Informație

Cum se izolează două plasmide din catena E. Coli?


Am o linie de celule E. coli pe care o folosesc pentru a exprima o proteină folosind un sistem cu două plasmide. Unul conferă AmpR și unul KanR.

Pentru mutageneză aș dori să separ plasmidele pentru a crește eficiența reacției mutagene PCR. Am reușit să vindec celulele plasmidei KanR deoarece este o copie redusă, în timp ce AmpR este o copie mare, așa că am putut crește cu ușurință celulele doar în ampicilină și am ajuns doar cu plasmida AmpR. Cu toate acestea, nu am putut face același lucru pentru a izola plasmida KanR.

Următoarea mea idee a fost să trec plasmidele printr-un gel și să fac o extracție. Din moment ce nu am făcut un rezumat, a fost foarte greu să diferențiez benzile și am ajuns să obțin un randament neglijabil. Cred că plasmidele au fost pur și simplu pătate prin gel datorită structurilor terțiare.

Speranța mea finală este de a efectua un digest pe plasmide folosind o enzimă de restricție care taie fiecare plasmidă o dată. Îngrijorarea mea este că nu voi putea obține stoechiometria corectă din cauza plasmidelor prezente în mod concentrație în concentrații foarte diferite.

Are cineva vreun sfat despre cum altfel aș putea izola plasmidele? Sau poate cineva are experiență efectuând un digest pe plasmide cu concentrații necunoscute? Chiar am nevoie de ajutor pentru a face asta. Proiectul de mutageneză se desfășoară de luni de zile și acesta nu este nici măcar un laborator de biologie moleculară ... așa că pierde timpul de la principalele obiective de cercetare!


O retransformare ar trebui să vă ofere o plasmidă pură. Transformați amestecul de plasmide în E.coli goale (nu folosiți prea mult ADN), plăci pe Kan / Amp în funcție de ce aveți nevoie. Probabilitatea ca o celulă să preia ambele plasmide este extrem de scăzută și puteți verifica cu PCR de colonie doar pentru a fi sigur.

În caz contrar: întrebați în jur, trebuie să existe stocuri (vechi) de plasmide singure în jur sau stocuri de glicerol de E. coli care conțin doar una dintre plasmide.

A treia opțiune: aruncați o privire asupra metodei dvs. de mutageneză. Pentru nevoile dvs., ar putea exista tehnici care să funcționeze pe un amestec de plasmide. Dacă aveți nevoie doar de o variantă sau de o singură bibliotecă de saturație a site-ului, puteți utiliza Quikchange de exemplu. Nu văd un motiv pentru care acest lucru nu ar funcționa pe un amestec de plasmide.


Analiza plasmidică a izolatelor de Escherichia coli din Coreea de Sud coproducând carbapenemaze NDM-5 și OXA-181

Recent, izolatele Escherichia coli care au coprodus metallo-β-lactamaza (NDM) -5 din New Delhi și oxacilinaza (OXA) -181 au fost identificate într-un spital de îngrijire terțiară din Coreea de Sud. Izolatul CC1702-1 a fost colectat din urină în ianuarie 2017 și izolatul CC1706-1 a fost recuperat de la un aspirat transtracheal al unui pacient internat în spital în mai 2017. Genele carbapenemazei au fost identificate prin PCR multiplex și secvențierea, iar secvențierea genomului întreg a fost efectuată ulterior folosind PacBio Sistem RSII. Ambele izolate de E. coli au aparținut aceleiași clone (ST410) și au fost rezistente la toate β-lactamele, inclusiv carbapenemele. Am obținut secvențe de plasmide întregi ale izolatelor: pCC1702-NDM-5 din CC1702-1 și pCC1706-NDM-5 și pCC1706-OXA-181 din CC1706-1. Cele două izolate de E. coli aparțineau aceleiași clone (ST410) și erau complet rezistente la toate β-lactamele, precum și la carbapeneme. Două blaNDM-5-plasmidele de adăpostire au aparținut aceluiași grup de incompatibilitate, IncFIA / B, și au constat din 79.613 bp și 111.890 bp cu 87 și respectiv 130 de secvențe de codificare. Structurile genetice ale celor două blaNDM-5-plasmide purtătoare, care erau distincte de blaNDM-5-plasmidele purtătoare din izolatele Klebsiella pneumoniae transmise anterior din Emiratele Arabe Unite (EAU) în Coreea de Sud, difereau între ele. În timp ce pCC1702-NDM-5 a arătat un grad ridicat de identitate cu plasmida dintr-un izolat multirezistent de Citrobacter fruendii P5571 găsit în China, pCC1706-NDM-5 a fost foarte asemănător cu plasmida dintr-un izolat multirezistent de E. coli AMA1176 găsit în Danemarca. pCC1706-OXA-181, care era o plasmidă IncX3 autotransmisibilă de 51 kb, a fost identică cu plasmidele E. coli pAMA1167-OXA-181 din Danemarca și pOXA-181-WCHEC14828 din China. Plasmidele care adăpostesc blaNDM-5 în izolatele E. coli s-ar putea să nu fie transferate din izolatele K. pneumoniae care co-produc NDM-5 și OXA-181. Probabil au provenit din mai multe surse.

Cuvinte cheie: Carbapenemază New Delhi metallo-β-lactamază (NDM) -5 Oxacilinază (OXA) -181.


Experimente CRISPR-Cas pentru școli și public

„Foarfecele genetice” CRISPR-Cas revoluționează în prezent domeniul biologiei moleculare cu un impact enorm asupra societății datorită potențialului larg de aplicare în biomedicină, biotehnologie și agricultură. Am dezvoltat experimente CRISPR-Cas simple, care pot servi la introducerea elevilor, studenților și non-oamenilor de știință deopotrivă cu puterea fascinantă a editării genei vizate. Cursul experimental este împărțit în două părți. În partea 1, vizăm lacZ purtat de plasmidă pentru a converti E. coli albastru în E. coli alb. În partea 2, analizăm rupturile de catenă dublă mediate de CRISPR-Cas9 în gena lacZ de către a) colonie PCR, b) gel de cracare a coloniei sau c) digestie de restricție a plasmidelor. Munca experimentală este încorporată în scurte părți de prelegere teoretice care oferă fundalul CRISPR-Cas și un tutorial pas cu pas pentru munca practică. Deși experimentul este robust, ieftin și simplu, trebuie remarcat faptul că este necesară îndrumarea unui instructor expert. Pe baza experienței noastre, un curs de laborator de o zi întreagă are o influență pozitivă asupra atitudinii participanților față de cercetare în general. Acest lucru este valabil atât pentru elevii de liceu, cât și pentru oamenii de știință (grupe de vârstă 16-70 de ani).

Cuvinte cheie: CRISPR Cas9 Experiment de clasă E. coli Modul educațional lacZ.

Copyright © 2019 Elsevier Inc. Toate drepturile rezervate.

Declarație privind conflictul de interese

Declarație de interes concurent Autorii declară că nu au interese financiare concurente cunoscute sau relații personale care ar fi putut părea să influențeze munca raportată în această lucrare.


Cifre

Determinarea numărului de copii plasmidice. O tulpină bacteriană care conține plasmidă a fost crescută într-un mediu cu săruri minime plus Casamino Acizi și glucoză. S-au efectuat etichetarea și liza, iar lizatul a fost centrifugat în gradientul de bromură de CsClethidium. Fracțiile cu șapte picături au fost colectate pe tăvi de microtitrare și testate pentru radioactivitate.

FIGURA 1

Determinarea numărului de copii plasmidice. O tulpină bacteriană care conține plasmidă a fost crescută într-un mediu cu săruri minime plus Casamino Acizi și glucoză. S-au efectuat etichetarea și liza, iar lizatul a fost centrifugat în gradientul de bromură de CsClethidium. Fracțiile cu șapte picături au fost colectate pe tăvi de microtitrare și testate pentru radioactivitate.


Acces

  • APA
  • Standard
  • Harvard
  • Vancouver
  • Autor
  • BIBTEX
  • RIS

Rezultatul cercetării: Contribuție la jurnal ›Articol› evaluare inter pares

T1 - Analiza secvenței a două plasmide criptice din Bifidobactenum longum DJO10A și construirea unui vector de clonare a navetei

N2 - Bifidobacterium longum DJO10A este un izolat uman recent cu caracteristici probiotice și conține două plasmide, denumite pDOJH10L și pDOJH10S. Secvențele complete ale ambelor plasmide au fost acum determinate și constau din două molecule ADN circulare de 10.073 și 3.661 bp, cu conținut de G + C de 62,2% și respectiv 66,2%. Plasmida pDOJH10L este o plasmidă cointegrată formată din regiuni ADN care prezintă o identitate de secvență foarte mare la alte două plasmide B. longum, pNAC2 (98%) și pKJ50 (96%), împreună cu o altă regiune. Interesant este că regiunile de replicare circulară (RCR) ale plasmidelor de tip pNAC2 și pKJ50 au fost întrerupte în timpul evenimentului de recombinare, ducând la un eveniment de recombinare suplimentar pentru a dobândi un replicon funcțional. Aceasta constă dintr-o nouă genă de repoziție fuzionată și un tip RCR pe care constă dintr-o cutie conservată DnaA într-o regiune bogată în AT urmată de patru secvențe repetate contigue, consistente cu o structură iteronică și o repetare inversată. Cel mai mic pDOJHIOS nu a avut nicio similaritate de secvență cu oricare altă plasmidă caracterizată din bifidobacterii. În plus, nu conținea nicio caracteristică compatibilă cu RCR, care este mecanismul de replicare propus pentru toate plasmidele bifidobacterii caracterizate până în prezent. A prezentat similaritatea secvenței cu mai multe proteine ​​de replicare legate de replicarea teta de la alte bacterii gram-pozitive, cu conținut ridicat de G + C, cu cea mai apropiată potrivire de la o plasmidă rodocră Rhodococcus, sugerând un mecanism teta de replicare. Analiza S1 nuclează a ambelor plasmide în B. longum DJO10A a relevat intermediari ADN monocatenar pentru pDOJH10L, care este consecvent pentru RCR, dar niciunul nu a fost detectat pentru pDOJH10S. Deoarece conținutul de G + C al pDOJH10S este similar cu cel al Rhodococcus rhodochrous (67%) și semnificativ mai mare decât cel al B. longum (60,1%), este posibil să fi fost dobândit prin transferul orizontal de gene de la o specie de Rhodococcus, deoarece ambele genuri sunt membri ai Actinomicetelor și sunt locuitori intestinali. Un Escherichia coli-B. vectorul de clonare a navetei longum a fost construit din pDOJH10S și regiunea E. coll ori a p15A, o genă lacZ cu un situs de clonare multiplă a pUC18 și o genă de rezistență la cloramfenicol (CAT) a pCI372 și a fost transformată cu succes în E. coli și B. longum. Nu a putut fi introdus în bacteriile lactice (Lactococcus și Lactobacillus), arătând că nu era foarte promiscuu. A fost menținut în mod stabil în B. longum în absența presiunii antibiotice timp de 92 de generații, ceea ce este în concordanță cu stabilitatea segregativă a plasmidelor care replică teta în bacteriile gram-pozitive. Acesta este primul vector de clonare pentru bifidobacterii care nu utilizează RCR și ar trebui să fie util pentru introducerea stabilă a genelor heteroloage în acești locuitori dominanți ai intestinului gros.

AB - Bifidobacterium longum DJO10A este un izolat uman recent cu caracteristici probiotice și conține două plasmide, denumite pDOJH10L și pDOJH10S. Secvențele complete ale ambelor plasmide au fost acum determinate și constau din două molecule ADN circulare de 10.073 și 3.661 bp, cu conținut de G + C de 62,2% și respectiv 66,2%. Plasmida pDOJH10L este o plasmidă cointegrată formată din regiuni ADN care prezintă o identitate de secvență foarte mare la alte două plasmide B. longum, pNAC2 (98%) și pKJ50 (96%), împreună cu o altă regiune. Interesant este că regiunile de replicare circulară (RCR) atât ale plasmidelor pNAC2, cât și ale pKJ50 au fost întrerupte în timpul evenimentului de recombinare, ducând la un eveniment de recombinare suplimentar pentru a dobândi un replicon funcțional. Aceasta constă dintr-o nouă genă de repoziție fuzionată și un tip RCR pe care constă dintr-o cutie conservată DnaA într-o regiune bogată în AT urmată de patru secvențe repetate contigue, consistente cu o structură iteronică și o repetare inversată. Cel mai mic pDOJHIOS nu a avut nicio similaritate de secvență cu oricare altă plasmidă caracterizată din bifidobacterii. În plus, nu conținea nicio caracteristică compatibilă cu RCR, care este mecanismul de replicare propus pentru toate plasmidele bifidobacterii caracterizate până în prezent. A prezentat similaritatea secvenței cu mai multe proteine ​​de replicare legate de replicarea teta de la alte bacterii gram-pozitive, cu conținut ridicat de G + C, cu cea mai apropiată potrivire de la o plasmidă rodocră Rhodococcus, sugerând un mecanism teta de replicare. Analiza S1 nuclează a ambelor plasmide în B. longum DJO10A a relevat intermediari ADN monocatenar pentru pDOJH10L, care este consecvent pentru RCR, dar niciunul nu a fost detectat pentru pDOJH10S. Deoarece conținutul de G + C al pDOJH10S este similar cu cel al Rhodococcus rodochrous (67%) și semnificativ mai mare decât cel al B. longum (60,1%), este posibil să fi fost dobândit prin transferul de gene orizontal de la o specie Rhodococcus, deoarece ambele genuri sunt membri ai Actinomicetelor și sunt locuitori intestinali. Un Escherichia coli-B. vectorul de clonare a navetei longum a fost construit din pDOJH10S și regiunea E. coll ori a p15A, o genă lacZ cu un situs de clonare multiplă a pUC18 și o genă de rezistență la cloramfenicol (CAT) a pCI372 și a fost transformată cu succes în E. coli și B. longum. Nu a putut fi introdus în bacteriile lactice (Lactococcus și Lactobacillus), arătând că nu era foarte promiscuu. A fost menținut în mod stabil în B. longum în absența presiunii antibiotice timp de 92 de generații, ceea ce este în concordanță cu stabilitatea segregativă a plasmidelor care replică teta în bacteriile gram-pozitive. Acesta este primul vector de clonare pentru bifidobacterii care nu utilizează RCR și ar trebui să fie util pentru introducerea stabilă a genelor heteroloage în acești locuitori dominanți ai intestinului gros.


Biologia comparativă a două variante naturale ale plasmidelor familiei IncQ-2, pRAS3.1 și pRAS3.2

FIG. 1. Compararea hărților genetice ale plasmidelor pRAS3 cu pTF-FC2 și pTC-F14. Procentele sub genele coloanei vertebrale ale plasmidei pTF-FC2 și pTC-F14 indică identitatea procentuală a secvenței de aminoacizi a produsului genetic cu cea a plasmidelor pRAS3. Procente sub oriT și oriV regiunile indică identitatea secvenței de nucleotide. Plasmidele pRAS3.1 și pRAS3.2 au un număr diferit de repetări 6-bp și iteroni 22-bp, în timp ce secvența nucleotidică a fiecărei repetări sau iteron este identică, așa cum se indică mai jos pRAS3. FIG. 2. Secvența intergenică dintre oriT și mobB din pRAS3.1, care arată poziția repetărilor de 6 bp. The oriT este subliniat și repetarea imperfectă inversată în oriT este indicat de săgeți inversate rupte. Situl hexameric conservat al nickului este indicat cu caractere aldine cu o săgeată verticală care indică poziția presupusă a nickului. Repetările CCCCCG de 6 bp sunt marcate de la 1 la 5. Prima repetare constă doar din 5 bp, deoarece nu are o bază de citozină. Un promotor presupus cu o regiune aproape consensuală -35 și o regiune slabă -10 este prezentat cu caractere italice aldine și este separat de un distanțier de 17 bp. FIG. 3. Alinierea oriT regiunile plasmidelor IncQ-2 și ale plasmidei IncPα RP4, arătând divergența secvenței care ar putea fi tolerată de proteinele Mob ale plasmidei pRAS3 în timp ce acestea erau încă capabile să mobilizeze ADN-ul dintr-un oriT. O săgeată verticală indică relaxarea frumos situs la care are loc scindarea monocatenară determinată pentru plasmida RK2 / RP4 (29). FIG. 4. Filogenii ale proteinelor toxice-antitoxine ale pRAS3 și comparație cu proteinele strâns înrudite, precum și cu proteinele PemIK și MazEF mai înrudite. (A) Antitoxinele au fost după cum urmează: Aromatoleum aromatium, CAI08016 Bartonella tribocorum, CAK00897 Dinoroseobacter shibae, YP_001541878 Nitrosomonas europaea ATCC 19718, 858518 CAD Xanthomonas axonopolis pv. tulpina citri 306, NP_644761 Xanthomonas campestris pv. vezicatoria tulpina 85-10, CAJ19793 Xylella fastidiosa Ann-1, ZP_00682677 E coli MG1165 MazE, AAA69293 plasmida R100 PemI, P13975. (B) Toxinele au fost după cum urmează: Aromatoleum aromatium, CAI08015 Bartonella tribocorum, CAK00896 Ferooxidani cu clorobiu, EAT59633 Nitrosomonas europaea ATCC 19718, CAD85217 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, AAZ37969 Xanthomonas axonopolis pv. citri tulpina 306, NP_644760 Xanthomonas campestris pv. vezicatoria tulpina 85-10, CAJ19792 E coli MG1165 MazF, AAA69292 plasmida R100 PemK, P13976. FIG. 5. Pierderea plasmidei test cu număr mic de copii, pOU82, cu și fără genele TA similare PemIK de la pRAS3 în absența selecției plasmidei.

Animația 34: Genele pot fi mutate între specii.

Stanley Cohen și Herbert Boyer transformă bacteriile cu o plasmidă recombinantă, iar Doug Hanahan studiază transformarea indusă.

Bună ziua, sunt Stanley Cohen ... Bună ziua, sunt Stanley Cohen ... și eu sunt Herbert Boyer. În 1972, am fost la o conferință de biologie în Hawaii. La acea vreme, studiam rezistența bacteriană la antibiotice, iar Herbert studia enzimele de restricție. Ne-am dat seama că putem lucra împreună pentru a recombina gene de la diferite bacterii într-o singură moleculă de ADN. Am folosit gene de la două tulpini rezistente la medicamente de bacterii E. coli - o genă oferă rezistență la antibioticul tetraciclină, iar cealaltă oferă rezistență la kanamicină. Fiecare genă este transportată pe o plasmidă în E. coli. Plasmidele sunt inele mici de ADN care există independent de cromozomul bacterian principal. Ele pot fi reproduse și transmise descendenților. Am numit aceste plasmide p pentru plasmidă și SC pentru Stanley Cohen. Plasmida pSC101 poartă o genă pentru rezistența la tetraciclină, iar pSC102 poartă o genă pentru rezistența la kanamicină. Am crescut tulpinile bacteriene care transportau aceste plasmide și apoi am izolat ADN-ul plasmidic. Am adăugat enzima de restricție EcoRI la ADN-ul plasmidic. EcoRI taie fiecare catena de ADN in afara centrului site-ului de recunoastere, producand secvente scurte, monocatenare numite capete "lipicioase". Am amestecat plasmidele tăiate și am adăugat ADN ligază. Fragmentele cu capete EcoRI sunt complementare. Acest lucru permite fragmentelor să se recombine cu oricare altul. Legăturile de hidrogen aliniază două capete lipicioase, până când ligaza repară legăturile zahăr-fosfat pentru a crea o moleculă recombinantă stabilă. Obiectivul nostru a fost de a combina gena kan r și gena tet r pe o plasmidă. Cu toate acestea, alte tipuri de molecule au fost legate între ele din părți. Înainte de a putea izola plasmida recombinantă pe care o doream, aveam nevoie de o modalitate de a ne introduce plasmidele ligate în E. coli. Experimentele clasice ale lui Oswald Avery și grupul său au arătat că bacteriile Pneumococcus sunt „transformate” în virulență atunci când preiau ADN-ul din tulpinile virulente. Cu toate acestea, transformarea naturală este un eveniment rar, așa că am folosit o metodă chimică dezvoltată în 1970 de Mandel și Higa la Universitatea din Hawaii. Aceasta a implicat amestecarea bacteriilor și ADN-ului într-o suspensie de clorură de calciu rece la temperatura de îngheț. Apoi, am ridicat și am scăzut rapid temperatura pentru a crea un „șoc termic”. Această tehnică induce bacteriile să ia ADN-ul plasmidic. Răspândim bacteriile transformate pe o placă de cultură care conține tetracilină și kanamicină. Doar bacteriile transformate care conțin ambele tipuri de gene de rezistență ar putea crește în prezența ambelor antibiotice. Acest rezultat a fost în concordanță cu transformarea bacteriilor cu o plasmidă recombinată care conține atât gena tet r, cât și gena kan r. Cu toate acestea, a fost, de asemenea, posibil ca unele bacterii să fi fost dublu transformate de versiunile religioase ale plasmidelor originale. Analiza restricțiilor a arătat că unele dintre colonii au fost într-adevăr transformate de o plasmidă recombinantă. Am putut spune care a fost când am tăiat plasmidele și le-am scos pe un gel de agaroză. (Rotiți fiecare bandă pentru a vedea diferența.) Am făcut prima plasmidă recombinantă. Câteva luni mai târziu, am arătat că aceleași metode ar putea fi utilizate pentru recombinarea genelor din organismele eucariote și procariote. Am inserat o genă broască într-o plasmidă E. coli. Bacteriile rezultate au produs ARN broască. Bună, sunt Doug Hanahan. Ca student absolvent la Harvard, am făcut primul studiu amănunțit despre transformarea indusă a E. coli. Iată ideile mele despre ce se întâmplă atunci când celulele bacteriene sunt transformate folosind metoda Mandel și Higa. În timpul creșterii rapide, membrana celulară a E. coli are sute de pori, numite zone de adeziune. Membrana celulară în sine este alcătuită din molecule lipidice care au fosfați încărcați negativ. Chiar dacă zonele de aderență sunt fizic suficient de mari pentru a admite ADN-ul plasmidic, fosfații încărcați negativ de pe helixul ADN sunt respinși de cei de pe lipide. Teoretic, ionii de Ca 2+ din clorura de calciu adăugată se pot complexa cu sarcinile negative, creând o situație neutră din punct de vedere electrostatic. De asemenea, scăderea temperaturii congelează membrana lipidică - stabilizând fosfații încărcați negativ și făcându-i mai ușor de protejat. Șocul termic creează un dezechilibru de temperatură de ambele părți ale membranei bacteriene, care poate crea un curent. Cu „scutul ionic” în poziție, ADN-ul este apoi măturat prin zona de aderență. Tehnici precum transformarea și ADN-ul recombinant au creat domeniul biotehnologiei. Acum este posibil să proiectăm bacteriile pentru a produce proteine ​​umane importante, cum ar fi insulina. Cu toate acestea, pentru ca bacteriile să producă insulină sau orice altă proteină eucariotă, trebuie luați în considerare o serie de factori. După cum ați aflat în Conceptul 24, genele animalelor eucariote au introni - secțiuni ale ADN necodificat. Bacteriile nu au introni în gene și, prin urmare, nu au mașini biochimice pentru a elimina intronii. Există, de asemenea, o altă considerație. Unele proteine ​​eucariote sunt procesate după traducere. De exemplu, insulina este mai întâi tradusă ca preproinsulină, care are o lungime de 108 aminoacizi. Primii 24 de aminoacizi sunt secvența semnal care duce preproinsulina în afara celulei. Pe măsură ce proteina părăsește celula, secvența semnal este scindată, lăsând proinsulina, care este stocată în pancreas pentru procesare ulterioară. Proinsulina se pliază într-o structură în buclă și punțile disulfură sunt realizate între grupările amino cisteină care se întind pe proteină. O întindere de 33 de aminoacizi este clivată, lăsând proteina insulină matură. Bacteriile nu pot procesa preproinsulina în insulină. Deci, pentru ca bacteriile să producă insulină utilizabilă, au fost folosite câteva trucuri. În primul rând, în loc să copieze ARNm de insulină, ADN-ul a fost realizat pe baza secvenței proteice a celor două lanțuri de insulină - A și B. Apoi, ADN polimeraza a fost utilizată pentru a face a doua catenă. Acestea sunt fragmentele de ADN dublu catenar care sunt inserate în plasmide. Fiecare fragment de ADN este inserat în gena -galactozidază pe o plasmidă. Plasmidele au, de asemenea, gena de rezistență la tetraciclină. Plasmidele sunt apoi transformate în bacterii. Se adaugă tetraciclină pentru a distruge orice bacterie netransformată. Bacteriile transformate sunt cultivate, apoi se recoltează și purifică proteina de fuziune -galactozidază și insulină. Partea -galactozidază a proteinei este clivată și aruncată. În cele din urmă, cele două lanțuri proteice sunt amestecate împreună. În condițiile potrivite, legăturile disulfidice se formează și insulina umană utilizabilă a fost fabricată din bacterii.

bacterii e coli, ADN ligază, rezistență bacteriană la antibiotice, ADN plasmidic, oswald avery, moleculă ADN, Herbert Boyer, antibiotic tetraciclină, enzime de restricție, legături de hidrogen, cromozom bacterian, catenă ADN, bacterii pneumococice, tulpini bacteriene, stanley cohen, enzimă de restricție

Continut Asemanator

17054. Experimente de laborator virtual în biotehnologie: transformare bacteriană

15028. Interes pentru plasmide, Herbert Boyer

Herb Boyer vorbește despre interesul lui Stanley Cohen pentru plasmide ca vectori pentru ADN.

15916. Transformarea ADN-ului

Stanley Cohen și Herbert Boyer au introdus molecula de ADN recombinant pe care au creat-o în bacteriile E. coli prin intermediul unei plasmide, inducând astfel absorbția și exprimarea unei secvențe de ADN străine cunoscute sub numele de „transformare”.

15476. Mecanism de recombinare, animație 3D cu narațiune de bază

Inginerie genetică: inserarea de ADN nou într-un vector plasmidic.

15626. Paul Berg și Stanley Cohen

Herbert Boyer: Fostul șef de linie universitar a devenit bigwig biotehnologic. Expert în tăierea ADN-ului înainte ca majoritatea oamenilor să știe că se poate face. Stanley Cohen: Un jucător născut a descoperit trucul utilizării buclelor de ADN numite plasmide pentru a transforma ADN-ul bacterian

16721. Biografie 34: Herb W. Boyer (1936 -)

Herb Boyer și Stan Cohen au „inventat” tehnologia ADN-ului recombinant.

16720. Biografie 34: Stan Norman Cohen (1935 -)

Stan Cohen și Herb Boyer au „inventat” tehnologia ADN-ului recombinant.

15030. Implicațiile muncii ADN recombinant, Herbert Boyer

Herb Boyer reflectă asupra importanței muncii lor asupra tehnologiei ADNr și a impactului acesteia asupra înțelegerii geneticii organismelor superioare.

16613. Animația 28: Unele tipuri de mutații sunt reparate automat.

Stan Rupert explică daunele UV și sistemele de reparare a ADN-ului activate de lumină și activitatea lui Richard Setlow privind repararea dimerilor timinici.

15917. Tăierea și lipirea ADN-ului

Descoperirea enzimelor care ar putea tăia și lipi ADN-ul a făcut posibilă ingineria genetică.


TS și ET au conceput studiul. AL, OS și TS au colectat datele. AL și TS au analizat și interpretat datele și au scris prima versiune a manuscrisului. CB a ajutat la adnotarea plasmidelor. SH și MF au efectuat secvențierea. ET a furnizat revizuiri critice amănunțite. Toți autorii au contribuit la articol și au aprobat versiunea trimisă.

Acest proiect a fost sprijinit de Institutul Național de Alimentație și Agricultură, Departamentul Agriculturii SUA, în temeiul acordului nr. 2013-67019-21375, programul REU & # x201CMolecular and Organismal Evolution & # x201D al National Science Foundation (grant de cercetare # 1460696), Premiul pentru dezvoltare instituțională (IDeA) de la Institutul Național de Științe Medicale Generale al Institutelor Naționale de Sănătate sub finanțare # P20GM103408 și printr-o subvenție de cercetare de licență de la Biroul de cercetare de licență de la Universitatea din Idaho. Secvențierea genomului a fost efectuată de IBEST Genomic Resources Core și a fost posibilă datorită NIH NIGMS (Premiul nr. P30 GM103324). AL a fost susținută parțial de Colegiul de Științe Grant de Cercetare de la Universitatea din Idaho.


Concluzii

Am dezvoltat o nouă metodă de clonare care oferă o abordare alternativă la asamblarea ADN-ului. Această metodă este independentă de site-urile de restricție și DpnTratamentul I și nu introduce secvențe operaționale nedorite la joncțiunile modulelor funcționale. Această nouă metodă simplifică procedurile complexe de clonare în care întinderi lungi de ADN pot fi inserate în plasmide circulare într-un mod nerestricționat, iar eficiența nu scade pentru inserțiile lungi de până la 20 kb. Simplitatea designului grundului și a procedurii în sine face ca metoda să fie potrivită pentru studii cu randament ridicat. Proteina de interes este exprimată fără adăugarea de reziduuri suplimentare provenite din procedura de clonare, ceea ce o face o metodă alternativă atractivă pentru genomica structurală.


Vectori de activare a transcrierii (SAM)

CRISPR / Cas9 Mediator de activare sinergică (SAM) este un complex proteic proiectat pentru a permite activarea transcripțională robustă a genelor endogene - fie o singură genă la un moment dat, fie până la 10 gene simultan în aceeași celulă. SAM profită de specificitatea și ușurința reprogramării nucleazelor Cas9, care sunt direcționate către un locus specific din genomul endogen de către ARN-ul ghid. Prin intermediul unei licențe cu Broad Institute *, GenScript oferă secvențe validate de SAM gRNA pentru a viza orice regiune de codificare din genomul uman, precum și proiectarea gratuită a SAM gRNA pentru orice altă specie. Secvențele de ARN ghid SAM sunt sintetizate la comandă și clonate în vectori lentivirali eficienți și sunt însoțite de componentele Cas9-VP64 și MS2-P65-HSF1 care formează complexul SAM din trei părți.


Priveste filmarea: How to isolate Plasmid DNA (Noiembrie 2021).