Informație

E5. Stări de oxidare ale centrelor Fe de azotare - Biologie


Prima jumătate: Ar fi dificil să se atribuie stări de oxidare specifice fiecărui ion Fe din complexul M. Mai întâi îl vom atribui unui ion Fe mediu, M0, cu o stare de oxidare atribuită în mod arbitrar de 0. La adăugarea unui electron, starea de oxidare ar merge de la M0 la M-1 pe măsură ce metalul este redus. Lor-1 starea este apoi oxidată pe măsură ce un electron este transferat la H+și când sunt transferați 2 electroni și un singur H- se face. Diagrama de mai jos arată schimbarea stării de oxidare în trecerea de la E0 la E4.

Căsuțele roșii evidențiază pași asemănători ciclului termodinamic, care arată cum ar putea fi vizualizate modificările stării redox a ionilor Fe (M). Rețineți că, trecând de la E0 la E4, starea efectivă de oxidare a lui M se schimbă de la 0 la +1 la 0 la +1 și înapoi la 0. Acest lucru este uimitor, având în vedere că s-au adăugat 4 electroni. Rețineți, de asemenea, că în caseta roșie care trece de la pasul E0 la E1, M merge de la -1 la +1, ceea ce corespunde descrierii noastre a unei adiții oxidative atunci când centrul metalic pierde doi electroni. Acest mecanism arată că nitrogenaza ar putea fi considerată un „dispozitiv de stocare a hidrurii”.

A doua jumătate (cu fața către producția NH3):

Cum face N2 interacționează inițial cu E4? Trebuie să depindă de modul în care hidrurile sunt eliberate ca H2, care dovezi arată că apare prin eliminare reductivă (re) și nu protonare cu hidrură (CP). În plus, N2 foarte rapid se transformă în diazen, HN = NH, cu H care pleacă2 luând cu el 2 H+s și 2 electroni (sau echivalenți reducători). Aceste evenimente ar putea apărea așa cum se arată în figura de mai jos.

Acum, cu N2 legat ca diazen (N2H2) si H2 eliberat, restul reacției ar putea apărea așa cum se arată mai jos. Este prezentat un nou pas, o inserție migratorie.

Cele două jumătăți ale reacției sunt similare cu hidrurile de punte utilizate. Intermediarul E4 Janus leagă cele două jumătăți între ele.

Colaboratori

  • Prof. Henry Jakubowski (Colegiul Sf. Benedict / Universitatea Sf. Ioan)

E5. Stări de oxidare ale centrelor Fe de azotare - Biologie

a Institutul Max Planck pentru conversia energiei chimice, Stiftstr. 34-36, 45470 M & # 252lheim an der Ruhr, Germania
E-mail: [email protected]
Tel: +49 208 306 3605

b Departamentul de Chimie, Universitatea din Washington, Box 351700, Seattle, WA 98195-1700, SUA
E-mail: [email protected]

c Institutul de Științe, Universitatea din Islanda, Dunhagi 3, 107 Reykjavik, Islanda

d Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais Brazilian Synchrotron Light Laboratory - LNLS Rua Giuseppe M & # 225ximo Scolfaro, 10.000 13083-970 Campinas SP, Brazil

Institutul pentru Biochimie și Centrul BIOSS pentru Studii de Semnalizare Biologică, Universitatea Albert Ludwigs din Freiburg, Germania
E-mail: [email protected]

f Departamentul de chimie și biologie chimică, Universitatea Cornell, Ithaca, NY 14853, SUA

Abstract

O investigație a cofactorilor activi ai azotului de molibden și vanadiu (FeMoco și FeVco) a fost efectuată utilizând spectroscopie cu raze X de înaltă rezoluție. Modelele sintetice heterometalice ale clusterelor de fier-sulf și calculele teoriei funcționale a densității completează studiul holoproteinelor MoFe și VFe utilizând atât spectroscopie de emisie cu raze X cât și non-rezonantă și rezonantă. Datele spectroscopice arată prezența legăturilor directe fier-heterometal, care se dovedesc a fi mai slabe în FeVco. Mai mult, se constată că carbură interstițială perturbă structurile electronice ale cofactorilor prin legături Fe-C foarte covalente. Implicațiile acestor concluzii sunt discutate în lumina reactivității diferențiale a azotazelor de molibden și vanadiu față de diferiți substraturi. Sunt detaliate rolurile funcționale posibile atât pentru heterometal, cât și pentru carbură interstițială.


Introducere

Fixarea biologică a azotului este un proces esențial necesar pentru a trage în rezervorul predominant de azot biodisponibil, atmosferic N2. Deși, la un moment dat, aproximativ 99% din totalul azotului din ciclul biosferei sunt prezente în această formă 1, doar o singură reacție enzimatică a evoluat pentru a rupe legătura triplă stabilă a moleculei de dinitrogen. Enzima azotazază este un sistem complex cu două componente care constă din proteina heterotetramerică MoFe (NifD2K2), unde substraturile sunt reduse, iar proteina dimerică Fe (NifH2) care servește ca singurul donator de electroni cunoscut pentru N2 reducere și ca situs al hidrolizei ATP 2,3. Nitrogenaza reduce N2 conform ecuației (1), precum și o serie de substraturi alternative, incluzând în mod vizibil monoxid de carbon transformat într-un amestec de hidrocarburi nesaturate cu potențială relevanță pentru producția de biocombustibili 4,5.

Proteina MoFe a azotazazei conține două clustere metalice unice, clusterul [8Fe: 7S] P, un centru de transfer de electroni cu o stare neobișnuită de bază 8Fe +2 ca izolat și cofactor FeMo (FeMoco), locul reducerii substratului. FeMoco a fost descris inițial ca un [Mo: 7Fe: 9S]:R-entitate homocitrată cu o cavitate centrală înconjurată de șase ioni de fier nesaturați coordonativ 6,7. Aranjamentul a sugerat intuitiv un site de coordonare pentru substraturi din cavitatea centrală, dar această ipoteză a fost contestată de inertitatea structurală a clusterului. Am descoperit apoi că un atom de lumină central care a fost mascat de o apariție nefavorabilă a artefactelor de terminare a seriei Fourier a fost în cele din urmă localizat în centrul cofactorului 8. Abia recent acest atom luminos a fost identificat ca o specie de carbon 9,10 care provine din S-adenosilmetionina 11 și nu se schimbă în timpul catalizei 12. Astfel, acesta constituie un element stabilizator care oferă rigiditate stării de bază a clusterului și explică omogenitatea structurală observată. Proteina Nitrogenază MoFe este izolată în mod obișnuit într-o formă redusă, cu un P-cluster diamagnetic, tot feros (P N) și cofactorul FeMo într-un S= Starea 3/2 (FeMoco N) care a fost caracterizată pe larg de rezonanța paramagnetică electronică (EPR) și dublă rezonanță nucleară îmbunătățită (ENDOR), spectroscopia de absorbție a razelor X (XAS) și spectroscopiile Mössbauer 13,14,15,16, 17. O analiză recentă a datelor EPR monocristale pentru starea FeMoco N a relevat orientarea magneticului g-tensor al clusterului din cadrul proteinei MoFe, subliniind faptul că câmpul potențial electrostatic indus de matricea proteică orientează sistemul de spin 18. În acest studiu, gz axa principală a tensorului magnetic orientată de-a lungul axei intrinseci de simetrie triplă a cofactorului FeMo, în timp ce gy sa constatat că axa se aliniază cu o margine de grup formată din atomii Fe1, Fe3, Fe7 și Mo (Fig. 1a).

(A) Structura cofactorului FeMo așa cum se observă în proteina MoFe din A. vinelandii (PDB-ID 3U7Q). Structura reprezintă S= 3/2 starea FeMoco N, o stare stabilă de repaus care nu leagă substraturile. (b) Strategie pentru rafinarea dispersiei anomale rezolvate spațial (SpReAD). Se alege un spectru XAS sau o scanare de fluorescență a marginii K de fier (roșu) pentru a determina energiile pentru colectarea seturilor de date de difracție completă. În acestea, contribuția de împrăștiere anormală poate fi rafinată pentru atomii individuali. (c) Hărți anormale de densitate electronică conturate la 3σ nivel în jurul cofactorului FeMo, calculat pentru seturile de date luate în pozițiile indicate de-a lungul marginii K de fier. Magnitudinea vârfului densității electronilor nu se reflectă direct f″, Dar creșterea semnalului este clar vizibilă. Rețineți că caracteristicile puternice apar mai întâi pentru cei mai buni atomi de electroni, Fe1, Fe3 și Fe7 (orientare ca în A).

Cu toate acestea, clarificarea finală a structurii cofactorului FeMo nu a ajutat la răspunsul la întrebarea cheie mecanicistă, iar site-ul de legare exact pentru substraturi, precum și mecanismul de reducere a acestora rămân de clarificat (Tabelul 1). O înțelegere mai profundă a sistemelor bioinorganice complexe apare de obicei numai dintr-o combinație de metodologii, cu informații structurale completate de spectroscopie, dar și de calcule teoretice și modele sintetice. Compușii cu molecule mici capabili să activeze dinitrogenul erau cunoscuți de decenii 19, dar numai compuși mai recenți, cum ar fi [HIPTN3N] Mo (N2) de Schrock 20 și [Mo (N2)2(PNP)]2(μ-N2) de către Nishibayashi 21, au realizat mai multe cicluri de rotație catalitică și s-au bazat pe molibden ca specie reactivă. Mai recent, Hou și colegii săi au prezentat un complex catalitic de hidrură de titan, [(C5Pe mine4SiMe3) Ti]4(μ 3 -NH)2(μ 2 -H)4 22. Peters și colab. a sintetizat un prim compus de fier [(TBP) Fe (N2)] care a realizat cataliza 23, iar Holland și colegii săi au extins cel mai recent acest lucru la un sistem bazat pe Fe cu liganzi de fier și carbon, care amintește chimic de FeMoco 24. Fiecare dintre aceste studii a reprezentat un progres major în chimia anorganică sintetică și cataliza reducerii dinitrogenului, dar nu au furnizat dovezi clare pentru modul de acțiune al enzimei. Datorită inertității stării de repaus, investigația interacțiunilor inhibitor / substrat cu cofactorul FeMo a fost limitată la metode spectroscopice, iar aici o înțelegere incompletă a structurii electronice a FeMoco a împiedicat atribuirea precisă a semnalelor 19. Foarte recent, descoperirea FeMoco legat de CO prin cristalografie cu raze X a furnizat informații structurale despre o stare funcționalizată a sitului activ pentru prima dată 25. Utilitatea unor astfel de date structurale pentru îndrumarea unor studii teoretice și spectroscopice suplimentare este evidentă și poate contribui la înțelegerea substanțială a mecanismului azotazazei. Cu toate acestea, o condiție prealabilă pentru această abordare este o descriere electronică detaliată a FeMoco și, în ciuda numeroaselor studii efectuate de mulți dintre lideri, este domeniul lor, abordările teoretice până în prezent nu au reușit să producă un model general acceptat 19. Diferite modele au propus legarea ligandului la cavitatea centrală 26,27, dar și la diferite poziții pe suprafața clusterului 28,29, iar cel mai recent aductul de CO a inspirat o propunere în care N2 este activat exact în aceeași poziție, posibilă prin H concomitent2 evoluția 30.

Datele experimentale privind distribuția efectivă a electronilor în FeMoco sunt rare, în mare parte deoarece tehnicile spectroscopice cu greu pot rezolva și caracteriza ionii Fe individuali dintre cele 30 de situri de Fe pe proteină MoFe. Pe de altă parte, rezoluția spațială precisă a datelor experimentale este un semn distinctiv al tehnicilor de difracție, dar, deși cristalografia cu raze X a fost extrem de importantă în descrierea structurii clusterului, nu este ușor de utilizat ca instrument pentru investigarea stărilor de oxidare a metale individuale. Recent am prezentat o metodă pentru a aborda această problemă și pentru a extrage informații suplimentare despre structura electronică a fiecărui site metalic din datele de difracție cu raze X 31. Această strategie exploatează proprietatea împrăștierii anormale care descrie defalcarea legii lui Friedel 32, simetria de inversare intrinsecă a difracției (F(S)=F(–S)), în apropierea unei muchii de absorbție a razelor X. Împrăștierea anormală este utilizată în mod obișnuit pentru a rezolva problema fazei cristalografice pentru ab initio determinarea structurii proteinelor 33, iar magnitudinea acesteia pe o margine este proporțională cu absorbția razelor X. Cu seturi de date de difracție colectate la diferite energii cu raze X, este posibil să se rafineze contribuțiile de împrăștiere anormale f " și f ′ Individual pentru fiecare dispersor anormal într-o structură (Fig. 1b și Tabelul suplimentar 1). Relevanța unei astfel de analize a dispersiei anomale rezolvate spațial (SpReAD) rezultă din faptul că proprietățile de absorbție ale unui dispersor dat reflectă mediul chimic, dar și starea electronică a atomului. La oxidare, energia de ionizare a electronilor din carcasa interioară care determină poziția unei margini de absorbție va crește, făcând poziția marginii un indicator puternic pentru starea de oxidare și permițându-ne să efectuăm această analiză în orice punct dat al spațiului, adică , pentru fiecare atom unic de un anumit tip. Metoda a fost aplicată cu succes pentru a identifica electronul localizat într-un cluster 31 redus [2Fe: 2S] și pentru a caracteriza un site suplimentar de Fe descoperit recent în proteina MoFe 34.

Aici am aplicat metodologia SpReAD enzimei azotazazei ca una dintre cele mai mari și mai complexe metaloproteine ​​cunoscute până în prezent. Arătăm că pozițiile de margine și, prin urmare, cel mai probabil stările de oxidare ale siturilor individuale de fier sunt distincte și sugerează o distribuție a electronilor care se potrivește cu ionul Mo (III) prezent în cluster pentru a produce rezultatele observate S= Starea 3/2. Înțelegerea structurii electronice a FeMoco este o condiție esențială pentru o analiză funcțională concisă a acestui centru unic, deschizând calea pentru posibile aplicații în cataliză și bioinginerie.


Cuprins

Deși formarea de echilibru a amoniacului din hidrogen molecular și azot are o entalpie de reacție negativă globală (Δ H 0 = - 45,2 k J m o l - 1 N H 3 < displaystyle Delta H ^ <0> = -45,2 mathrm , mathrm > mathrm >>), energia de activare este foarte mare (E A = 230 - 420 k J m o l - 1 < displaystyle E _ < mathrm> = 230-420 mathrm , mathrm >>). [1] Nitrogenaza acționează ca un catalizator, reducând această barieră energetică astfel încât reacția să poată avea loc la temperaturi ambiante.

Un ansamblu obișnuit constă din două componente:

  1. Proteina heterotetramerică MoFe, o nitrogenază care folosește electronii furnizați pentru a reduce N2 la NH3. În unele ansambluri este înlocuit de o alternativă omologă.
  2. Proteina homodimerică numai Fe, reductaza care are o mare putere de reducere și este responsabilă pentru furnizarea de electroni.

Reductase Edit

Proteina Fe, dinitrogenaza reductază sau NifH, este un dimer de subunități identice care conține una [Fe4S4] cluster și are o masă de aproximativ 60-64kDa. [2] Funcția proteinei Fe este de a transfera electroni de la un agent reducător, cum ar fi feredoxina sau flavodoxina la proteina azotazază. Transferul de electroni necesită un aport de energie chimică care provine din legarea și hidroliza ATP. Hidroliza ATP provoacă, de asemenea, o schimbare conformațională în cadrul complexului azotazazic, aducând proteina Fe și proteina MoFe mai aproape pentru a facilita transferul de electroni. [3]

Editarea azotazei

Proteina MoFe este un heterotetramer format din două subunități α și două subunități β, cu o masă de aproximativ 240-250kDa. [2] Proteina MoFe conține, de asemenea, două clustere de fier-sulf, cunoscute sub numele de clustere P, situate la interfața dintre subunitățile α și β și doi cofactori FeMo, în cadrul subunităților α. Starea de oxidare a Mo în aceste azotazaze se credea anterior Mo (V), dar dovezi mai recente sunt pentru Mo (III). [4] (Molibdenul din alte enzime este în general legat de molibdopterină ca Mo (VI) complet oxidat).

  • Nucleul (Fe8S7) a clusterului P ia forma a două [Fe4S3] cuburi legate de un atom central de sulf. Fiecare cluster P este legat covalent de proteina MoFe de șase resturi de cisteină.
  • Fiecare cofactor FeMo (Fe7MoS9C) este format din două clustere neidentice: [Fe4S3] și [MoFe3S3], care sunt legați de trei ioni sulfuri. Fiecare cofactor FeMo este legat covalent de subunitatea α a proteinei printr-un reziduu de cisteină și un reziduu de histidină.

Electronii din proteina Fe intră în proteina MoFe în grupurile P, care apoi transferă electronii către cofactorii FeMo. Fiecare cofactor FeMo acționează apoi ca un loc pentru fixarea azotului, cu N2 legându-se în cavitatea centrală a cofactorului.

Variații Edit

Proteina MoFe poate fi înlocuită cu azotaze alternative în medii scăzute în cofactorul Mo. Sunt cunoscute două tipuri de astfel de azotaze: vanadiu-fier (VFe Vnf) și fier-fier (FeFe Anf) tip. Ambele formează un ansamblu de două subunități α, două subunități β și două subunități δ (uneori γ). Subunitățile delta sunt omoloage între ele, iar subunitățile alfa și beta în sine sunt omoloage cu cele găsite în azotaza MoFe. Clusterele genetice sunt, de asemenea, omoloage, iar aceste subunități sunt interschimbabile într-o oarecare măsură. Toate nitrogenazele utilizează un grup de miez Fe-S similar, iar variațiile vin în metalul cofactor. [5] [6]

Anf azotaza în Azotobacter vinelandii este organizat într-un anfHDGKOR operon. Acest operon necesită încă unele dintre genele Nif pentru a funcționa. A fost construit un operon minim de 10 gene care conține aceste gene esențiale suplimentare. [7]

Mecanism general Edit

Nitrogenaza este o enzimă responsabilă de catalizarea fixării azotului, care este reducerea azotului (N2) la amoniac (NH3) și un proces vital pentru susținerea vieții pe Pământ. [8] Există trei tipuri de nitrogenază care se găsesc în diferite bacterii care fixează azotul: azotaza molibdenului (Mo), azotarea vanadiului (V) și a azotazei numai a fierului (Fe). [9] Azotaza de molibden, care poate fi găsită în diazotrofe, cum ar fi rizobia asociată leguminoaselor, [10] [11] este azotaza care a fost studiată cel mai mult și, prin urmare, este cea mai bine caracterizată. [9] Figurile 1-2 prezintă structura cristalină și componentele catalitice cheie ale azotazei molibdenice extrase din Azotobacter vinelandii. Azotobaza vanadică și azotaza numai cu fier pot fi găsite în anumite specii de Azotobacter ca azotază alternativă. [10] [12] Ecuațiile 1 și 2 arată reacțiile echilibrate ale fixării azotului în azotaza molibdenului și respectiv azotul vanadiului.

Toate nitrogenazele sunt sisteme bicomponente formate din componenta I (cunoscută și sub denumirea de dinitrogenază) și componenta II (cunoscută și sub denumirea de dinitrogenază reductază). Componenta I este o proteină MoFe în azotaza molibdenică, o proteină VFe în azotaza vanadiului și o proteină Fe în azotaza numai cu fier. [8] Componenta II este o proteină Fe care conține clusterul Fe-S (Figura 3: partea de sus), care transferă electroni la Componenta I. [12] Componenta I conține 2 clustere metalice cheie: clusterul P (Figura 3: mijloc ), și FeMo-cofactor (FeMo-co) (Figura 3: partea de jos). Mo este înlocuit cu V sau Fe în azonază vanadică și respectiv azotază numai cu fier. [8] În timpul catalizei, electronii curg dintr-o pereche de molecule ATP din componenta II către clusterul Fe-S, către clusterul P și, în cele din urmă, către FeMo-co, unde reducerea N2 la NH3 are loc.

Model cinetic Lowe-Thorneley Edit

Reducerea azotului la două molecule de amoniac se realizează la FeMo-co a componentei I după adăugarea secvențială a echivalenților de protoni și electroni din componenta II. [8] Măsurările cinetice ale stării de echilibru, înghețului și fluxului oprit efectuate în anii 70 și 80 de Lowe, Thorneley și alții au oferit o bază cinetică pentru acest proces. [14] [15] Modelul cinetic Lowe-Thorneley (LT) (descris în Figura 4) a fost dezvoltat din aceste experimente și documentează cele opt transferuri corelate de protoni și electroni necesare pe parcursul reacției. [8] [14] [15] Fiecare etapă intermediară este descrisă ca En unde n = 0-8, corespunzător numărului de echivalenți transferați. Transferul a patru echivalenți este necesar înainte de adăugarea productivă de N2, deși reacția lui E3 cu N2 este, de asemenea, posibil. [14] În special, reducerea azotului s-a dovedit că necesită 8 echivalenți de protoni și electroni, spre deosebire de cei 6 echivalenți preziși de reacția chimică echilibrată. [16]

Intermediari E0 prin E4 Editați | ×

Caracterizarea spectroscopică a acestor intermediari a permis o mai bună înțelegere a reducerii azotului de către azotază, cu toate acestea, mecanismul rămâne un domeniu activ de cercetare și dezbatere. Mai jos sunt enumerate pe scurt experimente spectroscopice pentru intermediari înainte de adăugarea de azot:

E0 - Aceasta este starea de repaus a enzimei înainte de începerea catalizei. Caracterizarea EPR arată că această specie are o rotație de 3 /2. [17]

E1 - Intermediarul cu un singur electron redus a fost prins în timpul cifrei de afaceri sub N2. Spectroscopia Mӧssbauer a intermediarului prins indică faptul că FeMo-co este un spin întreg mai mare de 1. [18]

E2 - Acest intermediar este propus să conțină grupul de metale în starea sa de oxidare în repaus, cu cei doi electroni adăugați depozitați într-o hidrură de punte și protonul suplimentar legat de un atom de sulf. Izolarea acestui intermediar în enzime mutante arată că FeMo-co are o rotație mare și are o rotație de 3 /2. [19]

E3 - Acest intermediar se propune a fi FeMo-co redus individual, cu o hidrură de punte și un proton. [8]

E4 - Denumit intermediarul Janus după zeul roman al tranzițiilor, acest intermediar este poziționat după exact jumătate din transferul de protoni de electroni și poate fie să se descompună înapoi la E0 sau continuați cu legarea azotului și terminați ciclul catalitic. Se propune ca acest intermediar să conțină FeMo-co în starea sa de oxidare de repaus cu două hidruri de punte și doi protoni legați de sulf. [8] Acest intermediar a fost observat mai întâi folosind tehnici de congelare cu o proteină mutantă în care reziduul 70, un aminoacid de valină, este înlocuit cu izoleucină. [20] Această modificare împiedică accesul substratului la FeMo-co. Caracterizarea EPR a acestui intermediar izolat arată o nouă specie cu o rotire de ½. Experimentele ENDOR au oferit o perspectivă asupra structurii acestui intermediar, dezvăluind prezența a două hidruri de punte. [20] 95 Mo și 57 Fe ENDOR arată că hidrurile pun podul între două centre de fier. [21] Cryoannealing al intermediarului prins la -20 ° C are ca rezultat pierderea succesivă a doi echivalenți de hidrogen la relaxare, demonstrând că intermediarul izolat este în concordanță cu E4 stat. [8] Decăderea lui E4 la E2 + H2 și în cele din urmă către E0 și 2H2 a confirmat semnalul EPR asociat cu E2 intermediar. [8]

Intermediarii de mai sus sugerează că grupul metalic este ciclat între starea sa originală de oxidare și o stare redusă individual, cu electroni suplimentari depozitați în hidruri. S-a propus, alternativ, că fiecare etapă implică formarea unei hidruri și că grupul de metale circulă de fapt între starea de oxidare originală și o stare de oxidare individuală. [8]

Căi distale și alternative pentru N2 fixare Edit

În timp ce mecanismul de fixare a azotului înainte de Janus E4 complexul este în general convenit, în prezent există două ipoteze pentru calea exactă în a doua jumătate a mecanismului: calea „distală” și „alternativă” (vezi Figura 5). [8] [22] [23] În calea distală, azotul terminal este hidrogenat mai întâi, eliberează amoniac, apoi azotul legat direct de metal este hidrogenat. În calea alternativă, un hidrogen este adăugat la azotul terminal, apoi un hidrogen este adăugat la azotul legat direct de metal. Acest model alternativ continuă până când se eliberează amoniac. [8] [22] [23] Deoarece fiecare cale favorizează un set unic de intermediari, încercările de a determina care cale este corectă s-au concentrat în general pe izolarea intermediarilor menționați, cum ar fi nitrido în calea distală, [24] și diazen și hidrazină în calea alternativă. [8] Încercările de a izola intermediarii în azotaza însăși nu au reușit până acum, dar utilizarea complexelor model a permis izolarea intermediarilor care susțin ambele părți în funcție de centrul metalic utilizat. [8] Studiile cu Mo indică în general spre o cale distală, în timp ce studiile cu Fe indică în general spre o cale alternativă. [8] [22] [23] [25] [26]

Sprijinul specific pentru calea distală a provenit în principal din activitatea lui Schrock și Chatt, care au izolat cu succes complexul nitrido folosind Mo ca centru metalic într-un complex model. [24] [27] Suportul specific pentru calea alternativă provine din câteva studii. S-a arătat că grupele de fier numai pentru model reduc catalitic N2. [25] [26] De asemenea, s-a demonstrat că grupurile mici de tungsten urmează o cale alternativă pentru fixarea azotului. [28] Vanadiu azotaza eliberează hidrazină, un intermediar specific mecanismului alternativ. [8] [29] Cu toate acestea, lipsa intermediarilor caracterizați în enzima nativă însăși înseamnă că niciuna dintre căi nu a fost definitiv dovedită. Mai mult, s-au găsit studii de calcul care susțin ambele părți, în funcție de faptul dacă se presupune că locul de reacție este la Mo (distal) sau la Fe (alternativ) în cofactorul MoFe. [8] [22] [23]

Mecanismul legării MgATP Edit

Legarea MgATP este unul dintre evenimentele centrale care au loc în mecanismul utilizat de azotază. Hidroliza grupului fosfat terminal al MgATP furnizează energia necesară pentru a transfera electronii din proteina Fe în proteina MoFe. [30] Interacțiunile de legare dintre grupările fosfat MgATP și resturile de aminoacizi ale proteinei Fe sunt bine înțelese prin compararea cu enzime similare, în timp ce interacțiunile cu restul moleculei sunt mai evazive datorită lipsei unui cristal proteic Fe structură cu legătură MgATP (începând cu 1996). [31] S-a demonstrat că trei reziduuri de proteine ​​au interacțiuni semnificative cu fosfații, prezentate în Figura 6. [14] În absența MgATP, există o punte de sare între reziduul 15, lizină și reziduul 125, acid aspartic. [31] La legare, această punte de sare este întreruptă. Mutageneza specifică site-ului a demonstrat că atunci când lizina este substituită cu o glutamină, afinitatea proteinei pentru MgATP este mult redusă [32] și când lizina este substituită cu o arginină, MgATP nu se poate lega din cauza faptului că puntea de sare este prea puternică. [33] Necesitatea acidului aspartic specific la locul 125 a fost demonstrată prin observarea reactivității modificate la mutația acestui reziduu la acid glutamic. [34] Al treilea reziduu care s-a dovedit a fi cheia pentru legarea MgATP este reziduul 16, serina. Mutageneză specifică site-ului a fost utilizată pentru a demonstra acest fapt. [34] Acest lucru a condus la un model în care serina rămâne coordonată la ionul Mg 2+ după hidroliza fosfatului pentru a facilita asocierea acestuia cu un fosfat diferit al moleculei de acum ADP. [35] Legarea de MgATP induce, de asemenea, modificări conformaționale semnificative în cadrul proteinei Fe. [14] Mutageneza direcționată pe site a fost folosită pentru a crea mutanți în care MgATP se leagă, dar nu induce o schimbare conformațională. [36] Compararea datelor de împrăștiere a razelor X la mutanți față de proteina de tip sălbatic a condus la concluzia că întreaga proteină se contractă la legarea MgATP, cu o scădere a razei de aproximativ 2,0 Å. [36]

Alte detalii mecaniciste Edit

Multe aspecte mecaniciste ale catalizei rămân necunoscute. Nu s-a raportat nicio analiză cristalografică pe substratul legat de nitrogenază.

Nitrogenaza este capabilă să reducă acetilena, dar este inhibată de monoxidul de carbon, care se leagă de enzimă și astfel împiedică legarea dinitrogenului. Dinitrogenul previne legarea acetilenei, dar acetilena nu inhibă legarea dinitrogenului și necesită un singur electron pentru reducerea la etilenă. [37] Datorită proprietăților oxidative ale oxigenului, majoritatea nitrogenazelor sunt inhibate ireversibil de dioxigen, care oxidează degradativ cofactorii Fe-S. [ este necesară citarea ] Acest lucru necesită mecanisme pentru fixatorii de azot pentru a proteja nitrogenaza de oxigen in vivo. În ciuda acestei probleme, mulți folosesc oxigenul ca acceptor terminal de electroni pentru respirație. [ este necesară citarea ] Deși capacitatea unor fixatori de azot, cum ar fi Azotobacteraceae, de a utiliza o azotază labilină în condiții aerobe a fost atribuită unei rate metabolice ridicate, permițând reducerea oxigenului la nivelul membranei celulare, eficacitatea unui astfel de mecanism a fost pusă la îndoială la concentrațiile de oxigen peste 70 μM (concentrația ambientală este de 230 μM O2), precum și în timpul limitărilor suplimentare de nutrienți. [38]

În plus față de reducerea dinitrogenului, nitrogenazele reduc și protonii la dihidrogen, ceea ce înseamnă că azotaza este și o dehidrogenază. O listă cu alte reacții efectuate de azotaze este prezentată mai jos: [39] [40]

S-a demonstrat că azoturile de vanadiu catalizează conversia CO în alcani printr-o reacție comparabilă cu sinteza Fischer-Tropsch.

Există două tipuri de bacterii care sintetizează azotaza și sunt necesare pentru fixarea azotului. Acestea sunt:

  • Bacteriile cu viață liberă (non-simbiotice), exemple includ:
      (Algă verde-albăstruie)
  • Azotobacter
    • Rhizobium, asociat cu plantele leguminoase
    • Spirillum, asociat cu ierburile de cereale
    • Frankia

    Cele trei subunități ale azotazazei prezintă o asemănare semnificativă a secvenței cu trei subunități ale versiunii independente de lumină a protoclorofilide reductazei care efectuează conversia protoclorofilidei în clorofilă. Această proteină este prezentă în gimnosperme, alge și bacterii fotosintetice, dar a fost pierdută de angiosperme în timpul evoluției. [44]

    Separat, două dintre subunitățile azotazazei (NifD și NifH) au omologi în metanogeni care nu fixează azot, de ex. Methanocaldococcus jannaschii. [45] Se înțelege puțin despre funcția acestor „clase IV” nif gene, [46] deși apar la mulți metanogeni. În M. jannaschii se știe că interacționează între ele și sunt exprimate constitutiv. [45]

    Ca și în cazul multor teste pentru activitatea enzimatică, este posibil să se estimeze activitatea azotazazei măsurând rata de conversie a substratului (N2) la produs (NH3). De când NH3 este implicat în alte reacții în celulă, este adesea de dorit să se eticheteze substratul cu 15 N pentru a oferi contabilitate sau „echilibru de masă” al substratului adăugat. Un test mai obișnuit, testul de reducere a acetilenei sau ARA, estimează activitatea azotazazei profitând de capacitatea enzimei de a reduce acetilena gazului la etilen gazos. Aceste gaze sunt cuantificate cu ușurință folosind cromatografia gazoasă. [47] Deși utilizat pentru prima dată într-un cadru de laborator pentru a măsura activitatea azotazazei din extractele de Clostridium pasteurianum celule, ARA a fost aplicat la o gamă largă de sisteme de testare, inclusiv studii de teren în care alte tehnici sunt greu de implementat. De exemplu, ARA a fost utilizat cu succes pentru a demonstra că bacteriile asociate cu rădăcinile orezului suferă ritmuri sezoniere și diurne în activitatea azotazazei, care erau aparent controlate de plantă. [48]

    Din păcate, conversia datelor din analizele azotazazei în moli reali de N2 redusă (în special în cazul ARA), nu este întotdeauna simplă și poate subestima sau supraestima rata reală din mai multe motive. De exemplu, H2 concurează cu N2 dar nu acetilenă pentru nitrogenază (ducând la supraestimarea azotazei de către ARA). Testele pe sticlă sau pe cameră pot produce impacturi negative asupra sistemelor microbiene ca rezultat al conținutului sau al întreruperii micro-mediului prin manipulare, ducând la subestimarea azotazazei. În ciuda acestor puncte slabe, astfel de teste sunt foarte utile în evaluarea ratelor relative sau a modelelor temporale în activitatea azotazazei.


    Abstract

    Proteinele de fier (Fe) ale molibdenului (Mo) -, vanadiului (V) - și fierului (Fe) doar azotazazele sunt codificate de nifH, vnfH, și anfH, respectiv. In timp ce nifHProteina Fe codificată a fost studiată pe larg în ultimii ani, informații referitoare la proprietățile vnfH- și anfH-encoded Fe proteins has remained scarce. Here, we present a combined biochemical, electron paramagnetic resonance (EPR) and X-ray absorption spectroscopy (XAS) analysis of the [Fe4S4] clusters of NifH, VnfH, and AnfH of Azotobacter vinelandii. Our data show that all three Fe proteins contain [Fe4S4] clusters of very similar spectroscopic and geometric structural properties, although NifH differs more from VnfH and AnfH with regard to the electronic structure. These observations have an interesting impact on the theory of the plausible sequence of evolution of nitrogenase Fe proteins. More importantly, the results presented herein provide a platform for future investigations of the differential activities of the three Fe proteins in nitrogenase biosynthesis and catalysis.


    Abstract

    Molybdenum nitrogenase catalyzes the reduction of dinitrogen into ammonia, which requires the coordinated transfer of eight electrons to the active site cofactor (FeMoco) through the intermediacy of an [8Fe-7S] cluster (P-cluster), both housed in the molybdenum–iron protein (MoFeP). Previous studies on MoFeP from two different organisms, Azotobacter vinelandii (Av) și Gluconacetobacter diazotrophicus (Gd), have established that the P-cluster is conformationally flexible and can undergo substantial structural changes upon two-electron oxidation to the P OX state, whereby a backbone amidate and an oxygenic residue (Ser or Tyr) ligate to two of the cluster’s Fe centers. This redox-dependent change in coordination has been implicated in the conformationally gated electron transfer in nitrogenase. Here, we have investigated the role of the oxygenic ligand in Av MoFeP, which natively contains a Ser ligand (βSer188) to the P-cluster. Three variants were generated in which (1) the oxygenic ligand was eliminated (βSer188Ala), (2) the P-cluster environment was converted to the one in Gd MoFeP (βPhe99Tyr/βSer188Ala), and (3) two oxygenic ligands were simultaneously included (βPhe99Tyr). Our studies have revealed that the P-cluster can become compositionally labile upon oxidation and reversibly lose one or two Fe centers in the absence of the oxygenic ligand, while still retaining wild-type-like dinitrogen reduction activity. Our findings also suggest that Av și Gd MoFePs evolved with specific preferences for Ser and Tyr ligands, respectively, and that the structural control of these ligands must extend beyond the primary and secondary coordination spheres of the P-cluster. The P-cluster adds to the increasing number of examples of inherently labile Fe–S clusters whose compositional instability may be an obligatory feature to enable redox-linked conformational changes to facilitate multielectron redox reactions.


    Proceduri experimentale

    Unless noted otherwise, all chemicals and reagents were obtained from Fisher Scientific or Sigma-Aldrich.

    Cell Growth and Protein Purification

    Toate Azobacter vinelandii strains were grown in 180 L batches in a 200 L New Brunswick fermentor in Burke’s minimal medium supplemented with 2 mM ammonium acetate. The growth rate was measured by cell density at 436 nm. After ammonia had been consumed, the cells were de-repressed for 3 h and subsequently harvested by using a flow-through centrifugal harvester (Cepa, Lahr/Schwarzwald, Germany). The cell paste was washed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). The ΔnifH NifDK, ΔnifB NifDK, and wild-type NifH proteins used in this work were purified as described previously. 9,14

    Sample Preparation

    All MCD samples were prepared in an Ar-filled anaerobic chamber (Vacuum Atmospheres, Hawthorne, CA) at an oxygen level of τ ppm. 11 The Ti(III) citrate solution was prepared as described previously. 15 DTN-reduced protein samples were in 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10% glycerol, and 2 mM dithionite (Na2S2O4). Ti(III) citrate-reduced protein samples were prepared by incubating protein with 12 mM Ti(III) citrate for 5 min and subsequently removing excess Ti(III) citrate with a G25 size-exclusion column. Indigo disulfonate (IDS)-oxidized protein samples were prepared by incubating samples with IDS for 5 min and subsequently removing excess IDS with a G25 size-exclusion column. Samples were then concentrated to � mg/mL in a Centricon-50 concentrator (Amicon) as described previously, 14 transferred to MCD sample cuvettes, and frozen in a liquid nitrogen/pentane slush. All samples contained 50% glycerol to ensure the formation of an optical glass upon freezing, and they were kept on dry ice during transit.

    MCD Spectroscopy

    MCD spectra were recorded with a modified CD spectropolarimeter (model J-715, Jasco) interfaced with a superconducting magnet (model 400-7T Spectromag, Oxford). Sample temperatures were monitored with two thin film resistance temperature sensors [model CX1050-Cu-1-4L (Lakeshore, Westerville, OH)] positioned directly (1 mm) above and below the sample cuvette. The linearity of the magnetic field was monitored with a calibrated Hall generator [model HGCA-3020 (Lakeshore)] placed directly outside the superconducting magnet.

    MCD sample cells were constructed from optical-quality Spectrosil quartz [170� nm, 1 mm path length, model BS-1-Q-1, Starna, model SUV R-1001 or FUV (Spectrocell, Oreland, PA)]. Each cuvette was cut into the appropriate dimensions to fit the sample holder (2.0 cm × 12.5 mm), resulting in a sample volume of approximately 160 μL.

    MCD spectra were recorded at a rate of 50 nm/min and a resolution of 10 nm. Two different photomultipliers were used, one with a spectral range of 200� nm and the other with a spectral range of 700� nm. Because of the strong absorbance of DTN, all of the spectra presented herein start at � nm. Because optical glasses formed at low temperatures often generate a strain-induced background CD spectrum, the CD spectrum was recorded in zero magnetic field to determine whether the background signal was excessive. To eliminate interference by any background CD signal, the corrected MCD spectrum was obtained for each sample by first recording the spectrum with the magnetic field in one direction and then subtracting from it the spectrum with the field in the opposite direction. All spectral intensities were corrected for path length and sample concentration.

    Analysis of Magnetization Data

    Magnetization curves were recorded at a set wavelength and temperature while the magnetic field was linearly varied from 0 to 6 T at a rate of 0.1 A/s with a resolution of 2 s. MCD magnetization data were analyzed by a previously published fit/simulation program. 16 The program allows the calculation of best-fit saturation magnetization curves using experimental data as a basis set and is valid for any spin state, half-integer or integer, at any specified temperature.

    Experimental data were analyzed by fitting the Spin Hamiltonian parameters (g pentru S = 1 /2 și D și E/D pentru S > 1 /2) and the effective transition moment products, Mxy eff , Mxz eff , and Mxy eff , with a scaling parameter Asatlim = γ/4πS, where γ is the magnetogyric ratio. The effective transition moment products represent the planes of polarization that reflect the anisotropy of the g factori. Because the initial slope of the magnetization curve is dependent on the g factors, the transition polarizations relate the transition dipole to the g factor axes of a powder or randomly oriented sample.


    Rezultate si discutii

    Recently, we have shown that NifEN contains a Mo-free FeMoco precursor (15, 17), which can reconstitute and activate the FeMoco-deficient ΔnifB MoFe protein in a so-called “FeMoco maturation assay” (15). Such an assay contains the following: (eu) NifEN, the source of FeMoco precursor (ii) Mo and homocitrate, the missing components from the precursor (iii) the Fe protein and MgATP, factors facilitating FeMoco maturation in an unknown fashion and (iv) ΔnifB MoFe protein, the receptor for FeMoco. Based on this assay, we developed a strategy to “uncouple” the original FeMoco maturation assay into several individual steps, allowing further determination of the sequence of events during FeMoco maturation and the roles of particular components in this process. Such a strategy includes the following steps: first, NifEN is incubated with molybdate, homocitrate, Fe protein, and MgATP then, His-tagged NifEN is repurified from the mixture by affinity chromatography and the nontagged wild-type Fe protein is repurified from the flow-through of the affinity column and finally, repurified components are tested for their capacities to reconstitute and activate the FeMoco-deficient ΔnifB MoFe protein. Analysis of repurified NifEN (designated NifEN complete ), therefore, enables the determination of the extent of maturation of the NifEN-bound precursor. Based on the study of NifEN complete , we have established that Mo and homocitrate are incorporated into the precursor while it is bound to NifEN (20). Meanwhile, analysis of the repurified Fe protein from the same incubation mixture (designated Fe protein complete ) allows the determination of whether Fe protein is indeed involved in Mo mobilization during FeMoco biosynthesis and, if so, what type of species it carries. Fe protein complete was examined by metal and spectroscopic analyses and tested for its capacity as (eu) a “Mo/homocitrate donor” in an assay that consists of Fe protein complete , NifEN, and ΔnifB MoFe protein and (ii) a direct “FeMoco donor” in an assay that consists of only Fe protein complete and ΔnifB MoFe protein. Control experiments were conducted with Fe proteins repurified from incubation mixtures that lacked one or more of the maturation factors or contained (eu) precursor-free ΔnifB NifEN instead of NifEN, (ii) ATP hydrolysis-deficient Fe protein variants instead of wild-type Fe protein, or (iii) ADP, or nonhydrolyzable ATP analogs, instead of ATP. Together with Fe protein complete , the repurified Fe proteins are categorically designated Fe proteins', with different superscripts indicating different conditions for sample preparation. For designations of Fe proteins', please refer to Materiale și metode.

    A Fe protein complete monomer, like that of the wild-type Fe protein, is ≈30 kDa (data not shown). The molecular mass of Fe protein complete is ≈60 kDa based on its elution profile on gel filtration Sephacryl S-200 high-resolution column (data not shown), indicating that Fe protein complete is a homodimer. Fe protein complete cannot serve as a direct FeMoco donor to the FeMoco-deficient ΔnifB MoFe protein because incubation of Fe protein complete with ΔnifB MoFe protein alone does not result in the reconstitution and activation of ΔnifB MoFe protein (Table 1). On the other hand, when Fe protein complete is incubated with NifEN and ΔnifB MoFe protein, ΔnifB MoFe protein is activated to approximately the same extent as it is by a complete FeMoco maturation assay or by incubation with NifEN complete (Table 1) (15, 20). Further, upon incubation with NifEN and increasing amounts of Fe protein complete , a maximum activity of ≈300 nmol of C2H4 formation per mg of ΔnifB MoFe protein per min is observed (Fig. 1 A). These observations indicate that Fe protein complete is competent in the maturation of the NifEN-bound FeMoco precursor without additional factors. Moreover, given that the precursor does not contain Mo and homocitrate and that no additional Mo and homocitrate are included in the assay, Fe protein complete appears to be the only source that can provide these two missing components for the transformation of the precursor into a fully assembled FeMoco. This argument is further supported by the observation that Fe protein minus Mo/homocitrate , Fe protein minus Mo , and Fe protein minus homocitrate are not competent in stimulating FeMoco maturation on NifEN (Table 1). These results strongly suggest that Fe protein acts as a Mo/homocitrate insertase that binds and delivers Mo and homocitrate to the Mo-free FeMoco precursor on NifEN.


    Combining a Nitrogenase Scaffold and a Synthetic Compound into an Artificial Enzyme

    Nitrogenase catalyzes substrate reduction at its cofactor center ([(Cit)MoFe7S9C](n-) designated M-cluster). Here, we report the formation of an artificial, nitrogenase-mimicking enzyme upon insertion of a synthetic model complex ([Fe6S9(SEt)2](4-) designated Fe6(RHH)) into the catalytic component of nitrogenase (designated NifDK(apo)). Two Fe6(RHH) clusters were inserted into NifDK(apo), rendering the conformation of the resultant protein (designated NifDK(Fe)) similar to the one upon insertion of native M-clusters. NifDK(Fe) can work together with the reductase component of nitrogenase to reduce C2H2 in an ATP-dependent reaction. It can also act as an enzyme on its own in the presence of Eu(II)DTPA, displaying a strong activity in C2H2 reduction while demonstrating an ability to reduce CN(-) to C1-C3 hydrocarbons in an ATP-independent manner. The successful outcome of this work provides the proof of concept and underlying principles for continued search of novel enzymatic activities based on this approach.

    Cuvinte cheie: CC coupling artificial enzyme hydrocarbon nitrogenase synthetic compound.

    © 2015 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.

    Cifre

    Nitrogenase cofactor, synthetic compound and…

    Nitrogenase cofactor, synthetic compound and protein scaffold. Structural models of the M-cluster (…

    C 2 H 2 reduction by NifDK Fe in ATP-dependent and independent reactions.…


    Present address: Department of Chemistry, Tulane University, New Orleans, LA, USA

    Afilieri

    Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

    Alex McSkimming & Daniel L. M. Suess

    Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

    Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

    Contribuții

    A.M. performed the experiments. A.M. and D.L.M.S. designed the research, analysed the data, and wrote the manuscript.

    Autorul corespunzator


    Priveste filmarea: Valenta si Numarul de Oxidare partea I. (Ianuarie 2022).