Informație

Care este mecanismul responsabil de „întârzierea” în canalele de potasiu redresoare întârziate?


Am încercat să găsesc o explicație cuprinzătoare cu privire la natura „întârzierii” în canalele de potasiu redresoare întârziate ale neuronilor. După cum este scris în introducerea mea în manualul de neuroștiințe, aceste canale sunt închise la tensiune și se activează atunci când membrana neuronală tipică atinge un potențial electric de aprox. -40mV. În timp ce canalul este activat în acest moment, acesta se deschide numai după o perioadă întârziată de aproximativ 1 ms.

În principal încerc să clarific că nu este o confuzie în redactare și că redresoarele întârziate nu sunt de fapt activate atunci când membrana interioară atinge o sarcină de aproximativ + 40mV care ar fi corelată (cel puțin în exemplele de manuale) cu „ 1 ms întârziere ', dar cauzată de încărcarea de fapt tipică observată la aproximativ 1 ms de întârziere în timpul unui potențial de acțiune.

Multumesc mult. Anunță-mă dacă pot clarifica ceva. Știu că acest lucru nu a fost neapărat atât de bine întrebat


Aceste canale răspund lent. După depolarizare sunt activate, dar numai după un timp relativ lung. Cinetica lor de închidere este, de asemenea, relativ lentă. O definiție este dată aici.


Epilepsie și anomalii neurocomportamentale la șoareci cu o variantă patogenă KCNB1 dominant-negativă

Encefalopatiile de dezvoltare și epileptice (DEE) sunt un grup de epilepsii severe care se prezintă de obicei cu convulsii intratabile, întârziere în dezvoltare și au adesea un risc crescut de mortalitate prematură. Numeroase gene au fost identificate ca fiind o cauză monogenă a DEE, inclusiv KCNB1. Canalul K de potasiu cu tensiuneV2.1, codificat de KCNB1, este în primul rând responsabil pentru curenții întârziați de potasiu, care sunt regulatori importanți ai excitabilității în celulele excitabile electric, inclusiv neuronii. În plus față de rolul său canonic de conductanță de potasiu cu tensiune, KV2.1 îndeplinește, de asemenea, o funcție structurală extrem de conservată, care organizează joncțiunile endoplasmatice reticulum-membrană plasmatică grupate în soma și dendritele proximale ale neuronilor. Varianta patogenă de novo KCNB1-p.G379R a fost identificată la un sugar cu spasme epileptice și convulsii atonice, focale și tonico-clonice care au fost refractare la tratamentul cu medicamente antiepileptice standard. Lucrările anterioare au demonstrat deficite în conductanța potasiului, dar nu au evaluat funcțiile neconductoare. Pentru a determina dacă varianta G379R a afectat KV2.1 gruparea la joncțiunile endoplasmatice reticul-membrană plasmatică, KV2.1-G379R a fost exprimat în celule HEK293T. KVExpresia 2.1-G379R nu a indus formarea de joncțiuni endoplasmatice reticul-membrană plasmatică și coexprimarea KV2.1-G379R cu KV2.1-inducția redusă de tip sălbatic a acestor structuri în raport cu KV2.1-WT singur, în concordanță cu un efect negativ dominant. Pentru a modela această variantă in vivo, am introdus Kcnb1 G379R la șoareci folosind editarea genomului CRISPR / Cas9. Am caracterizat expresia neuronală, fenotipurile neurologice și neurocomportamentale ale șoarecilor Kcnb1 G379R / + (Kcnb1 R / +) și Kcnb1 G379R / G379R (Kcnb1 R / R). Studiile de imunohistochimie pe creierele de la șoareci Kcnb1 + / +, Kcnb1 R / + și Kcnb1 R / R au relevat diferențe dependente de genotip în nivelurile de expresie ale KV2.1 proteine, precum și K asociateV2.2 și proteine ​​AMIGO-1. Șoarecii Kcnb1 R / + și Kcnb1 R / R au prezentat hiperactivitate profundă, comportamente repetitive, impulsivitate și anxietate redusă. Au fost observate convulsii spontane la șoareci Kcnb1 R / R, precum și convulsii induse de expunerea la medii noi și / sau manipulare. Atât mutanții Kcnb1 R / +, cât și mutanții Kcnb1 R / R au fost mai susceptibili la convulsiile induse de proconvulsivant. În plus, atât șoarecii Kcnb1 R / + cât și șoarecii Kcnb1 R / R au prezentat activitate EEG interictală anormală, inclusiv vârf izolat și unde lente. În general, șoarecii Kcnb1 G379R recapitulează multe caracteristici observate la indivizii cu DEE datorită variantelor patogene din KCNB1. Acest nou model de șoarece de DEE asociat KCNB1 va fi valoros pentru îmbunătățirea înțelegerii fiziopatologiei de bază și va oferi un instrument valoros pentru dezvoltarea terapiilor pentru tratarea acestui DEE farmacorezistent.

Cuvinte cheie: Tulburare din spectrul autist Tulburare de dezvoltare Encefalopatie Epilepsie K (V) 2.1 Canale ionice cu tensiune Canalele cu potasiu cu tensiune.

Copyright © 2020 Autorul (autorii). Publicat de Elsevier Inc. Toate drepturile rezervate.

Declarație privind conflictul de interese

Declarația de interes concurent

Cifre

Generarea și caracterizarea moleculară a ...

Generarea și caracterizarea moleculară a Kcnb1 G379R Șoareci. A) Localizarea glicinei-379 în ...

Mutația G379R perturbă K v ...

Mutația G379R perturbă K v 2.1 recrutarea mediată a VAPA la joncțiunile ER-PM în ...

Expresia de Kcnb1 transcriere și ...

Expresia de Kcnb1 transcriere și K v 2.1 proteine ​​în Kcnb1 G379R și…

Imunomarcarea lui K v 2 canale complexe în Kcnb1 G379R secțiunile creierului și ...

Anomalii EEG Ictal în Kcnb1 ...

Anomalii EEG Ictal în Kcnb1 Șoareci G379R. A) Urme reprezentative ale EEG din Kcnb1 ...

Anomalii EEG interietale în Kcnb1 ...

Anomalii EEG interietale în Kcnb1 Șoareci G379R. A – C) Urme reprezentative ale EEG din WT, ...

Fenotipuri neurologice și neurocomportamentale în ...

Fenotipuri neurologice și neurocomportamentale în Kcnb1 G379R și Kcnb1 fs / + șoareci. A)…


INTRODUCERE

Canalele de potasiu dependente de tensiune au patru subunități, fiecare conținând un senzor de tensiune (MacKinnon 1991). Aceasta a concentrat atenția asupra modului în care cei patru senzori de tensiune separați sunt cuplați la deschiderea canalului (revizuită de Bezanilla și Stefani 1994 Sigworth 1993). Modelul original Hodgkin și Huxley (1952) pentru conductanța redusă întârziată a potasiului axonului de calamar a propus că senzorii de tensiune sunt identici și acționează independent, iar canalul este deschis dacă și numai dacă toți cei patru senzori de tensiune sunt în poziția activată. Formalismul Hodgkin-Huxley rămâne utilizat pe scară largă pentru a descrie cinetica curenților ionici pentru modele de activitate electrică neuronală.

Cu toate acestea, studiile asupra canalelor de potasiu clonate, exprimate în sisteme heteroloage, au furnizat dovezi ample pentru caracteristicile porții care nu pot fi descrise de modelele Hodgkin-Huxley (Koren și colab. 1990 Sigworth 1993 Stefani și colab. 1994 Zagotta și Aldrich 1990 Zagotta și colab. 1994a ). În special, deschiderea canalului pare să implice mai mult decât mișcarea senzorului de tensiune. Cele mai recente modele necesită activarea tuturor celor patru senzori de tensiune înainte de deschiderea canalului (Sigworth 1993 Stefani și colab. 1994 Zagotta și colab. 1994a). Un mecanism alternativ, bazat pe modelul clasic Monod-Wyman – Changeux (MWC) pentru proteinele alosterice (Monod și colab. 1965), este acela că canalele se pot deschide cu orice număr de senzori de tensiune activați, dar activarea fiecărui senzor de tensiune favorizează deschiderea canalului cu o cantitate fixă ​​de energie (Marks și Jones 1992). O interpretare fizică este că mișcarea senzorului de tensiune este o schimbare conformațională locală în cadrul unei subunități, iar deschiderea canalului este o tranziție concertată care implică întreaga proteină a canalului.

Este important să testați aceste idei despre canalizarea canalelor pe canalele native exprimate efectiv în neuroni. Raportăm aici un studiu al cineticii de activare a redresorului întârziat al neuronilor simpatici de broască. Curenții de potasiu au fost studiați pe larg în aceste celule, iar procedurile pentru izolarea redresorului întârziat sunt bine stabilite (Adams și colab. 1982a Goh și colab. 1989, 1992 Lancaster și Pennefather 1987). Aceste celule rotunde, izopotențiale, permit clemă de tensiune a celulei de înaltă calitate. În special, cinetica redresorului întârziat poate fi studiată cu precizie pe o gamă largă de tensiune, deoarece constantele de timp sunt & gt1 ms de la -100 la +100 mV. Acest lucru este important, deoarece comportamentul constantelor de viteză la tensiuni extreme poate fi crucial pentru distingerea modelelor (Chen și Hess 1990 Koren și colab. 1990).

Am comparat patru clase de modele cinetice: modele MWC, modele Hodgkin și Huxley (1952), modele bazate pe Zagotta și Aldrich (1990) și Koren și colab. (1990) și un model C-C-C-O cu constante de rată arbitrare. Criteriile statistice obiective (Horn 1987), în combinație cu unele considerații calitative, au favorizat o versiune a modelului MWC în care singura stare care conduce efectiv ioni este starea „deschisă” cu toți cei patru senzori de tensiune activi (McCormack și colab. 1994). Date la tensiuni puternic depolarizate, în special observarea unei limitări pdeschis = 0,8 din analiza zgomotului în patch-urile atașate la celule, au fost critice în discriminarea între modele. Mulți dintre parametrii din modelul preferat (numit aici MWC-O4) au fost similare cu cele utilizate anterior pentru a descrie cinetica canalului de calciu (Marks și Jones 1992), dar tranziția imediată închis-deschis a fost mult mai lentă pentru canalul de potasiu.


Β1-Autoanticorpii adrenoceptorilor afectează acțiunea Durată potențială și întârzierea redresării curenților de potasiu la cobai

β1-Autoanticorpi adrenoceptor (β1-AAs) afectează durata potențială de acțiune (DAP) în cardiomiocite și sunt legate de aritmii ventriculare. Curentul de potasiu redresat întârziat (Eu K) joacă un rol crucial în APD, dar efectele β1-Ca mai departe Eu K nu au fost complet iluminate. Această lucrare a avut ca scop observarea efectelor β1-Ca mai departe Eu K și APD și explorează în continuare mecanismele β1-Aritmii ventriculare mediate de AA. β1-AA au fost obținute din serurile pacienților cu boală coronariană (CHD) și tahicardie ventriculară nedurată. Cu tehnica de prindere a patch-urilor cu celule întregi, potențialele de acțiune și Eu K au fost înregistrate. Rezultatele au ilustrat 0,1 μmol / L β1-AAs scurtat APD la 50% (APD50) și 90% (APD90) a repolarizării. Cu toate acestea, la 0,01 μmol / L, β1-AA nu a avut efecte asupra niciunui APD90 sau APD50 (P & gt 0,05). La 0,001 μmol / L, β1-AA ca APD prelungit semnificativ90 și APD50. Mai mult, β1-AAs (0,001, 0,01, 0,1 μmol / L) a crescut în funcție de doză curentul de potasiu rectificator întârziat cu activare rapidă (Eu Kr), dar în mod similar a scăzut curentul de potasiu redresat cu activare lentă (Eu Ks) și creșterea curenților de calciu de tip L la diferite concentrații. Luate împreună, EuCreșterea Kr indusă de concentrații mari de β1-AA este responsabilă pentru o reducere semnificativă a APD care ar contribui la modificări de repolarizare și ar declanșa aritmiile ventriculare maligne la pacienții cu CHD.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin instituția dvs.


Canalele de potasiu funcționează pentru a conduce ionii de potasiu în josul gradientului lor electrochimic, făcând acest lucru atât rapid (până la viteza de difuzie a ionilor K + în apă în vrac), cât și selectiv (excluzând, în special, sodiul, în ciuda diferenței sub-angstrom în raza ionică). [4] Din punct de vedere biologic, aceste canale acționează pentru a seta sau a reseta potențialul de repaus în multe celule. În celulele excitabile, cum ar fi neuronii, contracurentul întârziat al ionilor de potasiu formează potențialul de acțiune.

Contribuind la reglarea duratei potențiale de acțiune cardiacă în mușchiul cardiac, funcționarea defectuoasă a canalelor de potasiu poate provoca aritmii care pun viața în pericol. Canalele de potasiu pot fi, de asemenea, implicate în menținerea tonusului vascular.

De asemenea, reglează procesele celulare precum secreția de hormoni (de exemplu., eliberarea de insulină din celulele beta din pancreas), astfel încât funcționarea defectuoasă a acestora poate duce la boli (cum ar fi diabetul).

Unele toxine, cum ar fi dendrotoxina, sunt puternice deoarece blochează canalele de potasiu. [5]

Există patru clase majore de canale de potasiu:

    - deschise ca răspuns la prezența ionilor de calciu sau a altor molecule de semnalizare. - trece curentul (sarcina pozitivă) mai ușor în direcția interioară (în celulă). - sunt deschise constitutiv sau posedă o activare bazală ridicată, cum ar fi „canalele de potasiu în repaus” sau „canalele de scurgere” care stabilesc potențialul de membrană negativ al neuronilor. - sunt canale ionice cu tensiune care se deschid sau se închid ca răspuns la modificările tensiunii transmembranare.

Următorul tabel conține o comparație a principalelor clase de canale de potasiu cu exemple reprezentative (pentru o listă completă a canalelor din fiecare clasă, consultați paginile clasei respective).

Pentru mai multe exemple de modulatori farmacologici ai canalelor de potasiu, consultați blocantul canalelor de potasiu și deschizătorul de canale de potasiu.

  • inhibiție ca răspuns la creșterea calciului intracelular
    , [7][8][9][6][10][11][6]
  • Unele tipuri de dendrotoxină din veninul șarpelui mamba, [6]
  • BKCa-specific
      [12][13]
    • 1-EBIO
    • NS309
    • CyPPA
    • BKCa-specific:
      (Kir1.1)
    • reciclarea și secreția potasiului în nefroni
    • Neselectiv:
      • Ba 2+, [14]
      • Cs + [15]
        (Kir3.x)
      • mediază efectul inhibitor al multor GPCR
        [16][17][18][19][20][6][21][14]
        [22]
        (Kir6.x)
      • închideți atunci când ATP este ridicat pentru a promova secreția de insulină
        [este necesară citarea] [este necesară citarea] [este necesară citarea] [23][6] [este necesară citarea] [este necesară citarea] [24] [este necesară citarea] [este necesară citarea]
      • TWIK (TWIK-1, TWIK-2, KCNK7) [25] [26]
      • TREK (TREK-1, TREK-2, TRAAK [27]) [25] [26]
      • TASK (TASK-1, TASK-3, TASK-5) [25] [26]
      • TALK (TASK-2, [28] TALK-1, TALK-2) [25] [26]
      • THIK (THIK-1, THIK-2) [25] [26] [25] [26] [29] [30]
      • Contribuie la potențialul de odihnă
        [31][32][33][34][32][35][36][37][38][39] [este necesară citarea] [40][40]
      • Modulat de agoniști și antagoniști GPCR, [6]
      • Fără blocanți selectivi, [6]
        [32][41][42]
      • Anestezice volatile, de ex. Izofluran [6]
      • Modulat de agoniști și antagoniști GPCR, [6]
        (Kv11.1) (Kv7.1)
        repolarizare
      • limitează frecvența potențialelor de acțiune (tulburările provoacă aritmie)
        [43][44][6][45][46][47][6]
      • hERG (KCNH2, Kv11.1) -specific:
          [este necesară citarea] [48] [este necesară citarea]
        • [este necesară citarea]
        • KCNQ (Kv7) -specific: (Kv7) [49]

        Canalele de potasiu au o structură tetramerică în care patru subunități proteice identice se asociază pentru a forma o simetrică de patru ori (C4) complex aranjat în jurul unui por care conduce ionul central (adică un homotetramer). Alternativ, patru subunități proteice asociate dar nu identice se pot asocia pentru a forma complexe heterotetramerice cu pseudo C4 simetrie. Toate subunitățile canalelor de potasiu au o structură distinctivă a buclei porilor care acoperă partea superioară a porului și este responsabilă de permeabilitatea selectivă a potasiului.

        Există peste 80 de gene de mamifere care codifică subunitățile canalelor de potasiu. Cu toate acestea, canalele de potasiu găsite în bacterii sunt printre cele mai studiate canale ionice, în ceea ce privește structura lor moleculară. Folosind cristalografia cu raze X, [50] [51] au fost obținute informații profunde despre modul în care ionii de potasiu trec prin aceste canale și de ce ionii de sodiu (mai mici) nu. [52] Premiul Nobel pentru chimie din 2003 a fost acordat lui Rod MacKinnon pentru munca sa de pionierat în acest domeniu. [53]

        Filtru selectivitate Editare

        Canalele ionice de potasiu îndepărtează învelișul de hidratare din ion atunci când intră în filtrul de selectivitate. Filtrul de selectivitate este format dintr-o secvență de cinci reziduuri, TVGYG, denumită secvența de semnătură, în fiecare dintre cele patru subunități. Această secvență de semnătură se află într-o buclă între helica porilor și TM2 / 6, denumită în mod istoric bucla P. Această secvență de semnătură este foarte conservată, cu excepția faptului că un reziduu de valină în canalele procariote de potasiu este adesea substituit cu un reziduu de izoleucină în canalele eucariote. Această secvență adoptă o structură unică a lanțului principal, similară structural cu motivul structural al proteinei cuibului. Cele patru seturi de atomi de oxigen carbonil electronegativ sunt aliniate spre centrul porului filtrului și formează un anti-prismă pătrat similar cu o coajă de solvatare a apei în jurul fiecărui situs de legare a potasiului. Distanța dintre oxigenii carbonil și ionii de potasiu în locurile de legare ale filtrului de selectivitate este aceeași cu cea dintre oxigenii de apă din prima coajă de hidratare și un ion de potasiu în soluție de apă, oferind o cale favorabilă din punct de vedere energetic pentru de-solvatarea ionilor . Cu toate acestea, ionii de sodiu sunt prea mici pentru a umple spațiul dintre atomii de carbonil oxigen. Astfel, este favorabil din punct de vedere energetic ca ionii de sodiu să rămână legați de moleculele de apă în spațiul extracelular, mai degrabă decât să treacă prin porii ionici selectivi ai potasiului. [55] Această lățime pare să fie menținută prin legarea hidrogenului și forțele van der Waals într-o foaie de reziduuri de aminoacizi aromatici care înconjoară filtrul de selectivitate. [50] [56] Filtrul de selectivitate se deschide spre soluția extracelulară, expunând patru carboniloxigeni într-un reziduu de glicină (Gly79 în KcsA). Următorul reziduu către partea extracelulară a proteinei este Asp80 încărcat negativ (KcsA). Acest reziduu împreună cu cele cinci reziduuri de filtru formează porul care leagă cavitatea plină de apă din centrul proteinei cu soluția extracelulară. [57]

        Mecanism de selectivitate Edit

        Mecanismul selectivității canalelor de potasiu rămâne în dezbatere continuă. Oxigenii carbonilici sunt puternic electro-negativi și atrăgători de cationi. Filtrul poate găzdui ioni de potasiu în 4 locuri de obicei etichetate S1 până la S4 începând de la partea extracelulară. În plus, un ion se poate lega în cavitate la un loc numit SC sau unul sau mai mulți ioni de la partea extracelulară la site-uri mai mult sau mai puțin bine definite numite S0 sau Sext. Sunt posibile mai multe ocupații diferite ale acestor site-uri. Deoarece structurile de raze X sunt medii peste multe molecule, nu este totuși posibil să se deducă ocupările reale direct dintr-o astfel de structură. În general, există un dezavantaj datorat repulsiei electrostatice de a avea două situri învecinate ocupate de ioni. Propunerile pentru mecanismul selectivității au fost făcute pe baza simulărilor de dinamică moleculară, [58] modele de jucărie de legare a ionilor, [59] calcule termodinamice, [60] considerații topologice, [61] [62] și diferențe structurale [63] între selective și canale neselective.

        Mecanismul pentru translocarea ionilor în KcsA a fost studiat pe larg prin calcule teoretice și simulare. [57] [64] Predicția unui mecanism de conducere a ionilor în care cele două stări dublu ocupate (S1, S3) și (S2, S4) joacă un rol esențial a fost afirmată de ambele tehnici. Simulările dinamicii moleculare (MD) sugerează cele două stări extracelulare, Sext și S0, reflectând ionii care intră și ies din filtru, sunt, de asemenea, actori importanți în conducerea ionilor.

        Regiune hidrofobă Edit

        Această regiune este utilizată pentru a neutraliza mediul din jurul ionului de potasiu, astfel încât să nu fie atras de nicio sarcină. La rândul său, accelerează reacția.

        Editați cavitatea centrală

        Un por central, lat de 10 Å, este situat lângă centrul canalului transmembranar, unde bariera energetică este cea mai mare pentru ionul transversal datorită hidrofobiei peretelui canalului. Cavitatea umplută cu apă și capătul polar C al helicilor porilor ușurează bariera energetică pentru ion. Repulsia prin precedarea mai multor ioni de potasiu se crede că ajută la debitul ionilor. Prezența cavității poate fi înțeleasă intuitiv ca unul dintre mecanismele canalului pentru depășirea barierei dielectrice sau repulsie de către membrana cu dielectricitate scăzută, prin păstrarea ionului K + într-un mediu apos, cu dielectricitate ridicată.

        Fluxul de ioni prin porul canalului de potasiu este reglat de două procese conexe, denumite gating și inactivare. Gating este deschiderea sau închiderea canalului ca răspuns la stimuli, în timp ce inactivarea este oprirea rapidă a curentului dintr-un canal de potasiu deschis și suprimarea capacității canalului de a relua conducerea. În timp ce ambele procese servesc la reglarea conductanței canalului, fiecare proces poate fi mediat de o serie de mecanisme.

        În general, gating-ul este considerat a fi mediat de domenii structurale suplimentare care detectează stimuli și, la rândul lor, deschid porii canalului. Aceste domenii includ domeniile RCK ale canalelor BK, [65] [66] [67] și domeniile senzorilor de tensiune ale canalelor K + cu tensiune. Se crede că aceste domenii răspund stimulilor prin deschiderea fizică a porții intracelulare a domeniului porilor, permițând astfel ionilor de potasiu să traverseze membrana. Unele canale au mai multe domenii de reglare sau proteine ​​accesorii, care pot acționa pentru a modula răspunsul la stimul. În timp ce mecanismele continuă să fie dezbătute, există structuri cunoscute ale mai multor domenii de reglementare, inclusiv domeniile RCK ale canalelor procariote [68] [69] [70] și eucariote [65] [66] [67], domeniu de control al pH-ului din KcsA, [71] domenii de închidere a nucleotidelor ciclice, [72] și canale de potasiu închise în tensiune. [73] [74]

        Inactivarea de tip N este de obicei mecanismul de inactivare mai rapid și este denumită modelul "bilă și lanț". [75] Inactivarea de tip N implică interacțiunea capătului N-terminal al canalului sau a unei proteine ​​asociate, care interacționează cu domeniul porilor și închide calea de conducere a ionilor ca o „bilă”. Alternativ, se crede că inactivarea de tip C are loc în interiorul filtrului de selectivitate în sine, unde modificările structurale din filtru îl fac neconductiv. Există o serie de modele structurale ale filtrelor de canal K + inactivate de tip C, [76] [77] [78], deși mecanismul precis rămâne neclar.

        Editare blocante

        Blocanții canalelor de potasiu inhibă fluxul ionilor de potasiu prin canal. Acestea fie concurează cu legarea potasiului în cadrul filtrului de selectivitate, fie se leagă în afara filtrului pentru a exclude conducerea ionică. Un exemplu al unuia dintre acești concurenți este ionii de amoniu cuaternari, care se leagă la fața extracelulară [79] [80] sau la cavitatea centrală a canalului. [81] Pentru blocarea din cavitatea centrală, ionii de amoniu cuaternar sunt, de asemenea, cunoscuți ca blocanți de canal deschis, deoarece legarea necesită în mod clasic deschiderea prealabilă a porții citoplasmatice. [82]

        Ionii de bariu pot bloca, de asemenea, curenții canalului de potasiu, [83] [84] prin legarea cu afinitate ridicată în filtrul de selectivitate. [85] [86] [87] [88] Se consideră că această legare strânsă stă la baza toxicității bariului prin inhibarea activității canalului de potasiu în celulele excitabile.

        Medicamente blocante ale canalelor de potasiu, cum ar fi 4-aminopiridina și 3,4-diaminopiridina, au fost investigate pentru tratamentul unor afecțiuni precum scleroza multiplă. [89] Efectele medicamentelor care nu pot fi vizate pot duce la sindromul QT lung indus de medicamente, o afecțiune care poate pune viața în pericol. Acest lucru se datorează cel mai frecvent acțiunii asupra canalului hERG de potasiu din inimă. În consecință, toate medicamentele noi sunt testate preclinic pentru siguranța cardiacă.

        Activatori Edit

        Unele tipuri de canale de potasiu sunt activate de receptorii muscarinici și acestea sunt numite canale muscarinice de potasiu (EuKACh). Aceste canale sunt un heterotetramer compus din două subunități GIRK1 și două GIRK4. [90] [91] Exemplele sunt canalele de potasiu din inimă, care, atunci când sunt activate de semnale parasimpatice prin receptorii muscarinici M2, provoacă un curent exterior de potasiu, care încetinește ritmul cardiac. [92] [93]

        Roderick MacKinnon a comandat Nașterea unei idei, o sculptură înaltă de 1,5 metri bazată pe canalul de potasiu KcsA. [94] Opera de artă conține un obiect de sârmă care reprezintă interiorul canalului, cu un obiect din sticlă suflată care reprezintă cavitatea principală a structurii canalului.


        Materiale și metode

        Izolare celulară, cultură celulară și transfecție celulară cu KCNQ1 / KCNE1 și Kir6.2 / SUR1

        Celulele unice au fost obținute din inima porcilor de Guineea prin utilizarea unei metode de disociere enzimatică așa cum s-a descris anterior (Bar & # x000f3 și Escande, 1989). Concentrația enzimei utilizate a fost ajustată pentru a da o activitate de 350 & # x000a0U / ml pentru colagenază (tip I Sigma) și 0,61 & # x000a0U / ml pentru protează (tip XIV Sigma).

        Linia de celule africane de maimuță verde derivată din rinichi COS-7 a fost obținută din colecția American Type Culture (Rockville, MD) și cultivată în mediu Dulbecco și Eagle modificat și # x02019s suplimentat cu ser de vițel fetal 10 și # x00025 și antibiotice (100 și # x000a0IU / ml penicilină și 100 & # x000a0 & # x000b5g / ml streptomicină toate din Gibco, Paisley, Marea Britanie) la 37 & # x000b0C într-un incubator umidificat. Au fost subcultivați în mod regulat prin tratament enzimatic. Celulele au fost transfectate când cultura atinge confluența 60 & # x0201380 & # x00025, cu plasmidele (2 & # x000a0 & # x000b5g per ml de mediu de cultură) complexate cu JetPEI (Polyplus-transfecție, Strasbourg, Franța), conform protocolului standard recomandat de producător. ADNc-urile umane KCNQ1 și KCNE1 au fost subclonate în vectorul de expresie al mamiferelor, pCI și respectiv pCR (Promega, Madison, WI) sub controlul unui amplificator / promotor al citomegalovirusului. Mouse-ul pCMV-Kir6.2 (Inagaki și colab., 1995) și clonele de hamster pECE-SUR1 au fost furnizate cu amabilitate de S.Seino și respectiv C.G. Nichols. Plasmida care codifică proteina fluorescentă verde (GFP), utilizată pentru a identifica celulele transfectate a fost achiziționată de la Clontech. Pentru măsurarea curentului KCNQ1 / KCNE1, compoziția relativă a ADN-ului a fost 45 & # x00025 KCNQ1 / 45 & # x00025 KCNE1 / 10 & # x00025 GFP. Pentru măsurarea curentului Kir6.2 / SUR1, compoziția relativă a ADN-ului a fost 30 & # x00025 Kir6.2 / 30 & # x00025 SUR1 / 40 & # x00025 GFP.

        Electrofiziologie

        Douăzeci și patru până la 72 & # x000a0h post-transfecție, celulele COS-7 au fost montate pe scena unui microscop inversat și perfuzate constant cu soluția Tyrode la o rată de 2 & # x000a0ml / min. Un sistem de microperfuzie a permis aplicarea locală și schimbarea rapidă a diferitelor soluții experimentale. Temperatura băii a fost menținută la 22,0 & # x000a0 & # x000b1 1,0 & # x000b0C. Micropipetele (rezistență vârf 0.8 & # x020131.5 & # x000a0M & # x003a9) au fost extrase din sticlă cu pereți subțiri (Kimble Vineland, NJ) pe un extragător vertical (P30 Sutter Instruments, Co., Novato, CA), lustruit la foc și electric conectat la un patch & # x02013clamp amplifier (RK-300 Biologic Science Intruments, Claix, Franța). Stimularea, înregistrarea datelor și analizele au fost efectuate de Acquis1, un software realizat de G & # x000e9rard Sadoc (distribuit de Biologic Science Intruments) printr-un convertor analog-digital (Tecmar TM100 Labmaster Scientific Solution, Solon, OH, SUA). Reducerea curenților KCNQ1 / KCNE1, precum și cinetica de activare și dezactivare au fost studiate cu un protocol constând din pași de tensiune depolarizată de la un potențial de reținere (& # x0201380 & # x000a0mV) la & # x0002b40 & # x000a0mV (1 & # x000a0s) și apoi înapoi la & # x0201340 & # x000a0mV (500 & # x000a0ms), la fiecare 5 și # x000a0s. Pentru a se potrivi mai bine curentului de activare în formă de S, am folosit modelul Hodgkin și Huxley pentru o activare a canalului de potasiu dependent de tensiune: Ik & # x0003d & # x0005b1 & # x02013 exp (& # x02013t / & # x003c4act) & # x0005d 4 & # x000d7 Imax, cu & # x003c4act constanta de activare, t timpul și eumax amplitudinea curentului de potasiu atunci când canalele sunt complet deschise (Hille, 2001). Kinetica de dezactivare KCNQ1 / KCNE1 a fost obținută printr-o potrivire monoexponențială. Pentru jumătatea potențialului de activare (V0.5) calculul, potențialul membranei a fost treptat, în trepte de 10 mV, de la un potențial de reținere (& # x0201380 & # x000a0mV) la diferite tensiuni (potențial de impuls) între & # x02013100 și & # x0002b60 & # x000a0mV, și apoi a revenit la & # x0201340 & # x000a0mV, unde curenții cozii sunt vizibili. Curba de activare a fost obținută din extrapolarea curentului de coadă până la începutul etapei de tensiune pentru a evita contaminarea cu curentul capacitiv și a fost montată pe o distribuție Boltzmann. Curenții Kir6.2 / SUR1 au fost măsurați la un potențial de membrană de & # x0201350 & # x000a0mV (tensiunea pipetei & # x0003d & # x0002b50 & # x000a0mV). Curenții interiori la această tensiune sunt arătați ca semnale pozitive.

        Patch-ul de celule întregi și # x02013 clamparea cardiomiocitelor a fost descrisă anterior (Bar & # x000f3 și Escande, 1989). Miocitele izolate au fost perfuzate în mod constant cu soluția Tyrode menținută la 35 & # x000a0 & # x000b1 1.0 & # x000b0C. Micropipetele au fost trase mai îngust decât în ​​experimentele din interior spre exterior pentru a reduce diluția intracelulară a MgATP în pipetă. Au avut o rezistență mai mare a vârfurilor (1,5 & # x020134 & # x000a0M & # x003a9) atunci când sunt umplute cu soluția intracelulară. Experimentele Patch & # x02013clamp sunt prezentate ca media & # x000b1 SEM. Semnificația statistică a efectelor observate a fost evaluată de Student & # x02019s t-Test. Analiza off-line a fost efectuată utilizând programele Acquis1 și Microsoft Excel. Microsoft Solver a fost folosit pentru a potrivi datele printr-un algoritm de cel puțin pătrate.

        Model cinetic al PIP2 reglementarea KCNE1 / KCNQ1

        Simulările curenților KCNQ1 / KCNE1 în timpul redundării au fost generate din modelul prezentat în Figura & # x000a0 5 A. Curenții KCNQ1 / KCNE1 în timpul unei etape de depolarizare se bazează pe presupunerea că toate domeniile S4 sunt în conformitate cu & # x02018off & # x02019 (Cs4 oprit & # x0003d 1, Cs4 pe & # x0003d 0 și O & # x0003d 0) la începutul etapei de depolarizare. Curenții de coadă KCNQ1 / KCNE1 în timpul repolarizării sunt calculați din valoarea Po obținută la sfârșitul etapei de depolarizare. Doar kPIP2 este PIP2 dependente și valorile sale în timpul redundării simulate au fost alese pentru a se potrivi cel mai bine scăderii amplitudinii maxime a curentului la 40 & # x000a0mV în timpul redundării (cf. legenda din Figura & # x000a0 5). Microsoft Excel a fost folosit pentru a efectua simularea curenților.


        Abstract

        fundal Studiile la animale au arătat că Cl - activat Ca 2+ - curent (EuCl (Ca)) și curentul de schimb Na + / Ca 2+ (EuNa / Ca) contribuie la curentul interior tranzitoriu (Euti). Euti este responsabil pentru postdepolarizările întârziate proaritmice (DAD). Am investigat mecanismul ionic al Euti și DAD în celulele cardiace umane.

        Metode și rezultate Celulele ventriculare umane au fost izolate enzimatic de inimile explantate ale pacienților cu insuficiență cardiacă în stadiu final și studiate cu metodologia patch-clamp. EutiS-au obținut în prezența de 1 μmol / L norepinefrină prin trenuri de depolarizări repetitive de la -80 la +50 mV. DAD-urile au fost induse în prezența de 1 μmol / L norepinefrină la o frecvență de stimul de 1 Hz. Euti curenții au fost direcționați către interior pe intervalul de tensiune între -110 și + 50 mV. Nici acidul 4,4'-diizotiocianatostilbene-2,2'-disulfonic blocant al canalului Cl, nici modificările în [Cl -]eu afectat Euti sau amplitudine DAD. Aceasta exclude un rol important pentru EuCl (Ca). Blocarea schimbului de Na + / Ca 2+ prin substituirea tuturor Na + extracelulare cu Li +, invers, complet inhibat Euti. La iepure, EuCl (Ca) densitatea în celulele ventriculare izolate din inimile martor nu a diferit semnificativ de cea din celulele ventriculare izolate din inimile care se defectează.

        Concluzii Spre deosebire de multe specii de animale, Euti iar DAD-urile din celulele ventriculare umane din inimile deficitare constau doar din EuNa / Ca. La iepuri, insuficiența cardiacă în sine nu se modifică EuCl (Ca) densitate, sugerând că EuCl (Ca) poate lipsi, de asemenea, în timpul DAD-urilor în celulele ventriculare umane nereușite.

        Pacienții cu insuficiență cardiacă congestivă au o incidență ridicată a aritmiilor ventriculare. 1 Acestea prezintă un risc crescut de deces subit rezultat din tahicardie ventriculară și fibrilație ventriculară. 2 S-a demonstrat recent că aceste aritmii potențial letale la pacienții cu cardiomiopatie dilatată idiopatică în stadiul final apar în subendocard sau subepicardic printr-un mecanism focal nonreentrant. 3 Activitatea declanșată care se dezvoltă fie din postdepolarizări timpurii (EAD), fie din postdepolarizări întârziate (DAD) poate juca un rol esențial în inițierea acestor tulburări de ritm. 3

        Afterdepolarizările sunt „oscilații” în potențialul membranei. EAD-urile apar în timpul potențialului de acțiune, în timp ce DAD-urile apar după finalizarea potențialului de acțiune. 4 În celulele ventriculare din inimile umane care nu se află în stadiul final, EAD-urile de fază 2 se datorează reactivării curentului Ca 2+ de tip L. 5 Până în prezent, mecanismul DAD-urilor a fost investigat doar în modelele animale. Aceste studii au arătat că DAD sunt provocate de ritm cardiac ridicat în condiții în care [Ca 2+]eu este ridicat. 6 Curentul care cauzează DAD-uri se numește curent interior tranzitoriu (Euti). 7 Euti este activat prin eliberare spontană de Ca 2+ din reticulul sarcoplasmatic (SR). 6 Euti se dovedește a fi un curent eterogen. O componentă circulă prin canale de cationi neselectivi. 8 Curent mediat de schimbul Na + / Ca 2+ (EuNa / Ca) constituie o a doua componentă. 9 Mai recent, a fost identificată o a treia componentă. Evidence has accumulated that the Ca 2+ -activated Cl − current (EuCl(Ca)) also contributes to both Euti 10–12 and DADs. 13–15 We recently demonstrated in sheep heart cells that blockade of EuCl(Ca) reduced the DAD amplitude sufficiently to prevent 50% of the DADs from reaching the threshold for triggering action potentials. 14 This observation suggests that EuCl(Ca) blockade may be a promising therapeutic strategy in those instances in which DADs contribute to the genesis of arrhythmias that is, of course, only when EuCl(Ca) also plays a role in Eutis and DADs in human ventricular cells. In this article, we address this issue.

        Here, we report that Euti and DAD in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts are caused by EuNa/Ca numai. Furthermore, we show that in a rabbit model, heart failure does not lead to disappearance of EuCl(Ca). Our results suggest that failing, and presumably also nonfailing, human ventricular cells do not possess EuCl(Ca) canale. Our findings question the rationale behind EuCl(Ca) blockade as a therapeutic approach in arrhythmias caused by triggered activity based on DADs.

        Metode

        Cell Preparation

        Human Ventricular Cells

        Hearts were obtained from patients with end-stage heart failure caused by either ischemic or dilated cardiomyopathy. Patient characteristics are shown in the Table. All patients were in NYHA functional class IV and received standard therapy for chronic heart failure. Informed consent was obtained before heart transplantation, and the protocol complied with institutional guidelines. Ventricular cells were isolated from the left ventricle by enzymatic dissociation. 16

        Rabbit Ventricular Cells

        Heart failure was induced in New Zealand White rabbits by volume and pressure overload. 17 The heart failure index based on relative heart weight, relative lung weight, left ventricular end-diastolic pressure, third heart sound, and ascites was calculated as described previously. 17 We used only hearts of rabbits in which 4 of the aforementioned 5 parameters were abnormal. Age-matched animals served as control group. Animal care was in accordance with institutional guidelines. Cells from the left ventricle were isolated by enzymatic dissociation. 16 Cells isolated from failing hearts were significantly larger than control cells (301±53 pF [n=9] versus 110±37 pF [n=11]) and showed the well-known action potential prolongation.

        Recording Procedures

        Small aliquots of cell suspension were placed in a recording chamber on the stage of an inverted microscope and superfused with Tyrode’s solution (35°C to 37°C) containing (mmol/L) NaCl 140, KCl 5.4, CaCl2 1.8, MgCl2 1.0, glucose 5.5, and HEPES 5.0 (pH adjusted to 7.4 with NaOH).

        Membrane potentials and currents were recorded in the ruptured-patch whole-cell configuration of the patch-clamp technique. Patch pipettes (3 to 5 MΩ) were pulled from borosilicate glass and filled with solution containing either (mmol/L) potassium gluconate 125, KCl 20, and HEPES 10 (pH adjusted to 7.2 with KOH) or KCl 145 and HEPES 10 (pH adjusted to 7.2 with KOH). Potentials were corrected for the liquid junction potential. Membrane currents and potentials were low-pass filtered online with a cutoff frequency of 1 kHz and digitized at 2 kHz.

        Stimulation Protocols

        DADs and Eutis result from spontaneous SR Ca 2+ release in Ca 2+ -overloaded myocytes. 6 In our experiments, we induced sarcoplasmic Ca 2+ overload by application of 1 μmol/L norepinephrine (Centrafarm). DADs were induced by eliciting action potentials (1 Hz) with current pulses applied through the patch pipette. Euti was elicited by repeated trains of 15 to 20 200-ms voltage-clamp steps from −80 to +50 mV (Figure 1A). Time between the steps was 100 ms. Successive trains were 6 seconds apart.

        Figura 1. A, Voltage-clamp protocol for eliciting Euti. B, Current recording made during this protocol in a human ventricular cell. Arrow, Euti. Inset, Protocol for measuring Euti amplitude. C, Effects of 0.2 mmol/L tetracaine on occurrence of Euti (left) and DAD (right).

        During the first 5 to 6 successive voltage-clamp steps of a train, both the quasi steady-state current during the 200-ms depolarizing step and the inwardly directed “tail” current during the 100-ms repolarizing step increase until they reach a stable value (Figure 1B). Enhanced delayed rectifier current (EuK) și EuNa/Ca may underlie this phenomenon. 18 Both EuK și EuNa/Ca increase during a rise in [Ca 2+ ]eu, 18,19 as occurs during the train of voltage-clamp steps. 6,20 The latter results from repeated activation of Ca 2+ current and the diminished Ca 2+ extrusion by the Na + -Ca 2+ exchanger. 6,20 Slow inactivation kinetics of EuK presumably also plays a role in the increase of the quasi steady-state current.

        After cessation of a train, all cells develop ≥1 Euti oscillations, typically within 3 seconds (Figure 1B, arrow). Fiecare Euti was accompanied by a visible aftercontraction of the cell. The amplitude of Euti was measured as the difference between the peak of the transient current and mean current amplitude before and after the transient current (Figure 1B, inset). In case of successive Euti oscillations, the first one was taken for analysis.

        The effect of heart failure on EuCl(Ca) was studied in rabbit ventricular cells. EuCl(Ca) was elicited by depolarizing 500-ms voltage-clamp steps from a holding potential of −50 mV. The steps were applied once every 2 seconds and were incremented by 10 mV. EuCl(Ca) was defined as the transient outward current sensitive to the Cl − channel blocker 4,4′diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic acid (DIDS Sigma Chemical Co). DIDS was prepared as 0.5-mol/L stock solution in DMSO (Merck) and diluted before use in Tyrode’s solution to a final concentration of 0.5 mmol/L. All currents were normalized for cell size as described previously. 14

        Statistici

        Action potential characteristics were derived from 10 consecutive action potentials and averaged. Microsoft Excel software was used for statistical analysis of the data. Values are expressed as mean±SEM and considered significantly different at a value of P<0.05 in ANOVA or Student’s t Test.

        Rezultate

        In Human Ventricular Cells, Euti and DADs Are Caused by Spontaneous SR Ca 2+ Release

        We first asked the question whether in human ventricular cells Euti and DADs are activated by spontaneous SR Ca 2+ release. We tested the effects of 0.2 mmol/L tetracaine and 5 mmol/L caffeine, drugs known to inhibit spontaneous SR Ca 2+ release. 6,21 Both tetracaine (Figure 1C, n=3) and caffeine (n=4, data not shown) completely abolished Euti and DAD. From these experiments, we conclude that as in animal cells, in human ventricular cells Euti and DADs also are caused by spontaneous SR Ca 2+ release.

        No Role for a Cl − Current in Euti and DAD in Human Ventricular Cells

        Next, we investigated the currents contributing to Euti and DAD in human ventricular cells. We determined the current-voltage (I-V) relationship of Euti and its sensitivity to intracellular Cl − substitution. We reasoned that if EuCl(Ca) contributes to Euti, then a change in [Cl − ]eu has to alter the Euti I-V relationship. We applied the aforementioned train protocol, but now directly followed by 17 voltage-clamp steps of 3-second duration and ranging from −110 to +50 mV with 10-mV increments (Figure 2A, inset). Figure 2A shows typical current traces recorded at the membrane potentials indicated. In this and 4 other experiments, the low-Cl − pipette solution was used. The corresponding Cl − reversal potential (ECl) was calculated at −50 mV, which is the physiological ECl value in cardiac cells. 22 For 4 other cells, the high-Cl − pipette solution was used, for which ECl was 0 mV. Figure 2B shows the I-V relationships of Euti measured with low and high [Cl − ]eu. Irrespective of [Cl − ]eu, Euti was inwardly directed at all potentials tested and had a maximal amplitude at approximately −70 mV. Cele 2 Euti I-V relationships did not differ significantly. In accordance with this observation, we also found no significant effect of [Cl − ]eu on DAD amplitude (Figure 2C). In fact, resting membrane potential and the duration and amplitude of the action potential also were not affected. From these experiments, we conclude that it is not likely that EuCl(Ca) contributes much to Eutis and DADs in failing human ventricular cells.

        Figura 2. A, Typical example of voltage-dependence of Euti in human ventricular cells. Inset, Applied voltage-clamp protocol. Euti was measured at potentials between −110 and +50 mV. B, I-V relationship of Euti in human ventricular cells recorded with pipette solution containing high (n=4 ECl=0 mV) and low (n=5 ECl=−50 mV) Cl − . C, Action potential and DAD parameters recorded with pipette solution containing high (n=4 ECl=0 mV) and low (n=5 ECl=−50 mV) Cl − . APD50 and APD90 indicate action potential duration at 50% and 90% repolarization APA, action potential amplitude and Vm, resting membrane potential.

        To substantiate this conclusion, we studied the effects of EuCl(Ca) blockade on the Euti I-V relationship and DAD amplitude. We applied DIDS, a potent inhibitor of anion transport proteins, including EuCl(Ca) canale. 23 In these experiments, we used the low-Cl − pipette solution (ECl=−50 mV). Figure 3A shows typical examples of Eutis measured at −80 and +50 mV in the absence and presence of DIDS. The drug had no effect. Figure 3B shows the lack of effect of the stilbene on the mean Euti I-V relationship of 4 cells. Figure 3C and 3D shows that DIDS also had no effect on DAD amplitude or other action potential characteristics (n=4).

        Figura 3. A, Typical current traces recorded at −80 and +50 mV in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS. B, I-V relationship of Euti in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS (n=4). C, Typical action potential and DAD configuration in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS. D, Action potential and DAD parameters in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS (n=4). Abbreviations as in Figure 2.

        From these experiments, we conclude that there is no or only a very limited role for a Cl − current in DADs and Euti in failing human ventricular cells.

        Dominant Role for EuNa/Ca în Euti and DAD Formation in Human Ventricular Cells

        A salient feature of the Euti I-V relationship is the absence of a reversal potential (Figures 2B and 3B ). This suggests that not a channel mechanism but rather an electrogenic Na + /Ca 2+ exchange underlies Euti. Na + /Ca 2+ exchange can support inwardly and outwardly directed currents. 24 During spontaneous SR Ca 2+ release under voltage-clamp conditions, however, EuNa/Ca does not reverse sign and remains inwardly directed, because any rise in sarcoplasmic Ca 2+ concentration will shift the reversal potential of the exchanger toward more positive membrane potentials. 25,26 The Euti in human ventricular cells was small at positive membrane potentials and increased at more hyperpolarized potentials, with a maximum at −70 mV. At potentials negative to −70 mV, Euti decreases (Figures 2B and 3B ). This behavior is most likely related to voltage-dependency of EuNa/Ca itself, but also to the amount of Ca 2+ released by the SR. 24,27 Spontaneous [Ca 2+ ]eu oscillations seem to decrease at more hyperpolarized potentials, 20 which will result in a smaller Euti.

        Next, we tested the hypothesis that EuNa/Ca contributes to Euti. We inhibited Na + /Ca 2+ exchange by replacing extracellular Na + with equimolar amounts of Li + . Li + permeates through Na + channels and nonselective cation channels 28 but cannot replace Na + on the Na + /Ca 2+ exchanger. 29,30 Throughout these experiments, 0.5-mmol/L DIDS was present, and the low-Cl − pipette solution (ECl=−50 mV) was used. Figure 4A shows a typical example of the effects of Li + on Euti. Both at −80 and at +50 mV, an inwardly directed Euti was found (left), which completely disappeared after substitution of Li + for Na + (right). Aftercontractions were still visible, however, indicating that spontaneous SR Ca 2+ release was not disrupted. Figure 4B shows the mean Euti I-V relationship of 4 cells before and after the maneuver. After substitution of Li + for Na + , Euti was abolished at all potentials. Inhibition of Na + /Ca 2+ exchange and the consequent further loading of the sarcoplasm with Ca 2+ prevents stable current-clamp recordings. For this reason, we could not evaluate the effect of Li + on DAD formation. Nevertheless, from these data, we conclude that EuNa/Ca plays a dominant role in Euti and DAD formation in human ventricular cells of failing hearts.

        Figura 4. A, Typical current traces recorded before (left) and after (right) substitution of all extracellular Na + by Li + . B, I-V relationship of Euti before and after substitution of all extracellular Na + by Li + (n=4).

        In a Rabbit Model, EuCl(Ca) Density Is Not Affected by Heart Failure

        Thus far, we found that in human ventricular cells, DAD and Euti are carried predominantly by EuNa/Ca but not by EuCl(Ca). This is at odds with observations made in a number of animal models. In our experiments, ventricular cells were isolated from explanted hearts of patients with end-stage heart failure. We cannot exclude the possibility that heart failure affects EuCl(Ca) density, the more so because heart failure is associated with downregulation of a number of cationic currents 31,32 and alterations in Ca 2+ metabolism. 33

        In a concluding series of experiments, we determined whether in an animal model, heart failure influences EuCl(Ca) densitate. Am studiat EuCl(Ca) in cells isolated from control and failing rabbit hearts using the low-Cl − pipette solution (ECl=−50 mV). Moreover, the results obtained in rabbit cells were compared with those obtained with failing human cells. To measure EuCl(Ca), we applied voltage-clamp steps (see Methods) in the absence and presence of DIDS. Figure 5A shows typical examples of the current traces recorded at +50 mV in a control rabbit (left), a failing rabbit (middle), and a failing human (right) cell. By subtraction of the appropriate traces, the DIDS-sensitive EuCl(Ca) was obtained (Figure 5B). Figure 5C shows mean I-V relationships of EuCl(Ca) of 11 control rabbit, 9 failing rabbit, and 6 failing human cells. In both groups of rabbit cells, the typical bell-shaped EuCl(Ca) I-V relationship was found. EuCl(Ca) was not observed in human ventricular cells. Moreover, the EuCl(Ca) density in failing rabbit cells did not differ significantly from that in control rabbit cells. From these data, we conclude that in rabbit, heart failure per se does not necessarily lead to downregulation of EuCl(Ca).

        Figura 5. A, Superimposed current traces elicited by voltage-clamp steps from −50 to +50 mV in absence and presence of DIDS in a control rabbit cell (91 pF), failing rabbit cell (290 pF), and failing human cell (265 pF). B, DIDS-sensitive currents. C, I-V relationship of EuCl(Ca) in ventricular cells from control rabbit (n=11), failing rabbit (n=9), and failing human (n=6) hearts.

        Discuţie

        Prezentare generală

        The aim of this study was to elucidate the ionic mechanism of DADs and their underlying current, Euti, in failing human ventricular cells. We found that the Euti I-V relationship was inwardly directed between −110 and +50 mV (Figures 2 and 3 ). Neither changes in [Cl − ]eu nor application of DIDS (Figure 3) affected the DADs or Eutis (Figure 2). Euti was completely abolished, however, by substitution of Li + for extracellular Na + (Figure 4). Because this maneuver blocks EuNa/Ca, we conclude that EuNa/Ca is the principal ionic mechanism of DADs and Euti in failing human ventricular cells.

        Species-Dependency of Ionic Nature of DADs

        Our results indicate that in failing human ventricular cells, only EuNa/Ca contributes to Euti. This is similar to findings in ventricular cells of guinea pig 25,29 but contrasts with observations made in ventricular cells of dog, 11 rabbit, 12 sheep, 14 and ferret. 30 In these species, Euti consisted of both EuCl(Ca) și EuNa/Ca. In our experiments, norepinephrine was present. Adrenoceptor stimulation enhances EuCl(Ca) amplitude, 11 thereby potentially favoring EuCl(Ca) detection. Furthermore, we found that the density of EuCl(Ca) in rabbit heart cells is not affected by heart failure (Figure 5). Thus, neither our experimental conditions nor heart failure per se can clarify why EuCl(Ca) cannot be found in our failing human ventricular cell preparation. The simplest explanation is that our failing human heart cell preparation does not possess EuCl(Ca). Indeed, Köster et al 34 were not able to detect EuCl(Ca) currents in human ventricular cells when they applied caffeine to induce SR Ca 2+ release, whereas in rabbit Purkinje cells, that same maneuver does activate EuCl(Ca). 35 Finally, the lack of effect of DIDS application and/or intracellular Cl − substitution on steady-state membrane currents and action potentials of our failing human ventricular cells (Figures 2 and 3 ) also implies that in our preparation, both the heart failure–induced, persistently active swelling-induced Cl − current 36 and cAMP-dependent Cl − current (EuCl(cAMP)) 37 are absent. The latter agrees with findings of Oz and Sorota, 38 who were also not able to detect EuCl(cAMP) in human ventricular cells.

        Limitations of Our Study

        Animal models contribute much to our understanding of the electrophysiology of failing hearts. They can never completely substitute, however, for experiments with normal human cells. We found that heart failure in rabbits does not significantly alter EuCl(Ca). We take that as evidence that heart failure per se cannot account for our inability to detect EuCl(Ca) in human ventricular cells of failing hearts. Final proof for the notion that human heart cells do not express EuCl(Ca), of course, lies in experiments with normal human heart cells.

        Implications of Our Study

        The present study demonstrates that in failing human ventricular cells, DADs and their underlying current, Euti, are composed virtually exclusively of EuNa/Ca. EuNa/Ca is activated by spontaneous Ca 2 release from SR. This contrasts with observations made in ventricular cells of a number of animal species in which EuCl(Ca) also contributes to the DADs and Euti. Our findings question the rationale behind EuCl(Ca) blockade as a therapeutic approach in arrhythmias caused by triggered activity.

        This work was supported by the Research Council for Earth and Life Sciences with financial aid from the Netherlands Organization for Scientific Research (grant 805-06.155).


        Opțiuni de acces

        Obțineți acces complet la jurnal timp de 1 an

        Toate prețurile sunt prețuri NET.
        TVA va fi adăugat mai târziu în casă.
        Calculul impozitului va fi finalizat în timpul plății.

        Obțineți acces limitat la timp sau la articol complet pe ReadCube.

        Toate prețurile sunt prețuri NET.


        What is the mechanism responsible for the 'delay' in delayed rectifier potassium channels? - Biologie

        Potassium Channels

        K+ channels are membrane proteins that allow rapid and selective flow of K+ ions across the cell membrane, and thus generate electrical signals in cells. Voltage-gated K+ channels (Kv channels), present in all animal cells, open and close upon changes in the transmembrane potential. Kv channels are one of the key components in generation and propagation of electrical impulses in nervous system. Upon changes in transmembrane potential, these channels open and allow passive flow of K+ ions from the cell to restore the membrane potential.

        Voltage Gating

        Schematic view of the gating process in Kv channels.

        The tetrameric structure of Kv channels is made of two functionally and structurally independent domains: an ion conduction pore, and voltage-sensor domains. The ion conduction pore is made of four subunits which are arranged symmetrically around the conduction pathway. Voltage-sensor domains are positioned at the periphery of the channel and consist of four transmembrane segments (S1-S4). Structural rearrangement of the voltage-sensor domains in response to changes in the membrane potential, and in particular S4, which includes positively charged amino acids at every third position, results in conformational changes in the conduction pore, which could open or occlude the ion conduction pathway. The nature of these movements and conformational changes in the voltage-sensors have been subject to controversy and several models for voltage-gating have been proposed.

        The recently solved crystal structure of Kv1.2, from rat brain, revealed the molecular architecture of the voltage sensor domain in an open state of the channel. Four Arginine gating residues are identified in the voltage-sensor domain shielded from the lipid molecules. Coupling of the voltage-sensors to the (gate in the) pore domain is via an amphipathic alpha helix that runs parallel to the membrane plane inside the cell. Conformational changes in the voltage-sensor domain are transferred to the ion conduciton pore via the helical linker, and result in opening or closing of the intracellular gate of the ion conduction pathway. However, the nature of this coupling, and the interactions between the linker and the pore still remains a mystery.

        Ion Permeation

        The structural element responsible for the high selectivity of the channel, is a sequence of five amino acids that is highly conserved among potassium channels, voltage-gated or not. This stretch of amino acids, TVGYG, forms the narrowest part of the channel, also known as the selectivity filter. The ion conduction pathway is lined with oxygen atoms in this region which provide four binding sites for K+ ions. The ion conduction mechanism through the selectivity filter, has been postulated and studied . Our recent molecular dynamics study of the pore domain of Kv1.2, could provide trajectories of K+ ion conduction through the channel driven by a voltage bias across the lipid bilayer (click here to download a movie of the conduction trajectory (mpeg,1.6M)). Our results are consistent with the knock-on mechanism suggested by Hodgkin and Keynes, in 1955. During the simulation the selectivity filter is occupied by 2 or 3 K+ ions at each time. The ions reside mainly at sites identified previously by crystallography and modeling, separated by water molecules. When a K+ ion approaches the filter from the cytoplasmic side, the configuration of the ions inside the selectivity filter changes, until the K+ ion enters the selectivity filter. Upon entrance of the K+ ion to the selectivity filter from the cytoplasmic side, the outermost K+ exits the channel to the extracellular solution. The jumps of ions between these sites and the sequence of multi-ion configurations involved in permeation are described thoroughly in here.

        Different scenarios for the K+ conduction through the selectivity filter were observed in our simulations, for which movies of the simulation trajectories are provided here (mpeg,4.7M) and here (mpeg,1.4M).



        Kv1.2 embedded into a solvated lipid bilayer.

        A rotating movie of the open state of the channel is provided here. (mpeg, 11M)

        Gating Charge

        Upon opening of the channel, conformational changes in the voltage-sensor domains (VSD) result in the transfer of 12-13 elementary charges across the membrane electric field. This charge transfer is measured as a transient capacitive current that preceeds opening of the channel. Several charged residues of the VSD, in particular four arginine residues located regularly at every third position on the S4 segment, are known to move across the transmembrane field and contribute to the gating charge. The position of these arginines, known as gating arginines, are highly conserved in all voltage-gated potassium, sodium, or calcium channels. However, the extent of their movement and their displacement across the transmembrane potential has been subject to extensive debate.

        In collaboration with the Roux lab, we have been able to calculate the gating charge of a voltage-gated potassium channel, Kv1.2, from all-atom MD simulations. The total gating charge of the channel is calculated for the full tetrameric channel, as well as an individual voltage-sensor domain (VSD) in an explicit membrane-solvent environment.

        The free energy of each protein conformation (in the open or closed state) is a function of the external voltages applied. The displacement charge (or the electric dipole) of the entire system, including water, ions, and the lipid molecules, couples the potential energy of the protein state to the external voltages applied. When simulated under a voltage bias, the difference between the displacement charge of the two systems (open and closed) represents the gating charge of the channel. The open probability of the channel at a given voltage, is then determined from the difference in the free energy of the two protein states (open and closed) at this particular voltage.


        The gating charge of Kv1.2 calculated for the ful tetrameric channel (left) and an individual VSD (right). The calculations are performed on the open and closed state models of Kv1.2 (Pathak et al. Neuron 2007,56:124-40). The models are refined through externsive MD simulation in a membrane environment prior to these calculations.

        Electrostatic Potential within the VSD

        Across a perfectly homogeneous lipid membrane, the electrostatic potential drops linearly from the interacellular to the extracellular side. However, the irregular shape of the protein and its dielectric inhomogenity modulates the membrane potential within the VSD. In particular, water-filled crevices within the protein change the spatial variation of the potential across the membrane. Using free energy calculation in MD simulations, we have calculated the electrostatic free energy of several residue side chains along the TM helices of the voltage-sensor domains (VSD). These residues are known to move within the transmembrane field when the channel transitions from the open to the closed state, and contribute to the gating charge.

        We have calculated the transmembrane potential at the position of key charged residue side chains inside the VSD. In these calculations, the intracellular solution is assumed to be at potential V=1, while the extracellular solution is grounded. The calculations reveal that the transmembrane potential drops rapidly over a distance of about 10-15A within the protein. Such a sharp drop in the potential results in a very focused electric field within only one third of the bilayer thickness. The sharp drop in the transmembrane potential is due to the presence of a water-filled crevice located within the VSD, which provides a high-dielectric medium in contrast to the low-dielectric medium of the surrounding protein and lipid molecules.


        Fraction of transmembrane potential acting on key charged residues of the VSD plotted against z-axis normal to the membrane.

        In the open state of the channel, the potential acting on the gating residues (R1-R4) varies from its full value (at z=-5 A) to zero (at z = 10 A) over the extracellular half of the membrane bilayer. As a result, all four gating arginines positioned within 15 A of the membrane-solvent interface are exposed to the extracellular potential. This trend is also seen for the closed state of the channel. Although, the closed conformation of the VSD places the gating arginies near the intracellular inteface. These arginines, spread over a distance of

        10 A, are exposed to the intracellular potentia at 1V.

        Displacement of charged residues across the membrane potential results in the transfer of a net electric charge across the membrane that can be detected as gating currents in electrophysiological experiments. For example, in the open state of the channel, R4, the forth gating arginine of the VSD, is positioned near the center of the membrane at 0.2 of the potential. In the closed state of the channel, R4 is placed near the intracellular potential at 0.9 of the voltage bias. Upon transition of the channel from the open to the closed state, movement of R4 results in the transfer of 0.7 elementary charges across the membrane. We have determined the contribution of individual charged residues of the VSD to the total gating charge. The results show that the gating charge mainly arises from three of the four arginines, R2, R3, and R4, and the average movement of these residue side chains is about 9 A normal to the membrane.

        Final refinement

        13e). The difference can be accounted for by considering the contribution of individual residues to the gating charge. In contrast to what was expected, our results showes that R1, the first gating arginine, does not move signitficantly within the membrane potential. We have performed steered molecular dynamics (SMD) simulations, in which the side chain of R1 is pulled down toward the intracellular solution, and the total gating charge is monitored during the course of the simulation. The results show that relatively small motion of these residue side chains is sufficient to increase the gating charge by 2.5 e. During these simulations, rearrangement of arginine side chains is accompanied by disrupting a salt bridge interaction between R1 and E0 (on the S1 segment), and replacing it with strong interactions between R1 and E1 (on the S2 segment), which appear to block the entry of water molecules from the extracellular side. These results suggest that, rather than being the true resting state existing under hyperpolarizing conditions, the initial closed state model corresponds to an intermediate substate appearing early during channel activation.



        Permeation of potassium ions through VSD.

        Voltage sensor domains act as ion channels

        Voltage sensor domains (VSD) consist of four transmembrane segments that form an anti-parallel helical bundle (S1-S4). Mutation of the first gating arginine (R1) on the S4 segment to smaller uncharged amino acids such as serine or asparagine will turn the VSD into an ion channel, allowing permeation of cations through these helical bundles while the main ion conduction pore is closed. These currents, known as omega currents, travel through the VSD and are distinct from the K+ currents passing through the central ion conduction pathway. Omega pores are cation selective, and have a slight preference for larger cations. We have performed molecular dynamics simulations of ionic permeation through the VSD in its resting state conformation. Simulations of the wild-type VSD and four of its mutants revealed the presence of a negatively charged constriction region near the center of the membrane which might act as a selectivity filter that prevents permeation of anions through the pore. Two highly conserved charged residues, R1X and E1, on two helical segments of the VSD form part of this selectivity filter. Mutation of these residues, both in experiments and our simulations, significantly increases the magnitude of the omega-current, another indication that the resting state model of the VSD obtained through our simulations is a viable representative of the functional state of the protein.


        Study Questions for Lectures on the Molecular Biology of the Action Potential

        1. What is the proposed membrane topology for voltage-gated sodium channels? And what is it for Shaker potassium channels?

        2. What evidence is there that voltage-gated sodium, potassium, and calcium channels are related?

        3. What part of the sodium channel forms the pore? What part of the potassium channel forms the pore? How would you prove it?

        4. What accounts for ionic selectivity? What are their molecular bases? What is the key difference between potassium channels and sodium channels?

        5. Can you alter the ion selectivity of an ion channel? Explica.

        6. What part of the voltage-gated channel forms the voltage sensor? De ce crezi asta?

        7. What could you do experimentally (or what has already been done) to prove that this part of the channel is the one actually responsible for sensing voltage?

        8. How is the channel activated by voltage changes?

        9. Are all ion channels voltage-sensitive? If not, why aren't they?

        10. How do sodium and potassium channels inactivate? Could you identify the molecular basis of channel inactivation?

        11. What is voltage clamp? What could you learn about an action potential from voltage-clamp analysis? (assume that you vary the voltage from 㫞 mV to +70 mV, with 10 mV/step and that the neuron only has a fast sodium current and a delayed rectifier potassium current).

        12. If you treat a squid giant axon with TTX, what kind of current-voltage (I-V) plot do you get? De ce?

        13. If you treat a squid giant axon with TEA, what kind of current-voltage (I-V) plot do you get? De ce?

        14.What is reversal potential? What is Erev for sodium? What is Erev for potassium? Could you

        use them to explain the amplitude of an action potential?

        15. What will happen to the action potential shape if you partially reduce the amount of potassium currents?

        16. Draw an action potential. Label the following on your diagram: sodium channel activation, sodium channel inactivation, sodium channel closure, potassium channel activation, potassium channel closure.

        17. What are gating currents? Are they carried by charged ions such as sodium and potassium? Do they have a threshold for activation?

        18. Draw five traces of single channel currents from a voltage-gated sodium channel activated at +20 mV (from VH = -70 mV)? Compare them with the macroscopic current you obtained from voltage-clamp at the same depolarizing voltage. How do they differ?

        19. Could you use molecular terms to explain the refractory period of action potentials?

        Study Questions for `Other Ion Channels and Intrinsic Membrane Properties of Neurons' and `Ion Channels and Disease'

        1. What are considered the major factors that determine the personality (i.e. intrinsic membrane properties) of neurons?

        2. What are the minimal requirements of ion channel types for a tonically active neuron?

        3. What are the minimal requirements of ion channel types for a rhythmically bursting neuron?

        4. What is so special of low-voltage activated ion channels? Could you give a few examples of this kind of ion channels?

        5. Are channels always activated by depolarizations? If not, could you give two examples?

        6. What is so special of the transient potassium current (IA)? Could you explain it using your molecular biology knowledge?

        7. Give one unique feature of Ca 2+ -activated potassium current.

        8. What is afterhyperpolarization (AHP)? What are the cause and usefulness of it?

        9. Is inward rectifying potassium current identical to Ih? What are their differences?

        10. What is dendrite? Is it passive? How would a neuron use it to tune its own activity?

        11. How would one obtain the activation and inactivation curves of an ion channel experimentally? Use voltage-gated sodium channel as an example.

        12. What is reversal potential? How would one determine the reversal potential for voltage-gated sodium currents?

        13. Draw a current-voltage plot for each type of K channel (delayed rectifier, transient potassium channel, inward rectifier, and Ca 2+ -activated potassium channel).

        14. What does it mean that one of the sodium currents is transient and that one is persistent?

        15. What important consequence does the refractory period have for the conduction of action potentials?

        16. How does changing Ih affect neuronal firing?

        17. How does changing the delayed rectifier affect neuronal firing?

        18. How would you change the frequency of neuronal firing?

        19. What are specific examples of how modifications of channel properties lead to pathologies? Use sodium channel as an example.

        20. How might mutations in general affect channel properties (for example, a mutation in the promoter region might cause the over or under expression of a certain ion channel)?

        Study Question for Mechanisms of Synaptic Transmission

        1. Discuss the structure and function of electrical synapses.

        2. What advantages might electrical synapses have over chemical synapses?

        3. What steps are involved in chemical synaptic transmission?

        4. What currents might be responsible for excitatory synapses? What currents might be responsible for inhibitory synapses?

        5. In what ways are inputs integrated? What is the purpose of integrating inputs?

        6. What do you usually find in the presynaptic terminal? What is an active zone?

        7. Describe the interaction of sodium and potassium at the neuromuscular junction. Include the following terms in your description: ACh, reversal potential, EPSP.

        8. Describe the evidence supporting vesicle fusion with the presynaptic membrane.

        9. If calcium blockers are applied to the axon, what effect will this have on synaptic transmission if the axon undergoes an action potential?

        10. What are the differences between an EPSP and an IPSP? What determines whether a specific transmitter is excitatory or inhibitory?

        11. What is shunting? Explain it using the Ohms law.

        12. What are the two essential components of the vesicle hypothesis?

        13. What do you expect to see on the presynaptic terminal membrane using freeze-fracture techniques when a) the nerve is not stimulated and b) the nerve is intensely stimulated?

        14. What is capacitance? What would an increase in membrane capacitance suggest?

        15. What is a quantum? What is quantal release?

        16. What is a MEPP? How does this differ from an EPSP?

        17. What is the evidence that calcium is required for vesicle exocytosis?

        18. What is the core complex? Care sunt componentele sale?

        19. What is SNARE? How many SNARE proteins do you find in nerve terminals? Which one is v-SNARE and which is (are) t-SNAREs?

        20. Why do dermatologists use botulinum toxins to reduce wrinkles and keep their patients `youthful'? What do these toxins do to SNARE proteins?

        21. What is the SNARE hypothesis? Why do we think it is no longer correct?

        22. What evidence do we have to suggest that SNARE proteins are important for vesicle fusion?

        23. What are the advantages and disadvantages of `knock-out' experiments?

        24. What is synaptotagmin? Why is it suggested to be a calcium sensor?

        25. Is synaptotagmin the only calcium sensor? Dacă nu, de ce?

        26. Why do you need to recycle synaptic vesicles in nerve terminals?

        27. What is clathrin? How does it endocytose synaptic vesicles?

        28. How might the homogeneous sized vesicles be regulated?

        29. What is dynamin? What roles does it play during vesicle recycling?

        30. What impacts would defects in endocytosis and recycling have on vesicle exocytosis?


        Priveste filmarea: Interviu Marius Spiridon - Responsabilitate, Integritate, Autenticitate (Ianuarie 2022).