Informație

Cum se face o analiză a întregului genom al Mycobacterium tuberculosis rezistent la medicamente


Caut tutoriale și software care să mă poată ajuta să studiez secvențele de genom întregi și asociațiile genomului. Am Matlab și Bioconductor R, deci orice lucru care implică aceste pachete ar fi de preferat.


Ați ales un organism fascinant și foarte important de studiat. Din păcate, există mulți pași cu multe pachete software de care veți avea nevoie și fiecare pas următor va depinde de ceea ce găsiți, ceea ce face ca un anumit tutorial să fie aproape inutil. Îmi pare rău să spun că nu cred că cineva va renunța la o întreagă propunere de proiect sau la un flux de lucru ca răspuns. Vă voi oferi un răspuns pentru a vă începe cercetările.

Exemplu

Un exemplu excelent al unui astfel de studiu este Fellay și colab., 2007 și puteți găsi suplimentul materialelor și metodelor acestora aici.

O introducere în acest tip de cercetare

Mai întâi trebuie să găsiți secvențele de proteine ​​care credeți că sunt semnificative. Există o grămadă de modalități de a face acest lucru, dar vă sugerez să stați pe umerii giganților și să parcurgeți literatura (indiferent, găsiți un exemplu în care acest lucru a fost făcut în altă parte). Dacă nu există prea multe lucruri acolo sau pentru un punct de vedere complet nou cu privire la ceva, acest răspuns ar putea ajuta la găsirea proteinelor în secvența ADN.

Alinierea secvenței față de alte tulpini este cel mai bun pariu de a identifica mutațiile (și, eventual, un indicator de rezistență, ceea ce cred că urmăriți). Există o mulțime de a alege, dar BLAST este un instrument bun pentru a începe. Ar trebui să comparați tulpina rezistentă cu tulpinile nerezistente. Fiți foarte atenți atunci când analizați datele, nu fiecare mutație va fi semnificativă.


Tuberculoza este cauzată de un grup strâns legat de specii patogene care cuprinde Mycobacterium tuberculosis complex. Tulpinile sunt în general caracterizate prin tiparele lor distincte de spoligotip și grupate în șapte linii majore (1). Modelele de spoligotip sunt testate pe baza locurilor repetate din genom și au fost studiate pe larg în raport cu linia de tulpini, distribuția geografică, evoluția, virulența și sensibilitatea la medicament. Spoligotipurile distincte, inclusiv spoligotipurile noi, s-au dovedit anterior a fi asociate cu fenotipuri de rezistență specifice (2 & # x020134). Au fost raportate recent secvențe genomice ale membrilor reprezentativi ai genogrupurilor majore (5 & # x020139). Disponibilitatea secvențelor genomice de noi spoligotipuri ar oferi o nouă oportunitate de a înțelege arhitectura genomului și diversitatea acestor tulpini și ar oferi informații despre proprietățile lor fenotipice. În prezentul articol, descriem secvența genomică a unui izolat clinic multirezistent (MDR) Mycobacterium tuberculosis, OSDD105, aparținând unui model nou de spoligotip (777737777620000), strâns grupat cu genogrupul euro-american.

Izolatul clinic OSDD105 a fost obținut din depozitul de tulpini menținut la Institutul Național JALMA pentru lepră și alte boli micobacteriene, Agra, și a fost menținut ca parte a Open Source Drug Discovery Open Access Repository. A fost efectuată analiza de spoligotipare și sensibilitatea la medicament a fost evaluată conform protocoalelor standard (10 & # x0201312). Analiza a relevat că tulpina aparținea unui nou spoligotip care se strânge strâns la spoligotipul T2 al descendenței euro-americane, cu o probabilitate Spotclust (13) de 0,99. Analiza sensibilității la medicament a arătat că izolatul este rezistent la streptomicină, rifampicină, izoniazidă, etambutol, cicloserină și pirazinamidă și sensibil la ofloxacină, kanamicină, etionamidă, amikacină, capreomicină și para-aminosalicilat de sodiu (PAS). ADN-ul a fost izolat conform protocoalelor standard. Datele secvenței brute au fost generate după pregătirea bibliotecii pe Ion Torrent PGM conform protocoalelor recomandate de producători. Proiectele de genomi au fost asamblate de novo folosind CLC Genomics Workbench 6. Ansamblul a avut ca rezultat 181 contigs la N50 valori de 40.206 & # x000a0bp și un ansamblu total de 4.267.020 & # x000a0bp. Mai mult, predicția automată a genelor pe genomele de proiectare a fost efectuată utilizând serverul RAST (14). Analiza a relevat 4.760 de gene, inclusiv 48 de gene ARN.

Numere de acces la secvența nucleotidică.


Introducere

Boala tuberculozei (TBC) este o infecție respiratorie cronică, cauzată de Mycobacterium tuberculosis. Filipine este o țară cu sarcină mare pentru TBC, cu peste 300.000 de cazuri și 25.000 de decese doar în 2017 1. Cu toate acestea, descoperirile recente sugerează că peste un milion de filipinezi sunt infectați activ cu boala, plasând povara Filipinilor pe locul doi în fața Chinei 1. În plus, țara are o prevalență crescândă a HIV și o povară ridicată pentru rezistența multidrog (MDR-TB, rezistența la tratamente cu izoniazid și rifampicină (RIF)) care reprezintă provocări serioase pentru un control eficient 1. Filipine a adoptat Organizația Mondială a Sănătății (OMS) TB - strategia de control „Tratament observat direct, curs scurt” (TB-DOTS). S-a recunoscut că există o nevoie urgentă de a detecta și trata mai multe cazuri printr-o extindere a facilităților GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, CA) pentru un acces mai bun și pentru a fi utilizate ca instrument principal de diagnostic 1. În special, există un decalaj între cei care se așteaptă să aibă TB MDR (2% cazuri noi, 21% cazuri de retratare) și cele detectate și ulterior tratate. Mai mult, rezultatele tratamentului în rândul celor tratați prezintă rate de succes slabe, punând astfel țara în pericol la răspândirea în continuare a MDR-TB și a tulpinilor potențial rezistente la medicamente.

În ciuda faptului că TB este o problemă serioasă în Filipine, datele genomice pentru local M. tuberculoză tulpini lipsesc. Studiile anterioare au identificat descendențele „antice” (descendența 1) și „moderne” (2 și 4) ca fiind prezente în populația 2 cu membrii cladei EA12-Manila despre care se știe că sunt extrem de asociați cu populația filipineză 3,4. Sunt necesare mai multe izolate pentru a deduce cu exactitate distribuția filogeografică a M. tuberculoză tulpini din țară și să profite de noile instrumente genomice care permit secvențierea întregului genom (WGS). Datele WGS pot fi utilizate pentru profilarea M. tuberculoză pentru rezistența la medicamente 5,6, caracterizați descendențele antice și moderne și diferitele tipuri de tulpini de virulență 7 și stabiliți cine ar fi putut transmite către cine și astfel să permită resurse direcționate către zonele hotspot pentru a reduce transmisia 8 toate acestea au fost posibile prin progrese în domeniul informaticii de sănătate 5 . Mai mult, oportunitățile WGS sunt stabilite pentru a revoluționa diagnosticul și gestionarea clinică a pacienților cu TBC. De exemplu, Public Health England (Marea Britanie) folosește acum caracterizarea genetică a agenților patogeni ca standard clinic de îngrijire în managementul TB, iar un număr tot mai mare de țări din întreaga lume caută să adopte acest lucru ca parte a îngrijirii clinice. Cu toate acestea, pentru a fi eficiente, aceste abordări trebuie aplicate în țările cu sarcini ridicate ale TBC și coordonate cu programele de control stabilite.

În Filipine, un sondaj la nivel național de rezistență la medicamente (DRS) are loc la fiecare cinci ani (anii 2007, 2012, 2017) și există o supraveghere activă a MDR-TB, inclusiv monitorizarea fluorochinolonelor și a celei de-a doua linii a rezistenței injectabile la pacienții cu TB, care implică secvențierea loci de rezistență la medicamente. Aceasta implică caracterizarea polimorfismelor cu nucleotide unice (SNP) și a markerilor indel de rezistență la medicamente, în special în genele care codifică ținta medicamentului sau enzimele care se convertesc (de ex. katG, inhA, rpoB, pncA, embB, rrs, gyrA, gyrB gene). Seturi limitate de markeri de înaltă frecvență au fost incluse în instrumentele de diagnosticare (de exemplu, Xpert MTB / RIF și teste de sondă de linie pentru MDR-TB) pentru identificare în M. tuberculoză ADN (dimensiunea aproximativă a genomului 4,4 Mb). Cu toate acestea, aceste abordări utilizează mai puțin de 1% din genom, iar abordările WGS care identifică SNP-urile și alte variații oferă o rezoluție mult mai mare pentru profilare M. tuberculoză pentru rezistența la medicamente, tipurile de tulpini și detectarea focarelor, dar, de asemenea, informează noi mutații și mecanisme prin analize la nivelul genomului 6,9.

Până în prezent, au existat puține studii WGS în Filipine și aici vă prezentăm rezultatele secvențierii a 178 de izolate colectate recent în DRS 2012. Explorăm diversitatea genomică a tulpinii predominante din Manila și dezvoltăm un cod de bare molecular pentru aplicații de supraveghere. Arătăm că tipurile de tulpini și majoritatea mutațiilor de rezistență la medicamente identificate sunt similare cu cele găsite în populațiile globale, făcând utilizarea bazelor de date de mutație existente robuste pentru a detecta rezistența.


Rezultate

Identificarea agentului patogen

Scanările de tomografie computerizată (CT) ale rămășițelor mumificate ale episcopului Peder Winstrup din Lund, Suedia, au relevat un granulom calcificat cu o dimensiune de câțiva milimetri (mm) în plămânul drept prăbușit împreună cu doi

Calcificări de 5 mm în hilul drept (Fig. 1). Tuberculoza primară determină modificări parenchimatoase și limfadenopatie hilară ipsilaterală, care este mai frecventă pe partea dreaptă [15]. La rezoluție, poate lăsa o cicatrice parenchimatoasă, un mic granulom calcificat (focalizarea Ghon) și noduri ilare calcificate, care sunt împreună numite complex Ranke. În imagistică, acest complex sugerează infecția anterioară a tuberculozei, deși histoplasmoza poate avea același aspect [16]. Cu toate acestea, histoplasmoza este foarte rară în Scandinavia și este mai des întâlnită în alte părți ale lumii (de exemplu, America) [17]. Rezultatele imagistice au fost, prin urmare, considerate a rezulta din tuberculoza primară anterioară. Unul dintre nodurile ilare calcificate a fost extras din rămășițe în timpul unei intervenții chirurgicale toracoscopice asistate video, ghidat prin fluoroscopie. Materialul extras a fost ulterior submuestrat pentru analiză genetică. ADN-ul a fost extras din nodul și țesutul pulmonar însoțitor folosind protocoale optimizate pentru recuperarea materialului genetic antic fragmentat chimic degradat [18]. Biblioteca (LUND1) a fost pusă secvențiată la o adâncime de aproximativ 3,7 milioane de citiri.

Imaginea CT a complexului Ranke. Imagine CT a pieptului lui Peder Winstrup într-un plan axial ușor unghiular cu săgeata scurtă care arată un mic granulom calcificat în lobul superior probabil al plămânului drept prăbușit și două calcificări de aproximativ 5 mm în hilul drept, sugerând împreună un complex Ranke și un primar anterior tuberculoză. Cea mai laterală dintre cele două calcificări ilare a fost extrasă pentru o analiză ulterioară. În plus, există calcificări în aorta descendentă care propune ateroscleroza (vârful săgeții)

Lecturile decupate de adaptor și filtrele de calitate de bază au fost blocate taxonomic cu MALT [19] pe baza de date NCBI Nucleotide completă („nt”, aprilie 2016). În acest proces, 3.515.715 citiri, sau 95% din citirile metagenomice, ar putea fi atribuite taxonilor din baza de date. Analiza vizuală a profilului metagenomic în MEGAN6 [20] a relevat că majoritatea acestor citiri, 2.833.403 sau 81%, au fost atribuite Homo sapiens. Alte 1724 de citiri au fost atribuite către Mycobacterium tuberculosis nod complex (MTBC). Important, nu există alți taxoni din gen Mycobacterium au fost identificate, iar singurul alt taxon bacterian identificat a fost Ralstonia solanacearum (Fig. 2a), un agent patogen al plantei care locuiește în sol identificat frecvent în profilurile metagenomice ale probelor arheologice [22, 23] (Fișa suplimentară 1).

Screeningul datelor secvențiale din LUND1 arată conservarea ADN-ului gazdă și al agentului patogen. A Krona complotează reflectând compoziția metagenomică a nodulului pulmonar. Majoritatea citirilor secvențiale au fost aliniate la Homo sapiens (n = 2.833.403), demonstrând o conservare extinsă a ADN-ului gazdei. O mică parte a citirilor aliniate la organismele bacteriene și 80% din aceste citiri au fost atribuite nodului MTBC (n = 1724). b Graficele de daune generate de secvențierea citirilor sunt mapate direct la un genom strămoș MTBC reconstruit [21], demonstrând un model caracteristic ADN-ului antic

Citirile preprocesate au fost mapate atât la genomul de referință uman hg19, cât și la un strămoș MTBC reconstruit (strămoș TB) [21] folosind BWA așa cum a fost implementat în conducta Efficient Ancient Reconstruction Genome (EAGER) [24]. Citirile aliniate la hg19 cu maparea directă au constituit 88% din datele secvențiale totale (Fișierul suplimentar 2). Contaminarea mitocondrială umană a fost extrem de scăzută, estimată la doar 1-3% folosind Schmutzi [25] (Dosar suplimentar 3). Citirile au fost, de asemenea, mapate cu strămoșul TB (Tabelul 1). După filtrarea calității hărții și de-duplicarea citirii, 1458 citește, sau 0,045% din datele secvențiale totale, aliniate la referință (Tabelul 1) și au prezentat modele de deteriorare a citozinei-timină care indică ADN-ul antic autentic (Fig. 2b) [ 26, 27]. Conservarea calitativă a ADN-ului tuberculozei a fost ușor mai bună decât cea a ADN-ului uman, deoarece leziunile au fost mai mari în acesta din urmă (Dosarul suplimentar 2). Contaminarea pe bază de laborator, monitorizată prin controale negative în timpul proceselor de extracție și preparare a bibliotecii, ar putea fi exclusă ca sursă a acestui ADN (Fișa suplimentară 4).

Îmbogățirea și reconstrucția genomică

Datorită semnalului clar, dar cu abundență redusă, a fost construită o bibliotecă de uracil ADN glicozilază (UDG) pentru a elimina leziunile ADN cauzate de dezaminarea hidrolitică a reziduurilor de citozină [28] și îmbogățită cu o captură în soluție [29, 30] concepută pentru vizează date la nivel de genom care reprezintă întreaga diversitate a MTBC (vezi secțiunea „Metode”). Sondele de captare se bazează pe un genom strămoș al TBC reconstruit [21]. Biblioteca îmbogățită a fost secvențiată folosind un set de secvențiere Illumina cu capăt pereche de 150 de cicluri pentru a obține o distribuție completă a lungimii fragmentului (Fig. S1 în fișierul suplimentar 3). Datele de secvențiere rezultate au fost apoi aliniate la genomul ipotetic al strămoșilor TB [21], iar statisticile cartografice au fost comparate cu cele din datele de screening pentru a evalua îmbogățirea (Tabelul 1). Îmbogățirea a crescut proporția conținutului de ADN endogen MTBC cu trei ordine de mărime, de la 0,045 la 45,652%, iar secvențierea profundă a dat date la nivel de genom la o acoperire medie de aproximativ 141,5 ori. Citirile mapate au o lungime medie a fragmentului de

Am evaluat în continuare calitatea genomului reconstituit prin cuantificarea cantității de poziții heterozigote (vezi secțiunea „Metode”). Au fost numărate alelele derivate reprezentate de 10-90% din citirile care acoperă o poziție dată cu cinci sau mai multe citiri de acoperire. Doar 24 de situri heterozigoți au fost numărate în toate variantele de poziții în LUND1. Ca o comparație, celelalte cu acoperire ridicată (

125 ori) genomul antic inclus aici - body92 din Kay și colab. [6] - conținea 70 de poziții heterozigote.

Filogenia și întâlnirile

Analiza filogenetică preliminară utilizând îmbinarea vecinilor (figurile S2 și S3 în fișierul suplimentar 3), probabilitatea maximă (figurile S4 și S5 în fișierul suplimentar 3) și arborii de parsimonii maximi (figurile S6 și S7 în fișierul suplimentar 3) au indicat faptul că LUND1 grupuri din diversitatea tulpinii L4 ale MTBC și, mai precis, în subliniile L4.10 / PGG3. Această subliniere a fost definită recent de Stucki și colegii ei ca fiind clada care conține L4.7, L4.8 și L4.9 [31] conform nomenclaturii Coll acceptate pe scară largă [32]. După aceasta, am construit două seturi de date pentru a susține datarea moleculară a MTBC complet (fișierul suplimentar 5) și L4 al MTBC (fișierul suplimentar 6).

Setul de date care reflectă diversitatea existentă a MTBC a fost compilat după cum sa raportat în altă parte [5], cu șase genomi antici ca puncte de calibrare. Acestea includeau LUND1 două genome antice suplimentare, body80 și body92, extrase de la mumiile maghiare din secolul al XVIII-lea și începutul secolului al XIX-lea [6] și trei izolate de om Mycobacterium pinnipedii tulpini din Peru [5], cuprinzând toate vechile disponibile M. tuberculoză genomi cu acoperire suficientă pentru a apela SNP-uri cu încredere după o mapare strictă cu BWA [33] (vezi secțiunea „Metode” Fișierul suplimentar 5). Mycobacterium canettii a fost folosit ca outgroup. În generarea unei alinieri a variantelor de poziții în acest set de date, am exclus regiunile repetitive și regiunile cu risc de mapare încrucișată cu alte organisme așa cum sa făcut anterior [5], precum și site-urile potențial importate din evenimente de recombinare, care au fost identificate folosind ClonalFrameML [34]. ] (Fișier suplimentar 7). Am ales să excludem aceste potențiale site-uri recombinate în ciuda M. tuberculoză fiind în general recunoscut ca un organism în mare parte clonal fără recombinare sau transfer orizontal de gene, deoarece s-a constatat că aceste fenomene apar în M. canettii [35, 36]. Doar douăzeci și trei de variante de site-uri au fost pierdute din alinierea completă MTBC ca importuri potențiale. Am numit în total 42.856 poziții variabile în setul de date, aliniate la genomul strămoșului TB. După ce site-urile reprezentate incomplet au fost excluse, 11.716 au fost reportate pentru analiza din aval. Înainte de a efectua analiza Bayesiană a datării moleculare, am evaluat setul de date pentru structura asemănătoare ceasului cu TempEst (R 2 = 0,273 vezi secțiunea „Metode” Fig. S8 în fișierul suplimentar 3).

Pentru a explora impactul arborelui selectat anterior și al modelului de ceas, am rulat mai multe variante de modele disponibile pentru utilizare în BEAST2 [37]. Am folosit mai întâi un model de ceas strict și unul relaxat, împreună cu un model coalescent constant (CC + strict, CC + UCLD). Am constatat că există o diferență minimă între ratele deduse estimate de cele două modele. Această constatare, pe lângă variația ratei scăzute estimate în toate modelele, sugerează că există o variație mică a ratei între ramurile cunoscute ale MTBC. Cu toate acestea, ceasul relaxat părea să aibă o performanță puțin mai bună (Tabelul 2). Pentru a experimenta modele care permiteau populații dinamice, am aplicat un skyline bayesian coalescent (SKY + UCLD) și un skyline anterior nașterii-moarte (BDSKY + UCLD) combinat cu un model de ceas relaxat. În modelul BDSKY + UCLD, arborele a fost condiționat de rădăcină. Într-un studiu anterior, Kühnert și colegii săi au folosit priorii copacului naștere-moarte pentru a investiga două focare moderne de tuberculoză [38]. Din câte știm, acest studiu este primul care a folosit un copac naștere-moarte înainte de a deduce dinamica evolutivă a MTBC în timp ce utilizează date antice pentru calibrarea vârfurilor. Modelul BDSKY + UCLD a avut cea mai mare valoare de probabilitate marginală dintre toate modelele aplicate acestui set de date (Tabelul 2).

Pentru modelul BDSKY + UCLD a fost generat un arbore calibrat de credibilitate maximă a cladei (MCC), cu 3258 de ani înainte de prezent (TA) (95% densitate posterioară cea mai mare [95% HPD], 2190-4501 BP) ca dată estimată de apariție pentru MTBC (Fig. 3a). Topologia arborelui este de acord cu analizele filogenetice prezentate anterior ale MTBC complet [3, 5, 39].Pentru a testa semnificația calibrărilor vechilor noastre vârfuri, am efectuat un test de randomizare a datei acestui model în care am amestecat în mod aleatoriu datele vârfurilor între genomii din setul de date de zece ori și am comparat estimările ratei de ceas cu modelele randomizate cu cea a „ adevărat ”model BDSKY + UCLD pentru setul de date MTBC [40, 41]. Pentru acest set de date, amestecarea vârfului a cauzat o convergență extrem de lentă. Deși doar patru din zece modele randomizate au atins un ESS de peste 200 pentru parametrul ratei de ceas, toate randomizările au atins un ESS de 100 sau mai mare cu lungimi de lanț combinate de peste 1.000.000.000 (Fișier suplimentar 10). Data randomizărilor este evaluată pe baza a două criterii de stringență diferită: (i) estimarea ratei medii a randomizării nu se încadrează în intervalul 95% HPD al modelului original sau (ii) intervalul 95% HPD al randomizării nu se suprapune cu cel al modelului original [40]. Toate randomizările pentru setul de date MTBC au îndeplinit criteriile mai stricte ii, indicând calibrările vârfurilor din genomurile antice care ne-au informat ferm rezultatele (Fișier suplimentar 10 Fig. S9 în Fișierul suplimentar 3).

Arborele maxim de credibilitate al cladei MTBC. Acest arbore MCC al înălțimilor medii a fost generat din modelul BDSKY + UCLD aplicat setului de date MTBC complet. Linii sunt etichetate pe partea dreaptă. Genomurile antice sunt indicate prin asteriscuri roșii și etichetate pe lateral cu numele lor de eșantion. Outgroup-ul este etichetat ca „M. canettii. ” Intervalele de 95% HPD ale înălțimilor nodurilor ancestrale fiecărei filiații sunt indicate ca (limită inferioară - limită superioară) în ani înainte de prezent. Nodurile ancestrale sunt evidențiate printr-un cerc colorat pentru a se potrivi cu eticheta descendenței. Scara de timp este exprimată ca ani înainte de prezent, cu cea mai recentă perioadă din 2010. Traseul orizontal însoțitor poate fi găsit în Fig. S10 în fișierul suplimentar 3

Setul de date L4 include LUND1 și cele două mumii maghiare descrise mai sus [6] ca puncte de calibrare. Am selectat 149 de genomi moderni reprezentativi ai diversității cunoscute a L4 din seturile de date publicate anterior (Fișierul suplimentar 3) [3, 21, 31]. Un genom modern Lineage 2 (L2) a fost folosit ca grup outgroup. După excluderea siturilor, așa cum s-a discutat mai sus (Fișa Adițională 8), o aliniere SNP a acestor genomi în referință la genomul strămoșului TB reconstruit [21] a inclus un total de 17 333 de poziții variante, excluzând pozițiile unice pentru grupul L2. Doar cincisprezece site-uri variante s-au pierdut din alinierea setului de date L4. După ce site-urile lipsă din orice aliniere din setul de date au fost excluse din analiza din aval, 10.009 SNP au rămas pentru inferență filogenetică. Un total de 810 SNP-uri au fost identificate în LUND1, dintre care 126 au fost unice pentru acest genom. Ulterior, s-a efectuat o analiză a efectului SNP [42] pe aceste poziții derivate (Fișier suplimentar 3 Fișier suplimentar 9). De asemenea, am evaluat setul de date L4 pentru structura asemănătoare ceasului cu TempEst (R 2 = 0.113 vezi secțiunea „Metode” Fig. S9 în fișierul suplimentar 3).

Am aplicat aceleași modele descrise mai sus pentru setul de date MTBC complet, cu adăugarea unui model de orizont de naștere-moarte condiționat de originea rădăcinii (originea BDSKY + UCLD +). Toate înălțimile medii ale copacilor se află la 250 de ani una de cealaltă și intervalele de 95% HPD se suprapun în mare măsură. Modelele de origine BDSKY + UCLD și BDSKY + UCLD + prezintă cele mai mari valori de probabilitate marginală după prelevarea eșantionării. Am folosit modelul de origine BDSKY + UCLD + pentru a determina dacă originea estimată a setului de date L4 a fost de acord cu estimările înălțimii arborelui pentru setul de date MTBC complet. În mod curios, parametrul de origine estimat (Tabelul 3) sau strămoșul rădăcinii arborelui se suprapune în mare parte cu intervalul de 95% HPD pentru înălțimea arborelui MTBC, așa cum se vede în Tabelul 2.

Un arbore MCC calibrat (Fig. 4) a fost generat pe baza modelului BDSKY + UCLD pentru setul de date L4. Acest model a dat o dată estimativă a apariției pentru L4 de 1445 BP (95% HPD, 929-2084 BP). Arborele reflectă topologia cu zece subliniile prezentată de Stucki și colegii [31], cu gruparea LUND1 cu sublinierea L4.10 / PGG3. Datorită nivelului relativ scăzut R 2 pentru relația dintre timpul de eșantionare și distanța de la rădăcină până la vârf, calculată folosind TempEst, am efectuat, de asemenea, un test de randomizare a datei modelului L4 BDSKY + UCLD, în care am amestecat datele de eșantionare aleatoriu între toate genomurile [40, 41 ]. Am efectuat zece randomizări și am comparat estimările ratei de ceas rezultate cu cele ale modelului BDSKY + UCLD cu datele adevărate de eșantionare (Tabelul 3). Nouă din zece randomizări au îndeplinit criteriul ii mai stricte, prezentând nici o suprapunere între intervalele lor de 95% HPD și cele ale originalului (Fișier suplimentar 11 Fig. S12 în fișierul suplimentar 3). Toate cele zece randomizări au îndeplinit criteriul i (adică au dat o estimare medie a ratei care a căzut în afara intervalului 95% HPD al ratei din model folosind valori temporale adevărate).

Arborele maxim de credibilitate al cladei L4. Acest arbore MCC de înălțimi medii a fost generat din modelul BDSKY + UCLD aplicat setului de date L4. Subliniile sunt etichetate pe partea dreaptă. Genomurile antice sunt indicate prin asteriscuri roșii și etichetate cu numele probei lor. Grupul Lineage 2, reprezentat de L2_N0020, este etichetat pe lateral. Intervalul 95% HPD pentru înălțimea nodului este afișat pentru nodurile ancestrale ale fiecărei subliniere ca (limită inferioară - limită superioară) în ani înainte de prezent. Nodurile ancestrale sunt evidențiate printr-un cerc colorat pentru a se potrivi cu eticheta de subliniere. Scara de timp este exprimată ca ani înainte de prezent, cu cea mai recentă perioadă din 2010. Traseul orizontal însoțitor poate fi găsit în Fig. S13 în fișierul suplimentar 3


O analiză la nivel de genom a tulpinilor multirezistente și rezistente la medicamente Mycobacterium tuberculosis Genotipul de la Beijing

Genotipul de la Beijing al Mycobacterium tuberculosis (MTB) este una dintre cele mai de succes descendențe MTB care s-a răspândit în lume. În China, rata tuberculozei multirezistente (MDR) este semnificativ mai mare decât rata medie globală, iar tulpinile genotipului de la Beijing au cea mai mare pondere a tulpinilor MDR. Pentru a studia baza genetică a descoperirilor epidemiologice conform cărora genotipul de la Beijing a fost adesea asociat cu focare de tuberculoză și rezistență la medicamente, am determinat secvențele genomului a patru izolate clinice: două rezistente la medicamente (XDR1219, XDR1221) și două multirezistente (WX1, WX3 ), folosind secvențierea genomului întreg. Au fost identificate un număr mare de SNP-uri individuale și comune ale celor patru tulpini de la Beijing. Izolatele noastre adăposteau aproape toate mutațiile clasice asociate rezistenței la medicamente. Mutațiile responsabile de rezistența la medicament în cele două tulpini XDR au fost în concordanță cu nivelurile clinice cantitative de rezistență la medicamente. Analiza COG a relevat că tulpinile de la Beijing au abundențe semnificativ mai mari ale mutațiilor responsabile de biogeneza peretelui celular / membrană / anvelopă (COG M), biosinteza metaboliților secundari, transport și catabolism (COG Q), transportul și metabolismul lipidelor (COG I) și mecanismele de apărare (COG V). Genele mutante comune ale celor patru tulpini studiate de la Beijing au fost supra-reprezentate în mod semnificativ în trei căi de reparare a ADN-ului. Analizele noastre promovează înțelegerea polimorfismului genomului tulpinilor familiale din Beijing și oferă baza genetică moleculară pentru capacitatea lor largă de diseminare și rezistența la medicamente.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Analiza întregii secvențe a genomului multirezistentului Mycobacterium tuberculosis Beijingul se izolează de un focar din Thailanda

The Mycobacterium tuberculosis Familia Beijing este adesea asociată cu rezistență la mai multe medicamente și focare mari. A fost realizat un studiu de genotipare convențional al unui focar comunitar de tuberculoză multirezistentă (MDR-TB) care a avut loc în provincia Kanchanaburi, Thailanda. Studiul a relevat că focarul a fost clonal și tulpina a fost identificată ca membru al familiei Beijing. Deși, izolatele de focar au prezentat spoligotipuri identice și modele repetate repetate de unități repetitive-număr variabil miccobacteriene, a fost observată o discrepanță în ceea ce privește rezistența la etambutol. Caracterizarea aprofundată a izolatelor prin secvențierea întregului genom al primelor și ultimelor trei izolate din colecția noastră de cultură a arătat că aparțin grupului genetic principal 1, grupului de grup 2 polimorfism nucleotidic unic (SNP), tip secvență 10. Comparativ cu M. tuberculoza Genomul de referință H37Rv, 1242 SNP au fost frecvent găsite în toate izolatele. Genomul acestor izolate s-a dovedit a fi clonal și foarte stabil pe o perioadă de 5 ani și două sau trei SNP-uri unice au fost identificate în fiecare dintre ultimele trei izolate. Au fost analizate genele cunoscute a fi asociate cu rezistența la medicamente și regiunile promotorului lor, acolo unde este cazul. Prezența unor mutații reduse sau fără costuri de fitness pentru rezistența la medicamente și un SNP L731P suplimentar în rpoB gena a fost observată în toate izolatele. Aceste descoperiri ar putea explica transmiterea cu succes a acestei tulpini MDR-TB.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Cum se face o analiză a întregului genom al Mycobacterium tuberculosis rezistent la medicamente - Biologie

Tuberculoza multirezistentă (TB MDR), tuberculoza pre-extensivă rezistentă la medicamente (TB pre-XDR) și tuberculoza rezistentă la medicamente (TB XDR) complică controlul bolii. Am analizat datele secvenței genomului întreg pentru 579 rezistente fenotipic la medicamente M. tuberculoza izolate (28% din MDR / pre-XDR disponibile și toate izolatele TB cultivabile XDR colectate în Thailanda în perioada 2014-2017). Cele mai multe izolate provin din linia 2 (n = 482 83,2%). Analiza cluster a relevat că 281/579 de izolate (48,5%) au format 89 de clustere, incluzând 205 TB MDR, 46 TB pre-XDR, 19 TB XDR și 11 izolate TB rezistente la medicamente, bazate pe rezistența la medicamente genotipice. Membrii majorității grupurilor au avut același subset de mutații asociate rezistenței la medicamente, susținând rezistența potențială primară în TB MDR (n = 176/205 85,9%), TB pre-XDR (n = 29/46 63,0%) și TB XDR ( n = 14/19 73,7%). Treisprezece clade majore au fost semnificativ asociate geografiei (p & lt0.001). Clusterele de origine clonală contribuie în mare măsură la prevalența ridicată a tuberculozei rezistente la medicamente în Thailanda.

Tuberculoza (TBC), cauzată de Mycobacterium tuberculosis, este o problemă majoră de sănătate publică la nivel mondial. Asia de Sud-Est contribuie în mod semnificativ (44%) la cazurile globale de TBC. Thailanda se află în primele 30 de țări în ceea ce privește incidența TB rezistentă la medicamente (DR) (1). TB TB, inclusiv TB rezistentă la rifampicină și tulpini cu rezistență suplimentară la izoniazid (TB multirezistentă [MDR] TB), rămâne o mare provocare pentru controlul TB. În 2018, la nivel global au fost raportate 50000 de cazuri noi de TB rezistentă la rifampicină, dintre care 78% au fost TB MDR (1). Mai îngrijorător este TB rezistent la medicamente (XDR), care prezintă în plus rezistență la 1 fluorochinolonă și 1 medicament injectabil de a doua linie. Proporția medie a cazurilor globale de TB MDR cu TB XDR este de 6,2% (1). În Thailanda, în ciuda incidenței reduse a TB, numărul raportat de cazuri de TB MDR aproape sa dublat în perioada 2014-2018 (1) unele sunt probabil TB XDR. Tratamentul pentru pacienții cu TB TB este prelungit și costisitor, iar rezultatele sunt slabe.

Secvențierea întregului genom (WGS) al M. tuberculoza oferă informații despre rezistența la medicamente, în care mecanismele implică aproape în mod exclusiv mutații (în principal polimorfisme cu un singur nucleotid [SNP], dar și inserție / deleții) în gene care codifică țintele medicamentelor sau enzimele de conversie a medicamentelor. Datele WGS pot oferi, de asemenea, informații despre transmiterea și datarea clusterelor (2), în care tulpinile cu variante genetice aproape identice sunt susceptibile să facă parte dintr-un lanț de transmisie (3). Analiza M. tuberculoza Datele WGS din izolatele din Thailanda ar putea oferi informații foarte necesare despre transmiterea TB MDR / XDR. Studiile anterioare ale TB TB au utilizat tehnici de genotipare (de exemplu, spoligotipare, unitate repetitivă micobacteriană repetată - număr variabil tandem-repetare și polimorfism de lungime a fragmentului de restricție) (4,5), dar aceste metode au rezoluție limitată pentru deducerea transmisiei, deoarece investighează & lt1% din M. tuberculoza genom. O analiză recentă WGS a relevat posibila transmisie clonală a 4 izolate de TB MDR în provincia Kanchanaburi (6). Cu toate acestea, amploarea grupurilor de TB MDR și XDR TB din Thailanda este necunoscută. Scopul nostru a fost investigarea modelelor de grupare și a factorilor de risc ai posibilelor clustere de transmisie TB MDR, pre-XDR TB și XDR TB în Thailanda, folosind datele WGS.

Metode

Studiați populația și setarea

În perioada 2014–2017, în total 2.071 M. tuberculoza cazuri confirmate de cultură TB MDR, pre-XDR TB și cazuri XDR TB au fost enumerate în evidența de laborator a Laboratorului Național de Referință pentru Tuberculoză (Ministerul Sănătății Publice NTRL) și a Spitalului Siriraj, Universitatea Mahidol, Thailanda. Aceste 2 laboratoare acoperă 230 de spitale care tratează majoritatea cazurilor de TB în Thailanda (Anexa 1 Tabelele 1, 2) (7). Am selectat aleatoriu 547 M. tuberculoza izolate de TB MDR și cazuri de TB pre-XDR în 6 regiuni și 71 din 77 de provincii la nivel național. Am inclus, de asemenea, toate izolatele de TB XDR recuperabile (n = 32) (Anexa 1 Tabelul 3). Pentru 11 cazuri, s-au folosit perechi de izolate colectate în momente diferite ca controale interne pentru distanțele SNP. În fiecare pereche de control, am inclus izolatul cu cele mai multe mutații asociate cu rezistența la medicamente sau izolatul cronologic mai devreme în populația studiată (n = 579). Am preluat date demografice din înregistrările de laborator. Protocolul de studiu a fost aprobat de Centrul pentru Etică în Cercetarea Umană, Universitatea Khon Kaen (aprobare nr. HE601249).

Testarea fenotipică a sensibilității la droguri

Am efectuat teste fenotipice de sensibilitate la droguri (DST) folosind metoda standard proporțională cu agar în mediu Lowenstein-Jensen (8). Concentrațiile medicamentelor utilizate au fost de 0,2 μg / ml pentru izoniazidă 40,0 μg / ml pentru rifampicină, etionamidă, capreomicină și ciclozerină 2,0 μg / ml pentru etambutol, ofloxacină și levofloxacină 4,0 μg / ml pentru streptomicină 30,0 μg / ml pentru kanamicină și 0,5 μg / ml ml pentru para-acid amino-salicilic. Noi am folosit M. tuberculoza H37Rv ca tulpină de referință susceptibilă.

Analiza secvenței întregului genom

Am folosit mai multe bucle de M. tuberculoza colonii pentru extracția ADN genomic (cu metoda bromură de cetil-trimetil-amoniu-clorură de sodiu) (9). Date WGS pentru 590 M. tuberculoza izolatele au fost produse de NovogeneAIT (https://en.novogene.com) folosind platforma HiSeq (Illumina, https://www.illumina.com) care generează citiri de 150 bp. Am verificat calitatea citirilor secvenței folosind FastQC versiunea 0.11.7 (10). Am cartografiat citiri de înaltă calitate din fiecare izolat pe genomul de referință H37Rv (acces GenBank nr. NC_000962.3) folosind versiunea BWA-MEM 0.7.12 (Li H, date unpub., Https://arxiv.org/abs/1303.3997 ). Adâncimea medie de acoperire a secvențierii a fost ridicată (341,01 ± 61,98). Am folosit SAMtools versiunea 0.1.19 (11) și versiunea GATK 3.4.0 (12) pentru a apela SNP-uri și inserare / ștergere. Am filtrat variantele pe baza unei adâncimi minime de acoperire de 10 ori și a scorului de calitate minim al apelului de bază Q20, iar setul de intersecție al variantelor GATK și SAMtools a fost păstrat. Am folosit instrumentul online TB-Profiler versiunea 2.8.6 (13,14) pentru a deduce rezistența la medicamente și M. tuberculoza apartenență la descendență pe baza SNP-urilor din datele WGS. Datele WGS sunt disponibile în arhiva de citire a secvenței ENA (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home) (nr. De acces PRJNA598981 și PRJNA613706).

Analiza filogenetică

Am construit un arbore filogenetic bazat pe 26.541 SNP de înaltă încredere între 590 de izolate folosind metoda de maximă probabilitate cu modelul general selectat reversibil în timp cu modelul de distribuție gamma, implementat în versiunea MEGA 10.1 (15). Am exclus cele 130 SNP-uri cunoscute a fi asociate cu DR TB găsite în acest studiu pentru a ne asigura că acestea nu ar afecta analiza filogenetică. Am dedus un arbore de consens bootstrap din 1.000 de replici. Am produs imaginea arborelui filogenetic folosind iTOL (16).

Analiza datelor

Izolatele care formează grupuri monofiletice în care multe sau toate perechile au diferit de 25 SNP au fost plasate în aceeași cladă. Clusterele au inclus izolate care diferă de 0-11 SNP-uri. Am considerat membrii unui singur cluster ca descendenți dintr-o singură clonă prin transmisie recentă. Izolatele transmise mai puțin recent în cadrul unei clade au diferit de 12-25 SNP. Am calculat procentul de grupare ca (nr. Izolate de grupare / număr total de izolate) × 100. Am diferențiat izolatele cu TB TB dobândită de posibilele TB TB primare (TB MDR, TB pre-XDR și TB XDR) pe baza achiziționarea de mutații suplimentare asociate rezistenței, în special a celor asociate cu rezistența la fluorochinolone, kanamicină sau capreomicină, medicamente utilizate pentru clasificarea TB TB. Pentru grupurile care conțin izolate cu diferite tipuri de TB TB (cum ar fi TB MDR și TB XDR), am utilizat achiziționarea de SNP-uri suplimentare de rezistență la medicamente și relații co-ancestrale pentru a diferenția între 2 modele de rezistență dobândită: cronologic (tulpina ancestrală a avut mai puține mutații, tip mai mic de DR sau ambele) sau necronologice (tulpina ancestrală a avut mai multe mutații, tip mai puternic de DR sau ambele). Deși TB XDR și TB pre-XDR ar putea fi considerate subseturi de TB MDR, am analizat toate cele 3 ca categorii separate în analizele noastre.

Am analizat toate datele folosind software-ul statistic R versiunea 3.6.1 (https://www.r-project.org) și am considerat că valorile p & lt0.05 sunt semnificative statistic. Am analizat asocierile dintre clade / clustere și geografie folosind tests 2 teste și le-am vizualizat cu pachetul R vcd versiunea 1.4-8. Am calculat ratele de probabilitate (OR) cu 95% CI utilizând pachetul R epiR versiunea 1.0-4. Am testat factorii asociați cu gruparea izolatelor folosind Student t-test (date numerice), testul χ 2 sau testul exact Fisher (date categorice), atunci când este cazul. Am construit grafice folosind pachetul R ggplot2 versiunea 3.2.1 și am construit fito-hărți utilizând pachetul fitool versiunea 0.7-20.

Rezultate

Studiați populația și caracteristicile

Figura 1. Distribuția geografică și descendentă a 579 rezistente la medicamente Mycobacterium tuberculosis izolate în Thailanda, 2014–2017. A) Distribuția geografică a TB MDR, TB pre-XDR și TB XDR. B) Distribuția liniei de medicamente rezistente.

Cele mai multe (466 80,5%) dintre cele 579 de cazuri confirmate de cultură TB de DR în populația studiată au fost TB MDR, urmate de 81 TB pre-XDR (14,0%) (Anexa 1 Tabelul 2). Am inclus toate izolatele de TB XDR disponibile (n = 32), constituind 5,5% din eșantioanele noastre, dar doar 1,5% din 2.071 izolate confirmate de cultură de TB TB colectate la nivel național în perioada 2014-2017. Regiunile centrale și nord-estice ale Thailandei au avut cele mai mari proporții de TB TB (Figura 1).Cele 3 provincii cu cel mai mare număr de cazuri de TB TB au fost Bangkok (n = 85 14,7%), Kanchanaburi (n = 51 8,8%) și Chonburi (n = 37 6,4%) (Figura 1 Anexa 1 Tabelul 3). Majoritatea pacienților au fost bărbați (n = 419 73,1%) și vârsta medie a fost de 43,5 (± 14,7) ani (Anexa 1 Tabelul 4).

Analiza filogenetică

Figura 2. Arborele filogenetic pentru 590 rezistent la medicamente Mycobaterium tuberculosisizolate din Thailanda, 2014–2017. De la cercurile interioare la cele exterioare: testul de sensibilitate la medicament fenotipic pe bază de cultură, profilul de rezistență la medicamente bazat pe secvențierea genomului întreg (DR TB, MDR.

Cele mai multe dintre M. tuberculoza izolatele aparțineau liniei est-asiatice (linia 2) (n = 482 83,2%), urmată de linia indo-oceanică (linia 1) (n = 67 11,6%), linia euro-americană (linia 4) (n = 29 5,0%), și descendența est-african-indiană (descendența 3) (n = 1 0,2%) (Figura 2 Anexa 1 Tabelul 5). Liniage 2.2.1 (n = 413 71,3%) a fost principala subliniere în rândul TB MDR, pre-XDR și XDR.

Clustere și clustere posibile de transmisie

Figura 3. Distribuția geografică a 13 clade majore de tuberculoză rezistentă la medicamente în Thailanda. A) Cele 13 clade sunt evidențiate în cercul exterior. Bara de scară indică distanța genetică proporțională cu.

Arborele filogenetic (Figura 2) a arătat o diversitate enormă printre izolatele de tuberculoză DR din Thailanda. Multe izolate erau distincte, diferind de toate celelalte la o medie ± SD de 657 ± 626 SNP. Cele mai multe izolate (n = 319 55,1%) grupate în 13 clade, fiecare constând din 5-86 izolate (Figura 3 Anexa 2 Figura 1). Cladele 1, 6, 11 și 13 au fost formate dintr-un singur grup mic de izolate strâns legate, cladele rămase au inclus & gt 1 clustere posibile (Anexa 2 Figura 2). Izolatele grupate în fiecare cladă au fost semnificativ asociate cu o anumită regiune geografică (p & lt0.001 Anexa 2 Figura 3, panoul A). Clada 1 (Figura 3, panoul B) a fost găsită numai în provincia Trat și clada 13 a predominat în Kanchanaburi (Figura 3, panoul N).

Figura 4. Toate grupurile de izolate DR TB din Thailanda. A) Un total de 89 de clustere sunt evidențiate în cercul exterior. Bara de scalare indică distanța genetică proporțională cu totalul.

Un total de 89 de clustere conțineau 281 de izolate (48,5%) (Anexa 1 Tabelul 6). Șaizeci de clustere (izolate care diferă de ≤11 SNP), conținând 2-34 de izolate, au intrat în principalele clade. Alte 29 de clustere mai mici au apărut în altă parte a copacului. Majoritatea izolatelor dintr-un cluster au partajat legături geografice (Figura 4, panourile A-F Anexa 1 Tabelul 6). Procentele de izolate TB MDR, TB pre-XDR și XDR TB (bazate pe DST fenotipică) care au căzut în clustere au fost de 46,1% (215/466) pentru TB MDR, 49,4% (40/81) pentru TB pre-XDR, și 81,3% (26/32) pentru TB XDR (Anexa 1 Tabelul 6). Distanțele SNP în perechi din cadrul și dintre fiecare dintre cele 89 de clustere sunt prezentate pe scurt (Anexa 1 Tabelul 7).

Unele clustere au inclus izolate cu diferite tipuri de TB TB. Nouăsprezece dintre cele 89 de clustere (C2, C7, C10, C16, C22, C36, C37, C40, C43, C49, C59, C60, C63, C70, C72, C76, C80, C83 și C89) au avut un model cronologic bazat pe privind creșterea progresivă a numărului de mutații DR de la bază la vârfurile filogeniei (Anexa 1 Tabelul 8). Modelul mutațiilor DR a fost necronologic în grupurile C21, C23, C32, C35, C41, C55, C71 și C75. Dintre cele 281 de izolate de grupare, 81,9% au fost clasificate ca posibile TB TB primară (n = 230), inclusiv TB MDR (n = 176/205 85,9%), TB pre-XDR (n = 29/46 63,0%) și XDR TB (n = 14/19 73,7%). În plus, am identificat 10 izolate MDR fenotipic și 1 izolat fenotipic pre-XDR TB ca exemple posibile de rezistență la izoniazide primare (n = 11) pe baza DR genotipic. Alte izolate de grupare (n = 51/281, 18,1%) au prezentat TB DR obținută (TB MDR [n = 29/205 14,1%], TB pre-XDR [n = 17/46 37,0%] și TB XDR [n = 5/19 26,3%]) (Tabelul 1).

Printre izolatele grupate, a existat o oarecare discordanță între rezultatele fenotipice ale DST (TB MDR [n = 215], TB pre-XDR [n = 40] și TB XDR [n = 26]) și rezultatele DST genotipice (poly-DR TB [ n = 11], TB MDR [n = 205], TB pre-XDR [n = 46] și TB XDR [n = 19]) (Anexa 1 Tabelul 8). Am identificat 11 izolate de TB fenotipic MDR genotipic ca TB poly-DR (rezistent la medicamentul & gt1 dar nu atât la izoniazidă, cât și la rifampicină). Am identificat 66 MDR TB, 9 pre-XDR TB și 10 XDR TB clustere pe baza DST fenotipic (Anexa 1 Tabelul 9 Anexa 2 Figura 4, panourile A-F). Cele mai multe clustere pre-XDR TB și XDR TB aveau legături bazate pe spitale (Anexa 1 Tabelul 9). Sunt prezentate toate grupurile fenotipice de TB TB și tipurile de rezistență, stratificate în funcție de provincie (tabelul 10 din apendicele 1).

Factori asociați cu posibilele clustere de transmisie TB TB

Pacienții cu TBC de la care s-au obținut izolate de grupare au avut o vârstă medie de ≈42 ani. Izolatele care se încadrează în clustere au fost semnificativ asociate cu regiunile geografice (p = 0,001 Anexa 2 Figura 3, panoul B). Pacienții cu TBC care trăiau în provinciile de vest au avut un risc mai mare de a se afla în grupurile posibile de transmitere a TBC DR decât cei din alte părți (OR 2,44, 95% CI 1,53-3,89 Tabelul 2). Liniage 2.2.1 (comparativ cu alte linii) a fost asociată cu un risc mai mare de posibile clustere de transmitere a TB TB (OR 3,59, 95% CI 2,42-5,32). Liniage 1 a avut cel mai scăzut risc de a fi reprezentată în grupurile de transmitere a TB TB (OR 0,03, 95% CI 0,01-0,11). Clustering izolate au avut mutații de rezistență la medicamente, cum ar fi katG S315T, rpoB S450L și embB G406D (Tabelul 2).

Discuţie

TB MDR și TB XDR sunt probleme globale grave, dar puține studii s-au concentrat pe transmiterea lor la o rezoluție la nivel național. Thailanda are o povară mare de TB MDR și un număr tot mai mare de cazuri de TB MDR (1). Am obținut 579 izolate de TB DR în 71 de provincii în perioada 2014-2017. Aproape jumătate dintre acestea se aflau în posibile clustere de transmisie, implicând în cea mai mare parte M. tuberculoza descendență 2.2.1. Un total de 89 de clustere, cele mai multe distribuite în 13 clade majore, au contribuit la focare multiclonale de TB MDR asociate cu regiuni specifice din Thailanda. Bangkok, Kanchanaburi și Chonburi au fost provinciile cu cele mai mari proporții de grupuri de TB MDR, TB pre-XDR și XDR TB (adică grupuri de izolate care diferă de & lt 11 SNP). Am folosit 2 criterii pentru a selecta valorile limită SNP. În primul rând, limita diferenței & lt 11 SNP pentru un cluster a fost derivată direct din numărul maxim de diferențe dintre cele 11 izolate pereche utilizate ca control intern. În al doilea rând, am folosit o limită SNP concordantă sau mai strictă decât cele din studiile anterioare (1720). Limita noastră de 11 SNP a fost proporțional 0,0004 din cele 26 541 SNP din setul nostru total. Această proporție a fost concordantă cu cea dintr-un studiu anterior (21) și mai stricte decât cele din alte studii (18,20). A & lt12-SNP cutoff a fost propus anterior ca limită superioară pentru eventuale evenimente de transmitere a clusterului (2).

Analiza filogenetică a identificat 13 clade majore, fiecare asociată cu o anumită regiune. Diferențele SNP în perechi între izolatele din clade au variat de la & lt11 la ≈25, sugerând o serie de timpi de divergență față de un strămoș comun (Anexa 2 Figura 2). Pe baza estimărilor timpului de transmisie (0,5 SNP / genom / an) pentru M. tuberculoza (2), unele dintre aceste clade majore ar fi putut începe să circule în Thailanda în urmă cu 20–40 de ani, altele mai recent. Izolatele diferă de 12-25 SNP-uri, totuși au împărtășit adesea legături geografice. De exemplu, 17 din 21 de izolate (81%) din clada 7 (Figura 3, panoul H), care aveau diferențe în perechi care indică un strămoș comun relativ recent, erau situate în provinciile învecinate din sudul Thailandei. Cladele 1, 6, 11 și 13 au fost formate din izolate diferite la foarte puțini SNP-uri, oferindu-ne încredere că acestea au fost probabil exemple de transmisie recentă. Cu toate acestea, izolatele din clada 6 au apărut adesea în diferite provincii.

Cea mai mare și cea mai recentă cladă a fost clada 13 (Figura 3, panoul N), cuprinzând 62 de cazuri (46 TB MDR, 11 TB pre-XDR și 5 XDR TB bazate pe DST fenotipic) găsite în regiunea de vest, în special în Kanchanaburi. Această constatare sugerează că clone ale TB pre-XDR și TB XDR pot apărea din strămoșii recenți ai TB MDR. Am confirmat un raport anterior (22) că a existat un focar mare de TB MDR în Kanchanaburi. În plus, clada 13 este sora cladei 12, care constă din tulpini care se răspândesc atât în ​​centrul (în special Bangkok), cât și în nord-estul Thailandei și conțin tulpini transmise mai puțin recent. Prin urmare, clada focarului MDR TB din Kanchanaburi a fost derivată dintr-o cladă transmisă mai puțin recent în altă parte din Thailanda.

Am identificat 89 de clustere (izolate în fiecare diferă cu & lt 11 SNP) de TB TB în Thailanda. Izolatele grupate au arătat o asociere puternică cu regiunea geografică. Cel mai mare cluster (C89), din cadrul cladei 13 din Kanchanaburi, cuprindea 34 de izolate (27 TB MDR și 7 TB pre-XDR bazate pe DST fenotipic). În Africa de Sud, analiza WGS a unei cohorte mari de TB XDR (& gt400 cazuri) dintr-o singură provincie a arătat că doar 30% dintre participanți aveau legături epidemiologice clare (legătură persoană-persoană sau spital): 70% din evenimentele de transmitere ar fi putut rezulta din cazuri contact între persoane necunoscute (23). Un alt studiu efectuat în Africa de Sud a arătat că 19% dintre pacienții cu TB XDR externați din spital au cauzat cazuri secundare de TB XDR în comunitate (24). Aici, am găsit 9 clustere de TB pre-XDR (cel mai mare cu 7 izolate) și 10 clustere (cel mai mare cu 4 izolate) de TB XDR în Thailanda (Anexa 1 Tabelul 9 Anexa 2 Figura 4).

Pentru a reflecta amploarea focarului de tuberculoză DR din Thailanda, am calculat proporția de izolate care se încadrează în cele 89 de grupuri de tuberculoză DR (Tabelul 1). În unele grupuri, izolatele au prezentat diferite tipuri de TB TB asociate cronologiei, dezvăluind progresia mutațiilor DR în filogenie, deplasându-se de la strămoș spre vârfurile copacului (Anexa 1 Tabelul 8). Pe baza analizei de achiziție a mutațiilor în cadrul acestei filogenii, am văzut exemple de posibilă rezistență primară în 85,9% din TB MDR, 63,0% din TB pre-XDR și 73,7% din cazurile de TB XDR. Opt grupuri au inclus izolate cu diferite tipuri de DR și mai multe mutații asociate rezistenței în tulpina ancestrală decât în ​​descendenții săi. Această situație ar putea fi explicată prin durate diferite ale stadiului de latență care au loc după evenimente de transmitere care duc la apariția unor cazuri mai puțin supărătoare de TB DR (cum ar fi TB MDR) mai târziu decât cazurile mai supărătoare (cum ar fi TB XDR) (25). Deoarece nu toate cazurile din lanțul de transmisie posibil ar putea fi incluse, ar putea exista rezistență primară nedetectată. Sunt necesare date din toate cazurile de TB TB din comunitate și informații despre istoricul tratamentului și expunerea cunoscută pentru a estima cu precizie și complet amploarea TB TB primară. Proporția cazurilor primare de TB TB ar putea fi mai mare, deoarece am raportat un număr de cazuri TB MDR, cu excepția TB pre-XDR și TB XDR (fiecare dintre acestea fiind raportat ca un subset separat). În plus, este posibil ca unele cazuri de index să nu fi fost incluse în populația selectată.

Factorii raportați anterior care contribuie la transmiterea TB MDR includ consumul ilicit de droguri (26) diagnosticul de TB întârziat și vârsta de 45 de ani (18) și a fi singur, cu venituri mici, suferind frecvent de stres și alte boli și lipsit de asigurare medicală (27). Liniage 2 a predominat în studiile anterioare de transmitere a TB MDR (18,26,28). Am constatat că infecția cu descendența 2.2.1 este cel mai puternic predictor (de 3,6 ori) al grupurilor de TB TB, în timp ce infecția cu descendența 1 avea cel mai mic risc. Locuirea în regiunea de vest a Thailandei a crescut riscul de a fi în grupuri de tuberculoză DR de 2,4 ori. Regiunea vestică, fiind aproape de granița cu Myanmar, diferă de alte regiuni ale țării atât din punct de vedere etnic, cât și al dezvoltării economice. Aceste diferențe ar putea explica riscul crescut acolo (29). Anterior, izolatele din cluster erau mai susceptibile de a avea mutații ale rpoB S450L (18,30), katG S315T sau inhA promotor (31). De asemenea, am găsit un model de mutații asociate rezistenței la medicamente (katG S315T, rpoB S450L, embB G406D, rpsL K43R, ethA 639–640del și folC S150G) în clustere.

Situația DR TB în Thailanda este o preocupare majoră și necesită punerea în aplicare urgentă a măsurilor de control, cum ar fi depistarea activă a cazurilor pentru a perturba lanțul de transmisie și intervenția țintită și urmărirea contactelor în regiunile hotspot. Rata mortalității și costul tratamentului TB XDR este foarte mare (32) prin urmare, aceste tipuri de DR ar trebui să fie prioritatea intervenției. Dimensiunea mare a unor clustere ar putea reflecta transmisibilitatea lor ridicată (33) astfel, urmărirea cladei 13 la Kanchanaburi ar trebui să fie o prioritate. Pe lângă cele 13 clade majore, mai multe grupuri mici de DR TB au fost găsite în multe provincii. Nu se cunoaște potențialul de extindere a acestor mici grupuri. Aici am identificat și provinciile hotspot pentru a ajuta la prioritizarea locațiilor de intervenție.

La nivel global, puține studii la scară națională au utilizat analiza WGS a TB MDR, TB pre-XDR și TB XDR (26,30,3436). Studiile mai vechi au folosit instrumente de genotipare contondente (de exemplu, IS6110 polimorfism de lungime a fragmentului de restricție, spoligotipare și unitate repetitivă intercalată micobacteriană-număr variabil tandem-repetare) cu mărimi de probă limitate sau convenabile. Studiile privind TB TB folosind WGS în Arabia Saudită și Portugalia au dezvăluit grupuri de transmitere a TB MDR, cu toate acestea, au avut probe mici și au furnizat date limitate despre legăturile epidemiologice (36,37). Extrapolând rezultatele noastre, tulpinile de TB rezistente la primar pot fi principalii factori care contribuie la actuala problemă globală a prevalenței ridicate a TB MDR și TB XDR.

Principalele limitări ale studiului nostru au fost că era mai degrabă retrospectiv decât prospectiv, nu avea date socioeconomice pentru analiză și nu aveau date la scară fină despre legăturile epidemiologice: posibilele grupări de transmisie erau presupuse doar de la distanțele genetice dintre izolate și spitalul și provincia fiecărui pacient. şedere. În plus, nu se poate face o estimare exactă a timpului exact al transmiterii posibile: grupurile originare cu ani în urmă ar putea continua să se răspândească. De asemenea, nu ne-au lipsit informații despre tratament și istoricul expunerii și despre populația completă pentru a identifica toate cazurile de indice pentru a face diferența între TB primară și TB dobândită. În plus, prevalența și gruparea izolatelor de TB MDR, TB pre-XDR și TB XDR în unele provincii ar putea fi subestimate din cauza acoperirii reduse a DST pentru medicamentele de primă linie printre cazurile de TB (1).

În concluzie, am demonstrat utilitatea WGS pentru epidemiologia TB TB. Am arătat că aproape jumătate din cazurile de TB MDR, pre-XDR TB și XDR TB din Thailanda ar putea fi cauzate de clustere de transmisie. Două treimi din TB pre-XDR și trei sferturi din izolatele de grupare TB MDR și TB XDR au fost exemple posibile de rezistență primară. Aceste rezultate indică faptul că apariția cazurilor de TB MDR, TB pre-XDR și TB XDR în Thailanda ar putea proveni dintr-o bază îngustă de tulpini ancestrale. Prevalența ridicată a TB MDR / XDR în Thailanda ar putea fi rezultatul unor focare multiclonale. Oamenii care locuiesc în regiunea de vest a Thailandei au avut un risc crescut de 2,4 ori de apariție a grupurilor de tuberculoză DR, iar descendența 2.2.1 a conferit un risc crescut de 3,6 ori de a forma grupuri de tuberculoză DR în raport cu alte descendențe.

Domnul Nonghanphithak este doctorand în programul de microbiologie medicală, Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, Khon Kaen, Thailanda. Interesul său de cercetare este în epidemiologia moleculară și predicția rezistenței la medicamente în tuberculoză utilizând tehnici de secvențiere a genomului întreg.

Mulțumiri

Mulțumim Centrului de cercetare și diagnostic pentru bolile emergente și infecțioase (RCEID), Universitatea Khon Kaen, pentru sprijinirea laboratorului și a facilității de cercetare.

Această lucrare a fost susținută de Consiliul Național de Cercetare din Thailanda și de Institutul de Cercetare a Sistemului de Sănătate (HSRI) (numerele de subvenționare 60-057 și 62-003 către K.F.). D.N. este finanțat de Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen. T.G.C. este finanțat de Consiliul de Cercetări Medicale din Marea Britanie (nr. granturilor MR / M01360X / 1, MR / N010469 / 1, MR / R025576 / 1 și MR / R020973 / 1) și Consiliul de Cercetări în Biotehnologie și Științe Biologice din Marea Britanie (BB / R013063 / 1). A.C. este finanțat de Consiliul de cercetare medicală și Agenția Națională de Dezvoltare a Științei și Tehnologiei (MRC / NSTDA) (subvenția nr. P-18-50228).

Această lucrare este dedicată regretatei ASR Principesa Galyanivadhana, patroana Fondului pentru tuberculoză rezistentă la droguri.


Secvențierea întregului genom al Mycobacterium tuberculosis oferă informații despre tulpina din Manila și mutațiile de rezistență la medicamente din Filipine

Filipine are o incidență ridicată a bolii tuberculozei (TB), cu o prevalență crescândă a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) multirezistente care îngreunează controlul. Deși M. tuberculosis "Manila", vechea linie de tip 1 tulpină, se crede că este predominantă în țară, cu dovezi ale exportului către alții, se știe puțin despre diversitatea genetică a tulpinilor circulante. Prin secvențierea întregului genom (WGS) 178 de izolate din ancheta națională de rezistență la droguri din Filipine, am constatat că majoritatea (143/178 80,3%) aparțineau liniei 1 cladă Manila, minoritatea aparținând descendențelor 4 (european-american n = 33 ) și 2 (Asia de Est n = 2). O mare proporție sa dovedit a fi multirezistentă (34/178 19,1%), stabilită prin teste de sensibilitate la medicamente de laborator foarte concordante și metode de predicție in silico. Unele izolate MDR-TB au avut variații genomice aproape identice, oferind dovezi potențiale ale transmiterii. Plasând izolatele filipineze într-o filogenie a M. tuberculozei globale (n & gt 17.000), am stabilit că acestea sunt similare genetic cu cele observate în afara țării, inclusiv o cladă de tipuri de tulpini asemănătoare Manilei în Thailanda. O analiză a filogeniei a relevat un set de

200 SNP-uri specifice tipului de tulpină din Manila și un subset pot fi utilizate într-un cod de bare molecular. Șaizeci și opt de mutații cunoscute a fi asociate cu 10 rezistență la medicamente anti-TB au fost identificate în tulpinile filipineze și toate au fost observate la alte populații. În timp ce nouă putative rezistențe la streptomicină care conferă markeri în genele gid (8) și rrs (1) par a fi noi și cu consecințe funcționale. În general, acest studiu oferă o caracterizare de bază importantă a diversității genetice a M. tuberculosis pentru Filipine și va umple un gol în seturile de date globale și va ajuta la dezvoltarea unei baze de date la nivel național pentru studii epidemiologice și luarea deciziilor clinice. Mai mult, prin stabilirea unui cod de bare molecular pentru detectarea tulpinilor din Manila, acesta va ajuta la proiectarea instrumentelor de diagnostic pentru activitățile de control al bolii.

Declarație privind conflictul de interese

Autorii nu declară interese concurente.

Cifre

178 M . tuberculoză…

178 M . tuberculoză izolate: ( A ) Harta Filipinelor ...


Cum se face o analiză a întregului genom al Mycobacterium tuberculosis rezistent la medicamente - Biologie

Tuberculoza multirezistentă (MDR) și rezistentă la medicamente (XDR) (TB) este o amenințare emergentă pentru controlul TBC în Ucraina, o țară cu a treia cea mai mare sarcină a TBC XDR la nivel global. Am folosit secvențierea genomului întreg al unui eșantion de comoditate pentru a identifica factorii genetici bacterieni și factorii legați de pacient asociați cu TB MDR / XDR în această țară. TB MDR / XDR a fost asociată cu 3 distincte Mycobacterium tuberculosis clade complexe din linia 2 (Beijing), focar W148 Europa / Rusia, focar din Asia Centrală și focar din Ucraina, care cuprindea 68,9% din toate tulpinile de TB MDR / XDR din sudul Ucrainei. TB MDR / XDR a fost, de asemenea, asociată cu tratamentul anterior pentru TB și reședința urbană. Circulația tulpinilor de focar de la Beijing care conțin o rezistență largă la medicamente, împreună cu constrângeri în aprovizionarea cu medicamente și disponibilitatea limitată a testelor de sensibilitate fenotipică la medicamente, trebuie luată în considerare atunci când sunt implementate noi strategii de gestionare a tuberculozei în Ucraina.

În fiecare an, aproximativ jumătate de milion de cazuri noi de tuberculoză multirezistentă (MDR) (TB) provoacă sănătatea globală (1,2). TB MDR este cauzată de Mycobacterium tuberculosis tulpini complexe (MTBC), rezistente la cel puțin izoniazid și rifampicină (3). În Europa, Ucraina este un punct fierbinte al tuberculozei rezistente la medicamente, cu 6.564 cazuri MDR confirmate de laborator și cazuri rezistente la rifampicină (2) și a treia cea mai mare sarcină a tuberculozei rezistente la medicamente (XDR) (1.097 cazuri confirmate de laborator) la nivel global în 2017 (2). TB XDR este o formă complicată de TB MDR cu rezistențe suplimentare la & gt 1 medicament antimicrobian injectabil de linia a doua și o fluorochinolonă (1). Tratamentul TB XDR poate dura până la 2 ani (4) și sa raportat că tratamentul unui singur caz de TB XDR depășește 100.000 EUR (5,6), chiar dacă ratele de succes ale tratamentului rămân ± 30% în regiunea europeană a Organizației Mondiale a Sănătății (40 de țări raportate) (7). Îmbunătățirea prevenirii, diagnosticului și tratamentului TB MDR / XDR este una dintre activitățile de bază prioritare de către OMS și Societatea Respiratorie Europeană pentru eliminarea TB (6).

În plus față de neajunsurile în diagnosticul și tratamentul TBC, factorii genetici bacterieni ar putea juca un rol în succesul epidemiologic al anumitor tulpini MDR, în special al liniei 2 (Beijing) din Eurasia (811). S-a demonstrat că tulpinile de focar MDR de la Beijing dobândesc mutații care îmbunătățesc condiția fizică (adică mutații care cresc ratele de creștere in vitro) care pot duce la o virulență mai mare și la o transmisibilitate crescută, favorizând astfel epidemia de TB MDR în Europa de Est (810). În conformitate cu această ipoteză, modelele de calcul recente prezic că în multe țări cu incidență ridicată a tuberculozei, transmiterea de la persoană la persoană, dar nu achiziția legată de tratament, reprezintă aproape toate (95,9%) cazuri de TB MDR incidente (12). Secvențierea întregului genom (WGS), împreună cu o predicție moleculară a rezistenței la medicamente, a oferit o perspectivă asupra rețelelor de transmisie MTBC și a transmisibilității tulpinilor MTBC MDR / XDR (810,1315). Am aplicat o abordare epidemiologică moleculară bazată pe WGS pentru a identifica tiparele de rezistență moleculară, tipurile de tulpini dominante și factorii legați de pacient asociați cu TB MDR / XDR într-un eșantion de convenție din sudul Ucrainei.

Metode

Populația de studiu

Izolatele MTBC au fost colectate în perioada ianuarie-iunie 2015 în laboratorul clinic al spitalului regional de tuberculoză Odessa (acum Centrul regional Odessa pentru boli semnificative social Odessa, Ucraina), unde majoritatea culturilor clinice MTBC din regiune sunt izolate și analizate în mod obișnuit. Am finalizat subcultivarea și WGS pe un subset de izolate de cultură obținute la laboratorul clinic în perioada de studiu. Strategia de eșantionare a vizat să includă o proporție similară de izolate TB MDR / XDR și tulpini non-MDR (polirezistente și pansusceptibile). Am inclus eșantioane pe baza testului de sensibilitate fenotipică de rifampicină și izoniazidă care a clasificat izolatele ca tulpini MDR sau non-MDR TB, incluziunea a fost imparțială și izolatele au fost incluse direct din conducta clinică atunci când resursele umane și tehnice erau disponibile. Izolatele atât din cazurile noi, cât și din cazurile de retratare au fost eligibile pentru cazurile de retratare a incluziunii, incluzând recăderea, reinfectarea, eșecul tratamentului sau episodul de tratament întrerupt. În conformitate cu protocolul clinic din laborator, toate culturile MTBC care nu au fost incluse în studiul nostru au fost autoclavizate și eliminate.

Figura 1. Locații în care Mycobacterium tuberculosis probe de ADN complexe (MTBC) au fost colectate în regiunile Odessa și Vinnytsia. Punctele galbene indică localizarea pacienților infectați cu o tulpină de focar MTBC linia 2 Ucraina. Verde.

Studiul nostru a fost stabilit în principal în regiunea Odessa, care a avut cea mai mare sarcină TB (3.039 cazuri) din Ucraina, a doua cea mai mare sarcină TB TB (30,5% pentru cazurile noi și 46,9% pentru retratare) și incidența TB de două ori mai mare decât media țării (127,9 cazuri / 100.000 populație) în 2017 (16). În total, am inclus 186 de izolate MTBC, fiecare obținut de la 1 pacient majoritatea locuind în regiunea Odessa (95,2%). Restul eșantioanelor (4,8%) provin din regiunea administrativă limitrofă din Vinnytsia (Figura 1). Includerea acestor probe a susținut investigarea legăturilor epidemiologice între ambele regiuni. Astfel, analiza se concentrează pe diferențele dintre 103 tulpini non-MDR și 74 MDR / XDR MTBC, toate izolate din sudul Ucrainei. Caracteristicile pacienților evaluate pentru asocierea cu TB MDR / XDR au fost vârsta, sexul, reședința, starea HIV și definiția cazului.

Urmărirea prin contact a pacienților infectați cu o tulpină de focar din Ucraina

Am efectuat o revizuire retrospectivă a urmăririi contactului epidemiologic pentru pacienții infectați cu o tulpină de focar din Ucraina, prin evidența pacientului. Deoarece Ucrainei îi lipsesc resursele pentru urmărirea contactelor și TB este stigmatizată, am anticipat că informațiile jurnalului vor produce puține contacte. Pentru a ajuta la identificarea contactelor, am intervievat medici care acordă îngrijire pacienților cu o tulpină de tuberculoză din Ucraina. Am păstrat confidențialitatea datelor în conformitate cu aprobările etice regionale din Ucraina și Umea, Suedia (N 2012-292-31M). Am împărtășit imediat informații cu privire la transmiterea nosocomială a tulpinilor de focar din Ucraina cu administrația spitalului regional de tuberculoză din Odessa pentru a sprijini măsurile de control al infecțiilor.

Caracterizarea fenotipică a rezistenței la medicamente și izolarea ADN-ului

Am efectuat izolarea primară și testarea sensibilității la medicamente a tulpinilor MTBC folosind protocolul de diagnostic clinic pentru TBC în Ucraina. Pe scurt, am tratat probele de spută cu metoda N-acetil-L-cisteină-NaOH (NALC) pentru decontaminare și le-am prelucrat în continuare pentru colorarea Ziehl-Neelsen folosind GeneXpert-MTB / RIF (Cepheid, https: //www.cepheid. com), urmată de inoculare pe mediu Löwenstein – Jensen (LJ) și tuburi BACTEC MGIT960 (Becton Dickinson, https://www.bd.com) pentru confirmarea culturii și ulterior pentru testarea sensibilității fenotipice la medicamente. Am utilizat următoarele concentrații de medicamente (mg / L, pe mediu): izoniazidă, LJ 0,2, MGIT960 0,1 rifampicină, LJ 40,0, MGIT960 1,0 etambutol, LJ 2,0, MGIT960 5,0 pirazinamidă, MGIT960 100,0 și streptomicină, LJ 4,0, MGIT960 1,0. Reactivii individuali nu au fost întotdeauna disponibili pentru testarea de rutină a sensibilității la medicamente, iar profilurile de rezistență din acest manuscris se bazează pe markeri moleculari (Anexa 1 Tabelul 1, https://wwwnc.cdc.gov/EID/article/26/3/19- 0525-App1.xlsx). Am extras ADN micobacterian din culturile de LJ așa cum s-a descris anterior (17) folosind bromură de cetiltrimetilamoniu.

Secvențierea întregului genom

Am finalizat WGS folosind tehnologia Illumina (MiSeq, NextSeq 500 și kitul de pregătire a bibliotecii Nextera XT Illumina, https://www.illumina.com) conform instrucțiunilor producătorului. Am mapat datele brute citite (fișiere FASTQ) la M. tuberculoza Genomul H37Rv (nr. De acces GenBank NC_000962.3) utilizând potriviri maxime exacte ale Burrows-Wheeler Aligner (18) și mapări rafinate cu pachetul software Genome Analysis Toolkit (19). Am detectat variante, inclusiv polimorfisme cu un singur nucleotid (SNPs) și inserții și deleții (indels), cu Samtools mpileup (20). Pentru o aliniere a secvenței concatenate, baza reconstrucției filogenetice, am considerat doar SNP-uri cu praguri minime de 4 citiri atât în ​​orientare directă, cât și inversă, 4 citiri apelând SNP cu un scor Phred & gt 20 și 75% frecvență SNP. Am exclus SNP-urile consecutive pentru reconstrucția filogenetică detectată în & lt 12 bp, care poate apărea ca variante artificiale în jurul indelilor și care ar umfla distanța genetică a izolatelor individuale. Am combinat toate pozițiile SNP rămase care au avut un apel de bază clar pentru toate tulpinile și s-au potrivit nivelurilor de prag în & gt 95% din toate tulpinile într-o singură aliniere FASTA, excluzând în continuare regiunile repetitive și genele asociate rezistenței.

Reconstrucția filogenetică

Am calculat arborii cu probabilitate maximă cu FastTree versiunea 2.1.9 (21) utilizând un model general de substituție a nucleotidelor reversibil în timp și 1.000 de eșantionări. Arborele consens a fost înrădăcinat cu opțiunea rădăcină a punctului mediu în FigTree versiunea 1.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree). Am obținut cladograme de tulpini de focar și numărul de mutații specifice ramurilor prin parsimonie maximă folosind versiunea BioNumerics 7.6 (Applied Maths, https://www.applied-maths.com).

Am dedus linii filogenetice din SNP-uri specifice bazate pe Coll et al. (22) și Merker și colab. (8). Ca proxy pentru cazurile de TB asociate cu evenimente de transmisie directă, am considerat o distanță genetică maximă pereche între & gt 2 izolate MTBC de 5 SNP, propuse de Walker și colab. ca un prag strict care a identificat cazurile asociate cu transmiterea gospodăriei (23).

Predicția genotipică a rezistenței la medicamente

Am extras polimorfisme din 37 de ținte genomice asociate rezistenței la medicamente și capacității bacteriene (Anexa 1 Tabelul 1). Am exclus variantele filogenetice cunoscute și nou identificate, care nu au legătură cu rezistența (8,24,25) din prezicerea genotipică a rezistenței la medicamente (Anexa 1 Tabelul 3).

Genotipurile de rezistență au fost definite după cum urmează: pentru alelele de tip sălbatic (secvența de referință H37Rv) pentru toate țintele asociate rezistenței am dedus susceptibilitatea antimicrobiană (tip sălbatic genotipic, gWT). Am clasificat izolatele cu mutații necunoscute drept genotipice non-wild-type (non-WT) fără nicio altă clasificare. Am considerat că izolatele cu mutații cunoscute de mediere a rezistenței sunt rezistente la medicamentul antimicrobian respectiv (Anexa 1 Tabelul 1). Folosind predicții de rezistență genotipică, am clasificat izolatele ca XDR (mutații cunoscute care mediază rezistența la izoniazidă, rifampicină și gt 1 medicament injectabil de linia a doua și o fluorochinolonă), MDR (rezistență la isoniazidă și rifampicină, dar nu XDR) și non-MDR ( fie pansusceptibil, fie orice rezistență, dar nu MDR).

Analize statistice

Am creat un grafic de asociere în versiunea R 3.3 (https://www.r-project.org) folosind pachetul vcd versiunea 1.4. Presupunerea de bază este că proporția tulpinilor MDR / XDR MTBC din cadrul unui grup seamănă cu proporția acestui grup dintre toate izolatele analizate (adică, nivelul de rezistență este independent de grupările filogenetice). Am calculat reziduurile Pearson pentru a măsura abaterea de la independență față de fiecare celulă.26). Am pregătit un grafic cutie de distanțe genomice perechi de tulpini MTBC din grupuri de tulpini definite cu versiunea R 3.3 folosind pachetul ggplot2 versiunea 2.2 (Anexa 2 Figura 1).

Am analizat factorii asociați cu MDR / XDR TB prin regresie logistică (model univariat și multivariat) utilizând funcția glm în versiunea R 3.3.1 (27). Am exclus genotipul variabil MTBC din analiza multivariată, deoarece numărul de celule a inclus 0. Am comparat mediile distanțelor SNP perechi cu analiza varianței unidirecționale (ANOVA) și testele de comparație multiplă Bonferroni.

Rezultate

Populația de studiu

În perioada de studiu, serviciul TB a identificat 1.026 de pacienți cu specimen de cultură & gt 1 pozitiv în regiunea Odessa. Dintre aceste culturi, 330 de izolate au fost identificate ca MDR.

Studiul nostru a inclus 16,17% (169 / 1.026) din culturile pozitive identificate. Eșantioanele de TB MDR / XDR au constituit 21,82% (72/330) din toate culturile pozitive de TB MDR / XDR identificate în perioada de studiu. Restul de 97 de izolate au fost tulpini fenotipice non-MDR MTBC (50 pansusceptibile și 47 tulpini monorezistente sau polirezistente). În plus, am colectat și analizat în mod aleatoriu 6 izolate pansusceptibile și 2 MDR / XDR MTBC de la pacienții cu TBC înregistrați în regiunea limitrofă a Vinnytsia (Spitalul regional de TB Vinnytsia, Vinnytsia).

După finalizarea WGS, am retras 4,8% (9/186) din izolatele MTBC din analiză din cauza discrepanțelor dintre testele de sensibilitate fenotipică la medicamente și predicția aplicată a rezistenței la medicamente pe bază de genom. Prin urmare, am inclus 177 izolate clinice MTBC în analiză.

MDR / XDR MTBC Clade de focar din Beijing

Figura 2. Filogenia cu probabilitate maximă bazată pe 10.339 SNP și care folosește un model general de substituție reversibil în timp pentru 177 MDR / XDR clinice și non-MDR Mycobacterium tuberculosis izolate complexe din sudul Ucrainei. Ramurile sunt codificate în culori în conformitate cu.

Am clasificat un total de 177 izolate clinice pe baza datelor WGS din 10.339 poziții variabile, conform unui cod de bare SNP recent propus (22). Mai mult, am clasificat 89 dintre izolate (50,3%) ca genotip Beijing (descendență 2.2.1) și restul 88 (49,7%) ca descendență euro-americană 4. Am diferențiat descendența 4 tulpini la următoarele genotipuri și subliniile: 8 / 88 (9,1%) Ghana (linia 4.1) 32/88 (36,4%) H37Rv (linii 4.7 și 4.8) 16/88 (18.2%) Haarlem (linii 4.1.2 și 4.1.2.1) 21/88 (23,9% ) LAM (linii 4.3.3, 4.3.4.1 și 4.3.4.2) și 11/88 (12,5%) Ural (linia 4.2.1) (Figura 2).

În cadrul liniei 2.2.1 din Beijing, am identificat 3 subgrupuri strâns legate, care au prezentat o diversitate genetică mai mică comparativ cu alte tulpini de linie 2.2.1, pe baza distanțelor SNP perechi intragrup, între oricare 2 tulpini. Două dintre aceste subgrupuri au fost raportate anterior în alte setări (8) le-am identificat prin SNP-uri specifice cladei și le-am numit focar Asia Centrală și focar Europa / Rusia W148. Al treilea subgrup, numit focar Ucraina, nu fusese descris anterior. Aceste clade de la Beijing au arătat o distanță mediană mai mică a SNP în perechi de 25 (interval interquartile [IQR] 20,0-32,5) pentru focarul din Asia Centrală, 39 (IQR 25,0-48,0) pentru focarul Europa / Rusia W148 și 14 (IQR 11,5-18,0) pentru Izbucnirea Ucrainei, în contrast cu o distanță de 122 (IQR 170,8-139,0) pentru alte tulpini din Beijing (p & lt0,05, ANOVA unidirecțională, test de comparație multiplă Bonferroni) (Anexa 2 Figura 1).

Când am considerat un prag strict de 0-5 SNP-uri, așa cum s-a propus anterior pentru tulpinile MTBC izolate din contactele casnice (23), doar 9,0% din toți pacienții (16/177) ar putea fi legați de 7 rețele de transmisie putative cuprinzând câte 2-4 pacienți fiecare. Am găsit aceste rețele sau clustere moleculare printre cele 3 focare de la Beijing (3 evenimente de transmisie) și alte tulpini de la Beijing (1 eveniment de transmisie), precum și printre tulpinile euro-americane (linii 4.1 și 4.8 3 evenimente de transmisie) (Anexa 1 Tabelul 1).

Recenzie de urmărire a contactelor pentru cazurile de focare din Ucraina din Beijing

Legăturile epidemiologice dintre pacienții grupați au fost parțial confirmate prin analiza retrospectivă a urmăririi contactului la pacienții infectați cu tulpina de focar din Ucraina din 18 cazuri, 7 au fost noi și 11 au fost retratate (Figura 1 Anexa 1 Tabelul 4 Anexa 2 Figura 2). Cazurile de focar din Ucraina au fost înregistrate în mai multe locuri (Figura 1). 2 cazuri (odir-5192 și odir-1636, distanța SNP 3) au avut contact strâns prin vecinătatea lor imediată (Anexa 1 Tabelul 4 Anexa 2 Figura 2). Contactul de vecinătate a fost, de asemenea, detectat prin aplicarea pragului strict al SNP. Alți trei pacienți au avut un contact familial apropiat cu MDR TB, dar ADN-ul bacterian nu a fost disponibil pentru aceste cazuri. Nu s-a putut stabili o conexiune aparentă între 13 din 18 cazuri de focar din Ucraina.

Factorii pacienților asociați cu TB MDR / XDR

Pentru a identifica anumiți factori demografici și de tratament asociați TB MDR / XDR în sudul Ucrainei, am folosit în continuare analiza de regresie logistică (Tabelul 1). După analiza multivariată, 3 factori - tratamentul TB anterior (OR 3,5, 95% CI 1,0-12,8 p = 0,04), locuind într-un oraș (OR 6,0, 95% CI neaplicabil p = 0,005) și infecția cu o tulpină de focar de la Beijing (SAU 7,4, 95% CI 1,8-29,9 p & lt 0,001) - au fost semnificativ asociate cu TB MDR / XDR. Analiza multivariată a inclus variabilele suplimentare de vârstă, sex, starea HIV și genotipul MTBC.

Rezistența la droguri transmisă și dobândită printre tulpinile de focar de la Beijing

Figura 3. Grafic de asociere comparând numărul așteptat și observat de tulpini MDR / XDR și non-MDR din diferite grupuri filogenetice. Culorile și înălțimile barei reflectă reziduurile Pearson, lățimea cutiilor este.

În concordanță cu rezultatele analizei de regresie filogenetică și logistică, tulpinile de focar de la Beijing au fost principalii purtători de TB MDR / XDR. Tulpinile de focar Europa / Rusia, Asia Centrală și Ucraina au reprezentat 29,9% din cohortă, dar au contribuit la mai mult de două treimi (68,9%) din toate cazurile de TB MDR / XDR (Figura 3 Anexa 1 Tabelul 2). Cele 3 tulpini de focar din Beijing au avut toate rate mari de rezistență la medicamente de primă linie la izoniazidă (93% -100%), rifampicină (93% -100%), streptomicină (93% -100%), etambutol (86% -100%) ) și pirazinamidă (75% -100%) (Tabelul 2). În schimb, ratele de rezistență la medicamente de primă linie printre toate celelalte tulpini de la Beijing și non-Beijing au fost reduse (8% -33% pentru medicamentele individuale). În mod similar, ratele de rezistență la medicamentele de linia a doua dintre cele 3 tulpini de focar au fost ridicate (ofloxacină 14% –44%, kanamicină 14% –50% și protionamidă 57% –100%) comparativ cu alte Beijing (ofloxacină 11%, kanamicină 17 % și protionamidă 11%) și tulpini non-Beijing (ofloxacină 3%, kanamicină 8% și protionamidă 15%) (Tabelul 2).

Un complot de asociere a confirmat rezultatele analizei de regresie logistică care au demonstrat că TB MDR / XDR în rândul pacienților din sudul Ucrainei este în mod clar legată de cele 3 clade de focare de la Beijing și că rezistența la medicamente nu este distribuită în mod egal între tulpinile MTBC, așa cum ne-am aștepta de la eșecuri ale tratamentului aleatoriu (adică rezistența dobândită) (Figura 3).De exemplu, tulpina de focar din Ucraina, constituind 10,2% din cohorta totală, a fost asociată cu 24,3% din toate cazurile de TB MDR / XDR. În schimb, tulpinile non-Beijing, constituind 49,7% din cohortă, au fost asociate cu doar 17,6% din toate cazurile MDR / XDR.

Figura 4. Filogenii parsimonii maxime de 3 Mycobacterium tuberculosis clade complexe de la Beijing în Ucraina: focar W148 Europa / Rusia (A), focar Ucraina (B) și focar Asia Centrală (C). Mutații care mediază rezistența medicamentelor la diferite antibiotice.

Tulpinile din cele 3 focare au demonstrat mutații legate de rezistența la medicamente specifice cladei, în principal la medicamentele de primă linie (Figura 4). Toate tulpinile de focar din Ucraina au avut mutații identice care mediază rezistența la izoniazidă (katG S315T, inhA −15c / t), protionamidă (inhA −15c / t), rifampicină (rpoB S450L), streptomicină (rpsL K88R) și etambutol (embA −12 c / t și embB Y334H), sugerând că pacienții au fost infectați în primul rând cu o tulpină deja rezistentă la cel puțin aceste 5 medicamente. Pe de altă parte, mutații în pncA gena care conferă rezistență la pirazinamidă a fost diversă, indicând achiziția individuală și mai recentă a rezistenței la medicamente sub presiune selectivă (de exemplu, regimuri de tratament nereușite) (Figura 4). Modele similare pot fi observate pentru celelalte 2 focare: rezistență partajată de primă linie care muta mutații mutații unice care mediază rezistența la kanamicină (eis −8 del c, −10 g / a, −12 c / t, −14 c / t, −15 c / g, −35 g / a, −37 g / t) rezistență încrucișată la toate medicamentele injectabile (rrs 1401 a / g) și rezistență la fluorochinolone (gyrA A90V, S91P, D94G, D94N, D94Y, D94A) (Figura 4 Anexa 1 Tabelul 1). Nu am identificat niciun marker de rezistență cunoscut pentru cicloserină și linezolid (Anexa 1 Tabelul 2).

Tulpinile celor 3 clade de focar au dobândit mutații compensatorii putative, de exemplu, în rpoB sau rpoC sugerat anterior să atenueze deficitul de creștere a tulpinilor rezistente la rifampicină (10,11). Aceste mutații apar fie în comun, fie după mutația mediantă a rezistenței la rifampicină în rpoB regiunea care determină rezistența la rifampicină (Figura 4).

Discuţie

Acest studiu demonstrează că pacienții cu TB MDR / XDR din sudul Ucrainei sunt infectați predominant cu tulpini aparținând a 3 clade distincte de focar MTBC din Beijing. Faptul că tulpinile aparținând a 2 dintre aceste focare au fost izolate de pacienți din alte părți ale lumii indică transmiterea pe termen lung și prevalența acestor tipuri de tulpini pe o scară geografică mai largă (adică Europa de Est și Asia Centrală). Fiecare subgrup de focar a adăpostit combinații specifice de mutații care mediază rezistența la medicamente, rezultat probabil al expansiunii clonale a unui strămoș comun rezistent la medicamente, dând naștere unor clone aproape identice care au dobândit individual mutații suplimentare de rezistență la medicamente.

Luând în considerare distanțele medii perechi între cladele de focar (14 SNP pentru focarul Ucrainei, 25 pentru focarul Asiei Centrale și 39 pentru focarul Europa / Rusia) și o rată propusă de mutație pe termen scurt pentru tulpinile MTBC de .50,5 SNPs / genom / an (23), estimăm că fiecare progenitor al focarului a apărut acum 20-40 de ani. Clada focarului W148 Europa / Rusia și clada focarului din Asia Centrală au fost descrise anterior în teritoriile fostei Uniuni Sovietice (8,10). Clada focarului din Ucraina nu a fost găsită în alte setări și poate fi limitată geografic la Ucraina.

Încarcerarea a fost discutată ca principalul factor de transmisie a tuberculozei MDR / XDR în Ucraina (2830). Cu toate acestea, doar 1 dintre pacienții cu caz de focar din Ucraina au fost închiși anterior. Analiza de urmărire a contactelor indică transmisia gospodăriei / vecinătății și nosocomiale ca moduri de răspândire a tulpinilor de focar MDR / XDR. Faptul că 25 din 53 de tulpini de focar (Anexa 1 Tabelul 1) au fost izolate de noile cazuri de TBC din studiul nostru sugerează rețele de transmisie mai mari în comunitate. Cu toate acestea, din cauza limitărilor examinării urmăririi contactelor, este posibil să fi trecut cu vederea unele contacte legate de închisorile din Ucraina.

Profilurile de rezistență ale tulpinilor de focar indică faptul că regimurile de tratament TB incluzând izoniazidă, rifampicină, pirazinamidă, etambutol, kanamicină, amikacină, capreomicină, levofloxacină, moxifloxacină, etionamidă, protionamidă, acid para-aminosalicilic, linezolid și cicloserină (31) nu sunt suficiente pentru a trata în mod eficient pacienții infectați cu aceste tulpini. Într-adevăr, implementarea diagnosticului rapid Xpert MTB / RIF (Cepheid) în regiunea Odessa nu a dus la îmbunătățirea substanțială a rezultatelor tratamentului MDR TB (32). Regimurile standard de TB MDR care nu reușesc, care includ 2-3 medicamente active și 2-3 medicamente neactive, sunt încă utilizate în loc de tratament personalizat, confirmat de laborator (30). Un motiv pentru aceasta este lipsa accesului universal la medicamente anti-TB noi sau reutilizate, cum ar fi bedaquilina, delamanidul și meropenemul, și finanțarea limitată a îngrijirii paliative a TB care ar trebui folosită atunci când sunt disponibile mai puțin de 4 medicamente active (31).

Studiile efectuate în Africa de Sud și Argentina demonstrează că regimurile de tratament inadecvate sunt factori care determină expansiunea clonală a anumitor tipuri de tulpini și achiziționarea ulterioară a rezistenței la medicamente (13,33), care este valabil și pentru extinderea celor 3 clade de focar detectate de la Beijing în sudul Ucrainei. De fapt, profilurile de mutație observate ale tulpinilor de focar cu mutații identice de rezistență la medicamente de primă linie - mutații individuale care conferă rezistențe de medicament de linia a doua sunt caracteristice unei infecții MDR MTBC dobândite (rezistență primară), urmată de dezvoltarea rezistenței ulterioare sub regimuri de tratament suboptim (rezistență secundară) în timpul unei infecții mai recente sau regim de tratament. Prevalența ridicată a rezistenței la izoniazide la nivel înalt, mediată de katG S315T, precum și spectrul larg de mutații care rezistă la pirazinamidă, adaugă Ucraina pe lista țărilor în care regimul de tuberculoză MDR scurt propus recent nu va avea niciun efect (34,35).

Principala limitare a studiului nostru este că doar 21,81% din toate izolatele MDR înregistrate în perioada de studiu ar putea fi recuperate în cadrul practicii de rutină din cauza resurselor tehnice și umane limitate. Această deficiență ar putea introduce unele incertitudini cu privire la proporțiile reale ale cladelor focare. Mai mult, arătăm că pacienții cu TB MDR / XDR din sudul Ucrainei sunt infectați în principal cu 3 clade distincte de focar MTBC din Beijing. Cu toate acestea, locuitorii din sud-estul Ucrainei erau într-adevăr cu un risc mai mare de tuberculoză primară MDR (36,37). Această constatare ar putea fi legată de circulația tulpinilor de focar de la Beijing pe care le descriem, dar nu putem extrapola rezultatele noastre în întreaga țară, care sa dovedit a avea o distribuție asimetrică a TB MDR (37). În cele din urmă, numărul scăzut de evenimente de transmitere preconizate și confirmate genetic în studiul nostru se datorează probabil perioadei scurte de eșantionare.

În concluzie, demonstrăm că clonele distincte de focar MDR, în combinație cu schemele de eșec, au fost principalii factori motori ai epidemiei de TB MDR / XDR în Ucraina, mai degrabă decât respectarea slabă a tratamentului. Regimurile de tratament individualizate bazate pe profiluri de rezistență confirmate de laborator sunt cheia pentru conținerea TB MDR / XDR în aceste setări. Accesul la medicamente noi, cum ar fi bedaquilina și delamanidul, ar trebui să fie susținut, dar strict controlat, deoarece rezistențele sunt susceptibile să se dezvolte (38).

Dr. Merker este profesor asistent în grupul de micobacteriologie moleculară și experimentală la Centrul de Cercetare Borstel, Borstel, Germania. Cercetările sale se concentrează pe evoluția rezistenței la medicamente, M. tuberculoza genetică a populației și aplicarea tehnicilor de secvențiere de generație următoare pentru teste de rezistență moleculară la medicamente.


Apariția tulpinilor multirezistente (MDR) pentru tuberculoză (TB) are ca rezultat una dintre problemele majore de sănătate publică la nivel mondial. În 2012, rata incidenței TBC în Peru a fost de 95 de cazuri / 100.000 de populație, din care 3,9% au fost cazuri noi de TB-MDR (1), iar din aceste cazuri de TB-MDR, 79% au fost din Lima (2). În prezent, nu există informații genomice despre o tulpină MDR din Peru. Astfel, obținerea acestor informații este un pas cheie în înțelegerea biologiei agentului patogen și îmbunătățirea tratamentului pentru TBC (3). Aici, raportăm caracteristicile genomice ale unei tulpini multirezistente de Mycobacterium tuberculosis, INS-MDR, de la un pacient cu TBC activă din Peru.

Stabilirea acestei linii de tulpini & # x02019s s-a bazat pe 24 de unități variabile repetate micobacteriene repetate unitate-variabilă de loci de repetare în tandem (MIRU-VNTR) (4) și pe polimorfisme monoc nucleotidice (SNP) bazate pe filogenie (5). Secvențierea genomului INS-MDR a fost efectuată folosind un secvențiator Illumina HiSeq 2000 cu o acoperire de 1.331 și # x000d7. Citirile rezultate pereche au fost asamblate cu BWA v 0.5.9-r16 (6), folosind genomul H37Rv (NC000962.3) ca referință. Secvența genomică a fost adnotată cu serverul RAST (7), baza de date Proteinary Genome Annotation Pipeline (PGAAP) și Clusters of Orthologous Groups (COG) (8). O analiză comparativă a fost efectuată între INS-MDR și KZN 1435, o tulpină MDR din Africa de Sud (9), utilizând SNPsFinder (10) pentru a identifica diferențele dintre regiunile de codificare intergenice și clasificările ontologice genetice (COG).

S-a stabilit că INS-MDR aparține liniei LAM. Am obținut 58.157.302 citiri pereche care, după asamblare, au dus la 22 de contiguri cuprinzând aproximativ 99,98% comparativ cu genomul H37Rv. INS-MDR are o lungime de 4.383.671 și # x000a0bp, cu un conținut mediu de GC de 65,6%.

Au fost observate un total de 805 polimorfisme în ceea ce privește H37Rv, dintre care 703 localizate în regiunile de codificare care au fost clasificate în categoriile COG după cum urmează: biosinteza metabolitului secundar, transportul și catabolismul (n = 38) transportul și metabolismul lipidelor (n = 41) replicare, recombinare și reparare (n = 32) producția și conversia energiei (n = 35) transportul și metabolismul aminoacizilor (n = 30) transportul și metabolismul carbohidraților (n = 27) motilitatea celulei (n = 21) biogeneza peretelui / membranei / plicului celular (M) (n = 23) transportul și metabolismul coenzimelor (n = 22) mecanisme de transducție a semnalului (n = 22) transportul de ioni anorganici și metabolismul (n = 22) transcriere (n = 20) traducere, structură ribozomală și biogeneză (n = 16) modificarea posttranslationala si rotirea proteinelor (n = 13) transportul și metabolismul nucleotidelor (n = 11) mecanisme de apărare (n = 5) controlul ciclului celular, diviziunea celulară și partiționarea cromozomilor (n = 9) și procesarea și modificarea ARN-ului (n = 2).

Am identificat o mutație pe rpoB genă (D516V) legată de rezistența la rifampicină (11), mutații pe katG (S315T) și kasA genelor (G269S) legate de rezistența la izoniazidă (12, 13) și o mutație pe pncA genă (Q10R) legată de rezistența la pirazinamidă (14). De asemenea, am găsit mutații pe gyrA (E21Q, S95T, G247S, G668D) și o mutație pe embB genă (Y319S) care nu conferă rezistență (15, & # x0201317).

Comparația tulpinilor KZN 1435 și INS-MDR a demonstrat că, în ciuda diferențelor de origine geografică și a incidenței ridicate a TB în Africa de Sud (1), tulpinile au proporții similare de SNP, arătând grade ridicate de conservare a structurii genomului. Aceste rezultate sugerează că izbucnirea tuberculozei rezistente la medicamente în Lima poate fi o expansiune clonală a aceleiași tulpini, cu toate acestea, sunt necesare mai multe informații genomice.


Priveste filmarea: Bio Mol Bioinformática Parte 1 UFRA (Ianuarie 2022).