Informație

O proteină care se încadrează sub un prag poate declanșa un alt răspuns?


Este posibil ca scăderea concentrației unei proteine ​​sub un prag să declanșeze eliberarea sau producerea altei proteine?


Desigur, acest lucru este posibil. Voi da un exemplu simplu. Dacă proteina dvs. (X) este un inhibitor al celeilalte proteine ​​(Y), atunci când X scade, Y va crește. Acest lucru nu ar fi cu adevărat „prag”.

Există multe mecanisme care pot duce la praguri care includ cooperativitatea (în acțiunea lui X) și feedback-uri pozitive. Cum funcționează aceste mecanisme ar fi cu totul altă întrebare. (O lectură rapidă ar fi acest articol de pe Wikipedia).


Recomandări pentru transfuzia de plasmă și trombocite

Principala indicație pentru transfuzia de plasmă este de a corecta deficiențele factorilor de coagulare, pentru care nu este disponibil un concentrat specific, la pacienții cu sângerări active. Produsele disponibile sunt: ​​plasmă proaspăt congelată (FFP), plasmă care a suferit inactivare virală cu tratament solvent / detergent (S / D FFP), cu albastru de metilen (MB FFP) sau cu psoraleni, în special amotosalen (S59) și lumină 1 tehnologia de inactivare care utilizează riboflavină va fi disponibilă în curând 2.

Plasma proaspăt-congelată

Definiție

O componentă sanguină preparată din sânge integral sau colectată prin afereză, înghețată în limite de timp și la o temperatură care să păstreze în mod adecvat factorii de coagulare labili 3 & # x02013 5.

FFP preparat din unități de sânge integral și cel derivat din afereză sunt echivalente terapeutic în termeni de hemostază și efecte secundare (Grad de recomandare: 1A) 4 .

Proprietăți

FFP conține niveluri normale ale factorilor stabili de coagulare, albumină și imunoglobuline. Conține cel puțin 70% din factorul VIII coagulant original și cel puțin cantități similare din ceilalți factori de coagulare labili și inhibitori naturali ai coagulării 1, 3 & # x02013 5.

FFP de uz clinic nu trebuie să conțină anticorpi anti-eritrocitari neregulați clinic semnificativi. Pentru a-și crește siguranța, FFP poate fi pus în carantină pentru o perioadă minimă de 4 luni.

Diferențele individuale fiziologice în concentrațiile de proteine ​​plasmatice înseamnă că definiția generică a FFP se aplică produselor care diferă în special în ceea ce privește calitatea.

Plasma tratată cu solvent / detergent

S / D FFP este un produs farmaceutic, obținut dintr-un grup de aproximativ 1.000 de unități de FFP, cu următoarele caracteristici 2, 6 și # x02013 34:

- standardizare mare pe lot

- concentrația / activitatea declarată a proteinelor biologic active

- riscuri imunologice reduse legate de prezența anticorpilor, a celulelor (sau a fragmentelor acestora)

- inactivarea majorității agenților patogeni potențial transmisibili

- eliminarea selectivă a unităților contaminate de virusul hepatitei A sau parvovirus B19.

Plasmă tratată cu albastru de metilen

Albastrul de metilen (MB) este un colorant fenotiazinic cu efect virucid 2, 35 & # x02013 40. MB FFP nu este un produs farmaceutic, dar este derivat din utilizarea unei metode de inactivare aplicată unităților unice de plasmă.

Conținutul proteinelor biologic active ale acestui produs nu poate fi standardizat, astfel încât variabilitatea biologică a unităților rămâne ridicată.

Scăderea potențială a riscului de infectare reziduală este aceeași cu cea pentru S / D FFP.

Există unele dovezi în literatura de specialitate că metodele de inactivare virală determină o scădere a concentrațiilor unor factori de coagulare și inhibitori ai coagulării 33 & # x02013 40.

Indicații

Transfuzia de FFP este indicată în următoarele situații (Tabelul I):

Corectarea deficiențelor congenitale ale factorilor de coagulare, pentru care nu există un concentrat specific, sau a deficiențelor dobândite ale factorilor de coagulare multipli, atunci când PT sau aPTT, exprimat ca raport, este & # x0003e 1,5, în circumstanțele enumerate mai jos 1, 3 , 4, 41 și # x02013 67:

Sângerări continue la pacienții cu afecțiuni hepatice (Grad de recomandare: 1C +) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67.

Prevenirea sângerării, în cazul intervențiilor chirurgicale sau a procedurilor invazive, la pacienții cu afecțiuni hepatice (Grad de recomandare: 2C) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67 & # x02013 70.

Pacienții tratați cu antagoniști ai vitaminei K, în prezența hemoragiei majore sau a sângerărilor intracraniene sau în pregătirea pentru o intervenție chirurgicală care nu poate fi amânată (Grad de recomandare: 1C +) 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67, dacă concentratul complex de protrombină, tratamentul de primă alegere, nu este disponibil 55, 59 & # x02013 65.

Pacienți cu coagulare intravasculară diseminată acută (DIC) și sângerări active, în asociere cu corectarea cauzei de bază (Grad de recomandare: 1C +) 41 & # x02013 51, 53, 54, 56 & # x02013 58, 67.

Corectarea sângerărilor microvasculare la pacienții supuși transfuziei masive. Dacă PT și aPTT nu pot fi obținute într-un termen rezonabil, FFP poate fi transfuzat în orice caz, în încercarea de a opri sângerarea (Grad de recomandare: 1C +) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 66, 67.

Deficiențe ale factorilor de coagulare unici, în absența concentratului specific (de exemplu, deficit de factor V), în prezența sângerărilor active sau pentru a preveni sângerarea, în cazul intervențiilor chirurgicale sau a procedurilor invazive (Grad de recomandare: 1C +) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67.

Tratamentul aferetic al microangiopatiilor trombotice (purpura trombotică trombocitopenică, sindromul hemoliticuraemic, anemia hemolitică crescută a enzimelor hepatice și sindromul scăzut al numărului de trombocite [HELLP]), ca lichid de înlocuire (Grad de recomandare: 1A) 41 & # x02013 52, 56 & # x02013 58, 67.

Reconstituirea sângelui integral pentru transfuzie de schimb (Grad de recomandare: 2C) 71 , 72 .

Angioedem ereditar datorat deficitului de esterază, în absența inactivatorului C1 derivat plasmatic specific (Grad de recomandare: 2C +) 50 .

Tabelul I

Indicații pentru transfuzia de plasmă

Starea clinicăGoR
1. Corectarea deficiențelor congenitale sau dobândite ale factorilor de coagulare (pentru care nu există un concentrat specific), atunci când raportul PT sau aPTT este & # x0003e1.5:
& # x02003 & # x02003- Boală hepatică:
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- bleedi activng1C +
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- prevenirea sângerării în caz de intervenții chirurgicale sau invazive2C
& # x02003 & # x02003- În timpul tratamentului cu antagoniști ai vitaminei K (dacă complexul de protrombină, care este primul tratament de alegere, nu este disponibil):1C +
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- în prezența hemoragiei majore sau intracraniene
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- în pregătirea pentru intervenție chirurgicală decât nu poate fi întârziată
& # x02003 & # x02003- Coagulare intravasculară diseminată acută cu sângerări active, în asociere cu corectarea cauzei de bază1C +
& # x02003 & # x02003- Sângerări microvasculare în timpul transfuziilor masive (& # x0003e1 volum de sânge), chiar înainte de rezultatele PT și aPTT1C +
& # x02003 & # x02003- Deficiențe ale factorilor de coagulare unici, în absența concentratelor specifice (de exemplu, FV), în prezența sângerării active sau pentru a preveni sângerarea în timpul unei proceduri invazive1C +
2. Tratamentul aferetic al microangiopatiilor trombotice (purpură trombotică trombocitopenică, sindrom hemolitic-uremic, sindrom HELLP), ca lichid de înlocuire1A
3. Reconstituirea sângelui integral pentru transfuzii de schimb2C
4. Angioedem ereditar în cazul în care inhibitorul C1-esterazei nu este disponibil2C +

Legenda: GoR: Grad de recomandare HELLP: anemie hemolitică crescută a enzimelor hepatice și număr scăzut de trombocite

Indicații la nou-născuți

Timpii de coagulare la nou-născuți, care, în medie, sunt mai lungi decât cei la adult, nu sunt neapărat legați de riscul de sângerare 71 & # x02013 74. Acesta este și mai mult cazul nou-născuților prematuri, rezultatele anormale ale testelor de coagulare, în absența simptomelor sau a riscului hemoragic, nu sunt o indicație pentru transfuzia FFP.

FFP este indicat pentru sângerări cauzate de deficit de vitamina K și sângerări (sau risc ridicat de sângerare) din cauza DIC. Este, de asemenea, indicat pentru tratamentul deficiențelor congenitale ale factorilor de coagulare unici, atunci când concentratul specific nu este disponibil (Grad de recomandare: 2C) 4, 71 și # x02013 74.

FFP ar trebui să fie, de preferință & # x02018sigură & # x02019, în sensul că a suferit o inactivare virală sau a fost pusă în carantină.

Pentru detalii suplimentare, consultați recomandările comune ale Societății Italiene de Neonatologie și SIMTI 72.

Metode de utilizare

FFP trebuie dezghețat între 30 și # x000b0C și 37 & # x000b0C într-o baie de apă sub agitare continuă sau cu un alt sistem capabil să asigure o temperatură controlată. Plasma trebuie transfuzată cât mai curând posibil după decongelare, dar în orice caz în decurs de 24 de ore, dacă este păstrată la 4 & # x000b1 2 & # x000b0C 4, 5.

Consultați fișa rezumativă a produsului pentru informații cu privire la timpul maxim dintre finalizarea decongelării S / D FFP și începerea transfuziei sale.

FFP nu trebuie să fie înghețat după ce a fost dezghețat (Grad de recomandare: 1C +) 4 .

Regimul de dozare

Doza terapeutică recomandată de FFP este de 10 și # x0201315 ml / kg greutate corporală 1, 4, 43, 44, 47. Doza de FFP depinde totuși de situația clinică și de parametrii de laborator (Grad de recomandare: 1C +) 1, 4, 43, 44, 47, 50, ceea ce poate justifica administrarea unor doze mai mari 75 & # x02013 77.

Compatibilitate ABO / RhD

Plasma utilizată trebuie să fie compatibilă cu ABO cu destinatarul (Tabelul II) (Grad de recomandare: 1C +) 3 , 4 , 50 .

Tabelul II

Terapia transfuzională cu FFP: selectarea fenotipului ABO al unităților de transfuzat

Fenotip ABO al destinataruluiFenotip ABO al unităților de transfuzat (în ordinea preferințelor)
OO, A, B, AB
AA, AB
BB, AB
ABAB

FFP nu trebuie să fie profilaxie anti-D compatibilă cu Rh nu este necesară la destinatarii Rh D-negativi ai FFP Rh D-pozitiv (Grad de recomandare: 1C +) 3 , 4 .

Indicații inadecvate

- Extinderea volumului circulator

- corectarea deficiențelor imune

- corectarea deficiențelor congenitale sau dobândite ale factorilor de coagulare în absența hemoragiei sau corectarea tulburărilor de hemostază la pacienții cu afecțiuni hepatice cronice care nu sângerează (Grad de recomandare: 1C +) 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 68, 69, 71 & # x02013 73, 77 & # x02013 80.

Contraindicații

Contraindicațiile absolute pentru utilizarea FFP sunt documentate intoleranță la plasmă sau la componentele sale și deficiență congenitală a imunoglobulinei A (IgA) în prezența anticorpilor anti-IgA 4.

Contraindicațiile relative sunt insuficiența cardiacă și edemul pulmonar.

Monitorizarea indicilor pentru auditul clinic

- Utilizarea terapiei transfuzionale cu FFP în următoarele situații:

extinderea volumului circulator

corectarea deficiențelor imune

corectarea deficiențelor congenitale sau dobândite ale factorilor de coagulare în absența hemoragiei sau corectarea tulburărilor de hemostază la pacienții cu afecțiuni hepatice cronice care nu au sângerare.

- Evaluarea adecvării dozei de FFP.

Reacții adverse la transfuzia de FFP

ușoară (urticarie): apar la 1% dintre pacienți

severe și anafilactice: apar cu o frecvență mai mică de 1 caz la 100.000 de transfuzii.

- Leziune pulmonară acută legată de transfuzie (TRALI) 81 & # x02013 85: edem pulmonar non-cardiogen care se dezvoltă în 4 & # x020136 ore de la transfuzia FFP. Această complicație poate fi evitată prin utilizarea plasmei de la donatori de sex masculin care nu au fost transfuzați niciodată și de la donatori de sex feminin nulipari care nu au fost transfuzați niciodată sau prin utilizarea S / D FFP.

- Reacții febrile 3, 4, 42 și # x02013 51, 56 și # x02013 58, 71 și # x02013 73: acestea apar la mai puțin de 1% dintre pacienții transfuzați cu FFP și la până la 10% dintre pacienții supuși schimbului de plasmă.

- Toxicitate citrată 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: aceasta poate apărea după transfuzia rapidă a unor volume mari de plasmă și este deosebit de importantă la nou-născuți și la pacienții cu afecțiuni hepatice.

- Transmiterea infecțiilor 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: procesul de înghețare inactivează contaminarea și creșterea bacteriilor bacteriene, cu eliberarea de endotoxine, înainte de congelare, este extrem de improbabilă. Există, totuși, riscul, deși minim, de transmitere a infecțiilor virale sau a infecțiilor datorate altor agenți patogeni necunoscuți sau netestați.

- Boala grefă versus gazdă (GvHD) 4: nu au fost raportate vreodată cazuri de GvHD asociat FFP. Congelarea provoacă liza limfocitelor, astfel încât iradierea plasmei nu este necesară.

- Suprasolicitare circulatorie 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: aceasta poate apărea, în special la pacienții cu insuficiență renală sau cardiorespiratorie.

- Inhibitori împotriva proteinelor deficitare 86: aceștia se pot dezvolta după transfuzia plasmei la pacienții cu deficiențe severe de factori de coagulare.

Referințe


INTRODUCERE

În timpul mitozei, microtubulii axului sondează spațiul tridimensional al celulei într-un proces de „căutare și captare”, care este important pentru interacțiunea eficientă a microtubulilor plus se termină cu cortexul celular și kinetochorele (revizuită în Kline-Smith și Walczak, 2004) . Se crede că o creștere a dinamicii microtubulilor la debutul mitozei facilitează orientarea și alinierea în timp util a cromozomilor în metafază. O altă modificare a dinamicii microtubulilor a fost, de asemenea, propusă pentru a contribui la forțele care segregează cromozomii și alungesc fusul mitotic în anafază (revizuit în Scholey și colab., 2003). Inhibarea dinamicii microtubulilor prin mutații ale proteinelor care se asociază cu capetele plus ale microtubulilor sau prin adăugarea de medicamente duce la eșecuri în alinierea și segregarea cromozomilor (Berlin și colab., 1990 Dujardin și colab., 1998 Gruss și colab., 2002 Maiato și colab., 2002 Rogers și colab., 2002 Andrews și colab., 2004 Cassimeris și Morabito, 2004 Kline-Smith și Walczak, 2004 Vaughan, 2004). Astfel, reglarea corespunzătoare a proprietăților dinamice ale microtubulilor este esențială pentru asigurarea segregării exacte a cromozomilor în mitoză.

Deși modificările dinamicii microtubulilor în timpul mitozei sunt bine documentate, mecanismele care controlează comportamentul microtubulilor sunt mai puțin clare. Un număr de proteine ​​asociate microtubulilor, precum și factori solubili care provin de la cromozomi au fost implicați în reglarea dinamicii microtubulilor, sugerând că o rețea complexă de proteine ​​controlează microtubulii în timpul mitozei. Capetele plus ale microtubulilor sunt un loc important de legare pentru proteinele care reglează microtubulii. Așa-numita familie de proteine ​​+ TIPs s-a dovedit a regla dinamica microtubulilor într-un număr de sisteme și include EB1, CLIP-170, CLASP, dynein, LIS1, subunitatea dinactină p150 lipită și polenoză adenomatoasă coli (APC revizuită în Karsenti și Vernos, 2001 Kline-Smith și Walczak, 2004 Vaughan, 2004). În plus față de partajarea unei localizări comune la capetele plus ale microtubulilor, aceste proteine ​​modulează de obicei tranzițiile dintre creșterea microtubulilor și contracția. Unul dintre cele mai bine caracterizate + TIP-uri este EB1, a cărui funcție de factor „anti-pauză” este bine conservată. Inhibarea EB1 într-un număr de sisteme are ca rezultat microtubuli nedinamici care petrec majoritatea timpului într-o stare întreruptă (Tirnauer și colab.,1999, 2002b Rogers și colab., 2002). Experimente de imunodepletie EB1 în Xenopus extractele au ca rezultat o reducere dramatică a lungimii microtubulilor. În mod similar, epuizarea ARNi a EB1 în Drosophila embrionilor are ca rezultat o stabilitate redusă a microtubulilor și perturbarea fusurilor mitotice (Rogers și colab., 2002 Tirnauer și colab., 2002b). În schimb, alte proteine ​​+ TIP, inclusiv LIS1, au fost raportate pentru a suprima dinamica microtubulilor in vitro prin reducerea catastrofelor inhibarea LIS1 are ca rezultat atașamente defecte de kinetocor-microtubuli (Faulkner și colab., 2000 Coquelle și colab., 2002 Tai și colab., 2002). Astfel, este probabil ca un echilibru de activități la capetele microtubulului plus să optimizeze procesul de căutare și captare, asigurându-se că capetele microtubulului plus își găsesc în mod eficient locurile de atașament.

APC poate interacționa direct cu microtubulii prin regiunea sa de bază sau poate interacționa indirect cu microtubulii prin asocierea sa cu proteina asociată kinesinei II, KAP3a, sau cu + TIP, EB1 (Nathke și colab., 1996 Mimori-Kiyosue și colab.,2000a, 2000b Mogensen și colab., 2002 Etienne-Manneville și Hall, 2003 Wen și colab., 2004). Prin studiile de legare cu hibrizi doi și in vitro, s-a demonstrat că EB1 interacționează cu capătul carboxi al APC, în timp ce KAP3a interacționează cu domeniul armadillo amino terminal din APC (Su și colab., 1995 Jimbo și colab., 2002). Legarea capătului carboxi al APC la EB1 îmbunătățește capacitatea EB1 de a se lega de-a lungul microtubulilor in vitro-polimerizați, susținând că APC poate funcționa pentru a „încărca” EB1 pe microtubuli plus capete (Nakamura și colab., 2001). Conexiunea fiziologică potențială dintre APC și EB1 este susținută de lucrări recente care arată că interacțiunea dintre aceste două proteine ​​este importantă pentru formarea microtubulilor stabili în fibroblastele migratoare (Wen și colab., 2004). Aceste descoperiri ridică posibilitatea ca APC să regleze activitatea + TIP-urilor, cum ar fi EB1, ca răspuns la semnale asociate cu evenimente celulare polarizate.

Interesant este că APC a fost implicat și în funcționarea corectă a fusului mitotic. APC localizează capetele plus ale kinetocore-microtubulilor în timpul mitozei, sugerând că poate influența stabilitatea sau atașarea microtubulilor și în acest context. În concordanță cu această ipoteză, celulele ES lipsite de APC de tip sălbatic și celulele care exprimă forme mutante de APC sunt susceptibile la erori de segregare a cromozomilor (Fodde și colab., 2001 Kaplan și colab., 2001 Green și Kaplan, 2003 Dikovskaya și colab., 2004 Louie și colab., 2004). Lucrări recente demonstrează că segregarea cromozomilor și erorile de poziționare a fusului se pot datora defectelor de atașare a microtubulului plus la capăt în celulele care exprimă forme mutante de APC (Green și Kaplan, 2003 Tighe și colab., 2004).Este posibil ca mutanții APC să afecteze capacitatea microtubulilor de a-și localiza situsul de legare, prin perturbarea dinamicii microtubulilor sau, alternativ, prin afectarea integrității situsului de legare. EB1 și APC au fost, de asemenea, implicate în poziționarea axului în eucariote superioare (Lu și colab., 2001 McCartney și colab., 2001 Yamashita și colab., 2003). Astfel, este rezonabil să presupunem că EB1 și APC pot coopera la microtubuli plus capete pentru a regla dinamica microtubulilor în timpul mitozei.

Anterior am arătat că o formă trunchiată de APC (APC 1-1450), similară cu proteina exprimată în multe tipuri de cancer colorectal, compromite în mod dominant atașamentele de microtubuli plus-end în timpul mitozei, rezultând un fus mitotic întrerupt și erori în segregarea cromozomilor. În acest articol investigăm baza moleculară care stă la baza acestui fenotip dominant. Găsim că inhibarea EB1 sau APC cauzează defecte remarcabil de similare cu cele observate în celulele care exprimă APC 1-1450. Inhibarea atât a EB1, cât și a APC nu are un efect aditiv argumentând că aceste proteine ​​funcționează împreună pentru a regla fusurile mitotice. Găsim că inhibarea fie a APC, fie a EB1 cauzează defecte de aliniere a cromozomilor, dar nu există oprire mitotică, inhibarea altor + TIPS are ca rezultat atât defecte de aliniere a cromozomilor, cât și un stop mitotic robust. În concordanță cu o relație funcțională între APC și EB1, descoperim că APC 1-1450 formează un hetero-oligomer cu APC endogen și că formarea acestui complex exclude asocierea EB1 cu APC. Imaginea în direct a cometelor EB1-GFP relevă o creștere semnificativă a frecvenței pauzelor în celulele care exprimă APC 1-1450. Împreună, aceste rezultate oferă dovezi convingătoare că APC reglează fusul mitotic prin EB1 în plus, mutațiile inițiante ale tumorii APC pot promova erorile de aliniere a cromozomilor, permițând în același timp diviziunea celulară, contribuind astfel la instabilitatea cromozomului în celulele tumorale.


Introducere

Diversitatea și complexitatea proteomilor celulari au condus la dezvoltarea unei game largi de protocoale pentru îmbunătățirea analizelor prin spectrometrie de masă (MS). În experimentele tradiționale ascendente, aceste metode sunt optimizate pentru a spori adâncimea acoperirii proteomei prin generarea de condiții favorabile digestiei proteolitice și recuperării probelor (León și colab, 2013 Tanca și colab, 2013) și au condus la cartografierea proteinelor aproape complete ale diferitelor linii celulare de mamifere (Beck și colab, 2011 Moghaddas Gholami și colab, 2013 Branca și colab, 2014). Cu toate acestea, performanța în experimentele proteomice scade abrupt atunci când cantitățile de proteine ​​sunt limitate, din cauza ineficiențelor legate de prelucrarea probelor și sensibilitatea instrumentului. Deși inovațiile recente în instrumentarea spectrometrică de masă au accelerat viteza și sensibilitatea analizei proteomei (Hebert și colab, 2014), se pot obține îmbunătățiri suplimentare prin sublinierea optimizării, simplificării și miniaturizării pregătirii eșantionului.

Pentru a îmbunătăți prelucrarea eșantionului, sunt adesea utilizați agenți care ajută la întreruperea și solubilizarea celulelor, cum ar fi detergenți și haotropi. Problematic, majoritatea acestor aditivi sunt incompatibili cu proteoliza și analiza MS și, prin urmare, necesită îndepărtarea utilizând ultrafiltrarea (Wisniewski și colab, 2009) și pe bază de mărgele (Bereman și colab, 2011 Hengel și colab, 2012) sau abordările de precipitații, fiecare dintre acestea sporind manevrabilitatea și pierderea ulterioară a materialului. Pe măsură ce proteomica bazată pe MS se îndreaptă spre analiza probelor rare și cantitative, fluxurile de lucru ultrasunete care elimină aceste pierderi sunt esențiale (Altelaar & Heck, 2012). Acest lucru a condus la dezvoltarea metodologiilor care reduc la minimum manipularea și promovează recuperarea ridicată a probelor (Ethier & Hou, 2006 Umar și colab, 2007 Waanders și colab, 2009 Wang și colab, 2010 Di Palma și colab, 2011 Wisniewski și colab, 2011a Soare și colab, 2013 Erde și colab, 2014 Kulak și colab, 2014 Zougman și colab, 2014). Cu toate acestea, aceste protocoale au o flexibilitate limitată din cauza mai multor neajunsuri, inclusiv incompatibilitățile reactivilor (detergenți, haotropi, săruri), utilizarea necesară a alternativelor de detergenți (de exemplu, amfipoli), restricțiile legate de volumul absolut al probei, debitul și manipularea excesivă. Ulterior, aceste fluxuri de lucru s-au limitat de obicei la prelucrarea cantităților absolute de material & gt 1 μg sau au obținut o acoperire proteomică redusă (

2.000 de proteine ​​totale) atunci când se examinează cantități sub-micrograme de proteine. Aceste dezavantaje au împiedicat în mare măsură utilizarea proteomicii în aplicații în care reproducerea, sensibilitatea și capacitatea ridicată sunt necesare, cum ar fi în studiile clinice sau screeningul populației.

Extinderea rapidă a secvențierii de generație următoare a determinat dezvoltarea unor metode susceptibile de pregătire a bibliotecii de genom cu capacitate ridicată, care sunt mult facilitate de aplicarea de margele paramagnetice în platformele manuale și robotizate (DeAngelis și colab, 1995 Wilkening și colab, 2013). Cu toate acestea, utilizarea perlelor paramagnetice nu este comună în proteomica generală, deși acestea au fost utilizate în aplicații specializate pentru cuplarea covalentă sau purificarea afinității proteinelor, proteoliza imobilizată (ventilator și colab, 2014) și pentru îmbogățirea peptidelor modificate post-translațional (Yeh și colab, 2012 Zeng și colab, 2012). Tehnologii recente bazate pe particule de nanodiamond au ilustrat epuizarea substanțelor contaminante și îmbunătățirea proteomicii specifice compartimentului (Chen și colab, 2006 Pham și colab, 2013). Bazându-se pe dezvoltările tehnologice pionierate de imobilizarea reversibilă în fază solidă (SPRI) (DeAngelis și colab, 1995) și tehnologiile nanodiamondului (Chen și colab, 2006), și cu scopul de a îmbunătăți și simplifica prelucrarea generică a probelor de proteomică, am dezvoltat SP3. SP3 este un nou flux de lucru proteomic cu un singur tub, care asigură o legare eficientă și imparțială a proteinelor și peptidelor, permițând finalizarea rapidă și eficientă a fluxurilor de lucru proteomice comune într-o manieră de mare viteză.

În acest studiu, SP3 se aplică la o varietate de aplicații convenționale și ultrasunete de proteomică. Pe baza observației că SP3 a furnizat o platformă îmbunătățită pentru manipularea cantităților de sub-micrograme de material determinate din celulele HeLa în profunzime proteomă, am aplicat SP3 pentru a examina dezvoltarea embrionară folosind Drosophila embrioni. În timp ce există o multitudine de date privind expresia genelor pentru Drosophila, dinamica proteomei sale în timpul dezvoltării a fost în centrul a relativ puține studii (Carmena, 2009). Cu o abordare bazată pe SP3, proteomul de aici este profilat la o adâncime de & gt 6.000 de proteine, dintre cele 18.000 proteine ​​prezise în Drosophila genom, de la embrioni grupați la 2-4 h (stadiile 5-7) și 10-12 h (stadiile 13-15) de dezvoltare. Această analiză a fost extinsă pentru a capta dinamica într-un ecran ultrasensibil la o rezoluție cu un singur embrion. Aceste date reprezintă cel mai mare catalog al Drosophila proteom de embrion până în prezent, oferind în același timp o sensibilitate de neegalat pentru comparații cantitative care au potențialul de a dezvălui varianța inter-individuală a proteomului. Mai mult decât atât, utilizarea SP3 în aceste studii ilustrează avantajele sale potențiale în alte domenii ale biologiei dezvoltării și clinice, unde este necesară o analiză cantitativă în profunzime reproductibilă pentru a explica variația interindividuală cu cantități de eșantion rare.


Excitabilitatea musculaturii scheletice

Nicholas Sperelakis,. Hugo Gonzalez-Serratos, în Cartea sursă de fiziologie celulară (ediția a patra), 2012

XIII Conducerea potențialului de acțiune

Când EPP, generat la joncțiunea neuromusculară, atinge pragul pentru obținerea unui AP în fibra musculară scheletică a vertebratelor, un AP se propagă în jos în fibra musculară în ambele direcții de la placa finală. (În unele fibre musculare, există o a doua placă de capăt inervată de un motoneuron care iese din măduva spinării la un alt nivel.) AP depășește (până la aproximativ +40 mV) și se propagă cu o viteză constantă de aproximativ 5 m / s peste sarcolema de suprafață. Propagarea are loc prin intermediul curenți de circuit local care însoțesc impulsul, așa cum sa discutat în capitolul 19. Cititorul este trimis la acel capitol pentru detalii despre curenți radiali (transmembranari) si curenți longitudinali (axiali). Curenții longitudinali externi pot utiliza întregul spațiu ISF (deoarece curentul ia calea celei mai mici rezistențe), permițând înregistrarea electromiogramei (EMG) de pe piele deasupra unui mușchi schelet activat. Amplitudinea potențialelor EMG devine mai mare atunci când sunt activate mai multe fibre din mușchi (însumarea fibrelor), din cauza însumării căderilor de tensiune IR produse de fiecare fibră activată simultan. Frecvența potențialelor EMG reflectă frecvența și asincronia activării mușchiului.

Fibrele musculare scheletice sunt formate din celule mioblaste care s-au contopit cap la cap pentru a deveni miotuburi multinucleate lungi și apoi fibre cilindrice mai târziu în dezvoltare. Se comportă ca niște cabluri semi-infinite. Adică, un AP se poate propaga de la un capăt la altul al fibrei, uniform și fără obstacole. Constanta spațiului sau lungimea constantă (λ) cablului de fibră este de aproximativ 1,5 mm pentru fibrele sartorius de broască (Sperelakis și colab., 1967) și de aproximativ 0,76 mm pentru mușchiul EDL de șobolan (Sellin și Sperelakis, 1978). Constanta de lungime este distanța pe care o tensiune aplicată într-o regiune s-ar descompune la 1 / e (1 / 2,717 = 0,368) sau 36,8% din valoarea inițială. Adică, într-un cablu pasiv, tensiunea se descompune exponențial cu o anumită constantă de lungime, dată de:

Unde VX este tensiunea la distanță X și Vo este tensiunea la origine (X = 0). λ este dat de:

Asumand ro (rezistența longitudinală exterioară) este neglijabil de mică în comparație cu reu (acest lucru ar fi adevărat pentru o fibră superficială într-un pachet cufundat într-o baie mare):

Unde rm (Ω · cm) și reu (Ω / cm) sunt rezistența membranei și rezistența longitudinală internă normalizată pentru lungimea unitară a fibrei, Rm (Ω · cm 2) este rezistența membranei normalizată atât pentru raza și lungimea fibrelor, Reu (Ω · cm) este rezistivitatea mioplasmei (normalizată pentru lungime și secțiune transversală) și A (cm) este raza fibrei. Rm este adesea numit vag rezistivitate cu membrană, dar acest lucru nu este corect deoarece pentru adevărata rezistivitate a membranei (ρm) trebuie să existe corecții pentru grosimea membranei δ:

Factorii care determină viteza activă de propagare (θα) includ intensitatea curentului circuitului local, potențialul de prag și proprietățile cablului pasiv, λ și τm. După cum sa discutat anterior, cu cât rata de creștere a AP-ului este mai mare, cu atât este mai mare intensitatea curentului circuitului local, deci cu atât este mai mare θα. Pe lângă dependența sa de densitatea canalelor rapide de Na + (determinant al conductanței maxime a Na +, g ¯ Na), proprietățile cinetice ale canalului de canalizare și potențialul de prag (Va), max dV / dt este determinat și de RP (sau potențialul de decolare) (legat de h impotriva Em curba), după cum sa discutat anterior (Fig. 42.9). În plus, deoarece răcirea scade activarea canalului Na (Q10≃3), max dV / dt și θα sunt încetinite în consecință. Rm este crescut prin răcire, Q10 pentru RK la fibre sartorius de broască fiind de aproximativ 2,8 (difuziunea ionică în soluție liberă are un Q10 de aproximativ 1,2) (Sperelakis, 1969). Pentru o descriere a conducției pasive, consultați Anexa III la acest capitol.

FIGURA 42.9. Reprezentarea grafică a ratei maxime de creștere a APl (max dV / dt) în funcție de odihnă Em sau potențial de decolare. Max dv / dt este o măsură a intensității curentului interior (capacitatea membranei fiind constantă), care depinde de numărul de canale disponibile pentru activare h este factorul de inactivare al lui Hodgkin – Huxley as gN / A = g ¯ Na m 3 h, unde gN / A este conductanța Na +, g ¯ Na este conductanța maximă și m și h sunt variabile h reprezintă h la t = ∞ sau starea de echilibru (practic, după 20 ms). Canalele rapide de Na + încep să se inactiveze la aproximativ -75 mV și inactivarea aproape completă are loc la aproximativ -30 mV (h scăzut). Prin urmare, max dV / dt scade deoarece h scade.


3. REZULTATE

3.1 Expresia la nivel înalt a TIR1 determină epuizarea independentă de auxină a proteinei țintă

În primul rând, am comparat tulpinile PADH1-701-TIR1 și PADH1-409-TIR1 care exprimă constitutiv TIR1 la niveluri ridicate sau scăzute, respectiv (Figura 1a, b). În acest scop, am marcat C-terminal factorul de îmbinare Prp22 cu o fuziune între un degron dependent de auxină trunchiat, numit AID * (Morawska & Ulrich, 2013) și șase repetări în tandem ale epitopului FLAG, în tulpinile PADH1-701-TIR1 și PADH1–409-TIR1. Pentru a măsura rata de epuizare a proteinelor țintă, am adăugat auxină (acid indol-3-acetic) la culturi (timp 0), iar probele au fost prelevate după 5, 15 și 30 de minute și au fost congelate rapid.

Cuantificarea proteinelor din probe (Figura 1b, c) arată că la momentul 0 (fără auxină), nivelurile de Prp22 erau cu 47% mai mici în PADH1-701-TIR1 decât în ​​PADH1-409-TIR1. Deoarece PADH1-701-TIR1 exprimă în mod constitutiv TIR1 la un nivel superior, acest lucru poate indica faptul că prea mult TIR1 poate provoca epuizarea necontrolată a proteinei țintă. De asemenea, rata de epuizare a Prp22 a fost mai mare în PADH1-701-TIR1 decât în ​​PADH1-409-TIR1. La 30 de minute după adăugarea de auxină, nivelurile de Prp22 scăzuseră sub 6% din valorile inițiale în PADH1-701-TIR1, comparativ cu 35% rămase în PADH1-409-TIR1, sugerând că nivelurile ridicate de TIR1 favorizează epuizarea mai rapidă.

Prin urmare, am creat o tulpină TIR1 inductibilă prin plasarea OsTIR1 genă sub controlul promotorului Z4EV (Z4EVpr). Acest lucru a fost făcut prin înlocuirea nonesențialului APE2 genă în tulpina YMN3 care exprimă Z4EV (McIsaac și colab., 2013) cu un Z4EVpr-OsTIR1-Casetă V5 (Figura 1a). Pentru a promova localizarea proteinei TIR1 către nucleu, unde se află țintele noastre proteice, am fuzionat un semnal de localizare nucleară SV40 (NLS) la TIR1-secvență de codificare. Tulpina rezultată, PZ4EV-NTIR1, produce proteină TIR1-V5 rapid după adăugarea de β-estradiol la mediul de cultură (Figura 1b), iar auxina a fost adăugată după preinducerea TIR1 timp de 30 de minute. În aceste condiții, Prp22 a fost epuizat rapid după adăugarea de auxină, fără epuizare detectabilă independentă de auxină (Figura 1b, c).

Apoi, pentru a testa ipoteza că nivelurile TIR1 se corelează invers cu nivelurile proteinei țintă în absența auxinei, o cultură a PZ4EV-NTIR1 cu AID * -6FLAG-etichetat PRP22 a fost incubat cu β-estradiol, dar fără auxină, iar nivelurile de Prp22 au fost măsurate în timp. În conformitate cu observația noastră anterioară, la 50 de minute de incubație a β-estradiolului, nivelul Prp22 a scăzut semnificativ și a atins 35% din valoarea inițială la 2 ore de incubație, timp în care proteina TIR1-V5 a fost bine indusă (Figura 2 ). Depleția independentă de auxină a lui Yhc1 și Rrp44 este prezentată în Figura S2 și a fost mai puțin pronunțată cu Rrp44 mai abundentă. Concluzionăm că nivelurile ridicate de TIR1 pot provoca epuizarea independentă de auxină a proteinei țintă în drojdia în devenire.

3.2 Rata de epuizare poate fi reglată prin modularea duratei preincubării β-estradiolului

Apoi, am investigat modul în care rata de epuizare indusă de auxină este influențată de lungimea preincubării β-estradiolului. Pe baza rezultatelor anterioare, am anticipat că nu numai timpi mai lungi de preincubare vor duce la epuizare mai rapidă, ci și epuizare mai independentă de auxină și că poate exista un timp optim de preincubare, care este probabil să fie specific țintei. Pentru a testa acest lucru, am folosit ca ținte pentru epuizare, Prp22 (232 copii / celulă), Prp2, un alt factor esențial de îmbinare cu abundență similară (211 copii / celulă) și enzima decapantă mai puternic exprimată, Dcp1 (4.189 copii / celulă Kulak , Pichler, Paron, Nagaraj și Mann, 2014). Am efectuat o analiză a epuizării timpului în care culturile acestor tulpini etichetate cu AID * au fost preincubate cu β-estradiol pentru momente diferite (20, 30, 40 sau 60 min) înainte de adăugarea de auxină. Probele au fost apoi luate pentru analiza proteinelor la intervale de 5 minute. Pe măsură ce nivelurile TIR1 cresc cu timpul de incubație a β-estradiolului, acest lucru ne-a permis să măsurăm relația dintre abundența TIR1 și rata de epuizare dependentă de auxină a diferitelor proteine ​​țintă.

Analiza cuantificării proteinelor (Figura 3), arată că diferite proteine ​​țintă au fost epuizate la viteze diferite. O preincubare de 20 de minute cu β-estradiol a fost suficientă pentru a reduce Prp22 și Prp2 la niveluri scăzute (≤ 20%) în termen de 15 minute de la adăugarea auxinei, dar preincubările mai lungi cu β-estradiol au dus la degradarea independentă de auxină. În schimb, Dcp1 mai abundent a necesitat 60 de minute de preincubare a β-estradiolului pentru a obține o epuizare similară rapidă și eficientă, deoarece mai multe proteine ​​Dcp1 trebuie degradate pentru a obține o epuizare eficientă din punct de vedere al procentului din cantitatea de pornire și acest lucru necesită în mod evident mai mult Proteina TIR1. În special, cu toate cele trei proteine ​​țintă, a existat o corelație directă între durata preincubării β-estradiolului și rata de epuizare, astfel încât durata tratamentului cu β-estradiol să fie optimizată pentru fiecare proteină țintă (vezi și Figura S2).

3.3 SIDA β-est codificată de plasmidă și efectul localizării proteinelor TIR1 asupra eficienței epuizării țintite

Pentru a facilita inserția componentelor AID β-est în drojdie în devenire, am construit o plasmidă centromerică, pZTRL, care conține P ACT1 -Z4EV și Z4EVp-OsTIR1 (fără NLS) casete de expresie (Figura 4a). Am testat apoi pZTRL și, în același timp, am investigat efectul fuzionării unui NLS cu TIR1 asupra eficienței epuizării unei proteine ​​nucleare. În acest scop, am măsurat atât nivelurile de proteine ​​țintă TIR1, cât și Prp22 în tulpina purtătoare de pZTRL și în două tulpini care conțin integrate genetic TIR1, cu (PZ4EV-NTIR1) sau fără (PZ4EV-TIR1) NLS pe ​​terminalul N al TIR1 (Figura 4b, c).

Am observat că nivelul proteinei TIR1 indus de β-estradiol a fost de aproximativ trei ori mai mare în genomică TIR1 (PZ4EV-TIR1) tulpină comparativ cu genomic NLS-TIR1 (PZ4EV-NTIR1) sau codificat cu plasmidă TIR1 tulpini, indicând asta TIR1 este mai bine exprimat atunci când este integrat din punct de vedere genetic și lipsește un NLS.Interesant este că Prp22, care este o proteină localizată nucleară, a fost epuizată rapid, indiferent de prezența sau absența NLS în capătul N-terminal al proteinei TIR1. Acest lucru sugerează că, pentru epuizarea proteinelor nucleare, nu trebuie adăugat un NLS SV40 la TIR1. În special, epuizarea țintită a fost mai lentă în tulpina TIR1 codificată cu plasmidă în comparație cu celelalte două tulpini, ajungând la 15% comparativ cu 2% din valorile inițiale ale Prp22 la 30 de minute după adăugarea auxinei, probabil datorită unei expresii mai mici a TIR1 în această tulpină.


Poate întoarce monedele să înlocuiască experimentele pe animale?

În loc să repete un experiment cu un model de boală de șoarece în laboratorul lor, cercetătorii din Berlin, Germania au folosit o aruncare de monede pentru a confirma dacă un medicament protejează creierul împotriva unui accident vascular cerebral, așa cum sa raportat în publicația lor publicată pe 9 aprilie în jurnalul cu acces liber PLOS Biology.

Cu acest experiment provocator și aparent absurd, Sophie Piper și colegii de la Institutul de Sănătate din Berlin (BIH) și Charit & eacute -Universit & aumltsmedizin Berlin expun drastic o problemă care afectează potențial multe studii de biomedicină experimentală. Dimensiunile mici ale eșantionului, adesea sub 10, și pragurile aproape universal slabe pentru acceptarea semnificației statistice (5%) conduc la o rată ridicată de rezultate fals pozitive și la o supraestimare a efectelor reale. Studiul lor avertizează cercetătorii că, contrar așteptărilor obișnuite, replicarea unui studiu - în condiții comune în multe laboratoare din întreaga lume - ar putea să nu adauge mai multe dovezi la ceea ce s-ar putea obține din aruncarea unei monede.

Multe domenii de cercetare se luptă cu ceea ce s-a numit „criza replicării”. Destul de des rezultatele unui laborator nu pot fi reproduse de către cercetătorii dintr-un alt laborator, ratele de replicare reușite scăzând adesea sub 50%. Acest lucru a scuturat încrederea în soliditatea întreprinderii științifice în general și a stimulat căutarea cauzelor care stau la baza acestora. În acest scop, mulți cercetători au început să repete experimente în laboratoarele lor ca parte integrantă a științei robuste și a bunei practici științifice. Cu toate acestea, în articolul lor, Piper și colegii săi examinează utilitatea replicării experimentelor în laboratoare și transmit un mesaj surprinzător de prudență cu privire la practicile actuale de replicare. Acestea oferă informații teoretice și practice detaliate despre cum să efectueze și să raporteze în mod corespunzător studii de replicare pentru a ajuta oamenii de știință să economisească resurse și să prevină utilizarea inutilă a animalelor, sporind în același timp robustețea și reproductibilitatea rezultatelor lor.

"Replicarea este fundamentală pentru procesul științific. Putem învăța din replicarea reușită și eșuată - dar numai dacă le proiectăm, executăm și raportăm corect", au spus autorii.


Dondorp AM, Nosten F, Yi P, Das D, Phyo AP, Tarning J, Lwin KM, Ariey F, Hanpithakpong W, Lee SJ, Ringwald P, Silamut K, Imwong M, Chotivanich K, Lim P, Herdman T, An SS , Yeung S, Singhasivanon P, Day NP, Lindegardh N, Socheat D, White NJ: Rezistența la artemisinină în malaria Plasmodium falciparum. N Engl J Med. 2009, 361 (5): 455-467. 10.1056 / NEJMoa0808859.

Baird JK: Rezistența la terapii pentru infecția cu Plasmodium vivax. Clin Microbiol Rev. 2009, 22 (3): 508-534. 10.1128 / CMR.00008-09.

Wellems TE, Panton LJ, Gluzman IY, do Rosario VE, Gwadz RW, Walker-Jonah A, Krogstad DJ: Rezistența la clorochină nu este legată de gene asemănătoare mdr într-o cruce Plasmodium falciparum. Natură. 1990, 345 (6272): 253-255. 10.1038 / 345253a0.

Fidock DA, Nomura T, Talley AK, Cooper RA, Dzekunov SM, Ferdig MT, Ursos LM, Sidhu AB, Naude B, Deitsch KW, Su XZ, Wootton JC, Roepe PD, Wellems TE: Mutații în vacuola digestivă P. falciparum proteina transmembranară PfCRT și dovezi pentru rolul lor în rezistența la clorochină. Mol Cell. 2000, 6 (4): 861-871. 10.1016 / S1097-2765 (05) 00077-8.

Sa JM, Twu O, Hayton K, Reyes S, Fay MP, Ringwald P, Wellems TE: Modele geografice de rezistență la medicamente Plasmodium falciparum, distincte prin răspunsuri diferențiale la amodiaquină și clorochină. Proc Natl Acad Sci SUA. 2009, 106 (45): 18883-18889. 10.1073 / pnas.0911317106.

Mu J, Myers RA, Jiang H, Liu S, Ricklefs S, Waisberg M, Chotivanich K, Wilairatana P, Krudsood S, White NJ, Udomsangpetch R, Cui L, Ho M, Ou F, Li H, Song J, Li G , Wang X, Seila S, Sokunthea S, Socheat D, Sturdevant DE, Porcella SF, Fairhurst RM, Wellems TE, Awadalla P, Su XZ: Plasmodium falciparum scanează la nivelul întregului genom pentru selecție pozitivă, puncte fierbinți de recombinare și rezistență la medicamente antimalarice. Nat Genet. 2010, 42 (3): 268-271. 10.1038 / ng.528.

MalariaGEN: O rețea globală pentru investigarea epidemiologiei genomice a malariei. Natură. 2008, 456 (7223): 732-737. 10.1038 / nature07632.

Mu J, Ferdig MT, Feng X, Joy DA, Duan J, Furuya T, Subramanian G, Aravind L, Cooper RA, Wootton JC, Xiong M, Su XZ: Transportori multipli asociați cu răspunsuri ale parazitului malariei la clorochină și chinină. Mol Microbiol. 2003, 49 (4): 977-989. 10.1046 / j.1365-2958.2003.03627.x.

Anderson TJ, Nair S, Qin H, Singlam S, Brockman A, Paiphun L, Nosten F: Sunt genele transportoare, altele decât locusul de rezistență la clorochină (pfcrt) și gena de rezistență la multe medicamente (pfmdr) asociate cu rezistența la medicamente antimalarice ?. Agenți antimicrobieni Chemother. 2005, 49 (6): 2180-2188. 10.1128 / AAC.49.6.2180-2188.2005.

Gardner MJ, Tettelin H, Carucci DJ, Cummings LM, Aravind L, Koonin EV, Shallom S, Mason T, Yu K, Fujii C, Pederson J, Shen K, Jing J, Aston C, Lai Z, Schwartz DC, Pertea M , Salzberg S, Zhou L, Sutton GG, Clayton R, White O, Smith HO, Fraser CM, Adams MD, Venter JC, Hoffman SL: secvența cromozomului 2 al parazitului malariei umane Plasmodium falciparum. Ştiinţă. 1998, 282 (5391): 1126-1132.

Pizzi E, Frontali C: Regiuni cu complexitate scăzută în proteinele Plasmodium falciparum. Genomul Res. 2001, 11 (2): 218-229. 10.1101 / gr.GR-1522R.

Brocchieri L: Regiuni cu complexitate scăzută în proteinele Plasmodium: în căutarea unei funcții. Genomul Res. 2001, 11 (2): 195-197. 10.1101 / gr.176401.

Xue HY, Forsdyke DR: Segmente de complexitate scăzută în proteinele Plasmodium falciparum sunt în primul rând adaptări ale nivelului de acid nucleic. Mol Biochem Parasitol. 2003, 128 (1): 21-32. 10.1016 / S0166-6851 (03) 00039-2.

Kimura M: Rata evolutivă la nivel molecular. Natură. 1968, 217 (5129): 624-626. 10.1038 / 217624a0.

Ohta T: substituții mutante ușor dăunătoare în evoluție. Natură. 1973, 246 (5428): 96-98. 10.1038 / 246096a0.

Hughes AL: Aproape neutralitate: marginea principală a teoriei neutre a evoluției moleculare. Ann N Y Acad Sci. 2008, 1133: 162-179. 10.1196 / annals.1438.001.

Koonin EV: evoluția darwiniană în lumina genomicii. Acizi nucleici Res. 2009, 37 (4): 1011-1034.

Jeffares DC, Pain A, Berry A, Cox AV, Stalker J, Ingle CE, Thomas A, Quail MA, Siebenthall K, Uhlemann AC, Kyes S, Krishna S, Newbold C, Dermitzakis ET, Berriman M: Variația genomului și evoluția parazitul malariei Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39 (1): 120-125. 10.1038 / ng1931.

Rich SM, Leendertz FH, Xu G, LeBreton M, Djoko CF, Aminake MN, Takang EE, Diffo JL, Pike BL, Rosenthal BM, Formenty P, Boesch C, Ayala FJ, Wolfe ND: Originea malariei maligne. Proc Natl Acad Sci SUA. 2009, 106 (35): 14902-14907. 10.1073 / pnas.0907740106.

Kryazhimskiy S, Plotkin JB: Genetica populației dN / dS. PLoS Genet. 2008, 4 (12): e1000304-10.1371 / journal.pgen.1000304.

Korsinczky M, Chen N, Kotecka B, Saul A, Rieckmann K, Cheng Q: Mutațiile în citocromul Plasmodium falciparum b care sunt asociate cu rezistența la atovaquone sunt situate la un loc presupus de legare a medicamentelor. Agenți antimicrobieni Chemother. 2000, 44 (8): 2100-2108. 10.1128 / AAC.44.8.2100-2108.2000.

Sidhu AB, Sun Q, Nkrumah LJ, Dunne MW, Sacchettini JC, Fidock DA: Studiile de eficacitate in vitro, selectarea rezistenței și modelarea structurală implică apicoplastul parazitului malariei ca țintă a azitromicinei. J Biol Chem. 2007, 282 (4): 2494-2504.

Rottmann M, McNamara C, Yeung BK, Lee MC, Zou B, Russell B, Seitz P, Plouffe DM, Dharia NV, Tan J, Cohen SB, Spencer KR, Gonzalez-Paez GE, Lakshminarayana SB, Goh A, Suwanarusk R, Jegla T, Schmitt EK, Beck HP, Brun R, Nosten F, Renia L, Dartois V, Keller TH, Fidock DA, Winzeler EA, Diagana TT: Spiroindolonele, o clasă de compuși puternici pentru tratamentul malariei. Ştiinţă. 2010, 329 (5996): 1175-1180. 10.1126 / science.1193225.

Kimura M: Timp mediu până la fixarea unei alele mutante într-o populație finită sub presiune mutațională continuă: Studii prin metode analitice, numerice și pseudo-eșantionare. Proc Natl Acad Sci SUA. 1980, 77 (1): 522-526. 10.1073 / pnas.77.1.522.

Carlton JM, Adams JH, Silva JC, Bidwell SL, Lorenzi H, Caler E, Crabtree J, Angiuoli SV, Merino EF, Amedeo P, Cheng Q, Coulson RM, Crabb BS, Del Portillo HA, Essien K, Feldblyum TV, Fernandez -Becerra C, Gilson PR, Gueye AH, Guo X, Kang'a S, Kooij TW, Korsinczky M, Meyer EV, Nene V, Paulsen I, White O, Ralph SA, Ren Q, Sargeant TJ și colab.: Genomică comparată al parazitului malar uman neglijat Plasmodium vivax. Natură. 2008, 455 (7214): 757-763. 10.1038 / nature07327.

DePristo MA, Zilversmit MM, Hartl DL: Despre abundență, compoziția aminoacizilor și dinamica evoluției regiunilor cu complexitate scăzută din proteine. Gene. 2006, 378: 19-30.

Zilversmit MM, Volkman SK, Depristo MA, Wirth DF, Awadalla P, Hartl DL: Regiuni cu complexitate redusă în Plasmodium falciparum: Link-uri lipsă în evoluția unui genom extrem. Mol Biol Evol. 2010

Nomura T, Carlton JM, Baird JK, del Portillo HA, Fryauff DJ, Rathore D, Fidock DA, Su X, Collins WE, McCutchan TF, Wootton JC, Wellems TE: Dovezi pentru diferite mecanisme de rezistență la clorochină în 2 specii de Plasmodium care cauzează malaria umană. J Infect Dis. 2001, 183 (11): 1653-1661. 10.1086 / 320707.

Cowman AF, Morry MJ, Biggs BA, Cross GA, Foote SJ: Modificări ale aminoacizilor legate de rezistența la pirimetamină în gena dihidrofolat reductază-timidilat sintază a Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci SUA. 1988, 85 (23): 9109-9113. 10.1073 / pnas.85.23.9109.

Triglia T, Cowman AF: Structura primară și expresia genei dihidropteroate sintetaze a Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci SUA. 1994, 91 (15): 7149-7153. 10.1073 / pnas.91.15.7149.

Ng PC, Henikoff S: Prezicerea substituțiilor de aminoacizi dăunătoare. Genomul Res. 2001, 11 (5): 863-874. 10.1101 / gr.176601.

Sunyaev S, Ramensky V, Koch I, Lathe W, Kondrashov AS, Bork P: Predicția alelelor umane dăunătoare. Hum Mol Genet. 2001, 10 (6): 591-597. 10.1093 / hmg / 10.6.591.

Thomas PD, Campbell MJ, Kejariwal A, Mi H, Karlak B, Daverman R, Diemer K, Muruganujan A, Narechania A: PANTHER: o bibliotecă de familii de proteine ​​și subfamilii indexate după funcție. Genomul Res. 2003, 13 (9): 2129-2141. 10.1101 / gr.772403.

Jambou R, Martinelli A, Pinto J, Gribaldo S, Legrand E, Niang M, Kim N, Pharath L, Volnay B, Ekala MT, Bouchier C, Fandeur T, Berzosa P, Benito A, Ferreira ID, Ferreira C, Vieira PP , Alecrim MG, Mercereau-Puijalon O, Cravo P: Structurarea geografică a diversității genice a reticulului plasmic Plasmodium falciparum sarco (endo) Ca2 + ATPaza (PfSERCA). Plus unu. 2010, 5 (2): e9424-10.1371 / journal.pone.0009424.

Dharia NV, Bright AT, Westenberger SJ, Barnes SW, Batalov S, Kuhen K, Borboa R, Federe GC, McClean CM, Vinetz JM, Neyra V, Llanos-Cuentas A, Barnwell JW, Walker JR, Winzeler EA: Whole-genome secvențierea și analiza microarray a Plasmodium vivax ex vivo dezvăluie o presiune selectivă asupra genelor putabile de rezistență la medicamente. Proc Natl Acad Sci SUA. 2010, 107 (46): 20045-20050. 10.1073 / pnas.1003776107.

Weedall GD, Conway DJ: Detectarea semnăturilor de selecție echilibrată pentru a identifica țintele imunității antiparazitare. Trends Parasitol. 2010, 26 (7): 363-369. 10.1016 / j.pt.2010.04.002.

Su X, Kirkman LA, Fujioka H, ​​Wellems TE: Polimorfismele complexe într-o proteină de aproximativ 330 kDa sunt legate de P. falciparum rezistent la clorochine în Asia de Sud-Est și Africa. Celula. 1997, 91 (5): 593-603. 10.1016 / S0092-8674 (00) 80447-X.

Ferdig MT, Cooper RA, Mu J, Deng B, Joy DA, Su XZ, Wellems TE: Disecarea locurilor rezistenței la chinină la nivel scăzut în paraziții malariei. Mol Microbiol. 2004, 52 (4): 985-997. 10.1111 / j.1365-2958.2004.04035.x.

Prugnolle F, McGee K, Keebler J, Awadalla P: Selecția modelează genomii malariei și determină divergența dintre agenții patogeni care infectează hominidii versus rozătoarele. BMC Evol Biol. 2008, 8: 223-10.1186 / 1471-2148-8-223.

Krief S, Escalante AA, Pacheco MA, Mugisha L, Andre C, Halbwax M, Fischer A, Krief JM, Kasenene JM, Crandfield M, Cornejo OE, Chavatte JM, Lin C, Letourneur F, Gruner AC, McCutchan TF, Renia L , Snounou G: Despre diversitatea paraziților malariei la maimuțele africane și originea Plasmodium falciparum din Bonobos. PLoS Pathog. 2010, 6 (2): e1000765-10.1371 / journal.ppat.1000765.

Liu W, Li Y, Learn GH, Rudicell RS, Robertson JD, Keele BF, Ndjango JB, Sanz CM, Morgan DB, Locatelli S, Gonder MK, Kranzusch PJ, Walsh PD, Delaporte E, Mpoudi-Ngole E, Georgiev AV, Muller MN, Shaw GM, Peeters M, Sharp PM, Rayner JC, Hahn BH: Originea parazitului malariei umane Plasmodium falciparum la gorile. Natură. 2010, 467 (7314): 420-425. 10.1038 / nature09442.

King JL, Jukes TH: Evoluție non-darwiniană. Ştiinţă. 1969, 164 (881): 788-798. 10.1126 / science.164.3881.788.

Scherf A, Petersen C, Carter R, Alano P, Nelson R, Aikawa M, Mattei D, da Silva LP, Leech J: Caracterizarea unui mutant Plasmodium falciparium care a șters majoritatea locusului Pf11-1 specific gametocitului. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1992, 87 (Supliment 3): 91-94.

Bozdech Z, Llinas M, Pulliam BL, Wong ED, Zhu J, DeRisi JL: Transcriptomul ciclului de dezvoltare intraeritrocitară a Plasmodium falciparum. PLoS Biol. 2003, 1 (1): E5-

Le Roch KG, Zhou Y, Blair PL, Grainger M, Moch JK, Haynes JD, De La Vega P, Holder AA, Batalov S, Carucci DJ, Winzeler EA: Descoperirea funcției genetice prin profilarea expresiei ciclului de viață al parazitului malariei. Ştiinţă. 2003, 301 (5639): 1503-1508. 10.1126 / science.1087025.

Volkman SK, Sabeti PC, DeCaprio D, Neafsey DE, Schaffner SF, Milner DA, Daily JP, Sarr O, Ndiaye D, Ndir O, Mboup S, Duraisingh MT, Lukens A, Derr A, Stange-Thomann N, Wagoner S, Onofrio R, Ziaugra L, Mauceli E, Gnerre S, Jaffe DB, Zainoun J, Wiegand RC, Birren BW, Hartl DL, Galagan JE, Lander ES, Wirth DF: O hartă a diversității genomului în Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39 (1): 113-119. 10.1038 / ng1930.

Mu J, Awadalla P, Duan J, McGee KM, Keebler J, Seydel K, McVean GA, Su XZ: Variația la nivelul genomului și identificarea țintelor vaccinului în genomul Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39 (1): 126-130. 10.1038 / ng1924.

Hartl DL, Volkman SK, Nielsen KM, Barry AE, Day KP, Wirth DF, Winzeler EA: Genetica populației paradoxale a Plasmodium falciparum. Trends Parasitol. 2002, 18 (6): 266-272. 10.1016 / S1471-4922 (02) 02268-7.

Nei M, Gojobori T: Metode simple pentru estimarea numărului de substituții de nucleotide sinonime și nesinonime. Mol Biol Evol. 1986, 3 (5): 418-426.

Mu J, Duan J, Makova KD, Joy DA, Huynh CQ, Branch OH, Li WH, Su XZ: SNPs la nivel cromozomial dezvăluie o origine antică pentru Plasmodium falciparum. Natură. 2002, 418 (6895): 323-326. 10.1038 / nature00836.

Li WH: Estimare imparțială a ratelor de substituție sinonimă și nesinonimă. J Mol Evol. 1993, 36 (1): 96-99. 10.1007 / BF02407308.

Wootton JC: Domenii non-globulare în secvențe de proteine: segmentare automată folosind măsuri de complexitate. Comput Chem. 1994, 18 (3): 269-285. 10.1016 / 0097-8485 (94) 85023-2.

Sala N, Karras M, Raine JD, Carlton JM, Kooij TW, Berriman M, Florens L, Janssen CS, Pain A, Christophides GK, James K, Rutherford K, Harris B, Harris D, Churcher C, Quail MA, Ormond D , Doggett J, Trueman HE, Mendoza J, Bidwell SL, Rajandream MA, Carucci DJ, Yates JR, Kafatos FC, Janse CJ, Barrell B, Turner CM, Waters AP, Sinden RE: Un studiu cuprinzător al ciclului de viață al Plasmodium pe genomic , analize transcriptomice și proteomice. Ştiinţă. 2005, 307 (5706): 82-86. 10.1126 / science.1103717.

Tanabe K, Zakeri S, Palacpac NM, Afsharpad M, Randrianarivelojosia M, Kaneko A, Marma AS, Horii T, Mita T: Mutații spontane în genul sarcoplasmic / retoplasm endoplasmic Plasmodium falciparum Ca2 + -ATPase (parazit PfATP6) printre populațiile răspândite geografic la terapii combinate bazate pe artemisinină. Agenți antimicrobieni Chemother. 2011, 55 (1): 94-100. 10.1128 / AAC.01156-10.

Dahlstrom S, Veiga MI, Ferreira P, Martensson A, Kaneko A, Andersson B, Bjorkman A, Gil JP: Diversity of the sarco / endoplasmic reticulum Ca (2 +) - ATPase orthologue of Plasmodium falciparum (PfATP6). Infectează Genet Evol. 2008, 8 (3): 340-345. 10.1016 / j.meegid.2008.02.002.

Gama BE, de Oliveira NK, de Souza JM, Santos F, de Carvalho LJ, Melo YF, Rosenthal PJ, Daniel-Ribeiro CT, Ferreira-da-Cruz Mde F: izolate brazilian Plasmodium falciparum: investigarea polimorfismelor candidate pentru rezistența la artemisinină înainte introducerea terapiei combinate pe bază de artemisinină. Malar J. 2010, 9: 355-10.1186 / 1475-2875-9-355.

Eshetu T, Berens-Riha N, Fekadu S, Tadesse Z, Gurkov R, Holscher M, Loscher T, Miranda IB: Diferite modele de mutație ale Plasmodium falciparum în rândul pacienților din spitalul universitar Jimma, Etiopia. Malar J. 2010, 9: 226-10.1186 / 1475-2875-9-226.

Tahar R, Ringwald P, Basco LK: Epidemiologia moleculară a malariei în Camerun. XXVIII. Activitatea in vitro a dihidroartemisininei împotriva izolatelor clinice ale Plasmodium falciparum și analiza secvenței genei ATPase 6 a P. falciparum. Sunt J Trop Med Hyg. 2009, 81 (1): 13-18.

Bertaux L, Quang le H, Sinou V, Thanh NX, Parzy D: Noi mutații PfATP6 găsite în izolatele Plasmodium falciparum din Vietnam. Agenți antimicrobieni Chemother. 2009, 53 (10): 4570-4571. 10.1128 / AAC.00684-09.

Imwong M, Dondorp AM, Nosten F, Yi P, Mungthin M, Hanchana S, Das D, Phyo AP, Lwin KM, Pukrittayakamee S, Lee SJ, Saisung S, Koecharoen K, Nguon C, Day NP, Socheat D, White NJ : Explorarea contribuției genelor candidate la rezistența la artemisinină în Plasmodium falciparum. Agenți antimicrobieni Chemother. 2010, 54 (7): 2886-2892. 10.1128 / AAC.00032-10.

Bacon DJ, McCollum AM, Griffing SM, Salas C, Soberon V, Santolalla M, Haley R, Tsukayama P, Lucas C, Escalante AA, Udhayakumar V: Dinamica modelelor de rezistență la medicamente împotriva malariei în regiunea bazinului Amazonului după modificările tratamentului național peruvian politica pentru malaria necomplicată. Agenți antimicrobieni Chemother. 2009, 53 (5): 2042-2051. 10.1128 / AAC.01677-08.

Ibrahim ML, Khim N, Adam HH, Ariey F, Duchemin JB: Polimorfismul PfATPase în Niger: detectarea a trei noi mutații punctuale. Malar J. 2009, 8: 28-10.1186 / 1475-2875-8-28.

Menegon M, Sannella AR, Majori G, Severini C: Detectarea unor mutații punctuale noi în gena candidată Plasmodium falciparum ATPase6 pentru rezistență la artemisinine. Parasitol Int. 2008, 57 (2): 233-235. 10.1016 / j.parint.2007.12.004.


Abstract

Obiectiv- Studiile anterioare sugerează că proteina șocului termic (HSP) 60 are un rol contributiv în dezvoltarea aterosclerozei. Am examinat dacă proteina HSP70 circulantă și anticorpii anti-HSP70 sunt asociați cu boala coronariană (CAD).

Metode și rezultate— Au fost testate probe de sânge de la 421 pacienți (62% bărbați, vârstă medie 57 de ani) evaluate pentru CAD prin angiografie coronariană. HSP70 seric a fost detectabil la 67% din subiecții studiați cu niveluri cuprinse între 0,2 și 27,1 ng / ml (medie, 1,08 mediană, 0,5). Nivelurile HSP70 au fost mai mari la pacienții non-CAD decât pacienții cu CAD (mediană, 0,72 față de 0,34 P= 0,0006). Persoanele cu niveluri de HSP70 peste mediana (0,5 ng / ml) au avut jumătate din riscul de CAD decât persoanele cu niveluri sub mediana (raport de cote ajustat, limită de încredere 0,52 95%, 0,32-0,86). Asocierea nivelurilor ridicate de HSP70 cu un risc CAD redus a fost independentă de factorii de risc tradiționali CAD (P= 0,011). Severitatea bolii (numărul vaselor bolnave) a fost, de asemenea, invers asociată cu nivelurile de proteine ​​HSP70 (P= 0,010). Raportul de probabilitate ajustat al bolii multivesoare la pacienții cu niveluri ridicate de proteine ​​HSP70 a fost de 0,54 (limită de încredere de 95%, 0,36-0,81). În schimb, nu s-a găsit nicio asociere între seropozitivitatea anti-HSP70 IgG și prevalența CAD (P=0.916).

Concluzii - Aceste date oferă primele dovezi că nivelurile ridicate de HSP70 uman sunt asociate cu riscul redus de CAD, probabil prin efectele sale multiple de protecție asupra răspunsului unei celule la stres.

Proteinele de șoc termic (HSP) constituie o familie numeroasă de proteine ​​care ajută la răspunsul unei celule la stresul acut. Importanța acestor proteine ​​este evidentă prin faptul că sunt omniprezente și foarte conservate la nivelul speciilor. Deși HSP-urile sunt în principal molecule intracelulare, atunci când sunt supraexprimate ca răspuns la stres, ele pot fi transportate și să locuiască în membrana celulară, unde pot fi recunoscute de sistemul de supraveghere imună și funcționează ca autoantigene. De asemenea, pot fi eliberate din celule în sânge și au activitate biologică. 1,2 Astfel, atunci când sunt supraexprimate, HSP-urile pot evoca alte răspunsuri decât cele asociate cu localizarea lor intracelulară, iar aceste răspunsuri pot avea potențial de consecințe dăunătoare. De exemplu, nivelurile serice ale HSP60 au fost semnificativ crescute la subiecții cu ateroscleroză carotidă prevalentă / incidentă, precum și la pacienții cu hipertensiune la limită. S-a raportat că 3,4 anticorpi împotriva HSP60 sunt asociați atât cu prezența, cât și cu severitatea bolii coronariene semnificative clinic (CAD). 5

Dovezile experimentale sugerează un rol cardioprotector al unui alt membru al acestei familii, HSP70, în mai multe exemple de stres miocardic acut. 6-8 De exemplu, inimile șoarecilor transgenici care supraexprimă HSP70 prezintă o rezistență sporită la leziunile ischemice. 8 Deoarece anticorpii la HSP70 au fost detectați, la fel ca la HSP60, acest lucru crește posibilitatea ca HSP70 să declanșeze răspunsuri autoimune care ar putea atenua orice efect celular intrinsec benefic sau, ca răspunsul la HSP60, poate chiar exacerba dezvoltarea aterosclerozei. Cu toate acestea, sunt disponibile date experimentale sau clinice limitate cu privire la efectele HSP70 asupra aterogenezei.

Scopul prezentei investigații a fost să stabilească dacă există asocieri între expresia HSP70 și aterogeneză. Mai exact, am stabilit dacă proteina HSP70 circulantă și anticorpii anti-HSP70 sunt asociați cu CAD.

Metode

Subiecte

Patru sute douăzeci și unu de persoane, în cadrul unui protocol aprobat de Institutul Național de Sănătate, aprobat de Consiliul de revizuire instituțională, au intrat în studiu. Cohorta de studiu a constat din indivizi cu dureri toracice sau cu teste neinvazive compatibile cu ischemia miocardică care au fost îndrumați pentru angiografie coronariană. Toți participanții au fost supuși examinării clinice și evaluării expunerii curente și anterioare la factorii de risc tradiționali ai CAD, așa cum s-a descris anterior. 5 Un pacient a fost definit ca având CAD dacă există dovezi angiografice de ateroscleroză (≥50% stenoză a cel puțin 1 arteră coronariană majoră prin angiografie coronariană). Pacienții cu boli cardiace valvulare semnificative sau cardiomiopatie nonaterosclerotică au fost excluși. Niciun pacient internat în studiu nu a avut un infarct miocardic în ultimele 3 luni.

Proteine ​​serice HSP70 și anticorpi anti-HSP70

Probele de ser au fost obținute de la subiecții studiați înainte de momentul angiografiei coronariene. Probele au fost înghețate la -80 ° C, iar alicote au fost decongelate numai la efectuarea testelor specifice. Nivelurile serice de proteine ​​HSP70 au fost determinate folosind kituri ELISA disponibile comercial (StressGen Biotechnologies Corp). Concentrațiile de proteină HSP70 au fost determinate prin comparație cu o curbă standard în funcție de direcția producătorului. Curba standard are un interval de la 0,78 la 50 ng / mL, iar sensibilitatea testului este de 0,2 ng / mL.

Anticorpii IgG împotriva HSP70 umană au fost determinați prin ELISA. Nouăzeci și șase de plăci de microtitrare au fost acoperite cu 5 μg / ml HSP70 recombinant (StressGen Biotechnologies Corp) în 100 μL tampon carb / bicarb (pH 9,6) per godeu la 4 ° C peste noapte. După spălare cu tampon de spălare (Wampole) și blocare cu 3% BSA în PBS la temperatura camerei timp de 3 ore, plăcile au fost incubate cu 100 μL probe de ser diluate în diluant seric (Wampole) la 1 din 50 la temperatura camerei timp de 1 oră. După o spălare suplimentară, plăcile au fost incubate cu IgG anti-uman capră conjugată cu hrean-peroxidază diluată 1 din 10 000 cu PBS. După spălare, în godeuri s-au adăugat 100 μL soluție de cromogen / substrat conținând tetrametilbenzidină (Wampole). Absorbanța la 450 nm a fost măsurată după 10 minute după adăugarea soluției de oprire (Wampole). După corectarea absorbției de fundal, o probă de ser a fost considerată pozitivă pentru anticorpii împotriva HSP70 uman dacă densitatea optică a depășit o valoare limită definită prospectiv de 0,60. Această valoare limită este calculată din valorile absorbantei de control negative și pozitive.

Nivelurile proteinelor reactive C serice

Proteina C reactivă serică (CRP) a fost măsurată prin tehnologia imunologică de polarizare a fluorescenței (FPIA) (analizor TDxFLEx, laboratorul Abbott). Folosind acest test, 95% dintre indivizii sănătoși (n = 202) au avut un nivel CRP de ≤0,5 mg / dL și 98% au avut niveluri ≤1,0 mg / dL, respectiv, în serurile lor. Coeficientul de variație între teste al acestui test (n = 31) a fost de 4,3% și 2,2% la niveluri medii de 1,10 și respectiv 2,94 mg / dL.

Analize statistice

Datele distribuite în mod normal sunt prezentate ca medie și deviație standard (SD), în timp ce datele distribuite în mod normal sunt prezentate ca intervalul median și intercuartil (IQR). Comparații între punctele finale au fost făcute folosind t testați distribuțiile parametrice și Mann-Whitney U test pentru distribuții neparametrice. Datele categorice au fost analizate prin testul χ 2 sau testul exact al lui Fisher pentru probe mici. Toate testele au fost pe două fețe. Variabilele dihotomice care indică prezența și severitatea CAD au fost modelate în funcție de alți factori folosind regresia logistică multiplă. Odds ratio (OR) a fost utilizat ca o măsură a prezenței și severității CAD la pacienții cu un anumit factor de risc comparativ cu cei fără acel factor sau ca factor multiplicativ pentru fiecare creștere a unității în vârstă sau niveluri HSP70. Covariabilele luate în considerare au fost vârsta, sexul masculin, fumatul, diabetul, hipercolesterolemia, hipertensiunea (factori de risc tradiționali CAD), CRP seric, proteina HSP70 și nivelurile de anticorpi anti-HSP70. Toate covariabilele au fost examinate ca predictori ai prezenței și severității CAD în analizele univariate și ca grup într-un singur model multivariant.

Rezultate

Caracteristicile pacienților

Un total de 421 subiecți au fost studiați 62% au fost bărbați și 72% au fost albi, cu vârste cuprinse între 30 și 82 de ani (medie, 57,3 mediană, 57,0 ani). Au existat 258 (61%) cu dovezi angiografice de CAD (≥50% stenoză a cel puțin 1 arteră coronariană majoră prin angiografie coronariană). Cu excepția hipertensiunii arteriale, factorii de risc tradiționali ai CAD (vârstă, sex masculin, diabet și hipercolesterolemie) au fost asociați în mod semnificativ cu riscul de CAD, atât prin analize univariate, cât și multivariate. Fumatul a fost semnificativ asociat cu CAD prin analiza univariată, dar nu și analiza multivariată (Tabelul 1).

TABEL 1. Asocierea prezenței CAD cu factorii de risc tradiționali

Relația dintre proteina HSP70 și anticorpii HSP70 cu riscul CAD

Proteina serică HSP70 a fost detectabilă la 283 din 421 (67%) subiecți din studiu, cu niveluri cuprinse între 0,2 și 27,1 ng / ml (medie, 1,08 mediană, 0,5 ng / ml). Nivelurile de proteine ​​HSP70 au fost mai mari la pacienții non-CAD decât pacienții cu CAD (mediană, 0,72 și IQR, 1,42 versus mediană, 0,34 și IQR, 1,21 ng / ml P= 0,001). În plus, grupul cu nivel înalt HSP70 (peste valoarea mediană & gt0.5 ng / ml) conținea 51% pacienți CAD, în timp ce grupul scăzut HSP70 avea 71% pacienți CAD (P& lt0.001). Analiza de regresie logistică multivariată a arătat că persoanele cu niveluri ridicate de HSP70 au avut jumătate din riscul de CAD decât persoanele cu niveluri scăzute (OR ajustat, limită de încredere de 0,52 95% [CL], 0,32-0,86). Asocierea nivelului ridicat HSP70 cu riscul de CAD scăzut a fost independentă de factorii tradiționali de risc CAD (P=0.011).

Figura 1 prezintă efectele proteinei HSP70 asupra riscului CAD în fiecare grup de concentrație de proteine ​​HSP70 (afișat prin quartila HSP70). Persoanele din cea mai înaltă quartilă a nivelurilor HSP70 (& gt75th) au avut cu 59% mai puțin risc CAD comparativ cu cele din cea mai mică quartilă (25). RUP cu 95% CL de risc CAD asociat cu concentrația de proteină HSP70 egală sau mai mare decât percentilele 25, 50, 75 și 90 ale distribuției martor au fost 0,42 (0,26 până la 0,66), 0,46 (0,28 până 0,75), 0,44 ( 0,24 la 0,79) și, respectiv, 0,38 (0,17 la 0,85). Ajustarea pentru factorii de risc tradiționali CAD nu a avut niciun impact asupra reducerii riscului. A existat neliniaritatea relației dintre concentrația de proteină HSP70 și reducerea riscului CAD. Spre deosebire de proteina HSP70, anticorpii anti-HSP70 umani au fost detectați la doar 34% dintre subiecții studiați. Nu s-a constatat nicio diferență în prevalența seropozitivității anti-HSP70 între pacienții cu CAD și non-CAD (34,2% versus 33,71%, respectiv P=0.916).

Figura 1. SAU cu 95% CL pentru CAD în grupul individual de concentrație de proteine ​​HSP70 care este afișat prin quartila HSP70.

Relația dintre proteina HSP70 și anticorpii HSP70 cu severitatea CAD

O asociere similară a nivelurilor de proteine ​​HSP70 care scad sub cea mediană (& gt0,5 ng / ml) a fost, de asemenea, observată cu severitatea bolii, după cum a fost evaluat prin numărul de vase bolnave (Figura 2). Nivelurile de proteine ​​HSP70 peste mediană au fost legate de o severitate mai mică a CAD (P pentru tendință = 0,01). OR ajustat al bolii cu mai multe nave la pacienții cu niveluri ridicate de HSP70 a fost de 0,54 (95% CL, 0,36 - 0,81 P= 0,003). Cu toate acestea, nu a existat nicio asociere între anticorpii anti-HSP70 și severitatea CAD (P=0.264).

Figura 2. Prevalența severității CAD în raport cu nivelul proteinei HSP70. Un pacient a fost definit ca având CAD de 1, 2, 3 sau fără vas pe baza documentației angiografice a stenozei ≥50% a fiecăreia dintre cele 3 artere coronare majore. Datele sunt prezentate de la 395 de pacienți la care au fost disponibile date despre numărul total de nave bolnave. *P& lt0.01 atunci când se compară grupurile cu mai multe nave din grupurile HSP70 scăzute versus cele ridicate utilizând un test univariat.

Relația dintre proteina HSP70 și anticorpii HSP70 cu factorii de risc tradiționali CAD

Asocierea proteinei HSP70 cu factorii de risc CAD este prezentată în Tabelul 2. Nivelurile ridicate de proteină HSP70 nu au fost asociate cu sexul masculin, fumatul, diabetul, hipercolesterolemia sau hipertensiunea arterială atât pe analiza univariată cât și pe cea multivariantă (toate P& gt0.05). Deși proteina HSP70 a fost asociată semnificativ cu vârsta, nivelul scăzut de proteină HSP70 la pacienții cu CAD a fost independent de vârstă. Nu s-a găsit nicio asociere între prezența anticorpilor HSP70 și factorii de risc CAD (toate P& gt0.05, datele nu sunt afișate).

TABEL 2. Asocierea nivelurilor HSP70 cu factorii de risc tradiționali CAD

Relația dintre proteina HSP70 și anticorpii HSP70 cu inflamația

Nivelul mediu al CRP a fost de 0,84 ± 0,04 la indivizii cu nivel ridicat de proteină HSP70 și 0,90 ± 0,05 mg / dL ± SE în grupul de proteine ​​scăzut HSP70 (P= 0,361). Nivelul mediu al CRP a fost de 0,88 ± 0,05 la persoanele cu seropozitivitate anti-HSP70 și de 0,87 ± 0,04 mg / dL ± SE în seronegativitatea anti-HSP70 (P= 0,905). Nu a fost observată nicio corelație între nivelurile CRP și nivelurile de proteină HSP70 sau prezența anticorpilor HSP70 (ambele P& gt0.05).

Discuţie

HSP-urile sunt proteine ​​intracelulare abundente, împărțite în familii diferite în funcție de greutatea lor moleculară. Acestea se găsesc atât în ​​organismele procariote, cât și în cele eucariote și sunt extrem de conservate, iar funcția lor principală pare să fie aceea de chaperoni, implicați în plierea și transportul proteinelor. 1,2

HSP70 este unul dintre cele mai studiate HSP-uri. Cu stres, HSP70 se translocează în nucleu și se asociază cu nucleoli. 9,10 Împărtășește multe dintre funcțiile clasei HSP și, în plus, pare să protejeze împotriva leziunilor ischemice. Studiile au demonstrat că expunerea inimilor de animale izolate la stres termic sau ischemic induce expresia HSP70, 11 și studiile ulterioare 12,13 au arătat că expunerea prealabilă a întregului corp la căldură, care are ca rezultat creșterea nivelului de HSP70, îmbunătățește recuperarea inimilor animalelor din ischemie -leziune provocată. Dovezi mai convingătoare ale rolului protector al HSP70 în leziunile provocate de ischemie au fost găsite în studiile genetice. Acestea au demonstrat că supraexprimarea HSP70 în celulele cardiace primare cultivate protejează aceste celule împotriva stresului termic sau ischemic, în timp ce supraexprimarea HSP56 și HSP60 nu are un astfel de efect protector. 14-16 Studiile au constatat, de asemenea, că inimile șoarecilor transgenici care supraexprimă HSP70 sunt mai rezistente la leziunile ischemice. 17-20

Datorită efectelor protectoare cunoscute ale HSP-urilor, dar posibilității ca HSP-urile să conducă pe termen lung, prin dezvoltarea autoanticorpilor, la boli cronice (așa cum s-a demonstrat pentru HSP60), 1,2 a fost efectuată prezenta investigație. Am căutat să determinăm dacă proteina HSP70 circulantă și anticorpii anti-HSP70 sunt asociați cu CAD.

În studiul nostru, serul HSP70 a fost detectabil la aproape 70% din subiecții studiați. Cel mai interesant, a fost semnificativ mai mare la pacienții non-CAD decât la pacienții cu CAD, o asociație independentă de factorii de risc tradiționali. Mai mult, severitatea bolii, evaluată prin numărul de vase bolnave, a fost, de asemenea, invers asociată cu nivelurile HSP70. În contrast, anticorpii împotriva HSP70 au fost prezenți la doar o treime din subiecții studiați și nu a existat nicio asociere între anticorpii împotriva HSP70 și CAD.

Mecanismele responsabile pentru relația inversă dintre nivelurile serice HSP70 și CAD sunt, în acest moment, conjecturale. Nivelurile serice crescute pot exercita efecte biologice importante. De exemplu, HSP70 administrat exogen declanșează cascade de semnalizare proinflamatoare mediate la suprafața celulei care duc la exprimarea citokinelor inflamatorii multiple. 21,22 Cu toate acestea, această activitate ar fi de așteptat să exercite mai degrabă efecte proaterosclerotice decât antiaterosclerotice. De relevanță, concentrațiile extracelulare de HSP70 necesare pentru a exercita efecte de semnalizare sunt cu aproximativ 2 ordine de mărime mai mari decât concentrațiile serice pe care le-am măsurat în această investigație. Prin urmare, credem că asociațiile inverse pe care le-am găsit între nivelurile serice de HSP70 și CAD rezultă cel mai probabil din efectele intracelulare ale moleculei, nivelurile serice pe care le-am măsurat reflectând probabil, într-un mod aproximativ, nivelurile intracelulare.

Cele mai evidente mecanisme de protecție intracelulară derivă din efectele primare de acțiune de clasă-celulă ale HSP-urilor, care au efecte largi asupra proteinelor intracelulare. Alte acțiuni ar putea fi derivate din această funcție sau ar putea reprezenta activități independente ale HSP70. De exemplu, Suzuki și colab 23 au demonstrat că HSP72 (o proteină majoră din familia HSP70) îmbunătățește activitatea superoxidului dismutazei de mangan. Această enzimă păstrează funcția mitocondrială și limitează apoptoza legată de mitocondrie în timpul leziunii ischemiei miocardice-reperfuzie. Ethridge et al 24 au găsit o relație inversă între nivelurile intracelulare ale HSP70 și activitatea COX-2, o enzimă proinflamatorie majoră. Deși s-a demonstrat că această relație derivă din expresia HSP70 care inhibă COX-2, s-a sugerat, de asemenea, că această relație reciprocă face parte dintr-o buclă de feedback negativă. Dacă da, atunci acesta reprezintă un important efect antiinflamator al HSP70. Important, Shimizu și colab. 25 au demonstrat la șobolani că HSP70 formează complexe cu niveluri inhibitoare de κBα și atenuează activarea factorului nuclear-κB. Deoarece factorul nuclear-κB într-un factor cheie de transcripție care modulează expresia genelor proinflamatorii, aceasta este o altă activitate antiinflamatorie cheie a HSP70.

Constatările disparate legate de asocierea la CAD a HSP60 versus HSP70 sunt interesante de luat în considerare. Anticorpii anti-HSP60 sunt frecvenți în populație și s-a demonstrat că sunt asociați cu dezvoltarea aterosclerozei. 1,26,27 Nivelurile serice crescute ale proteinei HSP60 s-au dovedit a fi legate de ateroscleroză. 3,4 În schimb, anticorpii anti-HSP70 crescuti sunt relativ neobișnuiți. 28,29 În acest moment nu se știe de ce un HSP are capacitatea de a provoca un răspuns autoimun și de a predispune la CAD, în timp ce altul nu.

De asemenea, trebuie subliniat faptul că Pockley și colab. 30 au raportat, spre deosebire de constatările noastre, că 20 de pacienți cu boală vasculară periferică și 13 cu boală vasculară renală au avut niveluri crescute de HSP70 circulant în comparație cu controalele potrivite pentru vârstă și sex. În aceste studii, a existat o gamă foarte mare de concentrații HSP70 (0 până la 74 550 ng / ml la pacienții cu boală vasculară periferică și 0 până la 1960 ng / ml la martori). Am studiat 421 de pacienți și am constatat că asocierea dintre nivelurile mai ridicate de HSP70 și prevalența mai mică a severității CAD și CAD a persistat (OR ajustat, 0,52 CL 95%, 0,32-0,86) după ajustarea pentru factorii de risc tradiționali CAD (vârstă, sex masculin, fumat, diabet, hipercolesterolemie și hipertensiune). Astfel, rezultatele disparate dintre studiul nostru și cel al lui Pockley și colab pot fi legate de tipul de pacient studiat, testul utilizat pentru a cuantifica nivelurile HSP70 și ajustările datelor incluse în fiecare dintre studii. În plus, Schett și colab 31 au constatat că leziunea miocardică duce la eliberarea HSP60 și la suprimarea răspunsului imun anti-HSP65.Astfel de rezultate sugerează că diferențele de niveluri ale anticorpilor circulanți HSP70 sau HSP70 la pacienții non-CAD și CAD ar putea fi atribuibili unei consecințe a formării complexului imunitar. Un astfel de mecanism posibil ar fi un subiect foarte demn de investigație viitoare.

Pe scurt, această investigație oferă primele dovezi că nivelurile ridicate de HSP70 uman, reflectate de nivelurile serice crescute, sunt asociate cu riscul scăzut de CAD, probabil prin multiplele sale efecte intracelulare de protecție asupra răspunsului unei celule la stres. Rezultatele acestui studiu sugerează că nivelul seric al proteinei HSP70 este un marker puternic pentru susceptibilitatea redusă a CAD și poate fi util, împreună cu alți factori de risc recunoscuți în prezent, pentru a transmite mai precis riscul general al unei persoane pentru CAD.


Alte variabile

Pe baza rezultatelor viziunii pe termen lung, AmBisyon2040, datele au arătat că 79,2 la sută dintre filipinezi își doresc doar o viață simplă și confortabilă în 25 de ani. Doar 3,9 la sută dintre filipinezi și-au dorit să aibă viața celor bogați.

Indicatorii-eșantion sub Matatag includ întrebarea filipinezilor dacă sunt capabili să petreacă suficient timp cu familia și prietenii, în timp ce cei sub Maginhawa pot include, printre altele, incidența foamei, diversitatea dietei și plecarea în vacanțe. Indicatorii din Panatag includ cei care se referă la securitate și siguranță, inclusiv economii.

„Acest lucru va da procentul celor care consideră că se bucură de viața matatag, maginhawa și panatag [stabilă, confortabilă și sigură] pe care și-o doresc”, a spus Edillon. „Da, acest lucru poate răspunde la întrebarea despre dezbaterea„ decentă ”când vine vorba de incidența sărăciei bazată pe FIES, deoarece pe baza sondajului din 2016, această [AmBisyon] este viața pe care o dorim.”

Edillon a spus că Neda a făcut deja testul pentru măsura AmBisyon. Studiul pilot a fost deja realizat la nivel național, dar a avut doar 5.000 de respondenți. Ea a spus că a fost un exercițiu destinat pilotării chestionarului, astfel încât numerele obținute din sondaj nu au fost definitive.

Ea speră că, odată cu aprobarea și semnarea bugetului 2019 de luni, guvernul poate efectua sondajul de bază la nivel național pentru AmBisyon în cursul anului. Neda va licita proiectul unei terțe părți, mai probabil o instituție de cercetare, pentru a efectua sondajul.