molie individuală (N= 7) în timp ce media grupului este afișată în negru, cu zona gri umbrită reprezentând 1 s.d. Inserția arată perturbarea livrată antenelor la debutul stimulului.

(A) Micrografie electronică de scanare a bazei antenei care arată scapalul și perii pedicelari ai lui Böhm. (B) Primul plan al unui câmp de peri pedicelari, care arată câteva peri deviați de marginea cuticulară a peisajului (săgețile albe vezi și materialul suplimentar Film 1), așa cum s-ar întâmpla în timpul mișcărilor antene. (C) Diagrama schematică a experimentului pentru a studia poziționarea antenală prin perturbarea antenei cu un electromagnet. (D) O urmă brută reprezentativă care arată recuperarea unghiului inter-antenal la valoarea inițială (urma albastră) în urma perturbațiilor succesive cu electromagnetul. Urma roșie reprezintă starea electromagnetului (pornit / oprit) măsurată cu ajutorul unui LED roșu. (E) Coordonatele reprezentative ale unghiului theta (azimutal) reprezentativ ale antenei stângi neperturbate (sus) și ale antenei drepte perturbate (jos) care arată ipsilateralitatea poziționării antene. Fiecare urmă albastră este o medie a șapte încercări de la aceeași molie, în timp ce liniile roșii reprezintă abateri standard. Fiecare urmă a fost normalizată la vârful său. Zonele gri umbrite din D și E reprezintă durata când stimulul este pornit. (F) Decalajele de stimul decupate din seturile de date arată stereotipie în recuperarea poziției antene. Urmele albastre reprezintă un complot mediu pentru fiecare molie individuală (N= 7) în timp ce media grupului este afișată în negru, cu zona gri umbrită reprezentând 1 s.d. Inserția arată perturbarea livrată antenelor la debutul stimulului.

Pozițiile antenale pentru fiecare tratament au fost reprezentate ca diagrame de trandafiri ale distribuțiilor de frecvență ale unghiurilor interantene (măsurate de la 200 la 300 de cadre video digitalizate pe molie) în tratamente experimentale folosind Oriana (Kovach Computing Services, Anglesey, Marea Britanie) (Fig. 2 ). Datele au arătat direcționalitate semnificativă a vectorului mediu (lungimea vectorului mediu & gt0.9 în toate cazurile) și se potrivesc cu o distribuție Von Mises cu neuniformitate semnificativă (P& lt0.01 folosind atât testul Rayleigh, cât și testul de distanțare al lui Rao pentru uniformitatea circulară) (Batschelet, 1981). Prin urmare, am folosit parametrul Watson – Williams F-test (multisample, pairwise) pentru a compara mijloacele circulare ale unghiului interantenal între seturile de date (Zar, 1999).

Neuroanatomia perilor lui Böhm

Pentru a vizualiza circuitele neuronale care stau la baza sistemului mecanic și senzorial antenal, am anesteziat la rece molii, le-am introdus într-un tub de seringă tăiat și le-am imobilizat capul și toracele folosind ceară dentară topită. Capsula capului dorsal expus a fost apoi detartrată și disecată pentru a avea acces la mușchii antenali intrinseci și extrinseci pentru coloranți fluorescenți. Organizarea mușchilor antenali în D. nerii este identic cu cel al M. sexta (Kloppenburg și colab., 1997). Deoarece neuronii senzoriali sunt mai susceptibili de a stimula mușchii din același segment, am umplut fie mușchii intrinseci scapo-pedicellaris posteriori [Ms-pp (Niehaus și Gewecke, 1978)], în combinație cu o umplere senzorială a părului pedicelar posterior (pPB ), sau musculusul extrinsec tentorio – scapalis lateralis [Mt-sl (Niehaus și Gewecke, 1978) sau mușchiul depresor anterior (ADM) (Kloppenburg și colab., 1997)] în combinație cu perii scapali mediali (mSB). În scopul acestei lucrări, aceste perechi mușchi-peri pot fi văzute ca combinații reprezentative atât pentru umplerea coloranților, cât și pentru electrofiziologie. Neuroanatomia mai detaliată a altor combinații va fi publicată în altă parte.

Diagrame de trandafiri (dimensiunea coșului de 10 grade) reprezentând unghiuri interantene ale molilor de șoim zburători legați. Toate manipulările au fost efectuate numai pe antena dreaptă. (A) Molii de control intacte cu antene nemanipulate (N= 9). (B) Molii tratați cu rușine nu prezintă semnificative (P& gt0.05) creșterea unghiului inter-antenal (N= 10). (C) Reducerea aportului la organele Johnston prin restricționarea articulației pedicelare-flagelare nu modifică semnificativ poziționarea antenală (N= 9). (D) Ablația tuturor câmpurilor perilor lui Böhm pe antena dreaptă determină o poziționare antenală necorespunzătoare, așa cum este reprezentată de un semn semnificativ (*P& lt0.01) creșterea unghiurilor interantene. Antena stângă nemanipulată își asumă poziția normală (N= 10). (E) Ablația numai câmpurilor de peri scapali a dus la o creștere semnificativă a unghiului interantenal (*P& lt0.05), similar cu molii cu toate perile ablate (N= 10). (F) Ablația numai câmpurilor de peri pedicelari nu a avut niciun efect asupra unghiurilor interantene (N= 9). Linia neagră reprezintă unghiul mediu circular al fiecărui set de date, cu intervale de încredere de 95% reprezentate de arcul negru. Fiecare cerc concentric reprezintă o frecvență crescătoare în trepte de 1.

Diagrame de trandafiri (dimensiunea coșului de 10 grade) care reprezintă unghiuri inter-antene ale molilor de șoim zburători legați. Toate manipulările au fost efectuate numai pe antena dreaptă. (A) Molii de control intacte cu antene nemanipulate (N= 9). (B) Molii tratați cu rușine nu prezintă semnificative (P& gt0.05) creșterea unghiului inter-antenal (N= 10). (C) Reducerea aportului la organele Johnston prin restricționarea articulației pedicelare-flagelare nu modifică semnificativ poziționarea antenală (N= 9). (D) Ablația tuturor câmpurilor perilor lui Böhm pe antena dreaptă determină o poziționare antenală necorespunzătoare, așa cum este reprezentată de oP& lt0.01) creșterea unghiurilor interantene. Antena stângă nemanipulată își asumă poziția normală (N= 10). (E) Ablația numai a câmpurilor de peri scapali a dus la o creștere semnificativă a unghiului inter-antenal (*P& lt0.05), similar cu molii cu toate perile ablate (N= 10). (F) Ablația numai câmpurilor de peri pedicelari nu a avut niciun efect asupra unghiurilor interantene (N= 9). Linia neagră reprezintă unghiul mediu circular al fiecărui set de date, cu intervale de încredere de 95% reprezentate de arcul negru. Fiecare cerc concentric reprezintă o frecvență crescătoare în trepte de 1.

Am folosit Texas Red dextran apos (3000 MW, vârf de emisie 615 nm Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) pentru umplerea mușchilor antenali și fluoresceină apoasă-dextran (3000 MW, vârf de emisie 521 nm Molecular Probes) pentru a umple neuroni senzoriali expuse post-ablația perilor lui Böhm. Animalele au fost ținute în viață cel puțin 24 de ore după umplerea colorantului pentru a permite permeabilitatea completă a colorantului, după care creierul a fost fixat în paraformaldehidă 4% timp de 8-10 ore și disecat. Creierele disecate au fost deshidratate printr-o serie de alcool (50-100% etanol), curățate cu xilen și montate integral în DPX. Diapozitivele au fost fotografiate cu un microscop confocal cu scanare laser (Olympus FV1000) la mărire 10 × / 20 × (Fig. 3). Am colectat secțiuni optice de 1 μm ale creierului folosind scanarea secvențială cu un laser He-Ne de 543 nm și un laser Kr-Ar de 488 nm pentru a detecta fluorescența roșie și, respectiv, verde. Imaginile astfel obținute au fost procesate cu ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA).

În unele cazuri, am crio-secționat creierul pentru a obține o vedere mai clară a umpluturilor duble senzorimotorii (Fig. 3C, F). După umplere și disecare așa cum s-a descris mai sus, am incubat creierul într-o soluție de zaharoză 30% în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 24-48 ore la 4 ° C și l-am încorporat și înghețat în mediul de înghețare a țesutului Jung. Țesutul încorporat în acest bloc de secțiuni a fost tăiat în secțiuni de 60 μm folosind un criostat Leica CM 1850 la temperaturi sub –20 ° C. Secțiunile au fost montate în VectaShield H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA) și fotografiate folosind un microscop confocal (40 × / 60 ×, imersie în ulei).

Electromiografia mușchilor antenali

Pentru a înregistra activitatea mușchilor antenali ca răspuns la stimularea perilor lui Böhm, am imobilizat mai întâi molii adulte plasându-le într-un tub de seringă tăiat, așa cum este descris mai sus. Preparatul a fost montat pe o masă pneumatică sub un microscop de disecție pivotant (după 1 oră de recuperare), iar antena din stânga (în care am efectuat toate înregistrările) a fost introdusă într-un capilar de sticlă și lipită pe loc la aproximativ a 5-a inelă a flagel. Am restricționat articulația pedicel-flagelară folosind clei de cianoacrilat pentru a ne asigura că numai peisajul era liber să se miște. Mușchii antenali au fost expuși folosind o procedură similară cu umpluturile de neuron motor, iar un electrod de împământare a fost introdus în zona frontală a cuticulei capului.

Am înregistrat răspunsurile mușchilor extrinseci (Mt-sl) la stimularea perilor scapali (mSB) și a mușchilor intrinseci (Ms-pp) la stimularea perilor pedicelari (pPB) folosind un electrod de înregistrare a tungstenului (5 μm diametru, 2 MΩ) impedanță FHC, Bowdoin, ME, SUA) montat pe o treaptă de cap extracelulară (Dagan 8024, Minneapolis, MN, SUA). Am stimulat mecanic perii cu o perie montată pe arborele unui motor pas cu pas. Mișcarea periei a fost urmărită folosind un senzor optic. Folosind acest aparat, am livrat stimuli de impuls scurți de 50 ms (40-60 de încercări / molie) la perii Böhm folosind pCLAMP10.0 prin intermediul un convertor AD (DigiData 1322A Axon Instruments, Union City, CA, SUA) păstrând în același timp antena imobilă. Răspunsul la impuls al sistemului a oferit măsuri de latență a răspunsului. De asemenea, am livrat stimuli goi în cazul în care peria s-a deplasat în aer fără a contacta nicio suprafață pentru a identifica surse potențiale de zgomot electric datorate mișcării periei. Răspunsurile musculare au fost amplificate utilizând un amplificator intracelular dual (Dagan IX2 700) și zgomotul de frecvență de linie a fost eliminat folosind un eliminator de zgomot HumBug (Quest Scientific, North Vancouver, BC, Canada). După fiecare înregistrare, am umplut mușchii de pe locurile de înregistrare cu Texas Red dextran și câmpurile de peri stimulate cu dextran fluorescenic. După ce am păstrat molia în viață timp de 24 de ore, am fixat, disecat și imaginat creierul cu ajutorul microscopiei confocale.


Sensibilitatea la ținta unui erbivor specializat față de compușii toxici majori ai plantei gazdă: Na + K + -ATPaza moliei de șoim oleandru (Daphnis nerii) este extrem de susceptibil la cardenolide

Omizele moliei de șoim oleander, Daphnis nerii (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Sphingidae) se hrănesc în principal cu oleandru (Nerium oleander). Această plantă este bogată în cardenolide, care inhibă în mod specific Na + K + -ATPaza. Deoarece unele insecte care se hrănesc cu plante cardenolide posedă Na + K + -ATPaze rezistente la cardenolide, am testat dacă D. nerii deține, de asemenea, această strategie de eludare a toxicității cardenolidelor. Pentru a face acest lucru, am stabilit un test fiziologic, care a permis măsurarea directă a sensibilității cardenolide Na + K + -ATPase. Folosind Schistocerca gregaria, ca specie de referință sensibilă la cardenolide, am arătat că D. nerii Na + K + -ATPaza a fost extrem de sensibilă la cardenolida ouabain. În mod surprinzător, sensibilitatea sa este chiar mai mare decât cea a generalistului sensibil la cardenolide, S. gregaria. Prezența sau absența cardenolidelor în dieta de D. nerii nu a influențat sensibilitatea cardenolidului enzimei, indicând faptul că insensibilitatea la locul țintă nu este inductibilă la această specie. Cu toate acestea, în ciuda sensibilității Na + K + -ATPazei lor, omizi de D. nerii s-au recuperat rapid după o injecție cu o cantitate excesivă de ouabain în hemocoelul lor. Concluzionăm că D. nerii are adaptări, care îi permit să se hrănească cu o dietă bogată în cardenolide, alta decât cea descrisă anterior la insectele specializate în cardenolide și să discute despre alte mecanisme de rezistență potențiale.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


IndiaBioscience

Arnab Chakraborty

Ați văzut vreodată o insectă zburând într-o cameră, navigând în aer turbulent de la ventilator și aterizând la marginea ceștii dvs. de cafea? Ați văzut vreodată un plutitor peste o floare în vânt? Dansul delicat și frumos al aripilor sale este coregrafiat în timp real prin feedback-ul din sistemele sale senzoriale, condus de antene.

Hawk moth (Foto: Anand Krishnan)

Insectele își folosesc antenele pentru o varietate de funcții: olfacție, gravitație, temperatură, flux de aer, umiditate și pentru manevre care necesită corecție instantanee și control al zborului. Controlul eficient al zborului, impune insectei să sesizeze și să poziționeze antenele (în raport cu corpul său) cu precizie. Pentru a înțelege mai bine de ce, imaginează-ți că trebuie să atingi un obiect de lângă tine fără să te uiți la el. Pentru a face acest lucru cu succes, trebuie să aveți informații vizuale prealabile despre ultima poziție a obiectului și, de asemenea, să știți unde este brațul dvs. în prezent. Simțim poziția (prezentă) a brațelor noastre prin cunoașterea stărilor musculare din braț, iar poziția finală este dictată de o cunoaștere constantă a poziției brațului în timpul mișcării. Dacă totul merge bine, brațul intră în contact cu ținta sa. Pentru a obține o imagine mai clară a modului în care insectele dobândesc informații și, ulterior, își controlează poziția antenală, oamenii de știință de la Laboratorul de zbor al insectelor, NCBS (Anand Krishnan și colaboratorii, conduși de Sanjay P Sane) au studiat molia de șoim oleander (Daphnis nerii). Ei descoperă că comportamentul de poziționare antenală în molii de șoim este provocat de intrări din diferite sisteme senzoriale - mecanosensare și viziune.

În lucrările lor anterioare, echipa a arătat că o molie de șoim zburător dobândește feedback mecanosenzorial despre poziția antenelor sale folosind structuri numite peri ai lui Böhm. Perii lui Böhm sunt plăci mici de păr situate la baza antenelor. Când antenele se mișcă, se perie de peri, modificându-și și poziția și orientarea. Acest lucru le permite să simtă poziția curentă și orice schimbare de poziție a antenelor (propriocepție). În experimentele lor, echipa a îndepărtat aceste peri și a perturbat în mod deliberat poziția antenală. Ulterior, molii nu au reușit să recâștige poziția antenală. Experimente ulterioare au arătat căile neuronale implicate în acest proces și au arătat că timpul de răspuns (stimularea părului la activarea musculară) a fost foarte scăzut (la & lt10ms) - asemănător reflexului monosinaptic. Astfel, este clar că perii lui Böhm sunt esențiali pentru poziționarea antenală în zbor. Cercetătorii propun că poziționarea poate fi esențială pentru olfacție în timpul zborului. Această lucrare se bazează pe lucrările anterioare realizate de Sane (condus de Thomas L Daniel) că un alt organ din baza antenei răspunde la mișcări mici, de înaltă frecvență ale antenei, cum ar fi vibrațiile datorate sunetului sau fluxului de aer.

Dar viziunea atunci? Studiile efectuate pe multe insecte au arătat că modulează poziția antenei folosind și indicii vizuale - cum ar fi antena unui greier care poate urmări un obiect care se mișcă în fața sa. În cea mai recentă lucrare a lor, Krishnan și Sane au arătat că stimulii vizuali influențează poziția antenală și în moliile șoimului. Experimentele lor ajută la afirmarea faptului că o antenă răspunde (într-o manieră selectivă a mișcării și direcției) la indicii vizuali, permițând molilor șoim să moduleze poziția antenei. Ceea ce este interesant este diferența remarcabilă dintre scara de timp a acestui feedback vizual (vizuo-motor) (la

35 - 60ms, aproximativ câteva lovituri ale aripilor), în comparație cu răspunsul reflex la intrarea mecanico-senzorială a perilor lui Böhm (la & lt10ms). Acesta sugerează că, în timp ce molii șoimului se bazează în principal pe feedback mecanosenzorial pentru a efectua corecții sau manevre rapide în timpul zborului, feedback-ul vizual influențează și poziția lor antenală.

Cu aceste două studii care se adaugă la cunoștințele noastre anterioare, autorii concluzionează că atât viziunea, cât și mecanosensibilitatea se combină pentru a modula zborul. Cercetarea lor îmbogățește înțelegerea zborului și controlul acestuia în ceea ce privește înțelegerea insectelor, care pe termen lung se poate extinde la eforturile de eco / conservare, agricultură sau chiar la robotică.

Această piesă a primit un sprijin extins de la Taruni Roy - cine este doctorand integrat la Insect Flight Lab, NCBS.


Priveste filmarea: Snake-mimic caterpillar, Hemeroplanes triptolemus, Sphingidae (Decembrie 2021).