Informație

Knockout CRISPR-Cas9


Cu CRISPR-Cas9 am efectuat o eliminare direcționată a unei regiuni ADN care codifică o anumită proteină (lucrând cu leucocite). Întrebarea mea este, cât durează până când această proteină nu mai este detectabilă (de exemplu, prin colorarea suprafeței + citometrie de flux) după ce ADN-ul a fost manipulat? Sau în alți termeni: cât de des au loc transcrierea, traducerea etc.?


Pentru a răspunde la întrebarea dvs. mai mulți parametri care ar trebui luați în considerare.

Există două seturi principale de parametri: genă specifică și specific liniei celulare.

Parametrii legați de gena dvs. specifică de interes:

  • Știți timpul de înjumătățire al ARN-ului genei dvs. de interes? De cele mai multe ori nu se știe, dar există mai multe instrumente și resurse care o pot prezice pe baza multor caracteristici diferite, cum ar fi lungimi și stabilitate de 3'UTR, 5'UTR, numărul de exoni introni etc. Un alt indiciu este dacă există deja persoane care au efectuat fie o perturbare genetică (siRNA, CRISPR, etc), fie un test de degradare. În acest caz, ați putea să ghiciți care este timpul de înjumătățire relativă al ARN-ului sau al proteinei.
  • Ceea ce ne conduce la timpul de înjumătățire al proteinei de interes. Proteinele care sunt solubile tind, în general, să aibă un timp de înjumătățire mai mic decât proteinele din membrană (nu este necesar, există excepții). De exemplu, efectuarea unei eliminări funcționale complete a unui factor de transcripție ar putea fi mai ușoară decât un receptor GPCR. Dacă este o proteină membranară, la ce organit se localizează? Organelul reciclează membrana mult sau celula se împarte? În acest caz, este posibil să aveți șanse ca proteinele viabile prezente înainte de perturbarea genetică să se dilueze. În aceste exemple, este posibil să obțineți o proteină solubilă în mai puțin de 24-48 de ore, în timp ce o proteină membranară foarte stabilă poate dura 7-10 zile.
  • Numărul de copii de ARN este important, precum și numărul legat de ribozomi (mai puțin important) și localizarea lor în celulă (mai puțin important)
  • Abundența proteinelor în general.

Parametrii legați de linia dvs. de celule de interes:

  • Linia liniei celulare pe care ați selectat-o: diferite linii celulare au rate de transcriere și de traducere globale diferite.
  • Rata de divizare a liniei celulare (parametru extrem de important): cu cât linia celulară se va împărți mai repede, cu atât mai repede copiile ARNm care nu au fost perturbate (de tip sălbatic) și proteinele prezente înainte de perturbarea genetică vor fi diluate între celulele fiice.
  • Numărul de copii în linia celulară: dacă există mai multe copii ale genei dvs. de interes, va trebui să vă asigurați că fiecare copie a genei a fost perturbată pentru a duce la un KO funcțional.
  • Stabilitatea genomică a liniei celulare: unele linii celulare, cum ar fi HeLa, sunt destul de cunoscute pentru instabilitatea genomică, unde o mare parte din genom poate fi rearanjată, iar copiile perturbate pot fi remediate utilizând copii viabile

Nu în ultimul rând, depinde din punct de vedere tehnic de modul în care faceți perturbarea genetică CRISPR-Cas9: transfecția gARN-ului, electroporarea Cas9 cu gARN, livrare mediată lentiviral etc. Timpul pe care l-am oferit este după livrarea tuturor componentelor și sunt prezente în cantitate mare în nucleu.

Sper ca te ajuta!


Cuprins

Studii timpurii în Caenorhabditis elegans [1] și Drosophila melanogaster [2] [3] a văzut pe scară largă, pierderi sistematice ale funcției (LOF) efectuate prin mutageneză de saturație, demonstrând potențialul acestei abordări de a caracteriza căile genetice și de a identifica gene cu funcții unice și esențiale. Tehnica mutagenezei de saturație a fost aplicată ulterior în alte organisme, de exemplu peștele zebră [4] [5] și șoarecii. [6] [7]

Abordări vizate pentru deranjarea genelor au apărut în anii 1980 cu tehnici precum recombinarea omoloagă, [8] [9] ribozimele trans-clivante, [10] [11] și tehnologiile antisens. [12] [13]

Până în anul 2000, tehnologia de interferență a ARN-ului (ARNi) a apărut ca o tehnică rapidă, simplă și ieftină pentru deranjarea țintă a genelor și a fost folosită în mod obișnuit pentru a studia in vivo funcția genică în C. elegans. [14] [15] [16] [17] Într-adevăr, în numai câțiva ani de la descoperirea sa de către Foc și colab. (1998), [18] aproape toate

19.000 de gene în C. elegans au fost analizate folosind knockdown bazat pe ARNi. [19]

Producția de biblioteci RNAi a facilitat aplicarea acestei tehnologii pe scară largă a genomului, iar metodele bazate pe RNAi au devenit abordarea predominantă pentru ecrane knockdown la nivel de genom. [ este necesară citarea ]

Cu toate acestea, abordările bazate pe ARNi la ecrane knockdown la nivel de genom au limitările lor. În primul rând, efectele ridicate în afara țintei provoacă probleme cu observații fals pozitive. [20] [21] În plus, deoarece ARNi reduce expresia genelor la nivel post-transcripțional prin vizarea ARN, ecranele bazate pe ARNi au ca rezultat doar suprimarea parțială și pe termen scurt a genelor. Deși poate fi de dorit eliminarea parțială în anumite situații, a fost necesară o tehnologie cu eficiență îmbunătățită a țintirii și mai puține efecte în afara țintei. [ este necesară citarea ]

De la identificarea inițială ca sistem imunitar adaptiv procariot, [22] sistemul bacterian de tip II grupat în mod regulat, repetat cu repetiții scurte de palindrom (CRISPR) / sistemul Cas9 a devenit un instrument simplu și eficient pentru generarea mutațiilor LOF țintite. [23] A fost aplicat cu succes pentru a edita genomii umani și a început să înlocuiască ARNi ca instrument dominant în studiile la mamifere. [24] În contextul ecranelor knockout la nivel de genom, studii recente au demonstrat că ecranele CRISPR / Cas9 sunt capabile să realizeze o epuizare extrem de eficientă și completă a proteinelor și să depășească problemele în afara obiectivelor observate cu ecranele RNAi. [25] [26] În rezumat, apariția recentă a CRISPR-Cas9 ne-a mărit dramatic capacitatea de a realiza ecrane LOF pe scară largă. Versatilitatea și programabilitatea Cas9, împreună cu zgomotul redus, eficiența ridicată a knockout-ului și efectele minime în afara țintei, au făcut din CRISPR platforma de alegere pentru mulți cercetători care se angajează în direcționarea și editarea genelor. [24] [27]

CRISPR / Cas9 Pierderea funcției Edit

Sistemul de repetări scurte ale palindromului (CRISPR) / Cas9, regrupat în mod regulat, intercalat este o tehnologie de editare a genelor care poate introduce pauze dublu-catenare (DSB) la un locus genomic țintă. Prin utilizarea unui ARN ghid unic (sgRNA), endonucleaza Cas9 poate fi livrată într-o secvență specifică de ADN în care clivează lanțul nucleotidic. [28] Specificitatea SGRNA este determinată de o secvență de 20 nt, omologă locusului genomic de interes, iar legarea la Cas9 este mediată de o regiune de schelă constantă a sgRNA. Situl țintă dorit trebuie urmat imediat (5 ’până la 3’) de un motiv adiacent (PAM) protospaciant conservat cu 3 nucleotide. [29] [30] Pentru a repara DSB-urile, celula poate utiliza îmbinarea finală neomologă cu predispoziție la erori sau recombinarea omologă. Prin proiectarea sgRNA-urilor adecvate, inserțiile sau delețiile planificate pot fi introduse în genom. În contextul ecranelor LOF la nivelul genomului, scopul este de a provoca întreruperea genei și eliminarea. [ este necesară citarea ]

Biblioteci sgRNA Edit

Construirea unei editări de bibliotecă

Pentru a efectua eliminări CRISPR pe scară largă a genomului, trebuie să fie generate colecții de sgRNA cunoscute sub numele de biblioteci sgRNA sau biblioteci knockout CRISPR. Primul pas în crearea unei biblioteci sgRNA este identificarea regiunilor genomice de interes pe baza regulilor cunoscute de direcționare sgRNA. [31] De exemplu, sgRNA-urile sunt cele mai eficiente atunci când vizează regiunile codatoare ale genelor și nu UTR-urile de 5 ’și 3’. Exonii conservați prezenți ca ținte atractive și ar trebui luată în considerare poziția în raport cu locul de început al transcrierii. [31] În al doilea rând, toate site-urile PAM posibile sunt identificate și selectate pentru. [31] Ar trebui analizate activitățile care nu sunt vizate și care nu sunt vizate, precum și conținutul GC, iar întinderile homopolimerice ar trebui evitate. [31] Cea mai utilizată endonuclează Cas9, derivată din Streptococcus pyogenes, recunoaște o secvență PAM de NGG. [32]

Mai mult, nucleotidele specifice par a fi favorizate în locații specifice. Guanina este puternic favorizată față de citozină în poziția 20 chiar lângă motivul PAM, iar în poziția 16 este preferată citozina în locul guaninei. [33] Pentru nucleotida variabilă din motivul NGG PAM, s-a demonstrat că citozina este preferată și timina este defavorizată. [33] Având în vedere astfel de criterii, biblioteca sgRNA este proiectată pe bază de calcul în jurul siturilor PAM selectate. [31] [33] [34]

Ar trebui creați mai mulți sgRNA (cel puțin 4-6) împotriva fiecărei gene pentru a limita detectarea fals-pozitivă și ar trebui incluși sgRNA de control negativ fără ținte cunoscute. [31] [33] SGRNA-urile sunt apoi create de in situ sinteză, amplificată prin PCR și clonată într-un sistem de livrare a vectorilor.

Biblioteci existente Editați

Dezvoltarea unei noi biblioteci sgRNA este un proces laborios și care consumă mult timp. În practică, cercetătorii pot selecta o bibliotecă existentă în funcție de scopul lor experimental și de liniile celulare de interes. Începând cu februarie 2020, cele mai utilizate resurse pentru ecranele knock-out CRISPR la nivel de genom au fost cele două biblioteci CRISPR Knock-Out (GeCKO) create de laboratorul Zhang. [35] Disponibile prin addgene, aceste biblioteci lentivirale vizează exoni umani și șoareci, și ambele sunt disponibile ca sistem cu un singur vector (unde sgRNA-urile și Cas9 sunt prezente pe aceeași plasmidă) sau ca sistem cu doi vectori (unde ARNg și Cas9 sunt prezenți pe plasmide separate). Fiecare bibliotecă este livrată ca două jumătăți de biblioteci, permițând cercetătorilor să analizeze cu 3 sau 6 sgRNA / genă. [36]

În afară de GeCKO, o serie de alte biblioteci CRISPR au fost generate și puse la dispoziție prin addgene. Laboratoarele Sabatini & amp Lander au în prezent 7 biblioteci separate de oameni și șoareci, inclusiv sublibrări direcționate pentru subgrupuri distincte, cum ar fi kinazele și genele ribozomale (Addgene # 51043-51048). În plus, îmbunătățirile aduse specificității sgRNA-urilor au dus la bibliotecile de „a doua generație”, cum ar fi bibliotecile Brie (Addgene # 73632) și Brunello (Addgene # 73178) generate de laboratoarele Doench și Root, precum și biblioteca knockout din Toronto (TKO) (Addgene # 1000000069) generat de laboratorul Moffat. [36]

Vectorii lentivirali Editează

Knockout-ul de gene vizat folosind CRISPR / Cas9 necesită utilizarea unui sistem de livrare pentru a introduce sgRNA și Cas9 în celulă. Deși un număr de sisteme de livrare diferite sunt potențial disponibile pentru CRISPR, [37] [38] ecranele de pierdere a funcției la nivelul genomului sunt efectuate în principal folosind vectori lentivirali de generația a treia. [35] [39] [40] Acești vectori lentivirali sunt capabili să transducă eficient o gamă largă de tipuri de celule și să se integreze stabil în genomul celulelor care se divid și care nu se divid. [41] [42] Particulele lentivirale de a treia generație sunt produse prin co-transfectarea celulelor renale embrionare umane (HEK) 293T cu:

  1. două plasmide de ambalare, una care codifică Rev și cealaltă Gag și Pol
  2. o plasmidă de înveliș interschimbabilă care codifică o glicoproteină de înveliș a unui alt virus (cel mai frecvent proteina G a virusului stomatitei veziculare (VSV-G))
  3. unul sau doi (în funcție de biblioteca aplicată) transferă plasmide, codificând pentru Cas9 și sgRNA, precum și markeri de selecție. [35] [43] [44]

Supernatantul care conține particule lentivirale este recoltat, concentrat și ulterior utilizat pentru a infecta celulele țintă. [45] Protocolul exact pentru producția lentivirală va varia în funcție de scopul cercetării și de biblioteca aplicată. [35] [43] [44] Dacă se utilizează un sistem cu doi vectori, de exemplu, celulele sunt transduse secvențial cu Cas9 și sgRNA într-o procedură în doi pași. [35] [44] Deși este mai complex, acest lucru are avantajul unui titru mai mare pentru virusul bibliotecii sgRNA. [35]

Selecție fenotipică Edit

În general, există două formate diferite de ecrane knock-out CRISPR la nivel de genom: aranjate și combinate. Într-un ecran matricial, fiecare godeu conține un SGRNA specific și cunoscut care vizează o genă specifică. [46] Întrucât SGRNA responsabil pentru fiecare fenotip este cunoscut pe baza localizării fântânii, fenotipurile pot fi identificate și analizate fără a necesita secvențierea genetică. Acest format permite măsurarea unor fenotipuri celulare mai specifice, poate prin fluorescență sau luminescență, și permite cercetătorilor să utilizeze mai multe tipuri de biblioteci și metode de livrare. [46] Pentru ecranele LOF la scară largă, totuși, formatele matriculate sunt considerate cu eficiență scăzută și costisitoare în ceea ce privește resursele financiare și materiale, deoarece populațiile de celule trebuie izolate și cultivate individual. [46]

Într-un ecran colectat, celulele crescute într-un singur vas sunt transduse în vrac cu vectori virali care conțin colectiv întreaga bibliotecă sgRNA. Pentru a se asigura că cantitatea de celule infectate cu mai mult de o particulă care conține ARNg este limitată, se folosește o multiplicitate redusă de infecție (MOI) (de obicei 0,3-0,6). [46] [47] Dovezile de până acum au sugerat că fiecare sgRNA ar trebui să fie reprezentat în cel puțin 200 de celule. [48] ​​[23] Celulele transduse vor fi selectate pentru, urmată de selecția pozitivă sau negativă pentru fenotipul de interes, iar secvențierea genetică va fi necesară pentru identificarea sgRNA-urilor integrate. [46]

Secvențierea de generație următoare și analiza accesului la amplificatoare Edit

După selecția fenotipică, ADN-ul genomic este extras din clonele selectate, alături de o populație de celule de control. [23] [46] [49] În cele mai comune protocoale pentru eliminări la nivel de genom, se creează o „bibliotecă de secvențiere de generație următoare (NGS)” printr-o reacție în lanț a polimerazei în doi pași (PCR). [23] [46] Primul pas amplifică regiunea sgRNA, folosind primerii specifici secvenței de integrare lentivirală, iar al doilea pas adaugă secvențe Illumina i5 și i7. [23] NGS al produselor PCR permite identificarea SGRNA-urilor recuperate și poate fi utilizată o etapă de cuantificare pentru a determina abundența relativă a fiecărui SGRNA. [23]

Ultimul pas al ecranului este evaluarea computerizată a SGRNA-urilor semnificativ îmbogățite sau epuizate, trasarea lor înapoi la genele lor corespunzătoare și, la rândul lor, determinarea genelor și căilor care ar putea fi responsabile pentru fenotipul observat. În acest moment sunt disponibili mai mulți algoritmi, cel mai popular fiind metoda Analiză bazată pe model a metodei CRISPR / Cas9 Knockout (MAGeCK) la nivelul genomului. [50] Dezvoltat special pentru ecranele knockout CRISPR / Cas9 în 2014, MAGeCK a demonstrat o performanță mai bună în comparație cu algoritmii alternativi la momentul respectiv [50] și a demonstrat de atunci rezultate robuste și sensibilitate ridicată în diferite condiții experimentale. [51] Începând cu 2015, algoritmul MAGeCK a fost extins pentru a introduce măsurători de control al calității și pentru a ține cont de eficiența knockout sgRNA trecută cu vederea anterior. [51] Un instrument de vizualizare bazat pe web (VISPR) a fost, de asemenea, integrat, permițând utilizatorilor să exploreze interactiv rezultatele, analiza și controalele de calitate. [51]

Mecanisme de semnalizare celulară Edit

În ultimii ani, ecranul CRISPR la nivelul genomului a apărut ca un instrument puternic pentru studierea rețelelor complexe de semnalizare celulară. [52] Semnalizarea celulară este esențială pentru o serie de procese biologice fundamentale, inclusiv creșterea celulară, proliferarea, diferențierea și apoptoza.

Un exemplu practic este identificarea genelor necesare pentru semnalizarea proliferativă în celulele canceroase. Celulele sunt transduse cu o bibliotecă CRISPR sgRNA și studiate pentru creștere în timp. Prin compararea abundenței sgRNA în celulele selectate cu un control, se poate identifica ce sgRNA devin epuizate și la rândul lor care gene pot fi responsabile pentru defectul de proliferare. Astfel de ecrane au fost utilizate pentru a identifica genele esențiale ale cancerului în leucemia mieloidă acută [53] și neuroblastom [54] și pentru a descrie diferențele specifice tumorii între liniile celulare canceroase. [55]

Identificarea partenerilor letali sintetici Edit

Terapiile orientate împotriva cancerului sunt concepute pentru a viza gene specifice, proteine ​​sau medii care contribuie la creșterea sau supraviețuirea celulelor tumorale. Cu toate acestea, după o perioadă de tratament prelungit cu aceste terapii, celulele tumorale pot dezvolta rezistență. Deși mecanismele din spatele rezistenței la medicamente pentru cancer sunt slab înțelese, cauzele potențiale includ: alterarea țintei, degradarea medicamentului, evadarea apoptozei și modificările epigenetice. [56] Rezistența este bine recunoscută și pune o problemă gravă în gestionarea cancerului. [ este necesară citarea ]

Pentru a depăși această problemă, poate fi identificat un partener letal sintetic. Ecranele LOF la nivel de genom care utilizează CRISPR-Cas9 pot fi folosite pentru ecranarea partenerilor letali sintetici. [57] Pentru aceasta, o linie celulară de tip sălbatic și o linie celulară tumorală care conține mutația cauzatoare de rezistență sunt transduse cu o bibliotecă CRISPR sgRNA. Cele două linii celulare sunt cultivate și orice celule subreprezentate sau moarte sunt analizate pentru a identifica genele potențiale partenere letale sintetice. Un studiu recent realizat de Hinze și colab. (2019) [58] au folosit această metodă pentru a identifica o interacțiune letală sintetică între medicamentul chimioterapic asparaginaza și două gene din calea de semnalizare Wnt NKD2 și LGR6.

Factori de dependență a gazdei pentru infecția virală Editați

Datorită genomului lor mic și a numărului limitat de proteine ​​codificate, virușii exploatează proteinele gazdă pentru intrare, replicare și transmitere. Identificarea acestor proteine ​​gazdă, numite și factori de dependență a gazdei (HDF), este deosebit de importantă pentru identificarea țintelor terapeutice. În ultimii ani, multe grupuri au folosit cu succes CRISPR / Cas9 la nivelul genomului ca strategie de screening pentru HDF în infecțiile virale. [59]

Un exemplu este oferit de Marceau și colab. (2017), [60] care au urmărit disecarea factorilor gazdă asociați cu infecția cu dengue și hepatita C (VHC) (doi viruși în familie Flaviviridae). ELAVL1, o proteină de legare a ARN-ului codificată de gena ELAVL1, sa dovedit a fi un receptor critic pentru intrarea VHC și s-a demonstrat o divergență remarcabilă în factorii de dependență a gazdei între cele două flaviviride. [60]

Aplicații suplimentare Editați

Aplicații suplimentare raportate ale ecranelor CRISPR la nivelul genomului includ studiul: metabolismului mitocondrial, [61] rezistența la toxina bacteriană, [62] factorii genetici ai metastazelor, [63] rezistența la medicamente împotriva cancerului, [64] Moartea celulară indusă de virusul West Nile, [65] și rețele genetice ale celulelor imune. [66] [67]

Această secțiune va aborda în mod specific ecranele CRISPR la nivel de genom. Pentru o revizuire a limitărilor CRISPR, vezi Lino și colab. (2018) [38]

Biblioteca sgRNA Edit

Ecranele CRISPR la nivel de genom vor fi în cele din urmă limitate de proprietățile bibliotecii sgRNA alese. Fiecare bibliotecă va conține un set diferit de sgRNA-uri, iar acoperirea medie pe genă poate varia.Bibliotecile disponibile în prezent tind să fie părtinitoare spre sgRNA-uri care vizează exoni precoce (5 ’) care codifică proteinele, mai degrabă decât cele care vizează domeniile proteice mai funcționale. [58] Această problemă a fost evidențiată de Hinze și colab. (2019), [58] care au remarcat faptul că genele asociate cu sensibilitatea la asparaginază nu au reușit să înscrie în ecranul lor la nivelul genomului celulelor de leucemie rezistente la asparaginază.

Dacă nu este disponibilă o bibliotecă adecvată, crearea și amplificarea unei noi biblioteci sgRNA este un proces îndelungat care poate dura multe luni. Provocările potențiale includ: (i) proiectare eficientă a ARNg (ii) asigurarea unei acoperiri cuprinzătoare a ARNg în întregul genom (iii) proiectare a coloanei vertebrale lentivirale (iv) producerea unor cantități suficiente de lentivirus de înaltă calitate (v) depășirea eficienței reduse a transformării (vi) scalare adecvată a culturii bacteriene. [68]

Menținerea acoperirii celulare SGRNA Editați

Unul dintre cele mai mari obstacole pentru screening-ul CRISPR la nivelul genomului este asigurarea unei acoperiri adecvate a bibliotecii sgRNA în întreaga populație de celule. [23] Dovezile de până acum au sugerat că fiecare SGRNA ar trebui reprezentat și menținut într-un minim de 200-300 de celule. [23] [48]

Având în vedere că protocolul standard utilizează o multitudine de infecții ale

0,3 și o eficiență de transducție de 30-40% [44] [23] numărul de celule necesare pentru a produce și menține o acoperire adecvată devine foarte mare. Cu titlu de exemplu, cea mai populară bibliotecă sgRNA umană este biblioteca GeCKO v2 creată de laboratorul Zhang [30] conține 123.411 sgRNA. Studiile care utilizează această bibliotecă transduc în mod obișnuit mai mult de 1x10 8 celule [58] [59] [69]

Deoarece CRISPR continuă să prezinte zgomot redus și efecte minime în afara țintei, o strategie alternativă este reducerea numărului de ARNg-uri pe genă pentru un ecran primar. Cut-off-uri mai puțin stricte sunt utilizate pentru selectarea hit-urilor, iar sgRNA-uri suplimentare sunt utilizate ulterior într-un ecran secundar mai specific. Această abordare este demonstrată de Doench și colab. (2016), [33] care au descoperit că & gt92% din gene recuperate utilizând protocolul standard au fost, de asemenea, recuperate folosind mai puțini sgRNA pe genă. Ei sugerează că această strategie ar putea fi utilă în studii în care extinderea este costisitoare în mod prohibitiv. [ este necesară citarea ]

Limitări lentivirale Edit

Vectorii lentivirali au anumite limitări generale. Pentru unul, este imposibil să se controleze locul în care genomul viral se integrează în genomul gazdă și acest lucru poate afecta funcțiile importante ale celulei. Vannucci și colab. [70] oferă o revizuire excelentă a vectorilor virali, împreună cu avantajele și dezavantajele lor generale. În contextul specific al ecranelor CRISPR la nivelul genomului, producerea și transducerea particulelor lentivirale este relativ laborioasă și consumă mult timp, durând aproximativ două săptămâni în total. [44] În plus, deoarece ADN-ul se integrează în genomul gazdei, livrarea lentivirală duce la expresia pe termen lung a Cas9, conducând potențial la efecte în afara țintei. [ este necesară citarea ]

Ecranele matriciale vs combinate Editați

Într-un ecran matricial, fiecare godeu conține un SGRNA specific și cunoscut care vizează o genă specifică. Ecranele aranjate permit deci profilarea detaliată a unei singure celule, dar sunt limitate de costurile ridicate și de forța de muncă necesară pentru a izola și cultiva numărul mare de populații individuale de celule. [46] Ecranele convenționale convenționale CRISPR sunt relativ simple și rentabile de realizat, dar sunt limitate la studiul întregii populații de celule. Aceasta înseamnă că fenotipurile rare pot fi mai dificil de identificat și numai fenotipurile brute pot fi selectate, de ex. supraviețuirea celulară, proliferarea sau expresia genei raportoare. [ este necesară citarea ]

Media de cultură Edit

Alegerea mediului de cultură ar putea afecta relevanța fiziologică a descoperirilor din experimentele de cultură celulară datorită diferențelor în compoziția nutrienților și concentrații. [71] O tendință sistematică în seturile de date generate a fost recent arătată pentru ecranele de mutare a genei CRISPR și RNAi (în special pentru genele metabolice), [72] și pentru profilarea metabolică a liniilor celulare canceroase. [71] De exemplu, o dependență mai puternică de ASNS (asparagină sintetază) a fost găsită în liniile celulare cultivate în DMEM, care nu are asparagină, comparativ cu liniile celulare cultivate în RPMI sau F12 (conținând asparagină). [72] Evitarea unei astfel de prejudecăți ar putea fi realizată prin utilizarea unui mediu uniform pentru toate liniile celulare ecranate și, în mod ideal, folosirea unui mediu de creștere care să reprezinte mai bine nivelurile fiziologice ale nutrienților. Recent, au fost dezvoltate astfel de tipuri de media, precum Plasmax [73] și Human Plasma Like Medium (HPLM) [74].

CRISPR + single cell ARN-seq Edit

Tehnologiile emergente își propun să combine ecrane CRISPR combinate cu rezoluția detaliată a secvențierii ARN cu o singură celulă masiv paralelă (ARN-seq). Studiile care utilizează „CRISP-seq”, [75] „CROP-seq”, [76] și „PERTURB-seq” [77] au demonstrat citiri genomice bogate, identificând cu precizie semnăturile expresiei genelor pentru eliminarea genelor individuale într-un grup complex de celule . Aceste metode au avantajul suplimentar de a produce profile transcripționale ale celulelor induse de sgRNA. [ este necesară citarea ]


Rezultate

Generarea alelelor condiționate pentru Mecp2 genă folosind metoda de floxing cu doi donatori

Am încercat să reproducem un experiment care vizează Mecp2 genă, locusul pentru care crearea alelelor floxate utilizând metoda floxing cu doi donatori a fost eficientă la 16% [11]. Am folosit aceleași SGRNA și ssODN descrise în raportul original [11]. Trei centre independente de la Australian National University (ANU) din Australia, University of Nebraska Medical Center (UNMC) din SUA și Centrul Ceh de Fenogenomică din Republica Cehă (IMG) au efectuat aceste experimente pe șoareci consangvinizați C57BL / 6N. Zigotii microinjectați au fost cultivați la blastocisti, iar ADN-urile genomice au fost analizate prin genotiparea PCR-urilor și secvențierea Sanger (Tabelul 1). Folosind un amestec de concentrație de 10 ng / μl de ARNm Cas9, 10 ng / μl de sgRNA transcris in vitro și 10 ng / μl de ssODN, nu am observat nici o direcționare reușită (adică inserarea corectă a două LoxP site-uri în cis-configurare) chiar dacă ambii sgRNA au scindat ADN-ul țintă așa cum este indicat de prezența indels sau integrarea unui LoxP la locul dorit, care a variat de la 13 la 33% (Tabelul 1).

Interesant, am remarcat prezența ocazională a mutațiilor în cadrul LoxP site-uri care indică evenimente de reparații nelegitime la locul țintă sau erori care decurg din ADN-urile donatorului sintetizate comercial. Frecvența direcționării cu succes a două LoxP site-uri în cis a fost raportat anterior ca fiind de 16% [11], pe care nu am reușit să îl reproducem.

Un studiu global al generației de alele condiționate utilizând metoda floxing cu doi donatori

Pentru a evalua mai bine eficiența metodei de floxing cu doi donatori la alți loci, am evaluat 56 de loci suplimentari din genomul șoarecilor dintr-un consorțiu de 20 de instituții din Australia, Belgia, Japonia, SUA, Marea Britanie, Republica Cehă și Canada (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Acest studiu nu a fost proiectat în prealabil, ci mai degrabă constituie date din experimentele efectuate la numeroase laboratoare care au încercat să utilizeze metoda floxing cu doi donatori pentru a genera modele de șoarece cKO. De remarcat, deoarece condițiile experimentale descrise în metoda originală nu produceau eficiențe de dorit, laboratoarele din consorțiul nostru au modificat în continuare condițiile experimentale, în încercarea de a-i spori eficiența. Raportăm o compilație a acestor date de la aceste laboratoare și, prin urmare, reprezintă în mod natural o „situație din lumea reală”, deoarece constituie multe caracteristici diverse care nu au fost planificate în prealabil. Prin urmare, acest set de date a oferit o oportunitate de a investiga efectul multor parametri diferiți asupra eficienței metodei.

Datele de doi donatori de la consorțiu au fost colectate printr-un sondaj în care anchetatorii au fost rugați să introducă detalii despre diferiți parametri ai experimentelor într-un fișier de calcul tabelar Excel. Pentru prezentarea ușoară a setului mare de date, împărțim informațiile din foaia de calcul unică în 3 foi de calcul mai mici. Aceste date și rezultatele sunt prezentate ca fișier suplimentar 1: Tabel S1, fișier suplimentar 2: Tabel S2 și fișier suplimentar 3: Tabel S3, iar rezumatul general al rezultatelor este prezentat în fișierul suplimentar 4: Tabelul S4. Din 17.887 zigote (17.557 microinjectate și 330 electroporate vezi detaliile de mai jos) zigote, 12.764 (71,4%) au fost transferate chirurgical la femelele primitoare. Femelele primitoare au dat naștere la 1718 pui (9,6% din zigotii microinjecționați / electroporați), dintre care doar 15 pui (0,87%) conțineau alelele oxigenate.

Analiza factorilor care afectează rezultatul metodei de floxing cu doi donatori

Acest set mare de date ne-a permis să analizăm diferiții factori care afectează rezultatul metodei de floxing cu doi donatori. Acești factori includ diferite tulpini de șoarece, natura loci (gene esențiale vs neesențiale), distanța dintre cele două ghiduri, mod diferit de livrări (microinjecție sau electroporare), diferite formate de reactivi, diferite concentrații de reactivi și diferențe în practicile de testare a ghidului ( unele laboratoare pre-testează ARN-urile ghid, iar altele nu). Majoritatea proiectelor au fost realizate pe un fundal C57BL / 6J (39), în timp ce 18 proiecte au folosit fundalul C57BL / 6N și 3 suplimentare au folosit un fundal de mouse hibrid (B6C3HF1, B6SJLF1, FVBCD1F1). Analiza statistică a datelor noastre (testul exact Fisher, p = 0,74) nu a găsit niciun impact al fondului tulpinii asupra eficienței metodei. Dintre cei 56 de loci vizați (49 microinjecționați și 7 electroporați), 21 au fost clasificați ca gene esențiale bazate pe letalitatea embrionară sau postnatală timpurie a șoarecilor knockout homozigoti conform bazei de date a genomului șoarecelui http://www.informatics.jax.org [12] . Ștergerile țintite anterior de 18 din 56 de loci au fost raportate pentru a genera șoareci homozigoti care au fost viabile până la vârsta adultă, iar consecințele unei mutații nule la 17 loci au fost necunoscute. Împreună, aceasta indică faptul că repartiția dintre gena țintă esențială și neesențială presupusă a fost în frecvență egală (testul exact Fisher, p = 0,76). Folosind o metodă de învățare automată publicată anterior pentru a prezice esențialitatea genelor la șoareci [13], am confirmat o frecvență egală a genelor esențiale și neesențiale în setul nostru de date (testul exact Fisher, p = 0,99) Distanța dintre sgRNA a variat de la 250 pb la 1,1 Mb cu o mediană de 2 Kb. Exonii singuri la gene întregi sau regiuni genomice reglatoare (Fișa suplimentară 1: Tabelul S1) au fost depistate. Am investigat dacă distanța dintre SGRNA este critică pentru probabilitatea de succes a metodei de floxing cu doi donatori. Nu am reușit să găsim astfel de dovezi în setul nostru de date (testul Kruskal-Wallis de sumă de rang, chi pătrat = 32, p = 0,42), deși dimensiunea eșantionului a fost prea mică pentru a forma o concluzie (mărimea efectului lui Cohen d = 0,40 cu putere 1-beta = 0,27). Dintre cei 56 de loci, 49 de loci au fost microinjecționați (fișier suplimentar 2: Tabelul S2) și 7 loci au fost electroporați (Fișier suplimentar 3: Tabelele S3). Dintre zigoturile microinjectate pentru 49 de loci cu 53 de modele independente, un număr semnificativ mai mare de zigote a fost microinjectat numai la pronucleus (26/53), mai degrabă decât la citoplasma singură (10/53) sau atât la pronucleus, cât și la citoplasmă (17/53) (Fischer testul exact p = 0,004), care este în concordanță cu practica actuală în majoritatea instalațiilor de bază transgenice (Fig. 2a). S-au folosit diferite forme de reactivi CRISPR (sintetici sau in vitro transcriși sgRNA, Cas9 mRNA sau Cas9 proteină, sau sgRNA- și plasmidă care exprimă Cas9) (Fișă suplimentară 1: Tabel S1). Majoritatea proiectelor utilizate in vitro au transcris mARN (35/59) la diferite concentrații variind de la 10 la 100 ng / μl de Cas9 mARN (Fig. 2b) și de la 10 la 50 ng / μl sgRNA. ssODN au fost livrate la o concentrație variind de la 10 la 200 ng / μl. În 18 cazuri, Cas9 a fost administrat ca o proteină cu o concentrație variind de la 10 la 75 ng / μl. Șaizeci și șapte la sută (41 de perechi din 61 de perechi) de sgRNA au fost testate într-un test de clivaj in vitro înainte de injecția zigotică. Nu am găsit nicio diferență în ceea ce privește eficiența editării între seturile SGRNA testate și cele non-testate [5 'ghiduri: testul sumelor de rang Kruskal-Wallis, chi pătrat = 0,004, p = 0,94 ghiduri de 3 ′: testul sumelor de rang Kruskal-Wallis, chi pătrat = 0,2, p = 0,65]. Interesant este că pentru 6 loci, Cas9 și sgRNA au fost livrate sub forma unei plasmide himerice sgRNA-SpCas9 (pX330) la o concentrație de 5 ng / μl. Am căutat să determinăm dacă formele de eliberare a reactivilor, cum ar fi plasmida, ribonucleoproteina (RNP) sau ARNm, ar avea un efect asupra eficienței globale în direcționare utilizând metoda de floxing cu doi donatori. Nu am reușit să găsim astfel de dovezi (testul exact al lui Fisher p = 1).

Evaluarea cantitativă a succesului metodei de floxing cu doi donatori. A Metoda injecțiilor cu zigot (pronucleară, citoplasmatică sau ambele) pentru livrarea reactivilor CRISPR utilizați de centrele de raportare. Numerele indică procentul din totalul zigotilor microinjectați sau electroporați. b Forma reactivilor CRISPR (ARNm, proteină sau plasmidă) livrați zigotilor. Numerele indică procente. c Numărul de alele editate cu succes și corect LoxP inserții din numărul total de pui născuți în viață din zigoti microinjecționați și transferați. Numerele indică numere absolute. d Tipuri de editare observate la puii născuți în viață genotipați dintr-un submostru din 25 de loci. Numerele indică valori absolute

Recent, electroporarea zigotilor a fost dezvoltată ca o metodă eficientă pentru generarea eliminării, mutațiilor punctuale, alelelor marcate sau condiționate [14,15,16,17,18,19,20]. De la consorțiul nostru, trei laboratoare și programe au studiat probabilitatea de succes a metodei. Pentru șapte loci chestionați, am remarcat succesul în inserarea unui singur LoxP alelă (Fișa suplimentară 3: Tabelul S3) din analiza blastocisturilor sau a șoarecilor vii pentru doi din cei șapte loci. În schimb, am observat o frecvență relativ mare a ștergerilor mari și indels (până la 39% din ștergerile mari) indicând o editare reușită. Cu toate acestea, niciunul dintre loci nu a arătat două LoxP site-uri inserate în cis la descendenți, sugerând că livrarea reactivilor CRISPR prin electroporare nu face o diferență statistică în obținerea unui rezultat dorit din abordarea floxingului cu doi donatori, deși numărul mare de embrioni care pot fi manipulați permite recuperarea unui numărul de alele vizate corect.

Apoi, am emis ipoteza că succesul în generarea alelelor floxed utilizând abordarea floxing cu doi donatori poate depinde de factori precum (i) eficiența sgRNA, (ii) simultaneitatea în LoxP inserție sau (iii) concentrația reactivilor Cas9, sgRNA și ssODN. Pentru a obține informații despre aceste posibilități, am analizat în continuare datele din 56 loci (Fișier suplimentar 2: Tabel S2, Fișier suplimentar 3: Tabel S3). Rețineți că descendenții pentru 54 de loci au fost analizați în stadiul postnatal (Fișa suplimentară 2: Tabelul S2, Fișa suplimentară 3: Tabelul S3) în timp ce 2 loci au fost analizați în stadiul de blastocist (Fișa suplimentară 3: Tabelul S3). În unele cazuri, loci au fost analizate în continuare pentru a evalua activitatea de scindare a ghidului. Dintre cei 1684 șoareci fondatori, 676 (40%) au organizat evenimente de editare. Două sute șaptezeci și trei de șoareci (16%) au prezentat un anumit tip de editare (indels și / sau substituții), iar șoarecii 225 (13%) și 180 (11%) au adăpostit un singur LoxP inserție sau ștergeri între cele două situri de scindare, respectiv (Fig. 2c). Șoarecii pentru 25/56 loci au fost evaluați în continuare pentru evenimente de editare suplimentare, inclusiv ștergeri mari (Fig. 2c). Dintre cei 487 șoareci fondatori analizați (din cei 25 de loci), 219 (45%) 203 (41%), 52 (10,7%)% și (13) 2,7% eșantioane nu au conținut modificări, indels, singur LoxP inserții sau ștergeri mari, respectiv (Fig. 2d). Din cele 1684 de animale analizate, doar 15 șoareci (0,87%) au fost vizați corect cu intacti LoxP site-uri din cis-configurare (Fișier suplimentar 2: Tabel S2). Dintre cei 56 de loci, doar 11 loci au fost vizați cu succes (19,6%). Numărul mediu de zigoti necesari pentru a genera 1 animal corect vizat a fost de 1192. Esențialitatea genelor nu a avut niciun impact asupra probabilității de succes a floxingului cu doi donatori (4/23 succes în țintirea letalității embrionare sau postnatale față de 5/18 pentru șoareci homozigoti viabili și 2/15 pentru letalitate embrionară sau postnatală necunoscută, test Fisher exact p = 0,27). Am observat, de asemenea, din datele noastre, dintre cei 56 de loci analizați, 14% au prezentat ștergeri între cele 2 site-uri țintă pentru scindarea Cas9. De asemenea, am remarcat o apariție relativ mare de single LoxP inserții pentru & gt 20% din șoareci genotipați (din toate loci) și câteva cazuri de trans-LoxP inserții (pe alele diferite, reducând probabilitatea introducerii corecte a LoxP (Fig. 3). Prin urmare, am emis ipoteza că succesul acestei abordări depinde de eficiența combinată a SGRNA și de probabilitatea LoxP inserare pe ambele site-uri pentru a activa două în cis Evenimentele HDR să apară simultan. Pentru a evalua acest postulat, am efectuat o analiză de regresie liniară generalizată pentru a modela relația dintre Cas9, concentrația sgRNA, eficiența scindării sgRNA, distanța dintre LoxP inserții și frecvența LoxP inserții, cu succes al metodei de floxing cu doi donatori ca rezultat pozitiv. Analizele sunt rezumate în Tabelul 2. Eficiența LoxP inserțiile la ambele situri de 5 ′ și 3 ′ pare a fi cel mai bun predictor pentru probabilitatea de succes a metodei de floxing cu doi donatori, reprezentând peste 80% din varianța totală. Cu toate acestea, acest predictor nu a fost semnificativ în modelul nostru de regresie liniară. Predictori suplimentari, cum ar fi eficiența sgRNA sau eficiența în inserția de 5 ′ sau 3 ′ LoxP a explicat aproximativ 15% din varianța totală, dar niciunul dintre acești predictori nu a fost semnificativ în modelul nostru. Concentrația mRNA Cas9 a reprezentat mai puțin de 0,1% din varianța totală, dar a fost semnificativă statistic (p & lt 0,01) în modelul de regresie liniară generalizată ca predictor pentru succesul metodei de floxing cu doi donatori. Cu toate acestea, succesul metodei de floxing cu doi donatori a fost marginal corelat cu o creștere a concentrației de ARNm Cas9 (r 2 Pearson = 0,27, p = 0,08). Din analiza noastră, dimensiunea eșantionului de succes LoxP inserții în cis a fost prea mic pentru a exclude definitiv orice alți predictori (mărimea efectului lui Cohen d = 0,4, putere 1-beta = 0,41). Am argumentat că analiza numai a locurilor unde LoxP au fost observate evenimente de inserție care pot prezice mai bine probabilitatea succesului acestei abordări (chiar dacă aceste inserții nu au fost în cis-configurări). Pentru a testa acest lucru, am efectuat o analiză statistică numai asupra acelor loci care conțin LoxP site-uri și a exclus loci lipsă LoxP inserții în oricare dintre site-urile de decolteare a ghidului.Am identificat 28 de astfel de loci (dintr-un total de 56 de loci). Nu am găsit nicio diferență în prezicerea rezultatului analizei anterioare cu toți loci (date neprezentate). Împreună, aceste rezultate sugerează că prezența a două evenimente de recombinare simultane părea să fie cel mai bun predictor pentru generarea a două alele floxed în cis deși concentrația mai mare de ARNm Cas9 părea să fie un alt predictor, efectul său a fost marginal.

Rezultatele dorite și nedorite ale metodei de floxing cu doi donatori. a-f Locus de tip sălbatic care arată exonii 3, 4 și 5 ai unei gene ipotetice în care exonul 4 este ales ca exon țintă pentru inserare LoxP site-uri. A Rezultatul dorit care arată o alelă oxigenată. Apariția generală a fost & lt 1%. bf Diverse rezultate nedorite, inclusiv unul singur LoxP inserarea site-ului (b), numai indels creat pe unul sau ambele site-uri (c), combinatie de LoxP inserție și indels (d), ștergere între cele două site-uri de scindare (e), si nu indel sau fără evenimente de inserare (f)

Pentru a determina în continuare dacă factori precum compoziția nucleotidică a donatorului ssODN, lungimea ssODN sau concentrația de reactivi ar putea explica succesul acestei abordări, am aplicat un algoritm de învățare automată (păduri aleatorii) pe toți loci care au fost vizați corect sau incorect [21 ]. Validarea încrucișată a modelului de învățare automată prin agregarea bootstrapping (alias „eroare din geantă”), nu am găsit nicio asociere între succesul acestei abordări și concentrația reactivilor (p valoare = 0,84), 5 ′ și 3 ′ ssODN lungimea donatorului (respectiv p valori de 0,21 și 0,18) sau compozițiile nucleotidice la locul țintă. În general, am observat o performanță scăzută a modelului atunci când am inclus lungimea donatorului ssODN, compoziția nucleotidică la locul țintă și concentrația reactivilor cu o „valoare estimată în afara sacului” la 0,222. Pe scurt, evaluarea regresiei combinată cu analiza învățării automate nu a putut identifica în mod clar factori specifici care să contribuie la ineficiența metodei de oxigenare cu doi donatori.

Efectul factorului de abilitate de microinjecție asupra rezultatului metodei de dezoxidare a doi donatori

Deoarece microinjecția este unul dintre cei mai critici pași în experimentele de editare a genomului șoarecilor, am postulat că eficiența acestei metode ar putea depinde de abilitățile personalului tehnic care efectuează microinjecția. Dacă abilitatea influențează rezultatul (de exemplu, alelele de reducere a succesului), am putea determina o diferență între laboratoare. Am evaluat acest parametru prin calcularea corelației dintre laborator ca valoare predictivă și rezultatul pozitiv (alele oxigenate cu succes). Nu am găsit nicio dovadă a unui efect de „abilitate” care să influențeze rezultatul pozitiv (testul de sumă de rang Kruskal-Wallis, chi pătrat = 22, p = 0.16).

Ca o analiză independentă pentru efectul abilităților de microinjecție, am adunat un alt tip de set de date de mari dimensiuni (creând modele knockin folosind un donator SSODN) de la consorțiul nostru care a evaluat abilitățile de microinjecție ale personalului tehnic din consorțiul nostru. Cele 20 de laboratoare care au participat la acest studiu (inclusiv laboratorul ANU care a testat numai Mecp2 locus) a avut o rată de succes de aproape 90% în generarea modelelor knockin donator cu un singur ssODN 293 din 330 loci încercate au avut succes cu o eficiență generală de 13% șoareci născuți în viață care au alelele knockin dorite (Fișier suplimentar 5: Tabel S5) , sugerând că toate laboratoarele care au participat la studiu au suficiente abilități de microinjecție pentru a crea modele folosind instrumentul CRISPR. Prin urmare, lipsa succesului în generarea alelelor floxed utilizând metoda de floxing cu doi donatori la cele 20 de laboratoare participante nu s-a datorat lipsei abilităților tehnice în zigot-microinjecție a reactivilor CRISPR.

Evaluarea eficienței altor metode de generare a alelelor condiționate

În ultimii ani, au fost descrise câteva alte metode de generare a alelelor condiționate utilizând ADN cu un singur donator, cum ar fi Easi-CRISPR (adăugiri eficiente cu inserții ssDNA-CRISPR) sau CLICK (CRISPR cu alele cKO inducătoare de lssDNA) sau metode bazate pe ADN dublu catenar (dsDNA) [17, 22, 23]. Am emis ipoteza că unul dintre motivele pentru eficiența mai scăzută a metodei de floxing cu doi donatori ar putea fi faptul că necesită două evenimente de recombinare (fiecare dintre acestea fiind supusă în mod independent la evenimente mutaționale), în timp ce doar un singur eveniment de recombinare este suficient pentru „ADN-ul cu un singur donator”. ”Metode. Pentru a testa acest postulat, am folosit metoda ADN-ului cu un singur donator de a genera o alelă condiționată în mai mulți loci care inițial nu au reușit folosind metoda de floxing cu doi donatori. Dintre cele 61 de proiecte de direcționare independente (pentru 56 de loci), 48 de proiecte au eșuat cu metoda cu doi donatori. Nouă dintre aceste proiecte au fost apoi repetate folosind abordări lungi ale donatorului de ADN monocatenar (4 cu Ușor-Metoda CRISPR, 5 cu metoda CLICK), 2 proiecte cu metoda donatorului dsDNA și 1 proiect cu direcționarea celulelor ES tradiționale. În mod remarcabil, toate metodele cu un singur donator au condus la o generație de succes a alelelor cu oxigen (fișier suplimentar 6: Tabel S6). Dintre cele 11 proiecte care utilizează metode Easi-CRISPR, CLICK sau dsDNA, am constatat că rata medie de succes a fost de 18,3% ± 13% cu o medie de 13,2%, ceea ce corespunde unei îmbunătățiri medii de 20 de ori față de metoda de floxing cu doi donatori. (Testul Kolmogorov-Smirnov p valoare & lt 10 −5). Am examinat dacă această rată medie de succes de 18,3% s-ar putea datora unei eficiențe mai mari de decolteare a sgRNA-urilor. Analiza noastră a eficiențelor de decupare a ghidajului de 5 ′ și 3 ′ (prin numărarea indel sau LoxP evenimente de inserție) indică faptul că nu este cazul (Mann-Whitney U test cu un respectiv p valoarea de 0,43 și 1 sugerează că diferența de eficiență a editării nu este motivul acestei discrepanțe în rata de succes între aceste metode).

O posibilă explicație pentru diferența mare de eficiență dintre metoda de floxing cu doi donatori și cele care utilizează ADN-ul unui singur donator este că acesta din urmă necesită un singur eveniment de recombinare, în timp ce metoda de floxing cu doi donatori se bazează pe două evenimente de recombinare care au loc în cis. Dacă această ipoteză este adevărată, ar trebui să observăm o diferență în frecvența inserției simultane în siturile 3 'și 5' între aceste metode. Pentru a stabili această ipoteză, am comparat frecvența inserțiilor simultane de LoxP site-uri în 3 ′ și 5 ′ pentru livrarea Easi-CRISPR, CLICK sau dsDNA și metoda de floxing cu doi donatori și au găsit într-adevăr o diferență (6 ± 20% floxing cu doi donatori vs 76 ± 27% pentru alte metode Mann-Whitney U Test W = 1, p valoare = 4,7 × 10 −5) confirmând ipoteza noastră.

Recent, au fost raportate două modificări ale metodei de floxing cu doi donatori. Prima modificare implică inserarea celei de-a doua LoxP loc printr-o a doua injecție de reactivi în zigotii derivați de la liniile de șoarece ale primei injecții conținând doar unul din cele două LoxP inserții [24]. Ne referim la această metodă ca „a doua LoxP inserție în generația următoare. ” A doua modificare implică introducerea LoxP situri la două intervale separate în același zigot primul în stadiul de 1 celulă și al doilea în stadiul de 2 celule [25]. Ne referim la această metodă ca „livrare secvențială a LoxP site-uri." Am testat 7 (din cele 48 eșuate) proiecte folosind „al doilea LoxP inserarea în următoarea generație ”(fișierul suplimentar 6: Tabelul S6) metoda și toate au dus la generarea cu succes a alelelor floxate. Am constatat o eficiență de 14 ± 6% și, respectiv, 27 ± 32%, în prima și în a doua LoxP experimente de inserție, care indică faptul că frecvența recombinării este mult mai mare atunci când se introduce doar unul LoxP este tratat ca un eveniment separat. Cu alte cuvinte, eficiența evenimentelor de inserție „cu un singur donator” (evenimente individuale) este semnificativ mai mare decât eficiența combinată a inserției a doi donatori. Chiar dacă această abordare durează aproape 1 an pentru a fi finalizată, metoda generează în cele din urmă alele floxate la o eficiență echivalentă cu „abordările cu un singur donator”, cum ar fi Easi-CRISPR, CLICK sau livrarea de dsDNA. De asemenea, am testat „abordarea de livrare secvențială”, a doua modificare a metodei de floxing cu doi donatori introdusă mai sus, pe trei loci noi, dar niciuna nu a produs alele condiționate (Fișier suplimentar 7: Tabel S7). Observăm că am testat doar modul de livrare cu microinjecție pentru a evalua abordarea de livrare secvențială. Având în vedere că electroporarea este considerată o abordare mai puțin dură (deoarece menține o cantitate suficient de rezonabilă de viabilitate a zigotului după cele două runde consecutive de introducere a reactivului), sugerăm că această metodă poate necesita o evaluare suplimentară la locuri suplimentare pentru a trage o concluzie cu privire la eficiența sa.


Mulțumiri

Mulțumim lui O. Shalem, D.A. Scott și P.D. Hsu pentru discuții și perspective utile R. Belliveau pentru sprijinul general al cercetării R. Macrae pentru citirea critică a manuscrisului și întregul laborator Zhang pentru sprijin și sfaturi. O.O.A. a fost susținut de o bursă Paul și Daisy Soros, o bursă Friends of the McGovern Institute și Centrul Poitras pentru tulburări afective. J.S.G. a fost susținut de o bursă DOE Computational Science Graduate Fellowship. F.Z. a fost sprijinit de NIH prin Institutul Național de Sănătate Mentală (NIMH acordă 5DP1-MH100706 și 1R01-MH110049), National Science Foundation (NSF), Howard Hughes Medical Institute (HHMI), New York Stem Cell Foundation, Simons Foundation, Paul G. Allen Family Foundation și Vallee Foundation și James și Patricia Poitras, Robert Metcalfe și David Cheng. F.Z. este un New York Stem Cell Foundation-Robertson Investigator. Reactivii sunt disponibili prin intermediul forumurilor de asistență Addgene, iar instrumentele de calcul sunt disponibile prin intermediul site-ului web al laboratorului Zhang (http://www.genome-engineering.org).


Cuprins

Secvențe repetate Edit

Descoperirea repetărilor de ADN grupate a avut loc independent în trei părți ale lumii. Prima descriere a ceea ce mai târziu s-ar numi CRISPR este de la cercetătorul Yoshizumi Ishino al Universității din Osaka și colegii săi în 1987. Au clonat accidental o parte dintr-o secvență CRISPR împreună cu „iap "gene (conversia izozimică a fosfatazei alcaline) din genomul Escherichia coli [14] [15] aceasta a fost ținta lor. Organizarea repetărilor a fost neobișnuită. Secvențele repetate sunt de obicei aranjate consecutiv, fără secvențe diferite intercalate. [15] [11] Nu știau funcția repetărilor grupate întrerupte.

În 1993, cercetătorii din Mycobacterium tuberculosis în Olanda a publicat două articole despre un grup de repetări directe întrerupte (DR) în această bacterie. Au recunoscut diversitatea secvențelor care au intervenit repetările directe între diferite tulpini de M. tuberculoza [16] și a folosit această proprietate pentru a proiecta o metodă de tastare care a fost denumită spoligotipare, care este încă în uz astăzi. [17] [18]

Francisco Mojica de la Universitatea din Alicante din Spania a studiat repetările observate la organismele arhaeale din Haloferax și Haloarcula specii și funcția acestora. Supervizorul lui Mojica a presupus la momentul în care repetările grupate aveau un rol în segregarea corectă a ADN-ului replicat în celule fiice în timpul diviziunii celulare, deoarece plasmidele și cromozomii cu matrice repetate identice nu puteau coexista în Haloferax volcanii. Transcrierea repetărilor întrerupte a fost, de asemenea, observată pentru prima dată, aceasta a fost prima caracterizare completă a CRISPR. [18] [19] Până în 2000, Mojica a efectuat un sondaj de literatură științifică și unul dintre studenții săi a efectuat o căutare în genomurile publicate cu un program conceput de el însuși. Au identificat repetări întrerupte la 20 de specii de microbi ca aparținând aceleiași familii. [20] În 2001, Mojica și Ruud Jansen, care căutau repetări suplimentare întrerupte, au propus acronimul CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) pentru a atenua confuzia care rezultă din numeroasele acronime utilizate pentru a descrie secvențele din literatura științifică. [19] [21] În 2002, Tang și colab. au arătat dovezi că CRISPR repetă regiuni din genomul Archaeoglobus fulgidus au fost transcrise în molecule de ARN lungi care au fost ulterior procesate în ARN-uri mici cu lungime unitară, plus câteva forme mai lungi de 2, 3 sau mai multe unități de repetiție a distanțierilor. [22] [23]

În 2005, cercetătorul în iaurt Rodolphe Barrangou, a descoperit că Streptococcus thermophilus, după provocări iterative de fagi, dezvoltă o rezistență crescută a fagilor, iar această rezistență sporită se datorează încorporării unor secvențe de distanțare CRISPR suplimentare. [24] Compania daneză de alimente Danisco, pentru care la acea vreme lucra Barrangou, a dezvoltat apoi rezistența la fagi S. thermophilus tulpini pentru utilizare în producția de iaurt. Danisco a fost cumpărat ulterior de DuPont, care „deține aproximativ 50 la sută din piața mondială a culturii lactate”, iar tehnologia a devenit obișnuită. [25]

Sisteme asociate CRISPR Edit

O adăugire majoră la înțelegerea CRISPR a venit cu observația lui Jansen că grupul de repetare procariote a fost însoțit de un set de gene omoloage care alcătuiesc sistemele asociate CRISPR sau cas gene. Patru cas gene (cas 1-4) au fost recunoscute inițial. Proteinele Cas au prezentat motive de helicază și nuclează, sugerând un rol în structura dinamică a locurilor CRISPR. [26] În această publicație, acronimul CRISPR a fost folosit ca denumire universală a acestui model. Cu toate acestea, funcția CRISPR a rămas enigmatică.

În 2005, trei grupuri independente de cercetare au arătat că unele distanțieri CRISPR sunt derivate din ADN-ul fagic și ADN extracromozomal, cum ar fi plasmidele. [30] [31] [32] De fapt, distanțierii sunt fragmente de ADN adunate de la viruși care anterior au încercat să atace celula. Sursa distanțierilor a fost un semn că CRISPR /cas sistemul ar putea avea un rol în imunitatea adaptivă la bacterii. [27] [33] Toate cele trei studii care propuneau această idee au fost inițial respinse de revistele de profil înalt, dar au apărut în cele din urmă în alte reviste. [34]

Prima publicație [31] care propunea un rol al CRISPR-Cas în imunitatea microbiană, de către Mojica și colaboratorii de la Universitatea din Alicante, a prezis un rol pentru transcrierea ARN a distanțierilor în recunoașterea țintei într-un mecanism care ar putea fi analog cu interferența ARN sistem utilizat de celulele eucariote. Koonin și colegii săi au extins această ipoteză de interferență ARN propunând mecanisme de acțiune pentru diferitele subtipuri CRISPR-Cas în funcție de funcția prezisă a proteinelor lor. [35]

Munca experimentală a mai multor grupuri a dezvăluit mecanismele de bază ale imunității CRISPR-Cas. În 2007, au fost publicate primele dovezi experimentale conform cărora CRISPR era un sistem imunitar adaptativ. [11] [4] O regiune CRISPR din România Streptococcus thermophilus distanțieri dobândiți din ADN-ul unui bacteriofag infectant. Cercetătorii au manipulat rezistența S. thermophilus la diferite tipuri de fagi prin adăugarea și ștergerea distanțierilor a căror secvență se potrivește cu cele găsite în fagii testați. [36] [37] În 2008, Brouns și Van der Oost au identificat un complex de proteine ​​Cas (numite Cascade) care în E coli tăiați precursorul ARN CRISPR în repetări în molecule de ARN mature care conțin distanțier numite ARN CRISPR (ARNr), care au rămas legate de complexul proteic. [38] Mai mult, s-a constatat că Cascade, crRNA și o helicază / nuclează (Cas3) erau necesare pentru a oferi o gazdă bacteriană imunitate împotriva infecției cu un virus ADN. Prin proiectarea unui CRISPR antivirus, au demonstrat că două orientări ale ARNc (sens / antisens) asigură imunitate, indicând faptul că ghidurile de ARNc vizează dsADN. În acel an, Marraffini și Sontheimer au confirmat că o secvență CRISPR de S. epidermidis ADN vizat și nu ARN pentru a preveni conjugarea. Această constatare a fost în contradicție cu mecanismul propus de ARN-interferență asemănător cu imunitatea CRISPR-Cas, deși un sistem CRISPR-Cas care vizează ARN străin a fost găsit mai târziu în Pyrococcus furiosus. [11] [36] Un studiu din 2010 a arătat că CRISPR-Cas taie ambele catene de fag și ADN plasmidic în S. thermophilus. [39]

Cas9 Edit

Cercetătorii au studiat un sistem CRISPR mai simplu din Streptococcus pyogenes care se bazează pe proteina Cas9. Endonucleaza Cas9 este un sistem cu patru componente care include două molecule mici: ARNc și ARN CRISPR transactivant (tracrARN). [40] [41] Jennifer Doudna și Emmanuelle Charpentier au reproiectat endonucleaza Cas9 într-un sistem cu două componente mai ușor de gestionat prin fuzionarea celor două molecule de ARN într-un "ARN cu un singur ghid" care, combinat cu Cas9, ar putea găsi și tăia ținta ADN specificată de ARN-ul ghid. Această contribuție a fost atât de semnificativă încât a fost recunoscută de Premiul Nobel pentru chimie în 2020. Prin manipularea secvenței de nucleotide a ARN-ului de ghidare, sistemul artificial Cas9 ar putea fi programat pentru a viza orice secvență de ADN pentru clivaj. [42] Un alt grup de colaboratori din Virginijus Šikšnys împreună cu Gasiūnas, Barrangou și Horvath au arătat că Cas9 din S. thermophilus Sistemul CRISPR poate fi, de asemenea, reprogramat pentru a viza un site ales de el prin schimbarea secvenței acestuia. Aceste progrese au alimentat eforturile de a edita genomii cu sistemul CRISPR-Cas9 modificat. [18]

Grupuri conduse de Feng Zhang și George Church au publicat simultan descrieri ale editării genomului în culturi de celule umane folosind CRISPR-Cas9 pentru prima dată. [11] [43] [44] De atunci a fost utilizat într-o gamă largă de organisme, inclusiv drojdia de panificație (Saccharomyces cerevisiae), [45] [46] [47] agentul patogen oportunist Candida albicans, [48] [49] pește zebră (Danio rerio), [50] muște de fructe (Drosophila melanogaster), [51] [52] furnici (Harpegnathos saltator [53] și Ooceraea biroi [54]), țânțari (Aedes aegypti [55]), nematode (Caenorhabditis elegans), [56] plante, [57] șoareci, [58] [59] maimuțe [60] și embrioni umani. [61]

CRISPR a fost modificat pentru a face factori de transcripție programabili care permit oamenilor de știință să vizeze și să activeze sau să reducă la tăcere gene specifice. [62]

Sistemul CRISPR-Cas9 a demonstrat că face modificări genetice eficiente în zigotii tripronucleari umani descriși pentru prima dată într-o lucrare din 2015 de către oamenii de știință chinezi P. Liang și Y. Xu. Sistemul a realizat un clivaj de succes al beta-hemoglobinei mutante (HBB) la 28 din 54 de embrioni. 4 din cei 28 de embrioni au fost recombinați cu succes folosind un șablon donator dat de oamenii de știință. Oamenii de știință au arătat că în timpul recombinării ADN a catenei clivate, secvența endogenă omologă HBD concurează cu modelul donator exogen. Repararea ADN-ului la embrionii umani este mult mai complicată și mai particulară decât la celulele stem derivate. [63]

Cas12a (fost Cpf1) Edit

În 2015, nucleaza Cas12a (cunoscută anterior sub numele de Cpf1 [64]) a fost caracterizată în sistemul CRISPR / Cpf1 al bacteriei Francisella novicida. [65] [66] Numele său original, dintr-o definiție a familiei de proteine ​​TIGRFAM construită în 2012, reflectă prevalența subtipului CRISPR-Cas în Prevotella și Francisella linii. Cas12a a arătat câteva diferențe cheie față de Cas9, inclusiv: provocarea unei tăieturi „eșalonate” în ADN dublu catenar, spre deosebire de tăierea „directă” produsă de Cas9, bazându-se pe un PAM „bogat în T” (oferind site-uri de direcționare alternative Cas9) și necesitând doar un ARN CRISPR (crARN) pentru direcționarea cu succes. Prin contrast, Cas9 necesită atât ARNc, cât și un ARNc transactivant (tracrARN).

Aceste diferențe pot oferi Cas12a unele avantaje față de Cas9. De exemplu, crRNA-urile mici ale Cas12a sunt ideale pentru editarea genomului multiplexat, deoarece mai multe dintre ele pot fi ambalate într-un singur vector decât SGRNA-urile Cas9. De asemenea, surplomburile lipicioase de 5 ′ lăsate de Cas12a pot fi utilizate pentru asamblarea ADN care este mult mai specifică țintei decât clonarea tradițională a enzimei de restricție. [67] În cele din urmă, Cas12a clivează ADN 18-23 perechi de baze în aval de situl PAM. Aceasta înseamnă că nu există nicio întrerupere a secvenței de recunoaștere după reparații, astfel încât Cas12a permite mai multe runde de clivaj ADN. Prin contrast, deoarece Cas9 taie doar 3 perechi de baze în amonte de situl PAM, calea NHEJ are ca rezultat mutații indel care distrug secvența de recunoaștere, prevenind astfel runde suplimentare de tăiere. În teorie, rundele repetate de scindare a ADN-ului ar trebui să provoace o oportunitate sporită pentru a avea loc editarea genomică dorită. [68] O caracteristică distinctivă a Cas12a, în comparație cu Cas9, este că, după tăierea țintei sale, Cas12a rămâne legată de țintă și apoi scindează alte molecule ssDNA nediscriminatoriu. [69] Această proprietate se numește activitate de „clivaj colateral” sau „trans-clivaj” și a fost exploatată pentru dezvoltarea diferitelor tehnologii de diagnostic. [70] [71]

Cas13 (fost C2c2) Edit

În 2016, nucleaza Cas13a (cunoscută anterior ca C2c2) din bacterie Leptotrichia shahii a fost caracterizat. Cas13 este un endonuclează ARN ghidat de ARN, ceea ce înseamnă că nu clivează ADN, ci doar ARN monocatenar. Cas13 este ghidat de crARN-ul său către o țintă ssRNA și leagă și clivează ținta. Similar cu Cas12a, Cas13 rămâne legat de țintă și apoi clivează alte molecule ssRNA nediscriminatoriu. [72] Această proprietate de clivaj colateral a fost exploatată pentru dezvoltarea diverselor tehnologii de diagnostic. [73] [74] [75]

Repetări și distanțieri Editați

Matricea CRISPR este alcătuită dintr-o secvență de lider bogată în AT urmată de repetări scurte care sunt separate de distanțieri unici. [76] Repetările CRISPR variază în mod obișnuit între 28 și 37 de perechi de baze (bps), deși pot exista până la 23 bp și până la 55 bp. [77] Unii prezintă simetrie diadică, ceea ce implică formarea unei structuri secundare, cum ar fi o buclă stem („ac de păr”) în ARN, în timp ce altele sunt concepute pentru a fi nestructurate. Dimensiunea distanțierilor în diferite matrice CRISPR este de obicei de la 32 la 38 bp (intervalul 21 la 72 bp). [77] Noile distanțieri pot apărea rapid ca parte a răspunsului imun la infecția cu fagi. [78] Există, de obicei, mai puțin de 50 de unități din secvența de repetare-distanțare într-o matrice CRISPR. [77]

Structuri ARN CRISPR Edit

Gene CAS și subtipuri CRISPR Edit

Clustere mici de cas genele sunt adesea localizate alături de matricele de repartizare CRISPR. Colectiv 93 cas genele sunt grupate în 35 de familii pe baza similarității secvenței proteinelor codificate. 11 din cele 35 de familii formează cas nucleu, care include familiile de proteine ​​Cas1 până la Cas9. Un locus CRISPR-Cas complet are cel puțin o genă aparținând cas nucleu. [79]

Sistemele CRISPR-Cas se împart în două clase. Sistemele de clasa 1 folosesc un complex de proteine ​​Cas multiple pentru a degrada acizii nucleici străini. Sistemele de clasa 2 folosesc o singură proteină Cas mare în același scop. Clasa 1 este împărțită în tipurile I, III și IV. Clasa 2 este împărțită în tipurile II, V și VI. [80] Cele 6 tipuri de sisteme sunt împărțite în 19 subtipuri. [81] Fiecare tip și majoritatea subtipurilor sunt caracterizate printr-o „genă semnătură” găsită aproape exclusiv în categorie. Clasificarea se bazează și pe complementul cas gene care sunt prezente. Majoritatea sistemelor CRISPR-Cas au o proteină Cas1. Filogenia proteinelor Cas1 este în general de acord cu sistemul de clasificare. [79] Multe organisme conțin mai multe sisteme CRISPR-Cas, sugerând că sunt compatibile și pot împărți componente. [82] [83] Distribuția sporadică a subtipurilor CRISPR / Cas sugerează că sistemul CRISPR / Cas este supus transferului de gene orizontal în timpul evoluției microbiene.

Imunitatea CRISPR-Cas este un proces natural al bacteriilor și archaea. [98] CRISPR-Cas previne infecția bacteriofagelor, conjugarea și transformarea naturală prin degradarea acizilor nucleici străini care intră în celulă. [36]

Achiziționarea distanțierilor Editați

Când un microb este invadat de un bacteriofag, prima etapă a răspunsului imun este capturarea ADN-ului fagului și introducerea acestuia într-un loc CRISPR sub forma unui distanțier. Cas1 și Cas2 se găsesc în ambele tipuri de sisteme imune CRISPR-Cas, ceea ce indică faptul că acestea sunt implicate în achiziționarea distanțierilor. Studiile de mutație au confirmat această ipoteză, arătând că îndepărtarea cas1 sau cas2 a oprit achiziția distanțierului, fără a afecta răspunsul imun CRISPR. [99] [100] [101] [102] [103]

Au fost caracterizate mai multe proteine ​​Cas1 și structurile lor au fost rezolvate. [104] [105] [106] Proteinele Cas1 au diverse secvențe de aminoacizi. Cu toate acestea, structurile lor cristaline sunt similare și toate proteinele Cas1 purificate sunt nucleaze / metalaze dependente de metal care se leagă de ADN într-un mod independent de secvență. [82] Proteinele Cas2 reprezentative au fost caracterizate și posedă fie activitate endoribonuclează specifică (ADN ADS- [107], fie ADN-ADN (108) [109] (ADN ADS) (cu un singur fir).

În sistemul I-E al E coli Cas1 și Cas2 formează un complex în care un dimer Cas2 leagă doi dimeri Cas1. [110] În acest complex Cas2 îndeplinește un rol de schelă non-enzimatică, [110] legând fragmente dublu catenare de ADN invadator, în timp ce Cas1 leagă flancurile monocatenare ale ADN-ului și catalizează integrarea lor în matricele CRISPR. [111] [112] [113] Noi distanțieri sunt de obicei adăugați la începutul CRISPR lângă secvența lider creând o înregistrare cronologică a infecțiilor virale. [114] În E coli o proteină de tip histonă numită factor gazdă de integrare (IHF), care se leagă de secvența lider, este responsabilă pentru acuratețea acestei integrări. [115] IHF îmbunătățește, de asemenea, eficiența integrării în sistemul de tip I-F al Pectobacterium atrosepticum. [116] dar în alte sisteme pot fi necesari diferiți factori de gazdă [117]

Protospacer motive adiacente Edit

Analiza bioinformatică a regiunilor genomelor fagice care au fost excizate ca distanțieri (denumiți protospazieri) au arătat că nu au fost selectați aleatoriu, ci s-au găsit adiacente secvențelor ADN scurte (3-5 bp) denumite motive adiacente protospazere (PAM). Analiza sistemelor CRISPR-Cas a arătat că PAM-urile sunt importante pentru tipurile I și tip II, dar nu și pentru sistemele de tip III în timpul achiziției. [32] [118] [119] [120] [121] [122] În sistemele de tip I și tip II, protospazierele sunt excizate la pozițiile adiacente unei secvențe PAM, cu celălalt capăt al distanțierului tăiat folosind un mecanism de riglă, menținând astfel regularitatea mărimii distanțierului în matricea CRISPR. [123] [124] Conservarea secvenței PAM diferă între sistemele CRISPR-Cas și pare a fi legată evolutiv de Cas1 și secvența lider. [122] [125]

Noile distanțieri sunt adăugate la o matrice CRISPR într-o manieră direcțională, [30] apărând preferențial, [78] [118] [119] [126] [127] dar nu exclusiv, adiacente [121] [124] la secvența lider. Analiza sistemului de tip I-E din E coli a demonstrat că prima repetare directă adiacentă secvenței lider este copiată, cu distanțierul nou dobândit inserat între prima și a doua repetare directă. [102] [123]

Secvența PAM pare a fi importantă în timpul inserării distanțierului în sistemele de tip I-E. Această secvență conține o nucleotidă finală puternic conservată (nt) adiacentă primului nt al protospacerului. Acest nt devine baza finală în prima repetare directă. [103] [128] [129] Acest lucru sugerează că echipamentul de achiziție a distanțierului generează surplomburi monocatenare în poziția a doua până la ultima a repetării directe și în PAM în timpul inserării distanțierului. Cu toate acestea, nu toate sistemele CRISPR-Cas par să împărtășească acest mecanism, deoarece PAM-urile din alte organisme nu prezintă același nivel de conservare în poziția finală. [125] Este probabil ca în aceste sisteme, un capăt contondent să fie generat chiar la sfârșitul repetării directe și al protospacerului în timpul achiziției.

Variante de inserție Editați

Analiza Sulfolobus solfataricus CRISPR-urile au dezvăluit complexități suplimentare modelului canonic de inserare a distanțierilor, întrucât unul dintre cele șase locații CRISPR a introdus noi distanțieri în mod aleatoriu în întreaga sa matrice CRISPR, spre deosebire de inserarea cea mai apropiată de secvența lider. [124]

CRISPR-urile multiple conțin multe distanțieri la același fag. Mecanismul care cauzează acest fenomen a fost descoperit în sistemul de tip I-E al E coli. S-a detectat o îmbunătățire semnificativă în achiziționarea distanțierilor acolo unde distanțierii vizează deja fagul, chiar și nepotrivirile la protospazier. Această „amorsare” necesită ca proteinele Cas implicate atât în ​​achiziție, cât și în interferență să interacționeze între ele. Distanțierii nou achiziționați care rezultă din mecanismul de amorsare se găsesc întotdeauna pe același fir cu distanțierul de amorsare. [103] [128] [129] Această observație a condus la ipoteza că mașinile de achiziție alunecă de-a lungul ADN-ului străin după amorsare pentru a găsi un nou protospacer. [129]

Biogeneza Edit

CRISPR-ARN (crARN), care ghidează ulterior nucleaza Cas către țintă în timpul etapei de interferență, trebuie generat din secvența CRISPR. ARNc este transcris inițial ca parte a unui singur transcris lung care cuprinde o mare parte din matricea CRISPR. [28] Acest transcript este apoi scindat de proteinele Cas pentru a forma ARNc. Mecanismul de producere a ARNc diferă între sistemele CRISPR / Cas. În sistemele de tip I-E și tip I-F, proteinele Cas6e și respectiv Cas6f recunosc buclele stem [130] [131] [132] create prin împerecherea repetărilor identice care flancează ARNc. [133] Aceste proteine ​​Cas scindează transcrierea mai lungă la marginea regiunii împerecheate, lăsând un singur ARNc împreună cu un rest mic din regiunea repetată pereche.

Sistemele de tip III folosesc, de asemenea, Cas6, totuși repetările lor nu produc bucle stem. Decolteul apare în schimb prin înfășurarea mai lungă a transcrierii în jurul Cas6 pentru a permite decolteul chiar în amonte de secvența de repetare. [134] [135] [136]

Sistemele de tip II nu au gena Cas6 și utilizează în schimb RNaseIII pentru clivaj. Sistemele funcționale de tip II codifică un ARN extra mic care este complementar secvenței repetate, cunoscut sub numele de crARN transactivant (tracrARN). [40] Transcrierea tracrRNA și a transcriptului primar CRISPR are ca rezultat împerecherea bazelor și formarea dsRNA la secvența repetată, care este ulterior vizată de RNaseIII pentru a produce crARN. Spre deosebire de celelalte două sisteme, ARNc nu conține distanțierul complet, care este în schimb trunchiat la un capăt. [91]

CrARN-urile se asociază cu proteinele Cas pentru a forma complexe ribonucleotidice care recunosc acizii nucleici străini. CrARN-urile nu prezintă nicio preferință între firele de codificare și cele necodificate, ceea ce indică un sistem de direcționare a ADN-ului ghidat de ARN. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] Complexul de tip I-E (denumit în mod obișnuit Cascade) necesită cinci proteine ​​Cas legate la un singur crARN. [140] [141]

Editare interferență

În timpul etapei de interferență în sistemele de tip I, secvența PAM este recunoscută pe catena complementară crARN și este necesară împreună cu recoacerea crARN. În sistemele de tip I, asocierea corectă a bazelor între crARN și protospazier semnalează o schimbare conformațională în Cascade care recrutează Cas3 pentru degradarea ADN-ului.

Sistemele de tip II se bazează pe o singură proteină multifuncțională, Cas9, pentru etapa de interferență. [91] Cas9 necesită atât ARNc cât și tracrARN pentru a funcționa și clivează ADN folosind domeniile sale endonucleaze HNH duale și RuvC / RNaseH. În sistemele de tip II este necesară împerecherea de bază între PAM și genomul fagului. Cu toate acestea, PAM este recunoscut pe aceeași catenă ca și ARNc (catenă opusă sistemelor de tip I).

Sistemele de tip III, precum tipul I, necesită șase sau șapte proteine ​​Cas care se leagă de ARNc. [142] [143] Sistemele de tip III analizate din S. solfataricus și P. furiosus ambele vizează ARNm-ul fagilor, mai degrabă decât genomul ADN-ului fagic [83] [143], ceea ce poate face ca aceste sisteme să fie capabile în mod unic să vizeze genomii fagici pe bază de ARN. [82] De asemenea, s-a descoperit că sistemele de tip III vizează ADN în plus față de ARN utilizând o proteină Cas diferită în complex, Cas10. [144] Clivajul ADN-ului sa dovedit a fi dependent de transcripție. [145]

Mecanismul de diferențiere a sinelui de ADN-ul străin în timpul interferenței este încorporat în ARNc și, prin urmare, este probabil comun tuturor celor trei sisteme. De-a lungul procesului distinct de maturare a fiecărui tip major, toate crARN-urile conțin o secvență distanțieră și o porțiune a repetării la unul sau ambele capete. Este secvența de repetare parțială care împiedică sistemul CRISPR-Cas să vizeze cromozomul ca împerecherea bazelor dincolo de secvența distanțieră semnalizează sine și previne clivajul ADN-ului. [146] Enzimele CRISPR ghidate de ARN sunt clasificate ca enzime de restricție de tip V.

Se crede că genele cas din modulele adaptor și efector ale sistemului CRISPR-Cas au evoluat din două module ancestrale diferite. Un element de tip transposon numit casposon care codifică integraza de tip Cas1 și potențial alte componente ale modulului de adaptare a fost inserat lângă modulul efector ancestral, care probabil a funcționat ca un sistem imunitar independent înnăscut. [147] Genele cas1 și cas2 foarte conservate ale modulului adaptor au evoluat din modulul ancestral, în timp ce o varietate de gene cas efectoare clasa 1 au evoluat din modulul efector ancestral. [148] Evoluția acestor diferite gene ale modulului efector clasa 1 a fost ghidată de diferite mecanisme, cum ar fi evenimente de duplicare. [149] Pe de altă parte, fiecare tip de modul efector de clasa 2 a apărut din inserții independente ulterioare de elemente genetice mobile. [150] Aceste elemente genetice mobile au luat locul mai multor module efectoare genetice pentru a crea module efector genetice unice care produc proteine ​​mari care îndeplinesc toate sarcinile necesare ale modulului efector. [150] Regiunile distanțiale ale sistemelor CRISPR-Cas sunt preluate direct din elemente genetice mobile străine și, astfel, evoluția lor pe termen lung este greu de urmărit. [151] S-a constatat că evoluția ne-aleatorie a acestor regiuni distanțier depinde în mare măsură de mediu și de elementele genetice mobile străine particulare pe care le conține. [152]

CRISPR / Cas poate imuniza bacteriile împotriva anumitor fagi și astfel poate opri transmiterea. Din acest motiv, Koonin a descris CRISPR / Cas ca un mecanism de moștenire lamarckian. [153] Cu toate acestea, acest lucru a fost contestat de un critic care a menționat: „Ar trebui să ne amintim de [Lamarck] pentru binele pe care l-a contribuit la știință, nu pentru lucrurile care seamănă doar cu teoria sa superficială. ascunde modul simplu și elegant în care evoluează cu adevărat evoluția ”. [154] Dar pe măsură ce au fost efectuate studii mai recente, a devenit evident că regiunile distanțierilor dobândite ale sistemelor CRISPR-Cas sunt într-adevăr o formă de evoluție lamarckiană deoarece sunt mutații genetice care sunt dobândite și apoi transmise. [155] Pe de altă parte, evoluția mecanismului genei Cas care facilitează sistemul evoluează prin evoluția darwiniană clasică. [155]

Editare coevoluție

Analiza secvențelor CRISPR a relevat coevolutia genomului gazdă și a virusului. [156] Proteinele Cas9 sunt bogate în bacterii patogene și comensale. Reglarea genei mediate de CRISPR / Cas poate contribui la reglarea genelor bacteriene endogene, în special în timpul interacțiunii cu gazdele eucariote. De exemplu, Francisella novicida folosește un ARN unic, mic, asociat CRISPR / Cas (scaRNA) pentru a reprima un transcript endogen care codifică o lipoproteină bacteriană care este esențială pentru F. novicida pentru a diminua răspunsul gazdei și a promova virulența. [157]

Modelul de bază al evoluției CRISPR îl constituie distanțierii recent încorporați care conduc fagii pentru a-și muta genomul pentru a evita răspunsul imun al bacteriilor, creând diversitate atât în ​​fagi cât și în populațiile gazdă. Pentru a rezista unei infecții cu fagi, secvența distanțierului CRISPR trebuie să corespundă perfect cu secvența genei fagului țintă. Fagii pot continua să-și infecteze gazdele date de mutații punctuale în distanțier. [146] O stringență similară este necesară în PAM sau tulpina bacteriană rămâne sensibilă la fag. [119] [146]

Editare Tarife

Un studiu din 124 S. thermophilus tulpinile au arătat că 26% din toate distanțierele erau unice și că locurile CRISPR diferite prezentau rate diferite de achiziție a distanțierilor. [118] Unele locuri CRISPR evoluează mai rapid decât altele, ceea ce a permis determinarea relațiilor filogenetice ale tulpinilor. O analiză genomică comparativă a arătat că E coli și S. enterica evoluează mult mai încet decât S. thermophilus. Tulpinile acestuia din urmă care divergeau acum 250 de mii de ani conțineau încă același complement distanțier. [158]

Analiza metagenomică a două biofilme de drenaj cu mină acidă a arătat că unul dintre CRISPR-urile analizate conținea deleții extinse și adăugări de distanțieri față de celălalt biofilm, sugerând o activitate / prevalență mai mare a fagilor într-o comunitate decât cealaltă. [78] În cavitatea bucală, un studiu temporal a determinat că 7-22% dintre distanțieri au fost împărțiți pe parcursul a 17 luni într-un individ, în timp ce mai puțin de 2% au fost împărțiți între indivizi. [127]

Din același mediu a fost urmărită o singură tulpină folosind primerii PCR specifici sistemului CRISPR. Rezultatele la nivel larg ale prezenței / absenței distanțatorului au arătat o diversitate semnificativă. Cu toate acestea, acest CRISPR a adăugat 3 distanțieri pe parcursul a 17 luni, [127] sugerând că chiar și într-un mediu cu o diversitate semnificativă CRISPR, unii loci evoluează lent.

CRISPR-urile au fost analizate din metagenomii produși pentru proiectul microbiomului uman. [159] Deși majoritatea erau specifice corpului, unele dintre ele sunt împărtășite pe scară largă între indivizi. Unul dintre acești loci provine din specii streptococice și conținea aproximativ 15.000 de distanțieri, dintre care 50% erau unici. Similar studiilor vizate ale cavității bucale, unele au arătat o evoluție redusă în timp. [159]

Evoluția CRISPR a fost studiată la chimiostate folosind S. thermophilus pentru a examina direct ratele de achiziție a distanțierilor. Intr-o saptamana, S. thermophilus tulpinile au dobândit până la trei distanțieri atunci când au fost provocate cu un singur fag. [160] În același interval, fagul a dezvoltat polimorfisme cu nucleotide unice care s-au fixat în populație, sugerând că țintirea a împiedicat replicarea fagilor în absența acestor mutații. [160]

O alta S.termofil experimentul a arătat că fagii se pot infecta și replica la gazde care au un singur distanțier de direcționare. Un altul a arătat că gazdele sensibile pot exista în medii cu titruri ridicate de fagi. [161] Chimostatul și studiile observaționale sugerează numeroase nuanțe ale CRISPR și ale (co) evoluției fagilor.

CRISPR-urile sunt larg distribuite între bacterii și arhee [87] și prezintă unele asemănări ale secvenței. [133] Cea mai notabilă caracteristică a lor este distanțierile repetitive și repetările directe. Această caracteristică face CRISPR-uri ușor identificabile în secvențe lungi de ADN, deoarece numărul de repetări scade probabilitatea unei potriviri fals pozitive. [162]

Analiza CRISPR-urilor în datele metagenomice este mai dificilă, deoarece locurile CRISPR nu se asamblează de obicei, datorită naturii lor repetitive sau prin variația tulpinii, care confundă algoritmii de asamblare. Acolo unde sunt disponibili numeroși genomi de referință, reacția în lanț a polimerazei (PCR) poate fi utilizată pentru a amplifica matricele CRISPR și a analiza conținutul distanțier. [118] [127] [163] [164] [165] [166] Cu toate acestea, această abordare oferă informații numai pentru CRISPR-uri specific direcționate și pentru organismele cu reprezentare suficientă în bazele de date publice pentru a proiecta primeri de reacție în lanț polimerază (PCR) fiabili. Primerii degenerați cu repetare specifică pot fi folosiți pentru a amplifica distanțiere CRISPR direct din probe de mediu, ampliconii care conțin două sau trei distanțiere pot fi apoi asamblate computerizat pentru a reconstitui matrice CRISPR lungi. [166]

Alternativa este de a extrage și reconstrui matricele CRISPR din datele metagenomice ale pistolului. Acest lucru este mai dificil din punct de vedere al calculului, în special în cazul tehnologiilor de secvențiere de a doua generație (de exemplu, 454, Illumina), deoarece lungimile scurte de citire împiedică să apară mai mult de două sau trei unități repetate într-o singură citire. Identificarea CRISPR în citirile brute a fost realizată folosind pur de novo identificarea [167] sau prin utilizarea secvențelor de repetare directă în matricele CRISPR parțial asamblate de la contigs (segmente de ADN suprapuse care reprezintă împreună o regiune consensuală a ADN) [159] și secvențe de repetare directă de la genomurile publicate [168] ca cârlig pentru identificarea repetărilor directe în citiri individuale.

O altă modalitate prin care bacteriile se pot apăra împotriva infecției cu fagi este de a avea insule cromozomiale. Un subtip de insule cromozomiale numite insulă cromozomială inductă de fag (PICI) este excizat dintr-un cromozom bacterian la infecția cu fagi și poate inhiba replicarea fagilor. [169] PICI-urile sunt induse, excizate, replicate și în cele din urmă ambalate în capside mici de anumiți fagi stafilococici temperați. PICI utilizează mai multe mecanisme pentru a bloca reproducerea fagilor. În primul mecanism, Ppi codificat PICI blochează diferențial maturarea fagului prin legarea sau interacțiunea specifică cu fagul TerS, prin urmare blochează formarea complexului fag TerS / TerL responsabil pentru ambalarea ADN-ului fagului. În cel de-al doilea mecanism, PICI CpmAB redirecționează proteina morfogenetică a capsidei fagice pentru a face 95% din capsidă de dimensiune SaPI și ADN-ul fagic poate să împacheteze doar 1/3 din genomul lor în aceste capside mici și, prin urmare, să devină fag neviabil. [170] Al treilea mecanism implică două proteine, PtiA și PtiB, care vizează LtrC, care este responsabilă pentru producerea de proteine ​​virion și de liză. Acest mecanism de interferență este modulat de o proteină modulatoare, PtiM, se leagă de una dintre proteinele care interferează cu interferența, PtiA și, prin urmare, atinge nivelul necesar de interferență. [171]

Un studiu a arătat că fagul ICP1 litic, care vizează în mod specific Vibrio cholerae serogrupul O1, a achiziționat un sistem CRISPR / Cas care vizează un V. holera Element de tip PICI. Sistemul are 2 loci CRISPR și 9 gene Cas. Se pare că este omolog cu sistemul I-F găsit în Yersinia pestis. Mai mult, la fel ca sistemul bacterian CRISPR / Cas, ICP1 CRISPR / Cas poate dobândi noi secvențe, ceea ce permite fagului și gazdei să co-evolueze. [172]

S-a arătat că anumiți viruși arheici poartă mini-matrice CRISPR care conțin unul sau două distanțiere. S-a demonstrat că distanțierii din matricile CRISPR suportate de virus vizează alți viruși și plasmide, sugerând că tablourile mini-CRISPR reprezintă un mecanism de excludere heterotipică a superinfecției și participă la conflicte intervirale. [166]

Editarea genei CRISPR Edit

Tehnologia CRISPR a fost aplicată în industria alimentară și agricolă pentru a proiecta culturi probiotice și pentru a imuniza culturile industriale (pentru iaurt, de exemplu) împotriva infecțiilor. De asemenea, este utilizat în culturi pentru a spori randamentul, toleranța la secetă și valoarea nutrițională. [173]

Până la sfârșitul anului 2014 au fost publicate aproximativ 1000 de lucrări de cercetare care menționează CRISPR. [174] [175] Tehnologia a fost utilizată pentru inactivarea funcțională a genelor din liniile celulare și celule umane, pentru a studia Candida albicans, pentru a modifica drojdiile utilizate pentru fabricarea biocombustibililor și pentru a modifica genetic tulpinile de cultură. [175] Hsu și colegii săi afirmă că abilitatea de a manipula secvențele genetice permite ingineria inversă care poate afecta pozitiv producția de biocombustibili. [177] Abordările bazate pe CRISPR care utilizează Cas12a au fost recent utilizate în modificarea cu succes a unui număr mare de specii de plante. [178]

În iulie 2019, CRISPR a fost utilizat pentru a trata experimental un pacient cu o tulburare genetică. Pacienta era o femeie în vârstă de 34 de ani, cu boală de celule falciforme. [179]

În februarie 2020, s-au făcut progrese în ceea ce privește tratamentele HIV, cu 60-80% din ADN-ul îndepărtat la șoareci și unele fiind complet libere de virus după modificări care implică atât LASER ART, o nouă terapie antiretrovirală, cât și CRISPR. [180]

În martie 2020, virusul modificat CRISPR a fost injectat în ochiul pacientului în încercarea de a trata amavroza congenitală Leber. [181]

În viitor, editarea genei CRISPR ar putea fi utilizată pentru a crea specii noi sau pentru a revigora speciile dispărute din cele înrudite. [182]

Reevaluările bazate pe CRISPR ale afirmațiilor pentru relațiile gen-boală au dus la descoperirea unor anomalii potențial importante. [183]

CRISPR ca instrument de diagnosticare Edit

Nucleazele asociate CRISPR s-au dovedit a fi utile ca instrument pentru testarea moleculară datorită capacității lor de a viza în mod specific secvențe de acid nucleic într-un fundal înalt de secvențe non-țintă. În 2016, nucleaza Cas9 a fost utilizată pentru a epuiza secvențele de nucleotide nedorite în bibliotecile de secvențiere de generația următoare, necesitând în același timp doar 250 de picograme de intrare inițială de ARN. [184] Începând din 2017, nucleazele asociate CRISPR au fost, de asemenea, utilizate pentru testarea directă a diagnosticului acizilor nucleici, până la sensibilitatea unei singure molecule. [185] [186]

Prin cuplarea diagnosticului bazat pe CRISPR la procese enzimatice suplimentare, este posibilă detectarea moleculelor dincolo de acizii nucleici. Un exemplu de tehnologie cuplată este Profilarea transcrierii in vitro (SPRINT) bazată pe SHERLOCK. SPRINT poate fi utilizat pentru a detecta o varietate de substanțe, cum ar fi metaboliții din probele pacienților sau contaminanții din probele de mediu, cu un randament ridicat sau cu dispozitive portabile de punct de îngrijire. [187] Platformele CRISPR / Cas sunt, de asemenea, explorate pentru detectare [188] [189] [190] [191] [192] și inactivarea SARS-CoV-2, virusul care cauzează COVID-19. [193]


Screening

Ecranele permit o cercetare rapidă a unui număr mare de gene candidate sau site-uri genomice pentru implicarea în calea dvs. sau fenotipul de interes. Îmbunătățirile în producția de oligo combinate și manipularea datelor mari, combinate cu eficiența livrării lentivirale, permit cercetătorilor să ia în considerare mii de gene candidate simultan, fie ca o bibliotecă, fie ca un panou mai concentrat. Definim bibliotecile ca colecții de genom întreg de panouri de clone CRISPR sunt subseturi de gene mai mici. În general, panourile și bibliotecile pot fi asamblate în două formate: grupate (mii de gARN într-un singur tub) sau aranjate (un gARN per godeu în plăci cu 96 de godeuri). Ambele abordări oferă răspunsuri rapide la întrebări mai mari, oferind avantaje semnificative față de metodele anterioare care necesitau un proces intensiv în timp și muncă de interogare a genelor candidate pe rând.

Oferim o varietate de soluții de screening, inclusiv bibliotecile GeCKO combinate de la Biblioteca CRISPR Lentivirală cu genom întreg și Sanger Arrayed Whole Genome Lentiviral pentru a efectua ecrane de knockout genetice mari (8). Și, în curând, bibliotecile CRISPR / Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) pentru om și șoarece sunt puse la dispoziție pentru screeningul la nivel genom al fenotipurilor de activare transcripțională!


INTRODUCERE

Dezvoltarea instrumentelor de editare a genomului de înaltă precizie, cum ar fi nucleazele țintite, a accelerat progresele în știința fundamentală a plantelor și în creșterea culturilor (Zhang, Massel, Godwin și Gao, 2018). Repetatele repetate palindromice scurte intercalate în mod regulat (CRISPR) și proteina sa asociată cu CRISPR (Cas), este o nuclează ghidată de ARN dezvoltată din sistemul imunitar adaptiv microbian prin refacere pentru editarea genomului (Barrangou și Marraffini, 2014). Tehnologiile CRISPR-Cas pot facilita ingineria eficientă a genomului în celulele eucariote (Komor, Badran și Liu, 2017). Direcționarea precisă a proteinei Cas9 se realizează prin specificarea unei secvențe de direcționare de 20 nucleotide (nt) în ARN-ul său unic de ghidare (sgRNA Ran și colab., 2013). Aplicarea instrumentelor de editare a genomului, cum ar fi CRISPR-Cas9, în studiile genetice și pentru ingineria culturilor cu trăsături dorite a devenit un accent major atât pentru oamenii de știință a plantelor, cât și pentru crescătorii de plante de precizie (Borrill, 2020). Inducerea pauzelor dublu catenare specifice ADN-ului și repararea ulterioară prin ligaturare directă duce uneori la erori precum inserții sau ștergeri (indels) care duc la pierderea funcției genice (knockouts Rodgers & McVey, 2016).

Grauele domestice moderne sunt derivate din evenimente de hibridizare antice dintre speciile progenitoare ancestrale. Cele două grâuri cele mai cultivate sunt grâul dur tetraploid sau pastele (Triticum turgidum ssp. dur L.) și grâu de pâine hexaploidă (Triticum aestivum L.) (Matsuoka, 2011). Ambele specii au genomi mari - dur, ∼12 și hexaploidie, ∼16 Gbp - constând în principal din elemente repetitive. În cadrul acestor specii poliploide, fiecare genă există de obicei ca două copii în grâul dur tetraploid sau ca trei în grâul de pâine hexaploidă. Copiile genelor homeologice sunt de obicei foarte conservate în structura și secvența genelor dintre subgenomi (& gt95% Adamski și colab., 2020).

Prima utilizare raportată a CRISPR-Cas9 pentru a produce o plantă de grâu modificată cu genom stabil a fost eliminarea țintită a Mildew Locus O (Mlo), conferind rezistență la agentul patogen al mucegaiului Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt), acest lucru a fost realizat în combinație cu o tehnologie anterioară de editare a genei, nucleaze efectoare de tip activator de transcripție (TALEN Wang și colab., 2014). De la acest prim raport, genele de grâu cu interes științific fundamental și agronomic au fost vizate folosind tehnologia CRISPR-Cas9, cum ar fi genele α-gliadine pentru a reduce conținutul de boabe de gluten (Sánchez-León și colab., 2018), TaGW2 pentru a crește greutatea boabelor (Zhang, Li și colab., 2018), TaZIP4-B2 pentru a înțelege crossoverul omolog meiotic (Rey și colab., 2018), TaQsd1 pentru a reduce încolțirea pre-recoltare (Abe și colab., 2019), TaMTL și CENH3 pentru inducerea plantelor haploide (Liu și colab., 2019 Lv și colab., 2020).

Aici, descriem protocoale derivate experimental pentru selectarea țintelor sgRNA, construim asamblarea și analizăm screeningul pentru editarea genomului în grâul hexaploid.


CRISPR-Cas: biologie, mecanisme și relevanță

Procariotele au dezvoltat mai multe mecanisme de apărare pentru a se proteja de prădătorii virali. Repetările palindromice scurte intercalate în mod regulat (CRISPR) și proteinele asociate acestora (Cas) prezintă un sistem imunitar adaptiv procariot care memorează infecțiile anterioare prin integrarea unor secvențe scurte de genomi invadatori - denumiți distanțiere - în locusul CRISPR. Distanțierele intercalate cu repetări sunt exprimate ca mici ARN-uri CRISPR de ghid (crARN) care sunt folosite de proteinele Cas pentru a viza secvența invadatorilor, în mod specific la o infecție reapariție. Capacitatea sistemului minim CRISPR-Cas9 de a viza secvențe de ADN folosind ARN-uri programabile a deschis noi căi în editarea genomului într-o gamă largă de celule și organisme cu potențial ridicat în aplicații terapeutice. În timp ce numeroase studii științifice au aruncat lumină asupra proceselor biochimice din spatele sistemelor CRISPR-Cas, totuși, mai multe aspecte ale etapelor imunității nu au încă o înțelegere suficientă. Această revizuire rezumă descoperirile majore din domeniul CRISPR-Cas, discută rolul CRISPR-Cas în imunitatea procariotă și alte proprietăți fiziologice și descrie aplicațiile sistemului ca tehnologie de editare ADN și agent antimicrobian.

Acest articol face parte din numărul tematic „Noua bacteriologie”.

1. Introducere

Fiind cele mai abundente entități de pe planeta noastră, virușii bacterieni și arheici (bacteriofagi sau fagi) prezintă o amenințare constantă la adresa vieții procariote. Pentru a rezista fagilor, procariotele au dezvoltat mai multe strategii de apărare. În ultimul deceniu, sistemul imunitar procariot CRISPR-Cas (grupat în mod regulat cu repetiții scurte palindromice asociate cu CRISPR) a atras atenția din ce în ce mai mult în comunitatea științifică nu numai datorită naturii sale adaptative unice, ci și datorită potențialului său terapeutic. Această revizuire urmărește să rezume descoperirile majore făcute în domeniul CRISPR-Cas și descrie rolurile biologice ale sistemului în apărarea antivirală și alte căi biologice, precum și semnificația acestuia pentru aplicații medicale.

CRISPR-Cas este singurul sistem imunitar adaptiv din procariote cunoscut până acum. În acest sistem, sunt utilizate ARN-uri mici de ghidare (crARN) pentru interferențe specifice secvenței cu acizi nucleici invadatori. CRISPR-Cas cuprinde un locus genomic numit CRISPR care adăpostește elemente repetitive scurte (repetări) separate prin secvențe unice (distanțieri), care pot proveni din elemente genetice mobile (MGE), cum ar fi bacteriofagii, transpozonii sau plasmidele. Așa-numita matrice CRISPR este precedată de o secvență de lider bogată în AT și este de obicei flancată de un set de cas gene care codifică proteinele Cas [1-4]. Până în prezent, sistemele CRISPR-Cas pot fi împărțite în două clase principale, care sunt clasificate în continuare în șase tipuri și mai multe subtipuri [5-7]. Clasificarea se bazează pe apariția proteinelor Cas efectoare care transmit imunitate prin scindarea acizilor nucleici străini. În sistemele CRISPR-Cas de clasa 1 (tipurile I, III și IV), modulul efector constă dintr-un complex multi-proteic, în timp ce sistemele de clasa 2 (tipurile II, V și VI) utilizează o singură proteină efectoare [5].

2. Mecanisme moleculare: adaptare, maturare și interferență

Sistemul CRISPR-Cas acționează într-o manieră specifică secvenței prin recunoașterea și scindarea ADN-ului sau ARN-ului străin. Mecanismul de apărare poate fi împărțit în trei etape: (i) adaptarea sau achiziționarea distanțierului, (ii) biogeneza crRNA și (iii) interferența țintă (figura 1).

Figura 1. Model simplificat al mecanismelor de imunitate ale sistemelor CRISPR-Cas de clasa 1 și clasa 2. Sistemele CRISPR-Cas sunt compuse dintr-un cas operon (săgeți albastre) și o matrice CRISPR care cuprinde secvențe de repetare identice (dreptunghiuri negre) care sunt intercalate de distanțieri derivați de fagi (dreptunghiuri colorate). La infecția cu fagi, o secvență a ADN-ului invadator (protospacer) este încorporată în matricea CRISPR de complexul Cas1-Cas2. Matricea CRISPR este apoi transcrisă într-un precursor lung ARN CRISPR (pre-crRNA), care este procesat în continuare de Cas6 în sistemele de tip I și III (procesarea în sistemele CRISPR-Cas de tip I-C de Cas5d). În sistemele CRISPR-Cas de tip II, maturarea crARN necesită tracrARN, RNaza III și Cas9, în timp ce în sistemele de tip V-A Cpf1 singur este suficient pentru maturarea crARN. În starea de interferență a sistemelor de tip I, Cascade este ghidată de crRNA pentru a lega ADN-ul străin într-o manieră specifică secvenței și ulterior recrutează Cas3 care degradează catena deplasată prin activitatea sa exonucleolitică 3 ′ - 5 ′. Sistemele CRISPR-Cas de tip III-A și de tip III-B utilizează complexe Csm și, respectiv, Cmr pentru clivarea ADN-ului (triunghiuri roșii) și a transcrierilor acestuia (triunghiuri negre). Un complex ribonucleoproteic format din Cas9 și un tracrRNA: crARN duplex țintește și clivează invadând ADN-ul în sistemele CRISPR-Cas de tip II. Proteina efectoare Cpf1 ghidată de crARN este responsabilă pentru degradarea țintă în sistemele de tip V. Triunghiurile roșii reprezintă locurile de decolteare ale mașinilor de interferență.

(a) Adaptare

Într-o primă fază, o secvență distinctă a MGE invadator numită protospacer este încorporată în matricea CRISPR, obținând un nou distanțier. Acest eveniment permite organismului gazdă să memoreze materialul genetic al intrusului și afișează natura adaptativă a acestui sistem imunitar [1]. Două proteine, Cas1 și Cas2, par a fi implicate omniprezent în procesul de achiziție a distanțierilor, deoarece acestea pot fi găsite în aproape toate tipurile CRISPR-Cas. Excepție fac sistemele CRISPR-Cas de tip III-C, III-D și IV, care nu conțin proteine ​​omoloage. Mai mult, tipul V-C prezintă o compoziție minimă, întrucât cuprinde doar o proteină efectoare supusă numită C2C3 și un omolog Cas1 [5-7]. În ultimii ani, s-au făcut progrese majore în dezvăluirea principiilor biochimice și genetice ale imunității CRISPR-Cas. Cu toate acestea, mecanismul de achiziție a distanțierului nu este încă pe deplin înțeles [8,9]. Selecția protospazierelor și prelucrarea acestora înainte de integrare rămân pe larg obscure în multe tipuri CRISPR-Cas. Cu toate acestea, descoperirile recente au arătat lumina asupra biochimiei procesului de integrare a distanțierilor. S-a demonstrat că Cas1 și Cas2 ale sistemului de tip I-E al Escherichia coli formează un complex care promovează integrarea de noi distanțieri într-un mod care amintește de integrazele virale și de transpozaze [10-13]. Deși atât Cas1, cât și Cas2 sunt nucleaze [14-16], situsul activ catalitic al Cas2 este dispensabil pentru achiziționarea distanțierului [10-12]. Un nou distanțier este de obicei încorporat la limita lider-repetare a matricei CRISPR [1] în timp ce prima repetare a matricei este duplicată [17,18].

Mecanismele diferitelor tipuri CRISPR-Cas ar putea fi conservate doar într-o anumită măsură, deoarece mai multe studii au arătat variații în ceea ce privește cerințele și obiectivele mecanismului de adaptare. În timp ce Cas1 și Cas2 sunt suficiente pentru a promova achiziția de distanțieri în majoritatea sistemelor CRISPR-Cas de tip I studiate, tipul I-B necesită în continuare Cas4 pentru adaptare [19]. Sistemul CRISPR-Cas de tip I-F al Pseudomonas aeruginosa în plus, necesită mecanisme de interferență pentru a promova absorbția de noi distanțieri [20]. În mod similar, sistemele de tip II-A necesită Csn2, Cas9 și tracrRNA (trans activarea ARN CRISPR - vezi mai multe detalii mai jos) pentru achiziție [1,21,22]. Un alt mod de adaptare, până acum unic, a fost dezvăluit pentru o proteină Cas1 de tip III-B care este fuzionată cu o transcriptază inversă. Aici, a fost raportată achiziția atât din ADN, cât și din ARN [23].

Selectarea unei secvențe țintă care este integrată în locusul CRISPR nu este aleatorie.S-a demonstrat că în sistemele CRISPR-Cas de tip I, II și V, o succesiune scurtă, numită motiv adiacent protospacer (PAM), este situată direct lângă protospacer și este crucială pentru achiziție și interferență [24-29]. În sistemele CRISPR-Cas de tip II-A, domeniul de recunoaștere PAM al Cas9 este responsabil pentru selecția protospacerului [21,22]. Se crede că, după selectarea protospacerului, Cas9 recrutează Cas1, Cas2 și posibil Csn2 pentru integrarea noului distanțier în matricea CRISPR. Această caracteristică poate fi păstrată în toate sistemele CRISPR-Cas clasa 2, deși lipsesc dovezi experimentale. Pentru tipul I-E, complexul Cas1 – Cas2 este suficient pentru selectarea și integrarea distanțierilor, deși sa raportat că prezența complexului de interferență crește frecvența distanțierilor integrați care sunt adiacenți unui PAM adecvat [24,25]. Mai mult decât atât, într-un proces numit amorsare, mașinile de interferență ale mai multor sisteme CRISPR-Cas de tip I pot stimula absorbția crescută a unor noi distanțieri la legarea ghidată de ARNc la un protospacer care a fost selectat la o primă infecție [19,25,30]. Acest proces afișează un mod de adaptare distinct în comparație cu achiziția de distanțier naiv, deoarece necesită strict un distanțier preexistent care să corespundă țintei. De obicei, duce la rate mai mari de achiziție de la protospazieri care se află în imediata apropiere a sitului țintă [25]. Interesant este că achiziția de distanțiere amorsată nu depinde de clivajul țintei, deoarece funcționează și pentru site-urile țintă degenerate care ar duce de obicei la interferențe afectate [31]. Mecanismul exact rămâne obscur, dar s-a demonstrat că complexul de interferență poate recruta Cas1 și Cas2 în timpul legării independente de PAM la ADN [32].

(b) Biogeneză

Pentru a permite imunitatea, matricea CRISPR este transcrisă într-un lung ARNc precursor (pre-crARN) care este procesat în continuare în crARN-uri de maturitate care conțin secvențele memorate ale invadatorilor [33,34]. În sistemele de tip I și III, membrii familiei Cas6 efectuează etapa de procesare producând specii intermediare de ARNc care sunt flancate de o etichetă scurtă de 5 ′. O excepție este dată de sistemele de tip I-C, care nu codifică proteinele Cas6. Aici, proteina Cas5d procesează pre-ARNc, rezultând în ARNc intermediari cu o etichetă 5 'de 11 nt [33,35-38]. Tunderea suplimentară a capătului 3 'al crRNA intermediar de către o nuclează necunoscută poate produce și produce specii de crARN maturi compuse dintr-o porțiune completă distanțieră (capătul 5') și o porțiune repetată (capătul 3 '), care prezintă de obicei o structură de ac de păr în majoritatea sistemelor de tip I [39-41]. Maturarea crARN-urilor din sistemele CRISPR-Cas de clasa 2 diferă semnificativ. În sistemele de tip II, tracrARN este necesar pentru procesarea pre-ARNCR. Secvența anti-repetare a acestui ARN permite formarea unui duplex de ARN cu fiecare dintre repetările pre-crARN, care este stabilizat de Cas9. Duplexul este apoi recunoscut și procesat de gazda RNase III, obținându-se o formă intermediară de crARN care suferă o maturare suplimentară printr-un mecanism încă necunoscut pentru a conduce la ARN-ul mic de ghidare matur [42]. Un mecanism independent de RNase III a fost descoperit în sistemul CRISPR-Cas de tip II-C al Neisseria meningitidis. Aici, secvențele promotorului au fost identificate pentru a se afla în fiecare repetare și unii au reușit să inițieze transcrierea care duce la specii de ARNc intermediare. Chiar dacă a fost observată prelucrarea 3 ′ a RNase III a duplexului crRNA: tracrRNA, a fost dispensabilă pentru interferență [43]. În sistemul CRISPR-Cas de tip V-A, s-a demonstrat că Cpf1 are o funcție duală în timpul imunității CRISPR-Cas. Cpf1 procesează ARNc prematuri [28] și, după un alt eveniment de maturare de natură necunoscută, folosește ARNc procesate pe care le-a generat pentru a scinda ADN-ul țintă [28, 29].

(c) Interferențe

În ultima etapă a imunității, crARN-urile mature sunt utilizate ca ghiduri pentru a interfera în mod specific cu acizii nucleici invadatori. Sistemele de clasa 1 folosesc complexe asemănătoare Cascade (complex asociat CRISPR pentru apărare antivirală) pentru a realiza degradarea țintă, în timp ce în sistemele de clasa 2, o singură proteină efectoră este suficientă pentru interferența țintă [29,39,44-49]. Pentru a evita auto-direcționarea, sistemele de tip I, II și V recunosc în mod specific secvența PAM care este situată în amonte (tipurile I și V) sau în aval (tipul II) de protospacer [26,28,29,31,45,50– 52]. În sistemele de tip III, discriminarea între sine și non-sine se realizează prin intermediul etichetei 5 ′ a crARN-ului matur, care nu trebuie să bazeze perechea cu ținta pentru a permite degradarea de către complex [53].

În sistemele de tip I, Cascade localizează ADN-ul invadator într-o manieră dependentă de crARN și recrutează în continuare nucleaza Cas3 pentru degradarea țintă. Cas3 induce o crimă asupra ADN-ului străin și ulterior degradează ADN-ul țintă [54,55]. În sistemele CRISPR-Cas de tip II, duplexul tracrRNA: crRNA ghidează proteina efectoare Cas9 pentru a introduce o ruptură de dublă catenă în ADN-ul țintă [45]. Mașinile de interferență ale sistemelor de tip III cuprind complexe Cas10-Csm (tipuri III-A și III-D) și Cas10-Cmr (tipuri III-B și III-C) [5], care sunt capabile să vizeze atât ADN, cât și ARN [ 38,39,47,49,56-63]. În mod curios, s-a demonstrat că interferența sistemelor de tip III-A și de tip III-B depinde de transcrierea ADN-ului țintă [57,58]. Mai precis, subunitatea Cas10 clivează ADN-ul în timp ce Csm3 [59,60] și Cmr4 [61] scindează ARNm transcris în sistemele CRISPR-Cas de tip III-A și respectiv III-B. Interferența în sistemele CRISPR-Cas de tip V prezintă similarități cu interferențele din tipul II. Un duplex ARN, format din tracrARN și crARN, este strict necesar pentru scindarea țintă în sistemele de tip V-B [7]. Tipul V-A, cu toate acestea, utilizează doar ARNc pentru localizarea și degradarea țintă [28,29].

3. Mecanisme anti-CRISPR

Procariotii adăpostesc un remarcabil arsenal de strategii de apărare pentru a coexista cu prădătorii lor virali (caseta 1). Ca parte a cursei constante a armamentelor dintre bacterii și omologii lor virali, fagii au dezvoltat strategii diferite pentru a depăși mecanismele de apărare antivirale. Acest paragraf rezumă cercetările privind modul în care fagii evită sistemele CRISPR-Cas.

Caseta 1. CRISPR-Cas - Ce altceva? (Mecanisme alternative de apărare cu caractere aldine)

În afară de sistemele CRISPR-Cas, procariotele au dezvoltat un set cuprinzător de mecanisme de apărare pentru a se proteja împotriva prădătorilor. Ciclul infecției virale este inițiat prin adsorbția fagului pe suprafața celulei bacteriene, unde fagii recunosc receptori specifici gazdei de pe membranele exterioare sau pereții celulari ai gazdei. Bacteriile pot preveni adsorbția fagilor prin producerea unei matrice extracelulare care blochează fizic accesul la receptorul specific. Alte contra-strategii implică mutarea receptorilor fagici și producerea de inhibitori competitivi care ocupă receptorul și astfel duc la o susceptibilitate redusă la adsorbția fagului [64-66]. În etapa următoare a infecției, fagii își injectează materialul genetic în gazdă. Pentru a bloca intrarea ADN-ului viral, bacteriile folosesc așa-numitul excludere superinfecție (Sie) sisteme care sunt adesea codificate de profaci. Aceste sisteme cuprind un set de proteine ​​care previn translocarea ADN-ului fagului în citoplasmă [67,68].

Odată introdus, ADN-ul viral poate fi degradat de restriction-modification (RM) sisteme care folosesc nucleaze pentru a recunoaște și a scinde motive scurte prezente pe ADN-ul invadator. ADN-ul nemetilat este recunoscut de aceste enzime de restricție și auto-clivarea este prevenită prin metilarea situsurilor țintă de pe genomul gazdă [69,70]. O altă strategie de apărare blochează propagarea fagilor prin sacrificarea unei celule gazdă infectate, protejând astfel populația bacteriană. Aceste infecție avortată (Abi) mecanismele folosesc proteine ​​care simt infecțiile și, prin urmare, induc moartea celulelor prin, de ex. depolarizarea membranei, inhibarea aparatului de translație al gazdei sau exploatarea componentelor sistemelor toxine-antitoxine [71-74]. Sistemele antivirale mai puțin bine caracterizate cuprind excluderea bacteriofagilor (BREX) și procariotă Argonautele. În timp ce BREX inhibă replicarea virală și integrarea ADN-ului fagilor lizogeni [75], proteinele Argonaute sunt nucleaze ghidate de ADN sau ARN care scindează ADN-ul invadator într-o manieră specifică secvenței [76-78].

Fagii pot scăpa de mașinile de interferență CRISPR-Cas prin mutații aleatorii în regiunea protospacer sau secvența PAM [26,51]. Ca o contra-strategie, mai multe sisteme CRISPR-Cas de tip I arată o absorbție ridicată de noi distanțieri ca rezultat direct al nepotrivirilor în PAM sau în protospacerul vizat în timpul achiziției amorsate (vezi §2). Mai mult, eficiența evadării imunității CRISPR-Cas prin mutații punctuale este puternic afectată la populațiile bacteriene care prezintă o diversitate mare de distanțieri. O posibilă explicație pentru această observație este că diversitatea distanțierilor crește presiunea de adaptare asupra virusului și duce astfel la dispariția rapidă a prădătorului [79].

Studii recente au demonstrat că fagii de tip Mu, care infectează Pseudomonas aeruginosa, inhibă activ sistemele CRISPR-Cas ale gazdei lor. Acești fagi produc proteine ​​anti-CRISPR (Acr) care interacționează cu componente ale mașinilor de interferență CRISPR-Cas de tip I-F: de ex. proteinele fagice AcrF1 și AcrF2 leagă diferite subunități ale Cascade și astfel împiedică legarea complexului Csy de ADN-ul țintă. S-a demonstrat că AcrF3 leagă nucleaza Cas3, inhibându-i funcția în degradarea țintă. S-au găsit proteine ​​similare pentru a preveni imunitatea CRISPR-Cas de tip I-E în același organism, ridicându-se astfel întrebarea dacă proteinele Acr există pentru alte tipuri CRISPR-Cas [20,80-82].

Într-un raport unic până acum de evaziune imună, s-a demonstrat că Vibrio cholerae Fagii ICP1 codifică un sistem CRISPR-Cas de tip I-F care vizează o insulă genomică gazdă, cunoscută ca fiind implicată în apărarea anti-fag fără legătură cu CRISPR. Atacarea mecanismului de apărare a gazdei a fost crucială pentru propagarea fagilor, deoarece eficiența infecției a fost mult redusă atunci când au fost șterse distanțele de vizare din matricea CRISPR virală. În mod curios, analiza fagilor care încă au reușit să infecteze cu succes gazda a dobândit noi distanțieri care provin din același locus genomic, arătând astfel că virusul găzduiește un sistem CRISPR-Cas complet funcțional, care este, de asemenea, activ în achiziție [83].

4. Dincolo de imunitatea adaptativă

Pe lângă rolul lor în imunitatea procariotă, s-a demonstrat că sistemele CRISPR-Cas participă la alte căi celulare decât imunitatea.

(a) Repararea ADN-ului

Rapoartele timpurii au sugerat o implicare a E coli Proteina Cas1 în căile de reparare a ADN, deoarece s-a demonstrat că proteina interacționează cu componentele mașinilor de reparare celulară, cum ar fi RecB, RecC și RuvB. Cas1 a procesat în continuare structuri intermediare ale ADN-ului care apar adesea în timpul reparării și recombinării ADN, cum ar fi joncțiunile Holliday, furcile de replicare și clapetele 5'. Mai mult, ștergerile din cas1 gena a dus la o sensibilitate crescută la deteriorarea ADN și a afectat segregarea cromozomială [14]. Mai mult, participarea sistemului de recombinare RecBCD la imunitatea CRISPR-Cas a devenit mai evidentă în ultimii ani. Complexul RecBCD recunoaște rupturi de ADN cu catenă dublă (ADNd) care apar adesea la furcile de replicare. După recunoașterea ADN-ului deteriorat, RecBCD degradează ulterior ADN-ul până când ajunge la un sit Chi [84]. Un studiu recent a sugerat că produsele de degradare ale complexului de reparații servesc drept șabloane pentru achiziționarea distanțierilor, deoarece distanțierii noi au fost achiziționați în principal din regiuni aflate în imediata apropiere a furcilor de replicare blocate. În ceea ce privește imunitatea antivirală, RecBCD ar putea fi prima linie de apărare, deoarece recunoaște și degradează ADN-ul fag liniar și, astfel, permite echipamentelor de adaptare să colecteze noi distanțieri. Achiziția din ADN cromozomial este prevenită datorită distribuției frecvente a siturilor Chi în genomul gazdă [85]. Cerința RecB pentru imunitatea CRISPR-Cas de tip I-E a fost în cele din urmă dovedită de un alt studiu care a demonstrat că a recB ștergerea a abolit achiziția naivă de distanțier în E coli. Interesant este faptul că absența RecB nu a afectat achiziția de distanțiere amorsată. Aici, helicazele RecG și PriA au fost esențiale, în timp ce ADN polimeraza I a fost crucială atât pentru adaptarea naivă, cât și pentru cea inițiată [86]. Modelul apărut sugerează că, în timpul adaptării inițiate, RecG și PriA recunosc structura buclei R care apare prin legarea complexului Cascade: crRNA la ADN. Ca rezultat, Cascade se disociază de ADN-ul conducând la expunerea unor regiuni temporare de ADN monocatenar care pot stimula achiziția de distanțiere de către Cas1 și Cas2. Deoarece Cas3 este esențial pentru adaptarea amorsată, activitatea de nuclează a proteinei va promova generarea de fragmente de ADN care sunt captate de mașinile de achiziție. În timpul adaptării naive, deteriorarea ADN-ului este posibil indusă de Cas1 și duce la recrutarea complexului RecBCD așa cum este descris mai sus [85,86].

(b) Reglementarea genelor

Implicarea componentelor CRISPR-Cas în procesele de reglare celulară a devenit mai evidentă în ultimii ani. Sistemele CRISPR-Cas de tip II par să joace un rol semnificativ în reglarea virulenței bacteriilor patogene. În Francisella novicida, un complex ribonucleoproteic format din Cas9, tracrARN și un ARN mic unic unic asociat CRISPR reprimă expresia unei lipoproteine ​​bacteriene (BLP). Reducerea transcripțională a BLP este crucială pentru evaziunea imunitară, deoarece proteina poate fi recunoscută de sistemul imunitar al gazdei. Se presupune că complexul ribonucleoproteic leagă blp transcriere care duce la degradarea ARNm de către Cas9 sau o nuclează necunoscută. În consecință, BLP este subreprezentată pe suprafața celulei, rezultând un răspuns imun redus [87]. În mod similar, Neisseria meningitidis tulpini mutante cărora le lipsește o cas9 gena a prezentat defecte severe de supraviețuire în celulele epiteliale umane [87]. În Campylobacter jejuni, cas9 mutanții de deleție au prezentat citotoxicitate mai mică în liniile celulare umane. Probabil, absența C. jejuni Cas9 afectează compoziția biochimică a peretelui celular bacterian și astfel face celula mai predispusă la legarea anticorpilor [88]. O proteină Cas2 de tip II-B de Legionella pneumophila a fost crucială pentru infecția amibelor și reprezintă astfel o altă funcție legată de virulență [89]. Transcrierea unui tablou CRISPR abandonat (nr cas operon) în Listeria monocytogenes duce la stabilizarea unui ARNm parțial potrivit. Interesant, dacă matricea CRISPR este îndepărtată din genom, bacteriile au reușit să colonizeze mai eficient un ficat murin oferind dovezi pentru o funcție de reglare a virulenței printr-un mecanism ARN antisens [90].

Reglarea endogenă prin CRISPR-Cas poate afecta, de asemenea, comportamentul grupului într-o populație bacteriană, așa cum a fost identificat în ciclul de viață al Myxococcus xanthus. Δ-preoteobacteria este capabilă să producă mixospori pentru a depăși stresurile din mediu, cum ar fi deficiența de nutrienți. Mixosporii sunt produși în timpul unui proces complicat care implică mișcarea cooperată și agregarea celulelor dintr-o populație. Ca rezultat, agregatele celulare se diferențiază în așa-numitele corpuri fructifere care conțin sporii. Myxococcus xanthus posedă un sistem CRISPR-Cas de tip I-C și șterge cas7 și cas5 duce la sporulare foarte scăzută. Același lucru a fost valabil și pentru un cas8c ștergere care a dus în plus la agregarea celulară întârziată. Mai mult, Cas8c stimulează sinteza FruA, o proteină importantă în calea sporulației [91-93]. Implicarea mecanicistă a proteinelor Cas în formarea corpului fructifiant rămâne nedumeritoare, întrucât un studiu recent a adăugat încă un alt nivel de complexitate prin demonstrarea implicării unei matrice CRISPR de tip III-B în dezvoltarea corpului fructificator și producerea exopolizaharidelor [94].

(c) Evoluția genomului

Achiziționarea de distanțieri ADN străini este un pas crucial în imunitatea CRISPR-Cas și afișează natura adaptativă unică a acestui sistem de apărare. S-a raportat pe scară largă că, în unele cazuri, distanțierii provin din secvențe genomice proprii. Cu toate acestea, direcționarea cromozomului duce la deteriorarea ADN-ului și va ucide inevitabil celula bacteriană. În timp ce auto-direcționarea sistemelor CRISPR-Cas poate fi cu siguranță letală pentru un organism gazdă, mai multe studii au investigat rolul său potențial în evoluția genomului. Pe lângă modificări genetice la scară mică, cum ar fi mutații în secvențele PAM cromozomiale, protospazere sau cas operon, s-au observat mari rearanjări genomice în Pectobacterium atrosepticum când distanțierii potriveau secvențe din propriul genom. Aici, o insulă genomică de aproximativ 100 kb implicată în patogenitatea plantelor a fost remodelată sau ștearsă [95]. Un studiu genomic pe Termotogale a dezvăluit asocierea locurilor CRISPR la siturile de inversiuni ale ADN-ului și a altor rearanjări genetice. Chiar dacă implicarea exactă a matricelor CRISPR în promovarea modificărilor genetice observate rămâne necunoscută, CRISPR pare să promoveze aceste evenimente evolutive [96]. În schimb, un studiu bioinformatic a sugerat că auto-direcționarea sistemelor CRISPR-Cas este un efect destul de nedorit, deoarece transmite autoimunitate. Ca rezultat, sistemele CRISPR-Cas devin degenerate din cauza mutațiilor din cas genele și siturile țintă sau prin inactivarea sau ștergerea întregului sistem CRISPR-Cas care, într-adevăr, promovează variații evolutive, dar simultan duce la o pierdere a condiției fizice în ceea ce privește apărarea antivirală [97].

5. Semnificație și aplicații

Utilizarea CRISPR-Cas în abordările terapeutice a devenit din ce în ce mai relevantă în diferite domenii ale medicinei. Prezența secvențelor repetitive intercalate cu distanțiere scurte, cunoscute ulterior sub numele de CRISPR, a fost exploatată în scopuri de diagnostic și simpla tastare a Mycobacterium tuberculosis tulpini [98]. Acest lucru a ajutat la înțelegerea modalităților utilizate de agenții patogeni pentru transmiterea lor, analizând diferențele în conținutul de distanțier al tulpinilor înrudite [98,99]. Așa-numita spoligotipare (oligotipare distanțieră) a fost, de asemenea, adaptată pentru Salmonella enterica, Yersinia pestis și Corynebacterium diphteriae [100–105].

Utilizarea CRISPR-Cas ca instrument antimicrobian direct a fost studiată recent. Tablourile artificiale CRISPR au fost concepute pentru a ucide bacteriile patogene, vizând genele de rezistență la antibiotice sau virulență. Acest mod elegant vizează doar tulpini dăunătoare într-o populație bacteriană și permite tulpinilor nepatogene să crească agenții patogeni [106-108]. Un studiu recent a folosit fagii lizogeni pentru a introduce un sistem CRISPR-Cas în E coli, care vizează gene de rezistență la antibiotice. Matricea a fost concepută pentru a viza în plus genomii fagilor litici ducând la imunitate față de fagi numai a bacteriilor sensibilizate la antibiotice. Mai precis, bacteriile care este puțin probabil să dobândească gene de rezistență la antibiotice datorită conținutului lor de distanțier proiectat sunt, de asemenea, rezistente la fagii litici. Astfel, în cazul unei infecții cu fag, numai tulpinile patogene ar fi eradicate din populație [109].

Potențialul medical al sistemelor CRISPR-Cas depășește tratamentul antimicrobian. Introducerea unor modificări eficiente și precise în genele unui organism afișează baza pentru ingineria genomului. Se utilizează nucleaze programabile care leagă în mod specific regiunile genomice și scindează ADN-ul în poziția dorită. Nucleazele cu degetul de zinc (ZFN) și nucleazele efectoare asemănătoare activatorului de transcripție (TALEN) au fost utilizate pe scară largă pentru editarea ADN-ului. Ambele instrumente de editare a genomului se bazează pe același principiu: un domeniu de legare ADN specific secvenței, care oferă specificitate, este fuzionat cu o nuclează. Datorită simplității, eficacității și posibilității de a viza mai multe situri genomice simultan, utilizarea sistemului CRISPR-Cas9 este de obicei favorizată față de sistemele ZFN și TALEN [110-112]. Proteina bacteriană de apărare Cas9 este utilizată pentru a viza aproape orice secvență de ADN dorită cu ajutorul unui ARN vizat. Acest ARN cu un singur ghid (sgRNA) este un hibrid proiectat al tracrARN-ului natural: duplex crRNA și astfel simplifică aplicarea acestuia în scopuri de editare a genomului [45].

Reutilizarea sistemului CRISPR-Cas9 pentru editarea genomului exploatează mecanismele de reparare a ADN-ului celulelor eucariote: după introducerea unei rupturi de ADN cu catenă dublă, celula poate repara daunele prin îmbinarea finală neomologă (NHEJ). Acest proces este predispus la erori și duce adesea la mutații punctuale, ștergeri sau provoacă schimbări de cadre care modifică produsul genetic și, în cele din urmă, abolesc funcția acestuia, care este favorizată pentru eliminările genetice. Cu toate acestea, ingineria precisă a genomului se bazează pe o altă cale, denumită reparare direcționată către omologie (HDR), în care o bucată de ADN care prezintă omologie de secvență la locul țintă este utilizată pentru a repara ADN-ul prin recombinare omoloagă. Această scurtă secvență de ADN poate adăposti orice tip de inserție sau modificare, permițând integrarea oricărei secvențe de ADN dorite la locul țintă [50,113-117] (figura 2A).

Figura 2. Aplicații ale tehnologiei CRISPR-Cas9. (A) Cas9 este ghidat de un sgRNA pentru a induce o rupere a ADN-ului cu dublă catenă la un locus genomic dorit. Deteriorarea ADN-ului poate fi reparată prin NHEJ producând inserții sau ștergeri scurte aleatorii la locul țintă. Alternativ, o secvență de ADN care prezintă complementaritate parțială cu situsul țintă poate fi inserată în timpul HDR pentru scopuri precise de editare a genomului. (b) Mutațiile din domeniile catalitice ale Cas9 produc o variantă moartă (dCas9) care se leagă, dar nu clivează ADN-ul. Abordarea cu dCas9 este utilizată pentru reprimarea transcripțională prin legarea la regiunea promotor a unei gene și astfel blocarea accesului pentru ARN polimeraza. În mod similar, dCas9 poate fi fuzionat cu un represor transcripțional. Crucile roșii reprezintă inhibarea transcripției. (c) Fuziunea dCas9 la un activator transcripțional stimulează transcrierea unei gene adiacente prin recrutarea ARN polimerazei.

Mutațiile din motivele de nuclează ale Cas9 duc la o variantă „moartă” care nu este capabilă să scindeze ADN-ul și astfel poate fi utilizată pentru a regla transcrierea unei gene dorite. Prin vizarea regiunii promotorului sau a cadrului de citire deschis al unei gene, legarea ARN polimerazei este blocată fizic și alungirea ARNm este inhibată. Alternativ, dCas9 poate fi fuzionat la un represor care controlează transcrierea genei (figura 2b). Activarea transcripțională poate fi realizată prin fuzionarea dCas9 la un activator de transcripție care recrutează ARN polimeraza și induce expresia genei (figura 2c). În unele cazuri, knock-down-urile genetice sunt dorite în cazul knockout-urilor genetice, de ex. dacă gena vizată este esențială [116.118-122]. Metoda CRISPR-Cas9 a fost, de asemenea, exploatată pentru editarea epigenomului, care permite controlul expresiei genelor prin introducerea unor modificări precum metilarea ADN sau acetilarea histonei. Un studiu a arătat că o proteină de fuziune a dCas9 și domeniul de bază al acetiltransferazei umane p300 ar putea activa expresia genelor la anumite situri [123]. Mai mult, fuziunea dCas9 cu represorul KRAB a reușit să inducă metilarea la potențatori specifici, ducând la accesibilitate redusă a cromatinei și, astfel, la reducerea expresiei genei [124]. Editarea precisă a epigenomului are un mare potențial de a dezvălui modificarea cromatinei specifice site-ului și ajută la explorarea reglării expresiei genelor care ar putea duce la noi strategii terapeutice. Alte abordări - în principal la procariote - exploatează complexul endogen de efect I Cascade pentru experimente similare dacă nucleaza Cas3 este absentă [125-127]. În toate strategiile de manipulare a genomului menționate anterior, existența unui PAM adiacent situsului țintă este o cerință strictă [9].

Remodelarea precisă a genomului poate fi utilizată pentru a vindeca variantele genetice care cauzează boli genetice. Oamenii de știință au reușit să repare mutațiile care cauzează fibroza chistică (CF) prin corectarea cftr locus în celulele stem intestinale cultivate la pacienții cu CF [128]. Mai mult, folosind tehnica CRISPR-Cas9, un fenotip sănătos ar putea fi restaurat la șoarecii care suferă de tirozinemie ereditară, o boală genetică care provoacă leziuni hepatice severe [129]. Editarea genomului a fost folosită în continuare pentru a dezvolta abordări terapeutice antivirale. În consecință, genomul HIV a fost eradicat cu succes din celulele infectate latent [130]. Într-adevăr, un studiu recent a demonstrat că generarea de mutații induse de NHEJ în genomul viral a dus la defecte de replicare ale virusului. Cu toate acestea, a condus și la generarea de mutanți competenți în replicare care adăpostesc mutații la locul țintă și, prin urmare, nu mai sunt vizați de Cas9 [131]. Alte studii au ca scop modificarea unei proteine ​​specifice de suprafață numită CCR5 care servește drept co-receptor pentru ca virusul HI să pătrundă într-o celulă gazdă. Mutații în ccr5 gena poate preveni virusul de a infecta o celulă conducând la un fenotip foarte rezistent, dar altfel sănătos. De fapt, modificarea tipului sălbatic ccr5 gena duce la imunitatea monocitelor și a macrofagelor împotriva infecțiilor cu HIV [132-134].

Tehnica CRISPR-Cas9 a simplificat în continuare ecranele la scara genomului. Aceste ecrane caută să identifice genele care sunt implicate în anumite procese metabolice sau patogenetice prin abolirea funcției genetice și studierea fenotipului rezultat. Folosind această abordare, ar putea fi identificate gene care sunt implicate în creșterea tumorii [135] sau care transmit susceptibilitate la toxine bacteriene [136]. Anterior, interferența ARN (ARNi) a fost utilizată pentru a doborî expresia genelor într-o manieră specifică secvenței. Cu toate acestea, ARNi scade doar abundența transcrierilor, în timp ce CRISPR-Cas9 permite o eliminare completă a genelor candidate. Mai mult, multiplexarea (direcționarea mai multor loci genetici în același timp) este crucială pentru această abordare și poate fi realizată prin utilizarea unei biblioteci de sgRNA diferite care este livrată de obicei cu Cas9 de un sistem vector lentiviral [135-138].

6. Perspective

Interesul pentru domeniul CRISPR-Cas a crescut rapid în ultimii ani. Numeroase studii pun în lumină procesele genetice și biochimice care stau la baza sistemului imunitar procariot adaptativ, dezvăluind astfel potențialul său în medicina modernă (caseta 2). Fără îndoială, versatilitatea diferitelor sisteme CRISPR-Cas este uimitoare și, odată cu descoperirea recentă a trei noi tipuri, am putea începe să înțelegem pe deplin semnificația CRISPR-Cas ca sistem de apărare microbiană. Cu toate acestea, multe aspecte ale sistemului antiviral necesită o perspectivă suplimentară. Procesul de imunizare care se realizează prin încorporarea de noi distanțieri în matricea CRISPR este în continuare cel mai nedumeritor eveniment din imunitatea CRISPR-Cas. Baza biochimică precisă a achiziției distanțierului și gradul său de conservare între diferitele tipuri nu a fost încă descoperită. De exemplu, funcția proteinelor suplimentare precum Cas4 și Csn2 care s-au dovedit a fi necesare pentru adaptare necesită o investigație suplimentară. Adaptarea amorsată a fost observată numai în sistemele CRISPR-Cas de tip I, chiar dacă acest proces oferă un mare avantaj protector față de fagii mutați care ar scăpa de interferența CRISPR.

Caseta 2. Repere în cercetarea CRISPR-Cas.

Descris pentru prima dată în 1987 ca secvențe repetitive neobișnuite [139], interesul pentru CRISPR și genele asociate acestora a crescut încet pe parcursul anilor 1990 și începutul anilor 2000. Se credea inițial că participă la procesele de reparare a ADN-ului celular și de partiționare a repliconului, primele dovezi că sistemele CRISPR-Cas prezintă un sistem imunitar procariot adaptativ au fost furnizate în 2005 [4]. Cercetătorii au fost surprinși când au descoperit că majoritatea secvențelor intercalate între ele se repartizează între repetări identice derivate din ADN-ul cromozomial suplimentar, mai precis din genomii fagului și plasmidele conjugative [4.100.140]. Ipoteza a fost dovedită în cele din urmă doi ani mai târziu, când oamenii de știință au arătat încorporarea de noi distanțieri într-un loc CRISPR-Cas al Streptococcus thermophilus după provocarea bacteriei cu un bacteriofag. Noii distanțieri dobândiți au arătat întotdeauna o complementaritate perfectă cu secvențele de pe genomul fagului și au transmis rezistență față de acel fag particular la o infecție ulterioară [1]. Interesul cercetării din domeniul CRISPR s-a accelerat în curând, ducând la noi descoperiri care au ajutat la înțelegerea mecanismelor de bază ale sistemului imunitar. În 2008, procesarea transcrierii CRISPR în crARN-uri mature care ghidează complexul Cascade al E coli sistemul de tip I-E a fost validat experimental, oferind, de asemenea, indicii că ADN mai degrabă decât ARN este vizat [54]. Acesta din urmă a fost confirmat în același an în care un studiu a demonstrat că într-adevăr ADN-ul este molecula vizată [56]. Acest lucru i-a determinat pe oamenii de știință să se gândească la rolul potențial pe care l-ar putea juca acest sistem imunitar procariot ca instrument de manipulare a ADN-ului. Astăzi, CRISPR-Cas9 este un instrument frecvent valorificat în scopuri de editare a genomului și au fost prezentate în ultimii ani progrese majore în înțelegerea proceselor biochimice subiacente în Cas9 ghidat de ARN. În 2010, cercetătorii au arătat că Cas9 creează o singură ruptură dublu-catenară la o poziție precisă pe ADN-ul țintă [63]. O perspectivă suplimentară asupra mecanismului a fost livrată 1 an mai târziu, deoarece a fost arătată implicarea unui alt ARN mic, numit tracrARN. Maturarea crARN necesită tracrARN, precum și Cas9 și RNase III [42]. Dovezi că sistemul ar funcționa heterologic la alte bacterii au fost demonstrate în 2011, ca S. thermophilus sistemul CRISPR-Cas de tip II ar putea oferi imunitate în E coli [141]. Alte cercetări au arătat anumite elemente ale sistemului de tip II, inclusiv implicarea unei secvențe PAM în interferență [6,26,141], dar natura complexului de clivaj a rămas necunoscută. În 2012, s-a arătat că tracrRNA, care anterior se știa că este implicat în maturarea crRNA [42], formează o parte esențială a complexului de scindare a ADN-ului, cu tracrRNA dublu: crARN direcționând Cas9 pentru a introduce pauze dublu-catenare în țintă ADN [45]. O simplificare suplimentară a direcționării programate a fost realizată prin crearea unei fuziuni ARN cu un singur ghid de tracrARN și crARN, care ghidează Cas9 pentru scindarea ADN specifică secvenței [45]. La câteva luni după descrierea tehnologiei CRISPR-Cas9 [45], o serie de publicații și-au demonstrat puterea de a edita genomii în celulele și organismele eucariote, inclusiv celulele umane și de șoarece [116,117].

Un alt aspect nedumeritor este impactul sistemelor CRISPR-Cas asupra diversității procariote. S-a observat că sistemul imunitar protejează nu numai împotriva fagilor, ci și împotriva altor MGE care ar putea avea efecte benefice pentru un organism. De fapt, sistemul nativ CRISPR-Cas este redus la tăcere E coli de proteina structurantă nucleoasă asemănătoare histonelor H-NS [142], ridicând ideea că un sistem inactiv poate fi avantajos pentru bacterii. În plus, sistemele CRISPR-Cas pot interfera cu conjugarea plasmidelor și transformarea bacteriilor naturale competente [43.143]. Mai multe studii arată o corelație negativă între apariția sistemelor CRISPR-Cas și cantitatea de MGE din cromozom, ceea ce pare a fi o limitare a proceselor evolutive și a transferului orizontal de gene (HGT) [144, 145]. Rezultatele contradictorii au fost prezentate printr-o analiză evolutivă care nu a găsit nicio corelație semnificativă între activitatea unui sistem CRISPR-Cas și numărul de evenimente HGT [146]. Cu toate acestea, aceste relații trebuie evaluate în context cu alți factori precum presiunea prădătoare, apariția altor sisteme de apărare și costurile de fitness care sunt legate de menținerea apărării adaptive. S-a afirmat că bacteriile își pot pierde sau dezactiva sistemele CRISPR-Cas atunci când se confruntă cu o abundență mare de prădători. În astfel de medii, rezistența la fagi datorată, de exemplu, mutațiilor receptorilor pare a fi mai accesibilă [147]. Mai precis, ratele ridicate de mutație virală fac imunitatea adaptativă învechită, deoarece costurile de adaptare la un habitat de pradă dinamic depășesc beneficiile imunologice [148]. Interesant este faptul că un alt studiu a arătat că simpla menținere a unui sistem CRISPR-Cas fără presiune prădătoare poate duce la un echilibru negativ în ceea ce privește costurile de fitness. Aici, o tulpină de tip sălbatic a prezentat capacități competitive reduse comparativ cu o cas mutant knockout genetic. Cu toate acestea, în cazul infecției cu fagi, nu s-au observat costuri de fitness crescute, așa cum s-a descris mai sus [149] și, demonstrând astfel că aceste interacțiuni dinamice fag-gazdă sunt extrem de complexe și necesită mai multă elaborare în lucrările științifice viitoare.

De asemenea, sunt necesare cercetări suplimentare cu privire la funcțiile legate de imunitate ale sistemelor CRISPR-Cas. Numeroase studii au relevat implicarea lor în mai multe procese de reglare (a se vedea §4) și este necesară o perspectivă mai profundă, de exemplu, atunci când vine vorba de interacțiunea proteinelor Cas cu componentele căilor de reparare și recombinare a ADN-ului celular.

Pe lângă rolul lor fascinant în procariote, sistemele CRISPR-Cas au atras, fără îndoială, cea mai mare atenție pentru potențialul lor în aplicații medicale și numeroase alte aplicații biotehnologice, cum ar fi editarea culturilor, unitățile genetice (capacitatea de a stimula moștenirea părtinitoare a anumitor gene pentru a modifica o întreagă populație) și sintetică biologie (aplicațiile non-medicale nu sunt discutate aici, vezi [150] pentru detalii). În ciuda potențialului enorm care se află în cadrul tehnologiei CRISPR-Cas9, sunt necesare investigații suplimentare pentru a face sistemul un instrument aplicabil și sigur pentru abordări utile terapeutic. Problemele provocatoare care rămân și care trebuie abordate în viitor includ scindarea în afara țintei de către Cas9. Efectele în afara țintei sunt o preocupare majoră atunci când se remodelează cu precizie conținutul genomic al celulelor eucariote. În unele cazuri, modificările genetice la locurile în afara țintei au fost detectate la frecvențe mai mari decât mutația dorită, ceea ce relevă clar necesitatea unei specificități mai mari a tehnicii [151]. Strategiile de prevenire a efectelor neintenționate includ injectarea de Cas9 purificat direct într-o celulă în loc să exprime proteina recombinantă în celula țintă. Această metodă este convenabilă pentru scindarea rapidă a țintei, dar duce și la decăderea rapidă a Cas9, reducând astfel posibilitatea de efecte în afara țintei [152, 153]. Mai mult decât atât, folosirea a două SGRNA care vizează ambele fire ale secvenței țintă în combinație cu o variantă de Cas9 de tăiere a ADN-ului s-a dovedit a reduce semnificativ efectele în afara țintei [154]. Alte strategii se concentrează pe optimizarea secvențelor sgRNA pentru a realiza o editare mai fiabilă. Trunchierea SGRNAs cu 2-3 nt s-a dovedit a îmbunătăți specificitatea țintei [155]. De asemenea, adăugarea a două nucleotide de guanină la capătul 5 ′, direct lângă regiunea complementară țintă a ARN-ului de ghidare, ar putea reduce efectele în afara țintei [156]. O altă problemă care necesită investigații suplimentare este livrarea generală a sistemului CRISPR-Cas9 în celulele dorite ale unui organism multicelular. Promițătoare in vivo abordările includ sisteme vectoriale virale și non-virale care livrează Cas9 și sgRNA către celulele dorite [110, 157]. În plus, ex vivo conceptele se bazează pe izolarea celulelor derivate de pacienți care sunt transplantate înapoi după editarea genomică. Un avantaj major în utilizarea acestei abordări este evaluarea modificării genetice care a fost introdusă. Aici, numai celulele corect editate, fără mutații maligne în afara țintei, sunt alese pentru transplant [110, 157]. Deși rămân unele provocări, pare a fi doar o chestiune de timp până când editarea genomului bazată pe CRISPR-Cas9 va deveni o metodă sigură și aplicabilă utilizată într-o varietate de abordări terapeutice.


Concluzie

Utilizarea CRISPR-Cas9 pentru studii la nivel de genom a permis și extins natura și utilitatea ecranelor genetice la om pentru a corecta și modifica cu precizie genomul și reprezintă un potențial mijloc de corectare a mutațiilor cauzatoare de boli [195]. Deși încă la început, sistemul CRISPR-Cas9 a revoluționat studiile funcției genetice și are un impact imens asupra terapiei genetice în sănătatea umană. În comparație cu tehnicile anterioare de modulare genică, cum ar fi ARNi, utilizarea CRISPR-Cas9 este mai eficientă și mai specifică. Mai mult, sistemul CRISPR-Cas9 a devenit un instrument puternic de editare a genelor capabil să corecteze patologia legată de vârstă mediată de gene. Ștergerea extensiilor hexanucleotidice repetate în C9ORF72 genă folosind sistemul CRISPR-Cas9 sau corectarea SOD1 sau FUS mutațiile genetice pot ameliora ALS necunoscute și FTD, respectiv FALS (Fig. 2). AD cu debut precoce poate fi tratat prin corectarea mutațiilor în PSEN1, PSEN2, și APP, reducând generarea de beta-amiloid. În timp ce un CRISPR-Cas9 orientat spre mitocondrie ar putea fi utilizat pentru a reveni sau a elimina mutațiile care se acumulează odată cu vârsta. PD indusă de disfuncția mitocondrială poate fi tratată prin înlocuirea genelor mutante cu secvențele originale prevenind astfel acumularea de proteine ​​& # x003b1-sinucleină în corpurile Lewy și neurite Lewy, supraexprimarea factorilor neurotrofici care facilitează supraviețuirea neuronilor sau reducerea fluctuațiilor motorii pacientului prin administrarea AADC genă în putamenul pacienților cu PD. De asemenea, celulele canceroase pot fi vizate de sistemul CRISPR-Cas9, cu eliminări ale Par3L, Src-1 și GPRC6A care ameliorează cancerul colorectal, de sân și respectiv de prostată, rezultând o sensibilitate crescută la chimioterapie, o proliferare mai mică și o moarte mai mare a celulelor canceroase. . În timpul infecției, secreția de interleukină-1 servește ca citokină pro-inflamatorie în țesuturi, prevenind diferențierea celulelor stem și promovând degradarea agresivă a țesuturilor, ducând la deteriorarea țesutului [196]. La niveluri ridicate de secreție a sistemului imunitar de molecule inflamatorii, devine imperativ să se țintească aceste molecule. În plus față de țintirea IL-1, o altă strategie implică proiectarea celulelor stem pluripotente induse rezistente la inflamație (iPSC) prin eliminarea căii de semnalizare IL-1. În acest scenariu, CRISPR-Cas9 joacă un rol promițător, deoarece acest sistem a fost utilizat pe scară largă pentru a crea celule eucariote proiectate fie cu modificări ale pierderii funcției, fie ale câștigului funcției [9, 41]. Studii similare s-au făcut pe celulele zebră, liniile celulare tumorale și celulele dendritice primare [34, 197]. Prin urmare, rolul modulației CRISPR-Cas9 pare promițător în direcționarea inflamației, în special în țesuturile bolnave și deteriorate.Reducerea producției pro-inflamatorii de citokine prin eliminarea miR-155 este promițătoare ca strategie terapeutică atât pentru RA cât și pentru inflamație. În timp ce eliminarea MUC18, în AEC, a redus semnificativ inflamația și poate duce la reducerea umflăturii și blocării tractului respirator. Cu toate acestea, această tehnologie terapeutică este departe de a fi aprobată clinic de FDA din cauza provocărilor și limitărilor aferente (rezumate în tabelul 1), cum ar fi efectele în afara țintei, eficiența transfecției și timpul de înjumătățire scurt [9-13, 15] . Dacă se realizează utilizarea clinică, sistemul de editare a genei CRISPR-Cas9 va ameliora patologia asociată îmbătrânirii, afectând numeroase boli, reducând sarcina, morbiditatea și mortalitatea bolii.


Priveste filmarea: Tv Nocaute 9 (Ianuarie 2022).