Informație

Există vreo problemă cu utilizarea unui singur codon stop cu un singur CDS în procariote?


Toate secvențele de codificare a proteinelor din registrul iGEM ar trebui să se încheie cu un codon cu oprire dublă. Probabil, aceasta este pentru a reduce potențialul de citire, ceea ce ar putea fi problematic dacă se pune împreună un design policistronic.

Cu toate acestea, dacă proiectarea are un singur CDS și se adresează unui procariot (care are mecanisme de eliberare a ribozomilor "de rezervă"), atunci există vreo problemă cu utilizarea unui singur codon stop?


Impactul oricărei citiri dintr-un codon de oprire cu scurgeri într-o unitate de expresie cu un singur CDS ar depinde probabil de câteva lucruri, în principal (i) unde este următorul codon de oprire în cadru, (ii) ce încercați să expres și (iii) cât de scurgeri este codonul stop?

În cazurile în care următorul codon de oprire în cadru este la doar câteva perechi de baze distanță, probabil că ar fi un impact redus, cu toate acestea, în alte cazuri, următorul codon de oprire ar putea fi departe. În aceste cazuri, există două lucruri care pot provoca un impact.

Primul este că o secvență lungă de peptide ar putea fi adăugată la proteina dvs., care, în funcție de ceea ce exprimați, poate determina proteina să se plieze greșit sau să își piardă funcționalitatea.

Al doilea este că ați putea obține blocarea ribozomilor, mai ales dacă oricare dintre codonii dintre codonul de oprire și un al doilea codon de oprire necesită tRNA rare. După cum ați menționat în întrebarea dvs., există mecanisme de salvare în aceste scenarii, cu toate acestea, dacă CDS-ul dvs. este exprimat sub un promotor puternic pe o plasmidă cu număr mare de copii, este posibil ca acest mecanism să fie montat mult mai des decât de obicei și să provoace o sarcină asupra celulă. Trebuie să menționez că aceasta este o speculație din partea mea, deoarece nu găsesc studii care să demonstreze acest lucru.

Impactul real pe care oricare dintre aceste scenarii îl poate avea asupra sistemului dvs. ar depinde probabil de cât de scurgeri este de fapt codonul de oprire. Deoarece există multe exemple de construcții care utilizează doar un TAA unic în proiectarea lor fără efecte negative aparente, probabil în circumstanțe „normale” există un risc redus de a utiliza un singur codon stop.


Dacă există un singur CDS, probabil va exista o terminare transcripțională imediat după CDS (după codonul de oprire de fapt), ceea ce face ca orice read-through provenind din utilizarea unui singur codon de oprire să fie aproape neglijabil.


Poate că aș putea adăuga pentru sistemele eucariote care termină toți codonii stop cu o singură proteină, eRF1, acest studiu realizat de Schmied și colab., A arătat că readutarea tuturor codonilor stop este mai mică de 0,2% de eRF1 de tip sălbatic, ceea ce pare acceptabil de scăzut! Nu sunt sigur cum acest lucru s-ar transfera către sistemele procariote care divergă în utilizarea sa a doi factori de eliberare - RF1 și RF2. Aș crede că încetarea de către UAA, care este împărtășită de ambii factori, ar fi destul de strictă.


Predicția și clasificarea efectelor mutațiilor de inserție și ștergere asupra regiunilor de codificare a proteinelor

Mutațiile genelor pot afecta proteinele codificate în mai multe moduri, iar unele dintre aceste efecte sunt contraintuitive. În ceea ce privește orice alte cunoștințe, elevii trebuie să își creeze propria înțelegere profundă a Dogmei Centrale. Este posibil ca elevii să nu dezvolte această înțelegere deoarece au oportunități limitate de a practica manipularea secvențelor ADN și clasificarea efectelor lor. O astfel de practică poate îmbunătăți aprecierea elevilor pentru nenumăratele efecte posibile ale modificării ADN (mutație) asupra secvenței de aminoacizi. În această lecție, o serie de exerciții schelate oferă această oportunitate. Elevii identifică mai întâi secvențe genetice dintr-o bază de date online, își creează propriile mutații de inserție / ștergere și prezic efectele. Elevii folosesc apoi un instrument bazat pe web pentru a traduce și observa efectul mutației asupra secvenței proteinelor. Compararea ulterioară a efectelor prezise și observate utilizează testul chi-pătrat. Discutarea rezultatelor cu colegii implică clasificarea tipurilor de efecte posibile. Lecția se încheie cu un exercițiu care solicită elevilor să creeze o mutație cu un efect intenționat asupra proteinei. Împreună, exercițiile integrează raționamentul cantitativ și analiza statistică, alfabetizarea informațiilor și nivelurile multiple de învățare ale lui Bloom. Progresul elevilor este monitorizat utilizând trei evaluări formative și trei evaluări sumative.


Abrevieri

Factor de inițiere a traducerii eucariote

Factor de inițiere a traducerii procariote

Factor de alungire a traducerii eucariote

Factorul de alungire a traducerii procariote

Factor de terminare a traducerii eucariote (factor de eliberare)

Factor de eliberare a traducerii procariote

Factorul de reciclare a ribozomilor

Proteina subunității ribozomale mici procariote

Proteina subunității ribozomale mari eucariote

Proteina subunității ribozomale mici procariote

Proteina subunității ribozomale mari procariote

Centrul peptidil transferazei

Complex ribozom-lanț născut-mARN

Mutația ambiguității ribozomale

Dezintegrarea ARNm mediată prin prostii


Secvențierea genomului mitocondrial complet al Eimeria mitis tulpina USDA 50 (Apicomplexa: Eimeriidae) sugerează poziții inițiale conservate pentru regiunile care codifică mtCOI și mtCOIII

Patru secvențe mitocondriale complete (mt) dintr-o linie derivată dintr-un singur oocist Eimeria mitis S-au obținut USDA 50 (trei din produse PCR cu genom întreg clonate, unul din produs PCR cu genom întreg secvențiat direct). Genomul mt are o lungime de 6.408 pb cu trei gene (CytB, citocrom c subunitatea oxidază I (COI) și citocromul c subunitatea oxidază III (COIII)) și multe fragmente de rADN (subunitatea mare rADN 13, subunitatea mică rADN 10) organizarea a fost identică cu alte Eimeria sp. mt genomi. Pozițiile conservate ale codonului de start pentru COI și COIII sunt sugerate pentru toți Eimeria genomii mt, aceste poziții inițiale ale codonilor există și pot fi, de asemenea, conservate, în paraziții apicomplexani înrudiți. În cadrul celor trei produse PCR clonate separate ale genomilor mt aproape complet, au existat 26 de diferențe de nucleotide (colectiv) comparativ cu genomul mt secvențiat direct. Aceste modificări par a fi încorporări greșite de bază în timpul PCR. Secvențierea directă a produselor lungi de amplificare PCR poate fi mai probabil să genereze secvențe genomice mt precise decât clonarea și secvențierea ulterioară.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Exemplul 4

Productivitatea clonelor este analizată în experimente în lot și în loturi folosind diferite formate. Screeningul inițial al clonei se efectuează în teste discontinue cu 24 de godeuri prin însămânțarea celulelor pentru a scutura plăcile cu 24 de godeuri. Concentrațiile de anticorpi din supernatantul culturii celulare sunt determinate de proteina-A HPLC 10d după începerea culturii. Clonele cu cea mai mare producție sunt, de asemenea, analizate în modele de baloane de agitare în mod discontinuu și alimentat în lot. Culturile în loturi sunt însămânțate într-un balon de agitare 500 cu un volum de lucru de 100 ml și sunt cultivate într-un dulap de agitare (neumidificat) la 150 rpm și 10% CO2. Viabilitatea celulelor ar trebui să fie & gt90% la începerea testului. Densitatea celulelor de însămânțare este de 2 × 105 c / ml. Concentrația produsului / numărul celulei / determinarea viabilității a avut loc în zilele 3-7, 10 și 13. Experimentele pe loturi alimentate se fac folosind aceleași condiții, dar cu o densitate celulară inițială de 4 × 105 c / ml și cu adăugarea regulată de furaje. Stabilitatea clonală este evaluată prin cultivarea celulelor pe o perioadă de 14 săptămâni, cu măsurători de productivitate utilizând modelul de lot de balon de agitare la fiecare două săptămâni.


Rezultate si discutii

Rezumatul MAG organic și filogenia

Un MAG (Ga0307966_1000010) reprezentând un genom circular complet cu o lungime de 158.228 pb a fost identificat în noile date despre metagenom din Organic Lake. MAG a codificat 194 gene bacteriene, dintre care 156 s-au dedus ca fiind CDS (tabelul suplimentar 2) cu 145 funcții biologice presupuse atribuite (tabelul suplimentar 3). Cele mai multe (76 de proteine) au fost atribuite traducerii (inclusiv modificări ale ARNt) (Tabelul suplimentar 3). Alte categorii au fost sinteza acizilor grași (inclusiv oxidarea piruvatului) (18 proteine) biogeneza peretelui celular, inclusiv lipopolizaharidele (17), asamblarea clusterului de fier și sulf # (Fe-S) (8), plierea și stabilitatea proteinelor (8), replicarea și repararea ( 6) și transcrierea (6). Un total de 16 CDS nu a putut fi atribuit niciunei funcții, iar unele dintre acestea sau toate acestea ar putea fi pseudogene. MAG a avut câte o copie a fiecărei gene ARNr 23S, 16S și 5S și 34 gene ARNr identificabile (Tabelul 2 suplimentar). Potențialul genomic foarte limitat ilustrează că această bacterie nu ar fi capabilă de creștere autonomă și o numim Candidatus Organicella extenuata gen. et. sp. noiembrie numele genului derivă din localitatea de unde a fost recuperată inițial secvența MAG (Organic Lake, Antarctica) cu adăugarea sufixului latin diminutiv -ella specia & # x201Cextenuata & # x201D înseamnă redusă sau diminuată în latină și se referă la genom foarte redus.

MAG-uri suplimentare pentru Ca. Organicella a fost generată dintr-un număr de metagenomi din Antarctica (vezi secțiunea Ca. Distribuția de mediu Organicella și gazda de mai jos), permițând analiza 23 Ca. Gene ARNr Organicella 16S (Tabelul suplimentar 4). S-a constatat analiza filogenetică a acestor gene Ca. Organicella să fie cea mai strâns legată de Ca. Pinguicoccus (Serra și colab., 2020), cu 85% identitate genică ARNr 16S (vezi secțiunea Compararea Ca. Organicella și Ca. Genomii Pinguicoccus de mai jos). Ambii Ca. Organicella și Ca. Pinguicoccus aparține unui grup de Verrucomicrobia necultură care include, de asemenea Ca. Nucleococul și endosimbionții înrudiți ai anumitor protiști amitocondriați (Trichonympha, Caduceia, și Oxymonas) prezente în colțurile termite (Yang și colab., 2005 Hongoh și colab., 2007 Ikeda-Ohtsubo și colab., 2010 Sato și colab., 2014 Figura 1). Acest cluster, denumit anterior & # x201Ctermite cluster & # x201D (Sato și colab., 2014), nu este strâns legat de alți endosimbioni verrucomicrobieni cunoscuți (Vandekerckhove și colab., 2002) sau ectosimbioni (Petroni și colab., 2000). Având în vedere clusterul care include acum Ca. Organicella și Ca. Pinguicoccus și nu mai conține specii exclusive pentru intestinul termitelor, sugerăm ca clusterul să fie denumit & # x201CNucleococcus cluster. & # X201D. eucariote unicelulare.

Figura 1. Filogenia de Candidatus Organicella extenuata. Filogenia Verrucomicrobiei și a bacteriilor înrudite pe baza secvențelor de ARNr 16S, arătând Ca. Organicella extenuata cuibărită în noul grup propus & # x201CNucleococcus & # x201D, altul decât Ca. Organicella extenuata, acest grup cuprinde endosimbionul citoplasmatic Ca. Pinguicoccus supinus dintr-un ciliat de apă dulce și endosimbionți intranucleari de protiști amitocondriali rezidenți în intestinul termitelor. Arborele de maximă probabilitate a fost construit cu 59 de secvențe, iar pozițiile cu acoperire a site-ului mai mică de 80% au fost eliminate, rezultând 1.415 poziții în setul de date final. Valorile bootstrap & # x003E 70 sunt afișate lângă noduri individuale. Fusobacterium varium este grupul excesiv. Aderările sunt date ca accesări NCBI Nucleotide sau ID-uri IMG Gene: pentru Ca. Organicella extenuata, secvențele au fost incluse pentru Lacul Organic original MAG (contig Ga0307966_1000010, bazele 107297..108828), Lacul fără nume 18 (contig Ga0400283_000007, bazele 52431..53966) și & # x201CPortals & # x201D Lake (contig Ga0400669_00 ..1071 și contig Ga0400669_039189, bazele 1314..1821). Secvențe identice cu secvența de ARNr 16S din MAG-ul Organic Lake original au fost reprezentate în datele metagenomului de la alți 19 metagenomi din Lake Organic și, de asemenea, în Lake 13 fără nume (Tabelul suplimentar 4). Rețineți că accesiunile din nouă cifre sunt ID-uri gene IMG, iar toate celelalte sunt accesări ale nucleotidelor NCBI.

The Ca. Organicella + Ca. Ramura Pinguicoccus din grupul & # x201CNucleococcus & # x201D al arborelui genei 16S rRNA a fost mult mai lungă decât alte ramuri (Figura 1) și o topologie similară a apărut în copacii construiți folosind gene marker conservate (Figura 2 suplimentară). Astfel de ramuri lungi nu erau evidente pentru alte secvențe, inclusiv endosimbionții Ca. Nucleococ și Ca. Xiphinematobacter (Figura 1), ambele având genomi mult mai mari (& # x223C 1 Mbp) decât Ca. Organicella și Ca. Pinguicoccus (Tabelul suplimentar 1). Ramurile lungi reflectă probabil o evoluție rapidă a secvenței și sunt caracteristice genomului degenerat (McCutcheon și Moran, 2012), în concordanță cu Ca. Organicella și Ca. Pinguicoccus fiind singurii reprezentanți cunoscuți ai Verrucomicrobiei cu genomi extrem de reduși.

Caracteristici Endosymbiont

The Ca. Organicella MAG prezintă o serie de caracteristici tipice simbolurilor obligatorii care au genomi foarte reduși (McCutcheon și Moran, 2010, 2012). MAG are o densitate mare de codificare (95% pentru toate genele și 90% numai pentru CDS), cu regiuni intergenice scurtate și 23 de gene suprapuse (Tabelul suplimentar 1), care este caracteristic reducerii extreme a genomului (Nakabachi și colab., 2006 Moya și colab., 2008). MAG are cod genetic 4 3 cu codoni de oprire UGA recodificați în triptofan. De remarcat este că un ARNt-Opal-TCA este, de asemenea, codificat (Ga0307966_1000010189) care are cea mai mare similaritate cu trnW (UGA) din mitocondriile de Paralemanea sp. (GenBank aderare MG787097.1). Se știe că recodarea UGA-la-Trp apare rar, fiind descoperite în micoplasme (Yamao și colab., 1985) anumite bacterii simbiotice (McCutcheon și colab., 2009), inclusiv Ca. Pinguicoccus (Serra și colab., 2020) și mai multe descendențe mitocondriale (Knight și colab., 2001). Conversia UGA-la-Trp permite pierderea factorului de eliberare a lanțului peptidic 2 (PrfB) (care recunoaște codonii UGA) prin eroziunea genomului (McCutcheon și colab., 2009). Recodificarea UGA-la-Trp este de obicei asociată cu un conținut scăzut de GC (McCutcheon și colab., 2009), deși unii endosimbioni cu insecte cu UGA-la-Trp au un conținut ridicat de GC (de exemplu, Ca. Hodgkinia cicadicola 58% Ca. Tremblaya princeps PCIT 59%) (McCutcheon și Moran, 2012). Conținutul GC al fișierului Ca. Organicella MAG este de 32%, comparativ cu 25% pentru Ca. Pinguicoccus (Serra și colab., 2020) (a se vedea, de asemenea Compararea Ca. Organicella și Ca. Genomii Pinguicoccus, mai tarziu). Nu au fost identificate elemente mobile în Ca. Organicella MAG, care este o altă trăsătură a simbionților cu genomi extrem de reduși (McCutcheon și Moran, 2012).

Posesia unui complement minim de gene necesare transcrierii și traducerii (McCutcheon, 2010 McCutcheon și Moran, 2012) și o anumită capacitate de a efectua replicarea ADN, permite un nivel de autonomie față de procesele celulare care distinge bacteriile endosimbiotice de organite (McCutcheon și Moran , 2012). Ca. Organicella codifică unele enzime implicate în replicarea ADN, inclusiv ADN girază (GyrAB), ADN primază (DnaG) și ADN helicază replicativă (DnaB), dar o ADN polimerază dedicată pentru replicarea ADN nu a fost identificabilă. Deși anumitor endosimbioni insecte nu au holoenzima ADN polimeraza III, acestea cel puțin codifică ADN polimeraza și subunitatea # X03B1 (DnaE), responsabilă pentru activitatea de polimerizare 5 și # x2019 până la 3 și # x2019 a replicării ADN (McCutcheon, 2010 McCutcheon și Moran, 2012) . În absența DnaE, ​​replicarea genomică este probabil realizată de proteinele gazdă (Serra și colab., 2020). Ca și în multe alte genomuri reduse ale endosimbiontului, Ca. Organicella nu are proteina DnaA pentru inițierea replicării ADN-ului, iar această funcție este probabil îndeplinită de gazdă (Gil și colab., 2003 L & # x00F3pez-Madrigal și colab., 2013), posibil ca mecanism de exercitare a controlului asupra proliferării endosimbionților. (de exemplu, Akman și colab., 2002 Gil și colab., 2003 Bennett și colab., 2014 Bennett și Moran, 2015).

Au fost identificate trei subunități ale ARN polimerazei direcționate către ADN (RNAP) pentru transcripție (RpoA, RpoB și RpoC), precum și un factor sigma (RpoD), componente tipice endosimbionților (McCutcheon și Moran, 2012). Astfel, componentele RNAP reținute de Ca. Organicella este paralelă cu cea a simbionților fără legătură cu genomi de dimensiuni comparabile (McCutcheon, 2010 McCutcheon și Moran, 2012). Au fost identificate un total de 34 aminoacil tARN pentru toți cei 20 de aminoacizi proteinogeni, plus aminoacil tARN AR sintetaze (aaRS) pentru 13 dintre aminoacizii (Met, Leu, Ile, Val, Lys, Gly, Ser, Cys, Arg, Tyr, Ala, Phe și Glu) și o glutamil / aspartil-ARNt amidotransferază. AARS lipsă poate fi furnizată de gazdă (Van Leuven și colab., 2019), sau aaRS existent poate cataliza reacții multiple de aminoacilare (Moran și Bennett, 2014). Ca. Organicella codifică factorii de inițiere IF-1 și IF-2 (dar nu IF-3) factori de alungire EF-G, EF-Ts și EF-4 factor de eliberare translațional PrfA (dar nu PrfB) și factor de reciclare a ribozomilor. Au fost identificate majoritatea, dar nu toate, subunitățile ribozomale. Endosimbionții cunoscuți cu genomi foarte reduși nu codifică de obicei un set complet de proteine ​​ribozomale (McCutcheon, 2010 Moran și Bennett, 2014). Subunități ribozomale individuale care nu au putut fi identificate în Ca. Organicella MAG lipsește, de asemenea, din unele endosimbioni de insecte obligatorii (de exemplu, RplA, RpmC, RpmD, RpsF și RpmF) (Moran și Bennett, 2014). Anumite enzime de modificare a ARNt au fost, de asemenea, evidente în Ca. Organicella MAG (de exemplu, complex Mnm și TsaD) care sunt de obicei reținute în endosimbioni (McCutcheon și Moran, 2012 Van Leuven și colab., 2019) (vezi Text suplimentar și # x2013 Modificare ARNt).

Singura enzimă de reparare a ADN-ului dedicată identificabilă din Ca. Organicella a fost un omolog RecA. Abilitățile de reparare a ADN-ului epuizat sunt tipice bacteriilor cu genomi foarte reduși și contribuie la acumularea de substituții dăunătoare, inclusiv în CDS (McCutcheon și Moran, 2012 Bennett și Moran, 2015). PI mediu estimat de Ca. Proteinele Organicella au fost de 9,2 (Tabelul suplimentar 3). S-a propus că pI mare (alcalin) al proteomei paraziților intracelulari și endosimbionților poate rezulta din acumularea mutațiilor (Kiraga și colab., 2007). Cu toate acestea, nu toate Ca. S-a prezis că proteinele Organicella au un IP mare. În special, cele două proteine ​​cele mai acide sunt feredoxina (pI 4.1) și proteina purtătoare de acil (ACP) (pI 4.2), ambele proteine ​​acide în mod natural (Knaff și Hirasawa, 1991 McAllister și colab., 2006). Dacă pI ridicat apare din rate mari de mutație, pI acid al feredoxinei și ACP poate fi indicativul unei selecții puternice pozitive pentru a păstra funcția.

O altă trăsătură care este împărtășită între Ca. Organicella și simbionții bacterieni cunoscuți cu genomi foarte reduși este retenția proteinelor chaperone (GroES-GroEL DnaK) se crede că aceste proteine ​​chaperone ameliorează efectele adverse ale substituțiilor dăunătoare acumulate asupra plierii corecte a proteinelor (Moran, 1996 McCutcheon și Moran, 2012) . Bacteriile care sintetizează aceste chaperone sunt, prin urmare, sensibile la căldură, limitând toleranța termică a gazdelor lor (Burke și colab., 2010 Fan și Wernegreen, 2013 Moran și Bennett, 2014).Instabilitatea termică nu ar fi de așteptat să fie o problemă pentru Ca. Organicella în Antarctica (Franzmann și colab., 1987 Gibson, 1999 Yau și colab., 2013). Proteinele care sunt deteriorate și nu pot fi repliate corect ar putea fi degradate în peptide de către ClpXP codificat (Sabree și colab., 2013), deși soarta peptidelor este neclară în absența peptidazelor identificabile.

Ca. Distribuția de mediu Organicella și gazda

Pentru a examina distribuția de mediu a Ca. Au fost analizate Organicella, 337 lacuri antarctice și metagenomi marini, care cuprind 77 de locații acvatice diferite din Antarctica, incluzând o perioadă (decembrie 2006 până în ianuarie 2015) și o serie de adâncimi a lacului organic (Figura suplimentară 1 și Tabelul suplimentar 5). Acoperirea secvenței de Ca. MAG-urile Organicella din Lacul Organic au fost mai mari la adâncime în lac și mai mari în timpul iernii comparativ cu primăvara sau vara (Tabelul suplimentar 5). Deși cea mai mare abundență de Ca. Organicella provenea din Lacul Organic (până la o adâncime de citire mediană de 71), a arătat acoperirea citită Ca. Organicella a fost prezentă și în alte șapte lacuri din Dealurile Vestfold (Figura 1 suplimentară), inclusiv un MAG complet dintr-un mic iaz și # x223C15 km distanță de Lacul Organic (& # x201C Unnamed Lake 18 & # x201D), care avea o adâncime de citire mediană din 22 și acoperirea originalului Ca. Organicella MAG (Ga0307966_1000010) de 99,97% (Tabelul suplimentar 5). MAG-urile de la Organic Lake (11 aproape de lungime totală) au avut un ANI de & # x2265 99,5%, cu ANI în toate MAG-urile de la Organic Lake, Unnamed Lake 18, Portals Lake și Unnamed Lake 13 și # x226598,1% . În afara acestora Ca. MAG Organicella și Ca. Pinguicoccus, cele mai bune meciuri BLAST la Ca. Gena ARNr Organicella 16S în bazele de date NCBI-nr și IMG au fost & # x2264 82%. Aceasta indică faptul că o singură specie de Ca. Organicella este prezentă în Vestfold Hills, cu Ca. Pinguicoccus fiind singura specie similară identificabilă în altă parte a lumii.

Pentru a identifica potențialele gazde ale Ca. Organicella, metagenomii s-au asamblat folosind Metabat, generând un Ca. Organicella MAG (k141_311079) plus 188 coșuri potențiale de gazdă. Abundența fiecărui coș a fost determinată pentru fiecare dintre cei 29 de metagenomi în care Ca. Organicella a fost detectată prin maparea citirilor metagenomului la coșuri, iar corelația abundențelor coșului a fost calculată folosind SparCC. Abundența de Ca. Organicella a fost puternic corelată pozitiv cu bin81 (r = 0.89, p = 0), bin149 (r = 0.95, p = 0) și contig k141_859071 (r = 0.85, p = 0). Cele două coșuri și contigul au fost, de asemenea, extrem de corelate pozitiv între ele (r = 0,94 și # x2013 0,99, p = 0). Bin81 (12.580 contigs) și bin149 (18 contigs) au fost dominate de secvențe atribuite ciliatului Euplote (Euplotidae, Spirotrichea și Ciliophora) și contig-ul de 8,1 kb, k141_859071 conțineau o genă 28S rRNA (4.455 pb), regiunea unei gene rRNA 5.8S și gena rRNA 18S (1.895 bp) care se potriveau cu Euplote (de exemplu, ARNr 28S, 84,2% identitate cu Euplotes aediculatus peste 79% din lungimea interogării). Inferim că liniile 81 și 149 plus conturul ARNr reprezintă un MAG care aparține unei singure OTU la care ne referim ca & # x201CEuplote sp. AntOrgLke & # x201D (Tabelul suplimentar 6). The Euplote sp. AntOrgLke MAG (Suplimentar Dataset 1) cuprinde 29,98 Mbp pe 12,599 contigs (cel mai lung contig 19,935 bp, N50 = 2,645, L50 = 3,806, GC = 38,15%), cu 6,451 proteine ​​prezise împotriva bazei de date TaxDB_uniclust90_2018_08 (Supliment Dataset 2) și 15,3 împotriva bazei de date MERC_MMETSP_Uniclust50_profiles (Set de date suplimentar 3). De relevanță, abundența Ca. Organicella MAG a fost puternic corelată pozitiv cu Euplote sp. AntOrgLke MAG (r = 0.89, p = 0) (Figura 2), în concordanță cu faptul că acest ciliat este gazda. Mai mult, contigs aparținând Euplote sp. De asemenea, au fost detectați genomul mitocondrial AntOrgLke (Tabelul suplimentar 7 Setul de date suplimentar 4).

Figura 2. Co-apariția Candidatus Organicella extenuata și Euplote sp. AntOrgLke în metagenomii antarctici. Abundența de Ca. Organicella extenuata (k141_311079) și Euplote sp. AntOrgLke (bin81 + bin14 + contigk141_859071), calculat ca suma (lungimea contig & # x00D7 acoperire contig) pentru toate contigurile, a fost analizat folosind SparCC pentru a determina co-apariția lor (r, coeficient de corelație). Peste 29 de metagenomi în care Ca. Organicella extenuata a fost detectată, abundența de Euplote sp. AntOrgLke puternic corelat pozitiv cu abundența de Ca. Organicella extenuata (r = 0.89, p = 0), indicând Euplote sp. AntOrgLke a fost probabil gazda Ca. Organicella extenuata. Niciunul dintre celelalte 187 de coșuri reprezentând alte potențiale gazde nu a prezentat o corelație pozitivă mai sus r = 0.54. X-etichete axiale: Lac organic, ID-uri ale metagenomului (vezi tabelul suplimentar 5) Alte lacuri, denumiri de lacuri (fără prescurtare UN).

Euplote sp. AntOrgLke a avut 97% 18S rRNA identitate la Euplote cf. antarcticus și E. vanleeuwenhoeki. Topologia arborelui a fost consecventă pentru toate cele trei secvențe ARN polimerază (Figura 3) și secvența ARNr 18S (Figura Suplimentară 3) și Euplote sp. AntOrgLke pare a fi membru al Euplote Clade A (Syberg-Olsen și colab., 2016 Boscaro și colab., 2018 Serra și colab., 2020). AAI calculat din disponibil Euplote date genomice (șase specii, inclusiv Euplote sp. AntOrgLke) a variat de la 49 la 91%, cu Euplote sp. Partajarea AntOrgLke 53 & # x201357% cu celelalte cinci specii (Tabelul suplimentar 8). Astfel, datele noastre indică Euplote sp. AntOrgLke este probabil un nou membru antarctic al genului Euplote, și Ca. Organicella este un endosimbion verrucomicrobian al unei specii ciliate cunoscut sub numele de Ca. Pinguicoccus (Serra și colab., 2020). E. vanleeuwenhoeki, gazda lui Ca. Pinguicoccus, este un ciliat de apă dulce (Serra și colab., 2020), în timp ce Lacul organic este hipersalin (Franzmann și colab., 1987 Yau și colab., 2013).

Figura 3. Filogenia de Euplote sp. AntOrgLke. Filogenia de probabilitate maximă neînrădăcinată a proteinelor subunității II ARN polimerază de la membrii Ciliophora Euplote sp. AntOrgLke clustering cu membri ai Euplote gen. În cadrul grupului pentru fiecare tip de ARN polimerază (RPB, RPC și RPA), identitatea procentuală dintre Euplote sp. Proteina AntOrgLke și o proteină individuală sunt prezentate după numele speciei. Valorile Bootstrap & # x2265 70 sunt prezentate lângă noduri individuale, iar secvențele de proteine ​​sunt disponibile în setul de date suplimentar 5. Au fost utilizate în analiză 41 de secvențe de aminoacizi subunitatea II ARN polimerază. Pozițiile cu o acoperire a site-ului mai mică de 80% au fost eliminate și 944 de poziții au rămas în setul de date final, cu excepția MSTRG.29381.1_fr3, Euplotes vannus care a fost o secvență parțială (283 aa) și este marcată cu un & # x002A.

Euplote este un gen speciose de ciliat unicelular mobil, găsit în multe medii acvatice (Boscaro și colab., 2019), inclusiv în Lacul Organic, unde anterior a fost detectat pe baza secvențelor SSR rRNA (Yau și colab., 2013). Euplote speciile au tendința de a adăposti una sau mai multe bacterii endosimbiotice, cu cel puțin șase genuri și 21 de specii cunoscute până în prezent, toate rezidând în citoplasmă (Boscaro și colab., 2019 Serra și colab., 2020). Majoritatea au raportat Euplote speciile endosimbionte aparțin proteinelor și sunt predominant membre ale Burkholderiaceae (de exemplu, Polinucleobacter) și cladele intracelulare specializate Rickettsiales și Holosporales (Boscaro și colab., 2019). Excepția este Ca. Pinguicoccus, membru al Verrucomicrobia, și singurul endosimbiont cunoscut al E. vanleeuwenhoeki (Serra și colab., 2020). În E. vanleeuwenhoeki, Ca. Celulele Pinguicoccus sunt localizate libere în citoplasmă și s-a observat frecvent că sunt în contact cu mitocondriile și picăturile de lipide (Serra și colab., 2020). Beneficiul exact al Ca. Pinguicoccus pentru gazda sa ciliază este neclar, deși este puțin probabil să fie nutrițional (a se vedea Ca. Organicella & # x2013Eplicați interacțiunile, mai târziu) (Serra și colab., 2020). În mod similar, bazele relației simbiotice dintre endosimbionții proteobacterieni și Euplote sunt neclare, inclusiv cele care sunt simboluri esențiale (Polinucleobacter, Ca. Protistobacter și Ca. Devosia) și simboluri accesorii, acestea din urmă fiind parazitare (Boscaro și colab., 2013, 2019).

Ca. Organicella & # x2013Euplote Interacțiuni

O posibilitate este aceea Ca. Organicella furnizează gazdei sale grupuri de Fe-S și acizi grași ca bază pentru o simbioză mutualistă (Figura 4). Acest lucru este relevant pentru Euplote, în care, ca și în alte ciliate, genomul mitocondrial nu codifică aceste funcții. Am identificat 41,8 kb de Euplote sp. AntOrgLke secvența genomului mitocondrial & # x2014a lungime comparabilă cu secvențele genomului mitocondrial raportate pentru alte Euplote specii (de Graaf și colab., 2009 Serra și colab., 2020). La fel ca genomul mitocondrial al E. crassus, E. minuta, și E. vanleeuwenhoeki, cea a Euplote sp. AntOrgLke are gene care codifică proteinele lanțului de transport al electronilor, proteinele ribozomale, ARNr, ARNt și un citocrom c proteine ​​de asamblare, împreună cu mai multe gene care nu au funcții cunoscute, dar nu pot fi identificate gene Fe-S cluster sau gene de sinteză a acizilor grași (Tabel suplimentar 7 Pritchard și colab., 1990 de Graaf și colab., 2009 Swart și colab., 2011 Johri și colab. al., 2019 Serra și colab., 2020). În cadrul genului Euplote, codul genetic mitocondrial include un singur codon stop (UAA), un singur codon neutilizat (UAG) și UGA care codifică triptofanul (Pritchard și colab., 1990 Burger și colab., 2000 Brunk și colab., 2003 de Graaf și colab. ., 2009 Swart și colab., 2011). Prin comparație, în Ca. Organicella, UGA este reatribuit la Trp, în timp ce atât UAA cât și UAG sunt codoni de oprire.

Figura 4. Reprezentarea funcției Candidatus Organicella extenuata în interior Euplote sp. AntOrgLke. Capacitățile metabolice potențiale ale Ca. Organicella extenuata este limitată la asamblarea și conversia, transformarea, activarea și transferul de zaharuri de hexoză și heptoză. The Ca. Organicella extenuata MAG nu are gene identificabile pentru glicoliză, ciclul acidului tricarboxilic (în afară de oxidarea piruvatului), calea pentozofosfatului, respirația, fermentarea, generarea ATP (fie prin fosforilare oxidativă și ATP sintază, fie fosforilarea la nivel de substrat), fie sinteza fosfolipidelor (în afară de acizi grași), aminoacizi, acizi nucleici sau vitamine. Nu au existat gene transportoare identificabile. Procese, căi și enzime despre care s-a dedus că sunt funcționale Ca. Organicella extenuata este umbrită în roșu. OM, membrana exterioară IM, membrana interioară LPS, lipopolizaharidă. Sinteza acizilor grași (tip II): PDH, piruvat dehidrogenază CoA, coenzima A ACP, proteină purtătoare acil ACC, complex acetil-CoA carboxilază FabD, malonil-CoA-ACP-transacilază FabB și FabF, 3-oxoacil-ACP sintază FabG, 3 -oxoacil-ACP reductaza FabZ, 3-hidroxiacil-ACP dehidrataza FabV, enoil-ACP reductaza. Sinteza glicanului: GT, glicoziltransferaza (trei GT diferite) ColD, GDP-4-ceto-6-deoxi-D-manoză 3-dehidratază ColC, PIB-L-colitoza sintază Udg, UDP-glucoză 6-dehidrogenază LpsL, UDP-glucuronat epimerază Tkl, transketolază GmhA, fosfoheptoză izomerază HddA, D-glicero - & # x03B1-D-mano-heptoză 7-fosfat kinază HddC, D-glicero - & # x03B1-D-mano-heptoză 1-fosfat guanililtransferază. Replicarea ADN: GyrAB, ADN girază DnaG, ADN primază DnaB, ADN helicază replicativă. Transcriere: RNAP, ARN polimerază. Traducere: ARNt, ARN de transfer aaRS, aminoacil ARNt sintetaze. Ansamblu cluster Fe-S: Fdx, feredoxină SufS, cisteină desulfurază SUF, complex de asamblare cluster Fe-S (SufCBD, SufU, SufT). În această reconstrucție, piruvatul este furnizat de gazdă și singurul scop al PDH este de a furniza precursorul acetil-CoA pentru sinteza acizilor grași. Calea de sinteză a acizilor grași este completă funcțional în Ca. Organicella extenuata, cu FabF sau FabB care substituie FabH lipsă. Există trei căi implicate în sinteza subunităților heptoză (glicero-manno-heptoză) sau hexoză (acid galacturonic colitoză) a glicanilor lipopolizaharidici în Ca. Organicella extenuata, dar niciuna dintre aceste căi nu este completă și toate depind de precursori exogeni.

The Ca. Organicella MAG codifică feredoxina și factorul de utilizare a sulfului (SUF) proteine ​​implicate în biogeneza clusterelor Fe-S (SufCBD, SufU și SufT), inclusiv cisteina desulfurază (SufS) pentru mobilizarea sulfului din cisteină (Selbach și colab., 2014 Tabel suplimentar 3). În eucariote, căile de fier & # x2013sulfur (ISC) și căile SUF sunt căile dominante de sinteză a clusterelor Fe-S, cu proteine ​​de asamblare ISC situate în mitocondrii, în timp ce proteinele de asamblare SUF sunt localizate la organite plastide (Kispal și colab., 1999 Tsaousis , 2019), acesta din urmă incluzând cloroplastele și apicoplastele (Takahashi și colab., 1986 Lill și M & # x00FChlenhoff, 2005 Lim și McFadden, 2010 Gisselberg și colab., 2013), deși, în anumite protiste, proteinele de asamblare ale SUF sunt localizate în citoplasma (Tsaousis și colab., 2012 Karnkowska și colab., 2016). Tipic pentru eucariote, Euplote sp. AntOrgLke codifică omologi ai proteinelor ISC deduse prezenței în modelul ciliate Tetrahymena thermophila, incluzând cisteina desulfurază (Nfs1), feredoxina (Yah1) și feredoxina reductaza (Arh1) (Tabelul suplimentar 9) Ansamblul ISC ar avea loc în mitocondrie și ar depinde de enzimele codificate nuclear (Smith și colab., 2007). Sistemul SUF al Ca. Organicella ar putea deci să funcționeze ca un sistem complementar de asamblare a clusterelor Fe-S la ISC. Sistemul SUF este mai rezistent la speciile reactive de oxigen decât sistemul ISC (Santos-Garcia și colab., 2014), astfel sistemul SUF codificat de Ca. Organicella poate fi deosebit de importantă pentru gazdă în condiții de stres oxidativ ca răspuns la degradarea grupelor Fe-S de proteine ​​gazdă (Tsaousis, 2019). Sistemul SUF poate fi deosebit de relevant pentru Euplote sp. AntOrgLke în Lacul Organic și în celelalte lacuri Vestfold Hills datorită condițiilor de mediu predominante (concentrații ridicate de oxigen, temperaturi de îngheț crescute, iradiere UV îmbunătățită Figura 1 suplimentară) care promovează producția de specii reactive de oxigen (Ricci și colab., 2017).

Ca. Organicella codifică, de asemenea, o suită aproape completă de gene pentru sinteza bacteriană de acizi grași de tip II (FASII), cu excepția FabH, o enzimă implicată în alungirea acizilor grași (vezi Text suplimentar și # x2013 Oxidarea piruvatului și sinteza acidului gras). Este probabil ca o altă enzimă de condensare implicată în alungirea acidului gras codificată în Ca. Organicella (FabB sau FabF) ar înlocui FabH, după cum se deduce Ca. Wigglesworthia, căruia îi lipsește în mod similar FabH, dar altfel codifică o cale FASII completă (Zientz și colab., 2004 Parsons și Rock, 2013). În sprijinul acestui fapt, Escherichia coli și Lactococcus lactis mutanți cărora le lipsește fabH sunt încă capabili să sintetizeze acizi grași (Morgan-Kiss și Cronan, 2008 Yao și colab., 2012). Pentru Ca. Organicella, precursorul acetil-CoA pentru biosinteza acizilor grași cu lanț drept ar fi generat folosind un complex piruvat dehidrogenază (PDH), probabil folosind piruvat dobândit de la gazdă (Figura 4).

Mulți protiști depind de acizii grași furnizați de FASII mitocondriale pentru procese precum lipoilarea enzimelor esențiale sau pentru încorporarea în fosfolipide, în ciuda faptului că au propriul aparat citoplasmatic FAS (FAS tip I), acești eucarioti depind de acizii grași furnizați de mitocondrii (Stephens et. al., 2007 Hiltunen și colab., 2009). Cu toate acestea, ca și în alte ciliate, genomul mitocondrial al Euplote nu are gene asociate cu FASII (Pritchard și colab., 1990 Burger și colab., 2000 Brunk și colab., 2003 Swart și colab., 2011 Johri și colab., 2019). Astfel, propunem ipoteza că Ca. Organicella furnizează acizi grași gazdei în aceste scopuri esențiale.

O altă posibilitate este aceea că acizii grași sunt furnizați gazdei cu o capacitate nutrițională. De exemplu, există dovezi că acizii grași sintetizați de Ca. Blochmannia floridanus face parte din sprijinul nutrițional al simbiontei și # x2019 pentru gazda sa (furnică tâmplară) Camponotus chromaiodes) în perioadele în care gazda insectelor se hrănește cu exudate bogate în zahăr (Zientz și colab., 2004 Fan și Wernegreen, 2013). Cu toate acestea, considerăm acest lucru ca fiind puțin probabil, având în vedere că s-a prezis că simbiozele nutriționale nu vor fi necesare pentru hrănitorii heterogeni de alge și bacterii, cum ar fi Euplote care pot obține probabil toți nutrienții necesari din dietele lor (Boscaro și colab., 2013, 2019 Serra și colab., 2020).

De asemenea, este posibil ca FASII în Ca. Organicella contribuie la propriile cerințe celulare, inclusiv la lipoilarea propriului său PDH și furnizează precursori pentru modificarea propriului său înveliș celular (Figura 4). Pe lângă codificarea unei căi FASII complete funcțional, 17 Ca. Se anticipează că genele Organicella vor fi implicate în biosinteza precursorilor pentru componentele lipopolizaharidice: nouă proteine ​​sunt implicate în biosinteza unităților de heptoză și hexoză (deși nu am putut reconstitui căi complete) și opt proteine ​​sunt glicoziltransferaze care ar putea fi implicate în transfer de zaharuri activate de nucleotide pentru a construi lanțuri de glican (Tabelul suplimentar 3 Text suplimentar și # x2013 Glycan Synthesis). Endosimbionții obligați cu genomi și # x003C 500 kbp au de obicei puține gene, dacă există, pentru biogeneza învelișului celular, aceste căi fiind deosebit de predispuse la pierderi (McCutcheon și Moran, 2012 Moran și Bennett, 2014 Brown și colab., 2015). Ca. Organicella nu are aciltransferazele necesare pentru transferul acil-ACP în glicerol-3-fosfat pentru a produce acid fosfatidic, precursorul fosfolipidic al bacteriilor (Yao și colab., 2012) și nu există gene identificabile pentru biosinteza coloanei vertebrale glicerofosfat sau a grupelor de cap fosfolipide sau pentru 3-deoxi-D-acidul manno-octulosonic-lipida A (Kdo2-lipidul A) precursor al lipopolizaharidelor (Wang și colab., 2015).

Prin urmare, Ca. Organicella, ca și în alte endosimbioni cu genomi foarte reduși, se presupune că se bazează în totalitate pe membrane derivate din gazdă (Baumann, 2005 McCutcheon și Moran, 2012 Husnik și McCutcheon, 2016). Prezența lipopolizaharidelor și a altor gene legate de peretele celular nu este neobișnuită pentru bacteriile simbiotice cu genomi mai mari (Zientz și colab., 2004 Nikoh și colab., 2011), de exemplu, endosimbionții insectelor Ca. Wigglesworthia și Ca. Blochmannia (ambele între 615 și 706 kbp) codifică majoritatea genelor necesare pentru sinteza unui perete celular gram-negativ normal, inclusiv fosfolipide și lipopolizaharide (Akman și colab., 2002 Gil și colab., 2003 Zientz și colab., 2004 ). În plus, anumite bacterii simbiotice obligatorii cu genomi mai mari (& # x003E600 kb) păstrează un set complet de gene FASII (Akman și colab., 2002 Gil și colab., 2003 Nikoh și colab., 2011 Lamelas și colab., 2011 Chong și Moran , 2018).În aceste simbionte, reținerea genelor necesare pentru sinteza unui perete celular Gram-negativ normal (inclusiv lipopolizaharide) este posibil pentru protecția împotriva gazdei și / sau reflectă o asociere simbiotică relativ recentă (Akman și colab., 2002 Gil și colab. ., 2003). Acesta din urmă nu se aplică Ca. Organicella, cu reducerea extremă a dimensiunii genomului reflectând o simbioză antică (Serra și colab., 2020).

Cu toate acestea, Ca. Organicella ar putea contribui cu componenții glicanului la propriul său înveliș celular (inclusiv lipopolizaharidele). O posibilitate este că modificările peretelui celular endosimbiont conferă o anumită protecție împotriva gazdei, cum ar fi prin variația lungimii acidului gras sau prin modificarea fragmentelor glicane ale lipopolizaharidelor (nucleu și / sau polizaharide specifice O) folosind zaharuri modificate prin acțiunea glicoziltransferazelor (Serra și colab., 2020). Ca. Pinguicoccus are o dimensiune genomică și o compoziție genică foarte asemănătoare Ca. Organicella, inclusiv reținerea omologilor din aceleași gene legate de glican / lipopolizaharidă (a se vedea Compararea Ca. Organicella și Ca. Genomii Pinguicoccus, mai tarziu). Ca. Pinguicoccus rezidă liber în citoplasma de E. vanleeuwenhoekiși s-a propus că endosimbionții din citoplasma gazdă a celulelor eucariote se confruntă cu un mediu mai puțin stabil și posibil ostil în comparație cu acei endosimbionți care sunt cuprinși în bacteriocite specializate sau vezicule derivate din gazdă (Gil și colab., 2003 Wu și colab., 2004 Serra și colab., 2020). Din acest motiv, Ca. Pinguicoccus poate exercita un anumit control asupra compoziției învelișului său celular, deoarece este în contact direct cu citoplasma gazdă (Serra și colab., 2020). Acest lucru ar putea fi valabil și pentru Ca. Organicella, care, pe baza afilierii sale filogenetice strânse cu Ca. Pinguicoccus și având Euplote ca gazdă presupusă, trăiește probabil în citoplasma gazdei.

In comparatie cu Ca. Organicella și Ca. Genomii Pinguicoccus

Dimensiunile genomului Ca. Organicella (158.228 bp, 194 gene, 163 CDS) și Ca. Pinguicoccus (163.218 bp, 205 gene, 168 CDS Serra și colab., 2020) sunt note similare că secvențele de proteine ​​pentru Ca. Pinguicoccus NCBI (Accession CP039370) secvența genomului a fost auto-prezis cu codul genetic 11, dar folosind codul genetic 4, se prezice un total de 200 de gene [cinci mai puțin decât raportate în Serra și colab. (2020)], format din 163 CDS, 34 ARNt și genele ARNr 16S, 5S și 23S (Tabelul suplimentar 1). Cei doi genomi împărtășesc o sinteză extinsă (Figura suplimentară 4). Deși secvențele nucleotidice genomice au fost prea divergente pentru a calcula ANI, AAI între cele două genomi simbionți a fost determinat a fi de 46% (AAI bidirecțional bazat pe 134 de proteine, toate prezise cu codul genetic 4). Ambele genomi păstrează un subgrup mic aproape identic de gene reprezentate în Verrucomicrobia (Serra și colab., 2020 Tabelul suplimentar 3). De asemenea, împărtășesc proteine ​​omoloage necesare pentru replicarea, transcrierea și traducerea ADN, în comun cu alte endosimbionți, dar ambele nu au subunitatea catalitică a ADN polimerazei (DnaE), care este excepțională între endosimbionți (Serra și colab., 2020).

Ca. Pinguicoccus codifică aceleași componente ale sistemului SUF și o cale FASII completă funcțional ca și Ca. Organicella, sugerând asta Ca. Pinguicoccus conferă aceleași beneficii Euplote gazdă pe care o deducem Ca. Organicella. De interes este că Ca. Celulele pinguicoccus au fost adesea observate asociate cu picături de lipide în E. vanleeuwenhoeki citoplasmă, ridicând posibilitatea unei legături între reținerea genelor FASII și interacțiunea cu lipidele gazdei și # x2019s (Serra și colab., 2020). Ca. Pinguicoccus codifică, de asemenea, omologi ai acelorași glicoziltransferaze și enzime legate de heptoză și hexoză codificate în Ca. Organicella (Tabelul suplimentar 3). Cu toate acestea, Ca. Pinguicoccus păstrează o proteină de sinteză a fosfolipidelor (CDP-diacilglicerol-glicerol-3-fosfat 3-fosfatidiltransferază omolog) neidentificabilă în Ca. Organicella. Ca. Pinguicoccus codifică un sistem de tioredoxină și # x2013thioredoxin reductază (pentru menținerea echilibrului redox de tiol-disulfură) și glutamat dehidrogenază dependentă de NADP (pentru dezaminarea oxidativă reversibilă a glutamatului), niciuna dintre acestea nu este identificabilă în Ca. Organicella. Există, de asemenea, variații între cele două genuri în complementul exact al subunităților ribozomale, aaRS și subunităților factorului de inițiere (Tabelul suplimentar 3), aceste componente fiind predispuse la pierderea endosimbionților (Moran și Bennett, 2014). In orice caz, Ca. Organicella și Ca. Pinguicoccus posedă aceleași 34 de gene ARNt.

În general, datele sugerează că, deoarece divergența lor față de un strămoș comun avea un genom foarte redus, eroziunea genomică suplimentară a avut loc independent în Ca. Organicella și Ca. Pinguicoccus, cu pierderea diferențială a anumitor gene, în special a celor implicate în traducere. Prin contrast, SUF, FASII și anumite gene legate de lipopolizaharidă / glican sunt conservate între cele două genuri. Acest lucru sugerează că aceste gene particulare joacă roluri importante în interacțiunile acestor endosimbioni cu gazdele lor ciliate.


Concluzie

Marea majoritate a diversității eucariote este reprezentată de protiști [18], totuși au fost publicate doar câteva proiecte de secvențiere a genomului protist. Studiul nostru de sondaj de secvență a indicat faptul că o abordare combinată care utilizează atât eșantionare aleatorie din genom (GSS), cât și EST are succes în identificarea genelor (Tabelul 1). Am identificat 817 gene din secvențele GSS, în timp ce 473 gene cu omologii în alte organisme au fost detectate printre secvențele EST. Deoarece am colectat mai mult de două ori mai multe GSS decât secvențe EST, secvențierea EST pare a fi puțin mai eficientă pentru descoperirea genelor, dacă se ia în considerare doar cantitatea, așa cum era de așteptat. Cu toate acestea, secvențierea EST este orientată spre identificarea genelor extrem de exprimate, cum ar fi genele implicate în procesarea informațiilor genetice, în special traducerea, în timp ce secvențierea GSS detectează o selecție mai aleatorie a genelor (Tabelul 1). Această prejudecată funcțională a genelor detectate în studiile EST poate fi un avantaj dacă obiectivul studiului este în principal identificarea genelor identificate anterior în alte organisme utilizând aceeași abordare, dar este o limitare dacă eșantionarea genei este scopul.

Am constatat că o abordare combinată a secvențierii GSS și EST poate avea succes în detectarea ambelor gene foarte exprimate (și, probabil, de multe ori distribuite pe scară largă) și a unui set de gene mai diversificat. În combinație cu secvențierea completă a câtorva contigs, această abordare a fost eficientă pentru a dezvălui multe despre S. salmonicida genom. Deși am putea identifica mai mult de 600 de gene cu funcții adnotate, proteinele ipotetice conservate reprezintă în continuare cea mai mare categorie (Tabelul 1), indicând faptul că genele cu funcții adnotate oferă doar o imagine parțială a adevăratului potențial de codificare. Mai mult, 13 dintre cele 38 de gene identificate în cadrul contigs nu au prezentat nicio asemănare semnificativă a secvenței cu genele din bazele de date și 81% și, respectiv, 45% din secvențele GSS și EST, nu au arătat similitudine semnificativă cu nici o genă cunoscută. Acest lucru sugerează că o mare parte din genele din S. salmonicida genomului le lipsește similitudinea secvenței cu genele cunoscute, în ciuda faptului că este aproape completă G. lamblia complementul genetic este inclus în baza de date publică. Astfel, S. salmonicida genomul are un potențial de codificare semnificativ și mai ales necunoscut. Totuși, analizele genelor care ar putea fi adnotate nu numai că au identificat individ S. salmonicida gene și căi metabolice care au oferit o perspectivă asupra biologiei și evoluției organismului. În plus, aceste analize au relevat mai multe proprietăți specifice liniei care sugerează o mare diversitate genomică între S. salmonicida și alte eucariote studiate, inclusiv ruda sa cea mai apropiată studiată intens, diplomonada G. lamblia.

Analizele noastre indică într-adevăr că genomurile diplomatice sunt diverse. De exemplu, în S. salmonicida genomului am identificat achiziții genetice, o prejudecată compozițională de bază care variază de-a lungul genomului, o utilizare a codonilor diferită de cea a G. lambliași diferențele în procesele biologice moleculare de bază, cum ar fi poliadenilarea. G. lamblia și S. salmonicida reprezintă doar două specii în cadrul diplomonadelor, un grup parafiletic care poate include și enteromonade și retortamonade, organisme cu trăsături morfologice distincte [23, 24, 102]. Înțelegerea acestor grupuri interesante de protiști este foarte limitată la nivel genomic și proiectele genomului G. lamblia [103] și Spironucleus vortens [104], un alt agent patogen al peștilor, va aduce contribuții majore. Totuși, diplomatele sunt foarte diverse, așa cum se manifestă printr-un grad mare de divergență de secvență între membrii grupului și, după cum se indică aici, variații mari în structura și conținutul genomic. Dovezile circumstanțiale pentru un genom relativ mic (a se vedea mai sus), împreună cu un conținut global de G + C de 36% și o frecvență redusă a repetărilor, face S. salmonicida un candidat ideal pentru un proiect de secvențiere a întregului genom. Un astfel de efort ar oferi informații suplimentare asupra stilului de viață parazit al acestui organism, a biologiei fascinant de diverse a diplomatelor și ar extinde aprecierea noastră pentru diversitatea genomului și evoluția printre eucariote.


Molecule, proteine ​​și anticorpi ai acidului nucleic:

Moleculele de acid nucleic conform invenției pot fi preparate prin două metode generale: (1) pot fi sintetizate din trifosfați nucleotidici corespunzători sau (2) pot fi izolate din surse biologice. Ambele metode utilizează protocoale bine cunoscute în domeniu.

Disponibilitatea informațiilor despre secvența de nucleotide, cum ar fi ADNc având SECV ID NR: 1-8, permite prepararea unei molecule izolate de acid nucleic conform invenției prin sinteza oligonucleotidelor. Oligonucleotidele sintetice pot fi preparate prin metoda fosforamiditei utilizate în sintetizatorul ADN Applied Biosystems 38A sau dispozitive similare. Construcția rezultată poate fi purificată conform metodelor cunoscute în domeniu, cum ar fi cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC). Polinucleotidele lungi, dublu catenare, cum ar fi o moleculă de ADN conform prezentei invenții, trebuie sintetizate în etape, datorită limitărilor de dimensiune inerente metodelor actuale de sinteză a oligonucleotidelor. Astfel, de exemplu, o moleculă lungă cu catenă dublă poate fi sintetizată ca mai multe segmente mai mici de complementaritate adecvată. Segmentele complementare astfel produse pot fi recoapte astfel încât fiecare segment să posede capete de coeziune adecvate pentru atașarea unui segment adiacent. Segmentele adiacente pot fi ligate prin terminații coezive de recoacere în prezența ADN ligazei pentru a construi o întreagă moleculă lungă dublu catenară. O moleculă de ADN sintetic astfel construită poate fi apoi clonată și amplificată într-un vector adecvat.

În conformitate cu prezenta invenție, acizii nucleici care au omologia secvenței de nivel adecvate cu o parte sau toate regiunile de codificare și / sau regiunile de reglare a genelor care codifică proteinele care cuprind calea fenilpropanoidă pot fi identificați utilizând condiții de hibridizare și spălare cu severitate adecvată. Va fi apreciat de către specialiștii în domeniu că strategia menționată mai sus, atunci când este aplicată secvențelor genomice, va permite, pe lângă faptul că va permite secvențele de codificare a izolării pentru genele care codifică proteinele care cuprind calea fenilpropanoidă, să permită și izolarea promotorilor și a altor secvențe de reglare a genelor. asociate cu gene care codifică proteinele care cuprind calea fenilpropanoidă, chiar dacă secvențele reglatoare în sine nu pot împărți suficientă omologie pentru a permite hibridizarea adecvată.

Ca o ilustrare tipică, hibridizările pot fi realizate, conform metodei Sambrook și colab., Utilizând o soluție de hibridizare cuprinzând: 5 × SSC, 5 × reactiv Denhardt, 1,0% SDS, 100 μg / ml ADN de spermă de somon denaturat, fragmentat, 0,05% pirofosfat de sodiu și până la 50% formamidă. Hibridizarea se efectuează la 37-42 ° C timp de cel puțin șase ore. După hibridizare, filtrele sunt spălate după cum urmează: (1) 5 minute la temperatura camerei în 2 × SSC și 1% SDS (2) 15 minute la temperatura camerei în 2 × SSC și 0,1% SDS (3) 30 minute-1 oră la 37 ° C. în 2 × SSC și 0,1% SDS (4) 2 ore la 45-55 ° C în 2 × SSC și 0,1% SDS, schimbând soluția la fiecare 30 de minute.

O formulă comună pentru calcularea condițiilor de stringență necesare pentru a realiza hibridizarea între moleculele de acid nucleic ale unei omologii de secvență specificate (Sambrook și colab., 1989):


Tm =81,5 ° C. + 16,6 Jurnal [Na +] + 0,41 (% G + C) −0,63 (% formamidă) −600 / # bp în duplex

Ca o ilustrare a formulei de mai sus, folosind [Na +] = [0,368] și 50% formamidă, cu conținut de GC de 42% și o dimensiune medie a sondei de 200 de baze, Tm este de 57 ° C. Tm-ul unui ADN duplex scade cu 1-1,5 ° C. cu fiecare scădere de 1% a omologiei. Astfel, ținte cu o identitate de secvență mai mare de aproximativ 75% ar fi observate folosind o temperatură de hibridizare de 42 ° C. Într-un exemplu de realizare, hibridizarea este la 37 ° C. iar spălarea finală este la 42 ° C. într-un alt exemplu de realizare hibridizarea este la 42 ° C. iar spălarea finală este la 50 ° C. și într-un alt exemplu de realizare hibridizarea este la 42 ° C. iar spălarea finală este la 65 ° C., cu soluțiile de hibridizare și spălare de mai sus. Condițiile de severitate ridicată includ hibridizarea la 42 ° C în soluția de hibridizare de mai sus și o spălare finală la 65 ° C în 0,1 × SSC și 0,1% SDS timp de 10 minute.

Acizii nucleici conform prezentei invenții pot fi menținuți ca ADN în orice vector de clonare convenabil. Într-o variantă preferată, clonele sunt menținute în vectorul de clonare / exprimare a plasmidei, cum ar fi pGEM-T (Promega Biotech, Madison, Wis.), PBluescript (Stratagene, La Jolla, California), pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, California) .) sau pET28a + (Novagen, Madison, Wis.), toate acestea putând fi propagate într-un E coli celula gazda.

Moleculele de acid nucleic conform invenției includ ADNc, ADN genomic, ARN și fragmente ale acestora, care pot fi cu un singur, dublu sau chiar triplu catenar. Astfel, această invenție furnizează oligonucleotide (fire de sens sau antisens de ADN sau ARN) având secvențe capabile de hibridizare cu cel puțin o secvență a unei molecule de acid nucleic conform prezentei invenții. Astfel de oligonucleotide sunt utile ca sonde pentru detectarea genelor care codifică proteinele care cuprind calea fenilpropanoidă sau ARNm în probe de testare de țesut vegetal, de exemplu, prin amplificare PCR, sau pentru reglarea pozitivă sau negativă a genelor de expresie care codifică proteinele care cuprind calea fenilpropanoidă la sau înainte de translația ARNm în proteine. Metodele în care oligonucleotidele sau polinucleotidele pot fi utilizate ca sonde pentru astfel de teste includ, dar nu se limitează la: (1) hibridizare in situ (2) Hibridizare sudică (3) hibridizare nordică și (4) reacții de amplificare asortate, cum ar fi reacțiile în lanț ale polimerazei (PCR, inclusiv RT-PCR) și reacția în lanț a ligazei (LCR).

Polipeptidele codificate de acizii nucleici conform invenției pot fi preparate într-o varietate de moduri, conform metodelor cunoscute. Dacă sunt produse in situ, polipeptidele pot fi purificate din surse adecvate, de exemplu, semințe, pericarpi sau alte părți ale plantei.

Alternativ, disponibilitatea moleculelor de acid nucleic care codifică polipeptidele permite producerea proteinelor utilizând metode de exprimare in vitro cunoscute în domeniu. De exemplu, un ADNc sau o genă pot fi clonate într-un vector de transcripție in vitro adecvat, cum ar fi un pSP64 sau pSP65 pentru transcrierea in vitro, urmată de traducere fără celule într-un sistem de traducere adecvat fără celule, cum ar fi germeni de grâu sau reticulocite de iepure . Sistemele de transcriere și traducere in vitro sunt disponibile comercial, de exemplu, de la Promega Biotech, Madison, Wis., BRL, Rockville, MD sau Invitrogen, Carlsbad, California.

Conform unei variante preferate, cantități mai mari de polipeptide care cuprind calea fenilpropanoidă pot fi produse prin exprimare într-un sistem procariot sau eucariot adecvat. De exemplu, o parte sau o parte a unei molecule de ADN, cum ar fi ADNc-urile care au SECV ID NR: 1-8, pot fi inserate într-un vector plasmidic adaptat pentru exprimare într-o celulă bacteriană (cum ar fi E coli) sau o celulă de drojdie (cum ar fi Saccharomyces cerevisiae), sau într-un vector baculovirus pentru exprimare într-o celulă de insectă. Astfel de vectori cuprind elementele de reglare necesare pentru exprimarea ADN-ului în celula gazdă, poziționate în așa fel încât să permită exprimarea ADN-ului în celula gazdă. Astfel de elemente de reglare necesare pentru exprimare includ secvențe promotor, secvențe de inițiere a transcripției și, opțional, secvențe amplificatoare.

Polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă produsă prin expresia genelor într-un sistem procariot sau eucariot recombinant pot fi purificate în conformitate cu metodele cunoscute în domeniu. Într-o realizare preferată, poate fi utilizat un sistem de exprimare / secreție disponibil comercial, prin care proteina recombinantă este exprimată și apoi secretată din celula gazdă, pentru a fi purificată cu ușurință din mediul înconjurător. Dacă nu se utilizează vectori de expresie / secreție, o abordare alternativă implică purificarea proteinei recombinante prin separarea afinității, cum ar fi prin interacțiunea imunologică cu anticorpii care se leagă în mod specific la proteina recombinantă. Astfel de metode sunt utilizate în mod obișnuit de către practicieni calificați.

Polipeptidele invenției pot fi, de asemenea, sintetizate și exprimate ca proteine ​​de fuziune cu unul sau mai multe domenii suplimentare legate de acestea pentru, de exemplu, producerea unei peptide mai imunogene, pentru a izola mai ușor o peptidă sintetizată recombinant, pentru a identifica și a izola anticorpii și B care exprimă anticorpii celule și altele asemenea. Domeniile care facilitează detectarea și purificarea includ, de exemplu, peptide de chelatare a metalelor, cum ar fi tractele de polihistidină și modulele histidină-triptofan care permit purificarea pe metale imobilizate, domeniile proteinei A care permit purificarea pe imunoglobulină imobilizată și domeniul utilizat în sistemul de purificare FLAGS extensie / afinitate (Immunex Corp, Seattle Wash.). Includerea unei secvențe linker clivabile, cum ar fi Factorul Xa sau enterokinaza (Invitrogen, San Diego, California) între un domeniu de purificare și peptida sau polipeptida care conține motiv pentru a facilita purificarea. De exemplu, un vector de expresie poate include o secvență de acid nucleic care codifică epitopul legată de șase resturi de histidină urmate de o tioredoxină și un situs de clivare a enterokinazei (a se vedea, de exemplu, Williams, Biochimie 1995, 34: 1787-1797 Dobeli, Proteine ​​Expr. Purif 1998, 12: 404-14). Reziduurile de histidină facilitează detectarea și purificarea în timp ce situsul de scindare a enterokinazei oferă un mijloc de purificare a epitopului din restul proteinei de fuziune. Tehnologia referitoare la vectori care codifică proteinele de fuziune și aplicarea proteinelor de fuziune sunt bine descrise în literatura științifică și de brevet (vezi, de exemplu, Kroll, Celula ADN. Biol. 1993, 12: 441-53).

Polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă, preparate prin metodele menționate anterior, pot fi analizate conform procedurilor standard.

Polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă purificată din cafea sau produse recombinant, pot fi utilizate pentru a genera anticorpi policlonali sau monoclonali, fragmente de anticorpi sau derivați așa cum sunt definiți aici, conform metodelor cunoscute. Anticorpii care recunosc și leagă fragmente din polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă conform invenției sunt de asemenea avute în vedere, cu condiția ca anticorpii să fie specifici pentru polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă. De exemplu, dacă analizele proteinelor sau analizele sudice și de clonare (a se vedea mai jos) indică faptul că genele clonate aparțin unei familii multigene, atunci pot fi generați anticorpi specifici pentru membri, realizați peptidelor sintetice corespunzătoare regiunilor neconservate ale proteinei.

Kituri care cuprind un anticorp conform invenției pentru oricare dintre scopurile descrise aici sunt, de asemenea, incluse în scopul invenției. În general, un astfel de kit include un antigen de control pentru care anticorpul este imunospecific.

Acizii clorogenici joacă probabil un rol în diferite aspecte ale sănătății și sănătății umane. S-a demonstrat că acizii clorogenici sunt antioxidanți puternici in vitro (Rice-Evands, CA și colab. 1996), prezintă efecte protectoare împotriva deteriorării ADN-ului in vitro (Shibata, H și colab. 1999), prezintă proprietăți anticarcinogene și antimutagene și, în cele din urmă, pot reduce riscul anumitor tipuri de cancer (Olthof, MR și colab. 2001 și Hollman, PC 2001) și poate fi protejat împotriva bolilor cardiovasculare (Olthof, MR și colab. 2001 și Hollman, PC 2001). Această listă de beneficii pentru sănătate atribuite acizilor clorogeni este menită să fie ilustrativă și nu exhaustivă și se presupune că există multe alte efecte benefice asupra sănătății atribuite acizilor clorogeni în prezent necunoscuți. În consecință, polipeptidele de cafea care cuprind calea biosintetică a acizilor clorogeni descrise și exemplificate aici sunt de așteptat să găsească utilitate într-o varietate de aplicații alimentare, de sănătate și de sănătate. De exemplu, polipeptidele de cafea care cuprind calea biosintetică a acizilor clorogeni sau produsele lor respective din acid clorogenic, pot fi utilizate ca suplimente alimentare sau în diverse produse alimentare și băuturi.

Una sau mai multe dintre aplicațiile menționate anterior pentru polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă pot fi urmărite prin exploatarea disponibilității polinucleotidelor care codifică polipeptidele care cuprind calea fenilpropanoidă descrisă aici pentru a genera cantități semnificative de proteine ​​pure folosind organisme recombinante (de exemplu, în drojdie) Picia pastoris sau în alimente compatibile Lactobacilisau în celule vegetale) și apoi testarea proteinelor în teste noi sau stabilite pentru potențial antioxidant, potențial chimioprotector sau chimioterapeutic, potențial de a promova sănătatea cardiovasculară și altele asemenea. Testări similare pot fi efectuate folosind acizii clorogeni produși de aceste proteine ​​în conformitate cu mijloacele adecvate stabilite sau dezvoltate în domeniu. Dacă proteinele specifice purificate sau produsele cu acid clorogenic produse de astfel de proteine ​​se dovedesc a fi deosebit de utile, versiunile naturale ale acestor proteine ​​și produsele lor din acidul clorogenic pot fi izolate și din boabele de cafea determinate a fi bogate în acele polipeptide particulare care cuprind calea fenilpropanoidă .


Materiale și metode

Analiza pseudogenă bazată pe ipoteză

O listă a genelor legate de viziune obținute din baza de date ontologică a genelor (GO: 0007601: percepție vizuală) și a sistemului vizual din biblioteca căii QIAGEN (http://www.qiagen.com/Products/Genes%20and%20Pathways/) definite prezența, numărul copiei și natura genelor corespunzătoare în M. davidii și P. alecto genomi. Proteinele din genele legate de viziunea umană și genele lor învecinate au fost descărcate din versiunea Ensembl 64. Cel mai lung transcript a fost ales pentru a reprezenta fiecare genă în cazurile în care s-a demonstrat că există variante alternative de îmbinare. Am supus apoi toate proteinele la analiza tBlastn împotriva genomilor liliecilor cu pragul de limită de similitudine al valorii e = 1e −5. Cu proteina umană setată ca referință, am găsit cel mai bun rezultat pentru fiecare proteină umană din cei doi genomi de lilieci utilizând criteriile conform cărora mai mult de 30% din secvența aliniată a arătat o identitate peste 30%. Am folosit algoritmul GeneWise (Birney și colab. 2004) (cu parametrii -genesf -for -quiet) pentru a defini structura detaliată exon-intron a fiecărei gene gen liliac și pentru a identifica potențialii pseudogeni dintre genele vizuale liliac.

Inițial, am vizat examinarea ortologilor de lilieci pentru pseudogene legate de vedere identificate la șobolanul alunecos gol Heterocephalus glaber (Kim și colab. 2011), o specie cu viziune slabă adaptată vieții în întuneric. Genele care conțin schimbări de cadru sau codoni de oprire prematură au fost considerate candidați. Am filtrat după cum urmează: (1) Pentru a evita modificările raportate ale cadrelor sau codonii de oprire prematură care au fost cauzate de o defecțiune a algoritmului GeneWise, am aliniat toate proteinele umane la locurile lor corespunzătoare din genomul uman și genele cu schimbări de cadru sau oprirea prematură codonii din aliniamentele de la om la om au fost filtrate (2) Folosind rezultatele alinierii de la om la om de la GeneWise, au fost filtrate pseudogene candidate cu erori evidente de îmbinare în apropierea schimbărilor de cadru sau codoni de oprire prematură (3) Pseudogene candidate cu un numărul redus de citiri care acoperă deplasarea cadrelor sau site-urile codonului de oprire prematură au fost considerate erori de asamblare. Genele cu un număr considerabil de citiri datorate variației genotipului la aceste situri au fost tratate ca heterozigoți și filtrate.

Analiza CUB la nivel de genom fără hipoteză

Au fost propuse o serie de statistici CUB și există un consens mic cu privire la abordarea optimă. O revizuire foarte recentă care prezintă argumentele pro și contra unor abordări de cuantificare CUB aplicate în mod obișnuit poate fi găsită aici în Behura și Severson (2013). Statistica noastră CUB folosește conceptul de entropie, care estimează regularitățile datelor pe baza unei combinații de ordine și proporție. Puterea sa constă în aplicabilitatea și sensibilitatea sa largă. Deoarece nu este influențat în mod sistematic de lungimea genelor și ține cont de compoziția aminoacizilor, poate fi aplicat destul de mult în interiorul și între genomi. Cu toate acestea, nu ține cont de conținutul GC de fundal și nici nu determină dacă părtinirea este spre codoni preferați sau nepreferiți. Din acest motiv, conținutul GC de fundal și o analiză mai detaliată a utilizării codonilor trebuie să fie evaluate retrospectiv de la caz la caz (adică, la acele gene ale căror proprietăți entropice au fost determinate ca fiind extreme și, prin urmare, demne de o investigație mai profundă).

Pentru a rezuma, am determinat întinderea CUB pentru fiecare secvență de codificare utilizând o statistică bazată pe teoria informației, așa cum a fost descris anterior (Hudson și colab. 2011). Pentru fiecare secvență de codare observată, am calculat entropia acidului nucleic și l-am comparat cu entropia medie a 20 de secvențe aleatorii. Secvențele aleatorii au fost generate într-un mod în care ar codifica aceeași secvență de aminoacizi, dar unde codonii au fost selectați la întâmplare. Deoarece entropia oferă o măsură a regularității datelor, entropia diferențială dintre secvența observată și aleatoare corespunde cu gradul de regularitate atribuit CUB.

Mai întâi am clasat toate secvențele de codificare în funcție de amploarea CUB pe baza genomului. Pentru a stabili gradul de analiză funcțională a îmbogățirii listelor clasificate Myotis și Pteropus au fost supuși instrumentului web GOrilla (Eden și colab. 2009). GOrilla folosește statistici hipergeometrice pentru a determina dacă anumite procese biologice sunt îmbogățite în cadrul oricărui set de gene de intrare clasificat. Am folosit opțiunea de listare clasificată unică pe baza adnotării funcționale umane și am importat ID-uri SWISSPROT, care este unul dintre identificatorii de intrare preferați desemnați pentru analiza GOrilla. De asemenea, am comparat părtinirea relativă a codonilor în ortologii în comun între cele două specii (dintre care am identificat 6748). Această analiză secundară ajută la identificarea genelor care ar putea să nu fie extreme pe baza genomului, dar care încă posedă proprietăți semnificativ diferite între cele două specii.

Deoarece îmbogățirea GOrilla se bazează pe adnotarea incompletă a proceselor funcționale și poate trece cu vederea conexiunile funcționale chiar și în gene bine adnotate, am folosit îmbogățirea superioară ca punct de interes pentru curarea manuală ulterioară, bazată pe extragerea bazei de date a literaturii PubMed. Un subset de gene CUB anterioare au fost evaluate retrospectiv pentru conținutul regional de GC. Aceasta a fost calculată din gena însăși, plus 10 kb în amonte de codonul de pornire și 10 kb în aval de codonul de oprire.

Validare independentă a CUB divergent:

Statistica de entropie diferențială este una dintre multele modalități de măsurare a CUB. Într-un efort de a furniza o linie independentă de dovezi pentru CUB diferențial la cele două specii de lilieci și îmbogățirea funcțională diferențială ulterioară, am rulat, de asemenea, numărul efectiv publicat anterior de codoni (ENC) (Wright 1990) prin intermediul site-ului web CodonW: http: // codonw.sourceforge.net/. Potrivit lui Behura și Severson (2013), ENC este utilizat pentru a măsura cât de departe se îndepărtează utilizarea codonilor unei gene de utilizarea egală a codonilor sinonimi. Valorile CE variază de la 20 (polarizarea extremă a codonilor atunci când se utilizează un codon exclusiv pentru fiecare aminoacid) până la 61 (în cazurile de lipsă a polarizării codonilor în care codonii sinonimi sunt la fel de susceptibili să codeze aminoacidul).

CUB verificarea calității genelor anterioare:

Deoarece este posibil ca lacunele din datele asamblării genomului să poată duce la artefacte cu secvențele CD-urilor, datele secvenței CD-urilor pentru toate M. davidii Genele anterioare CUB au fost confirmate prin comparație cu secvențele de CD-uri de la alte specii. Am folosit traducerea BLAST pentru a identifica potențiale probleme de asamblare, inclusiv lacune în secvențele noastre de CD-uri. Liliecii M. brandtii și M. lucifugus plus alte specii de mamifere disponibile în Genbank au fost utilizate pentru alinierea secvenței. În cazul unor exoni potențiali lipsă, ne-am referit la M. davidii asamblare genomică pentru a confirma calitatea datelor secvenței genomice.

Analiza CUB la două specii suplimentare de lilieci: M. lucifugus și P. vampyrus:

Pentru a detecta dovezi comparative pentru CUB în aparatul senzorial la liliecii ecolocați, am calculat CUB într-un ecolocator suplimentar (M. lucifugus) și nonecolocator (P. vampyrus). Ansamblurile actuale ale genomului din baza de date Ensemble pentru P. vampyrus (pteVam1) și M. lucifugus (Myoluc2.0) au fost utilizate pentru această analiză. Pentru aceste două specii de comparație, am obținut date de secvență de codare de la Biomart, obținând 14.141 cd-uri adnotate pentru M. lucifugus și 8, 845 pentru P. vampyrus. CUB a fost estimat utilizând statistica entropiei așa cum a fost descris anterior.


Există vreo problemă cu utilizarea unui singur codon stop cu un singur CDS în procariote? - Biologie

Numărul de brevet american 10.724.033 [Numărul cererii 15 / 671.447] a fost acordat de oficiul de brevete în data de 28.07.2020 pentru afișarea suprafeței celulare a izoformelor polipeptidice prin citirea codonului stop. Această acordare de brevete este în prezent atribuită către Novartis AG. Beneficiarul enumerat pentru acest brevet este NOVARTIS AG. Invenția este creditată lui Thomas Jostock, Hans-Peter Knopf, Audrey Nommay, Burkhard Wilms.

Brevetul SUA 10,724,033
Jostock și colab. 28 iulie 2020
Afișarea suprafeței celulare a izoformelor polipeptidice prin citirea codonului stop

Este descrisă o metodă pentru selectarea celulelor gazdă de mamifere care exprimă o polipeptidă de interes cu randament ridicat. Celulele gazdă cuprind o casetă de expresie cuprinzând cel puțin o primă polinucleotidă care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire cu etanșare care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină. Celulele gazdă sunt cultivate pentru a permite exprimarea polipeptidei de interes astfel încât cel puțin o porțiune din polipeptida de interes este exprimată ca o polipeptidă de fuziune care este afișată pe suprafața celulei. Celulele sunt selectate pe baza prezenței sau cantității de polipeptidă de fuziune afișată. De asemenea, sunt furnizate metode pentru producerea unei polipeptide care utilizează o selecție respectivă pentru a identifica celulele gazdă cu expresie ridicată.

1. O metodă pentru selectarea a cel puțin unei celule gazdă eucariote care exprimă un nivel dorit al unei polipeptide de interes, cuprinzând: a) furnizarea unei pluralități de celule gazdă eucariote care cuprinde un acid nucleic heterolog care cuprinde cel puțin o casetă (Cas-POI) cuprinzând la cel puțin un prim polinucleotid (Pn-POI) care codifică polipeptidul de interes, cel puțin un codon de oprire scurgeri în aval de primul polinucleotid și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină b) cultivarea celulelor gazdă eucariote permite exprimarea polipeptidei de interes astfel încât cel puțin o porțiune a polipeptidei de interes să fie exprimată ca o polipeptidă de fuziune care cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei, în care polipeptida de fuziune menționată este afișată pe suprafața celulei gazdă menționate c) selectând cel puțin una celulă gazdă eucariotă bazată pe prezența sau cantitatea de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei.

2. O metodă pentru producerea unei polipeptide de interes cu randament ridicat, metoda cuprinzând: a) furnizarea unei pluralități de celule gazdă eucariote cuprinzând un acid nucleic heterolog cuprinzând cel puțin o casetă (Cas-POI) cuprinzând o primă polinucleotidă (Pn-POI ) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire cu scurgeri care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină b) cultivarea celulelor gazdă eucariote pentru a permite exprimarea polipeptidei de interes că cel puțin o porțiune din polipeptida de interes este exprimată ca o polipeptidă de fuziune care cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei, în care respectiva polipeptidă de fuziune este afișată pe suprafața celulei gazdă menționate c) selectând cel puțin o celulă gazdă eucariotă pe baza prezenței sau cantitatea de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei d) cultivarea celulei gazdă eucariote selectate în mediu de cultură în condiții care permit exprimarea polipeptidei de interes.

3. Metodă conform revendicării 1, în care expresia casetei (Cas-POI) are ca rezultat un transcript care cuprinde cel puțin o primă polinucleotidă, în care traducerea primei polinucleotide menționate are ca rezultat polipeptida de interes cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de numitul prima polinucleotidă o a doua polinucleotidă în aval de codonul de oprire menționat, în care traducerea celui de-al doilea polinucleotid are ca rezultat ancorarea transmembranară a imunoglobulinei, în care cel puțin o porțiune a transcriptului este tradusă într-o polipeptidă de fuziune care cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei prin citirea translațională a cel puțin un codon stop.

4. Metodă conform revendicării 1, în care ancora transmembranară a imunoglobulinei este selectată din grupul constând din a) o ancoră transmembranară IgA, IgE, IgM, IgG și / sau IgD, b) o ancoră transmembranară a imunoglobulinei care cuprinde un domeniu citoplasmatic și c) o ancoră transmembranară de imunoglobulină care cuprinde o secvență așa cum se arată în SECV ID NR: 2, SECV ID NR: 3, SECV ID NR: 4, SECV ID NR: 5, SECV ID NR: 6 și / sau SECV ID NR: 7.

5. Metodă conform revendicării 1, în care etapa c) cuprinde contactarea multitudinii de celule gazdă eucariote cu un compus de detecție care leagă polipeptida de fuziune și selectarea a cel puțin unei celule gazdă eucariote pe baza prezenței sau cantității de compus de detecție legat.

6. Metodă conform revendicării 3 în care citirea translațională a codonului de oprire are ca rezultat aproximativ până la 50%, până la 25%, până la 15%, până la 10%, până la 5%, până la 2,5%, până la 1,5%, până la 1% sau până la 0,5% din polipeptidă de fuziune.

7. Metodă conform revendicării 1, în care sunt efectuate două sau mai multe cicluri de selecție, în care în fiecare ciclu de selecție este selectată cel puțin o celulă gazdă eucariotă pe baza prezenței sau cantității de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei.

8. Metodă conform revendicării 5, în care legarea compusului de detecție la suprafața celulei gazdă eucariote este detectată prin citometrie în flux.

9. Metodă conform revendicării 2, în care expresia casetei (Cas POI) are ca rezultat un transcript care cuprinde cel puțin o primă polinucleotidă, în care traducerea primei polinucleotide menționate are ca rezultat polipeptida de interes cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de menționatul prima polinucleotidă o a doua polinucleotidă în aval de codonul de oprire menționat, în care traducerea celui de-al doilea polinucleotid are ca rezultat ancorarea transmembranară a imunoglobulinei, în care cel puțin o porțiune a transcriptului este tradusă într-o polipeptidă de fuziune care cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia prin translație citirea codonului cel puțin un stop.

10. Metodă conform revendicării 2, în care ancora transmembranară a imunoglobulinei este selectată din grupul constând dintr-o) o ancoră transmembranară IgA, IgE, IgM, IgG și / sau IgD, b) o ancoră transmembranară a imunoglobulinei care cuprinde un domeniu citoplasmatic și c) o ancoră transmembranară de imunoglobulină care cuprinde o secvență așa cum se arată în SECV ID NR: 2, SECV ID NR: 3, SECV ID NR: 4, SECV ID NR: 5, SECV ID NR: 6 și / sau SECV ID NR: 7.

11. Metodă conform revendicării 2, în care etapa c) cuprinde contactarea multitudinii de celule gazdă eucariote cu un compus de detecție care leagă polipeptida de fuziune și selectarea a cel puțin unei celule gazdă eucariote pe baza prezenței sau cantității de compus de detecție legat.

12. Metodă conform revendicării 9, în care citirea translațională a codonului de oprire are ca rezultat aproximativ până la 50%, până la 25%, până la 15%, până la 10%, până la 5%, până la 2,5% , până la 1,5%, până la 1% sau până la 0,5% din polipeptidă de fuziune.

13. Metodă conform revendicării 2, în care sunt efectuate două sau mai multe cicluri de selecție, în care în fiecare ciclu de selecție este selectată cel puțin o celulă gazdă eucariotă pe baza prezenței sau cantității de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei.

14. Metodă conform revendicării 11, în care legarea compusului de detectare la suprafața celulei gazdă eucariote este detectată prin citometrie în flux.

15. Un acid nucleic vector adecvat pentru exprimarea a cel puțin unei polipeptide de interes într-o celulă gazdă eucariotă, cuprinzând a) cel puțin o casetă (Cas-POI) cuprinzând un loc de inserție pentru o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și / sau o primă polinucleotidă care codifică o polipeptidă de interes, b) cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de locul de inserție menționat și / sau în aval de primul polinucleotid și c) o a doua polinucleotidă în aval de codonul de oprire care codifică o transmembrana de imunoglobulină ancoră.

16. Vector acid nucleic conform revendicării 15, cuprinzând cel puțin una dintre următoarele caracteristici: o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes din casetă (Cas-POI) o casetă de expresie (MSM) cuprinzând un mamifer genă marker selectabilă și / sau o casetă de expresie (MASM) cuprinzând o genă marker selectabilă amplificabilă la mamifere.

17.15. Acid nucleic vector conform revendicării 15 pentru exprimarea a cel puțin unei molecule de imunoglobulină sau a unei variante funcționale a acesteia, cuprinzând o casetă de expresie (Exp-POI) cuprinzând o primă polinucleotidă care codifică lanțul greu al unei molecule de imunoglobulină sau un fragment funcțional al acesteia, cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină și o casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') care cuprinde o polinucleotidă care codifică lanțul ușor corespunzător al unei molecule de imunoglobulină sau o funcțională fragment al acestuia.

18. Metodă pentru producerea unui acid nucleic vector conform revendicării 15, în care metoda cuprinde asamblarea a cel puțin unei casete (Cas-POI) într-un vector astfel încât caseta menționată (Cas-POI) cuprinde o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire cu scurgeri în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină.

19. O celulă gazdă eucariotă izolată cuprinzând o casetă (Cas-POI) cuprinzând cel puțin o polinucleotidă heterologă care codifică o polipeptidă de interes, cel puțin un codon stop care se scurge în aval de polinucleotida heterologă menționată și o polinucleotidă în aval de codonul stop care codifică o imunoglobulină transmembrana. ancoră în care respectiva celulă gazdă eucariotă este obținută opțional prin metoda conform revendicării 1.

20. O celulă gazdă eucariotă izolată cuprinzând o casetă (Cas-POI) cuprinzând cel puțin o polinucleotidă heterologă care codifică o polipeptidă de interes, cel puțin un codon stop care se scurge în aval de polinucleotida heterologă menționată și o polinucleotidă în aval de codonul stop care codifică o imunoglobulină transmembrana. ancoră în care respectiva celulă gazdă eucariotă cuprinde un vector acid nucleic conform revendicării 15.

21. Metodă pentru producerea unei polipeptide de interes, respectiva metodă cuprinzând cultivarea unei celule gazdă eucariote conform revendicării 19.

22. O metodă pentru producerea unei polipeptide de interes, în care o celulă gazdă eucariotă conform revendicării 20 este cultivată pentru exprimarea polipeptidei de interes.

23. Metodă pentru producerea unei polipeptide de interes conform revendicării 2, cuprinzând suplimentar cel puțin o etapă selectată dintre etapele: obținerea polipeptidei din cultura celulară obținerea polipeptidei din mediul de cultură în care polipeptida este secretată în mediul de cultură perturbând celulele gazdă eucariote pentru a obține polipeptida exprimată izolând polipeptida exprimată purificând polipeptida exprimată și prelucrând în continuare sau modificând polipeptida exprimată.

24. Metodă pentru producerea unei polipeptide de interes conform revendicării 21, cuprinzând suplimentar cel puțin o etapă selectată dintre etapele: obținerea polipeptidei din cultura celulară obținerea polipeptidei din mediul de cultură în care polipeptida este secretată în mediul de cultură perturbând celulele gazdă eucariote pentru a obține polipeptida exprimată izolând polipeptida exprimată purificând polipeptida exprimată și prelucrând în continuare sau modificând polipeptida exprimată. Descriere

Prezenta invenție se referă la o metodă de selectare a celulelor gazdă de mamifere cu producție mare, precum și la vectori și celule gazdă adecvate pentru utilizare într-o metodă respectivă. Mai mult, prezenta invenție se referă la o metodă pentru producerea eficientă a polipeptidelor cu randament ridicat.

Selecția liniilor celulare de mare producție este un prim pas important în dezvoltarea oricărui bio-proces și este una dintre cele mai mari provocări în biotehnologie. O problemă este că astfel de clone cu producție ridicată sunt rare, își pot cheltui o mare parte din energie pe producția de polipeptide și, prin urmare, au rate de creștere reduse. Acest lucru duce la creșterea excesivă și la celule care nu produc sau sunt scăzute. Cu toate acestea, în producția de polipeptide este de dorit să se obțină linii celulare care produc polipeptida de interes cu un randament ridicat. În mod tradițional, liniile celulare cu producție mare au fost selectate prin runde de clonare prin diluție limitativă, urmate de analiza produsului. Cu toate acestea, această rută tradițională are mai multe dezavantaje, deoarece este atât costisitoare, cât și costisitoare. Dincolo de aceasta, întregul proces consumă mult timp și poate dura câteva luni până la finalizare și chiar și atunci nu există nicio garanție că linia de celule clonice va fi stabilă și atât de utilă pentru bioprocesarea industrială. Mai mult, selecția celor mai mari producători poate fi compromisă prin limitări practice ale numărului de celule care pot fi verificate, reducând astfel eficiența selecției celulelor cu abundență scăzută și productivitate ridicată.

Prin urmare, s-au depus multe eforturi pentru a furniza metode alternative pentru selectarea clonelor cu producție ridicată. De exemplu, citometria în flux a facilitat monitorizarea productivității și izolarea celulelor cu caracteristici specifice. Avantajele importante ale citometriei în flux includ capacitatea de a selecta rapid un număr mare de celule, cu capacitatea de a distinge subpopulațiile celulare și capacitatea de a selecta în mod eficient celulele cu abundență redusă, demonstrând caracteristicile dorite. Majoritatea abordărilor tradiționale pentru selectarea celulelor cu productivitate ridicată utilizând citometria în flux au fost stabilite pentru selectarea celulelor hibridom.

O abordare se bazează pe conținutul de anticorpi ai suprafeței celulare a celulelor hibridom care prezintă o cantitate crescută de anticorpi de la suprafața celulei care pot fi identificați și recuperați prin utilizarea anticorpilor marcați cu fluorescență. Cu toate acestea, o corelație cantitativă nu a fost documentată pe scară largă.

Au fost dezvoltate abordări suplimentare pentru a selecta celulele bazate pe anticorp secretat ca strategie alternativă pentru a ocoli unele dintre limitările selecției anticorpilor de suprafață a celulelor. O abordare aplică o matrice de afinitate, cealaltă folosește o tehnologie de microdroplet cu gel. Prima metodă se bazează pe crearea unei matrice de afinitate artificială, specifică pentru produsul secretat de interes. Moleculele secretate se leagă de matricea de afinitate de pe suprafața celulei secretoare și sunt marcate ulterior cu reactivi fluorescenți specifici pentru analiza citometrică în flux și sortarea celulelor.

Incapsularea microdropletelor implică încapsularea completă a celulelor unice în mărgele de agaroză. Aceste margele conțin anticorpi de captare specifici și astfel captează simultan produs secretat și previn alimentarea încrucișată a produsului între celule.

Alte metode se bazează pe coexpresia genelor marker, care sunt detectabile prin citometrie în flux. Dezavantajele sunt o legătură slabă a expresiei genei marker (de exemplu, proteina de fluorescență verde) cu expresia genei de interes. Mai mult, expresia genei marker costă celule energie suplimentară și ar putea induce stres.

O metodă alternativă se bazează pe o coexpresie inductibilă a proteinelor de captare legate de membrană. Proteinele de captare legate de membrană sunt ancorate pe suprafața celulei și captează polipeptida secretată imediat ce sunt eliberate din celule. Aceste molecule capturate pot fi apoi detectate pe suprafața celulei. Cu toate acestea, sunt necesare celule gazdă modificate genetic și, de asemenea, ar putea apărea hrănirea încrucișată a celulelor care nu produc.

De asemenea, produsele secretate asociate tranzitoriu cu membrana celulară au fost utilizate pentru a selecta celulele producătoare. Cu toate acestea, are loc hrănirea încrucișată a celulelor neproductive și această metodă are o activitate de fond destul de mare. Mai mult, s-a constatat că nu este posibil să se efectueze mai multe runde de îmbogățire și selecție.

Prin urmare, este nevoie de dezvoltarea unei tehnologii pentru selectarea celulelor gazdă de mare producție. Astfel, obiectivul prezentei invenții este de a furniza o metodă pentru detectarea celulelor gazdă recombinante cu producție ridicată într-o populație mare de celule care nu produc, scăzute și / sau medii și să furnizeze o metodă pentru producerea polipeptidelor cu un randament ridicat. .

Prezenta invenție rezolvă această problemă prin furnizarea unei metode pentru îmbogățirea sau selectarea a cel puțin unei celule gazdă eucariote care exprimă un nivel dorit al unei polipeptide de interes, cuprinzând: a) furnizarea unei pluralități de celule gazdă eucariote cuprinzând un acid nucleic heterolog care cuprinde cel puțin o casetă (Cas-POI) cuprinzând cel puțin o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină varianta funcțională a acesteia b) cultivarea celulelor gazdă eucariote pentru a permite exprimarea polipeptidei de interes astfel încât cel puțin o porțiune a polipeptidei de interes să fie exprimată ca o polipeptidă de fuziune care cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, în care polipeptida de fuziune menționată este afișat pe suprafața celulei gazdă menționate c) selectând cel puțin una celulă gazdă eucariotă bazată pe prezența sau cantitatea de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei.

Un "acid nucleic heterolog" se referă la o secvență polinucleotidică care a fost introdusă într-o celulă gazdă de ex. prin utilizarea tehnicilor recombinante precum transfecția. Celula gazdă poate cuprinde sau nu o polinucleotidă endogenă corespunzătoare, respectiv fiind identică cu polinucleotida heterologă. Cu toate acestea, în special termenul "acid nucleic heterolog" se referă la o polinucleotidă străină introdusă în celula gazdă. Introducerea poate fi realizată de ex. prin transfectarea unui vector adecvat care se poate integra în genomul celulei gazdă (transfecție stabilă). În cazul în care acidul nucleic heterolog nu este inserat în genom, acidul nucleic heterolog poate fi pierdut în etapa ulterioară, de ex. când celulele suferă mitoză (transfecție tranzitorie). Ambele variante sunt adecvate, cu toate acestea, este preferată transfecția stabilă. Vectorii potriviți pot fi, de asemenea, menținuți în celula gazdă fără a se integra în genom, de ex. prin replicare episomală. Cu toate acestea, sunt cunoscute și alte tehnici în stadiul tehnicii pentru introducerea unui acid nucleic heterolog într-o celulă gazdă, care sunt, de asemenea, descrise în detaliu mai jos.

O "polinucleotidă" este un polimer de nucleotide care sunt de obicei legate de la o dezoxiriboză sau riboză la alta și se referă la ADN, precum și la ARN, în funcție de context. Termenul "polinucleotidă" nu cuprinde restricții de dimensiune.

O "casetă" descrie un grup de elemente polinucleotidice, legate în mod operabil între ele, cuprinzând de ex. o polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, o polinucleotidă care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau o variantă funcțională a acesteia, o polinucleotidă care codifică un marker, elemente de reglare și / sau alte polinucleotide descrise aici. O "casetă" așa cum este utilizată aici cuprinde cel puțin două elemente polinucleotidice. O casetă poate cuprinde sau nu elemente de reglare ca polinucleotide, cum ar fi de ex. un promotor, un amplificator și / sau un site polyA. Conform unei variante de realizare, caseta este o „casetă de expresie” potrivită pentru exprimarea unei polipeptide. O casetă de expresie cuprinde cel puțin un element de inițiere a transcrierii, de ex. un promotor, ca element de reglementare legat operabil de o regiune de codificare, de ex. o polinucleotidă (Pn-POI) care codifică o polipeptidă de interes, care este în consecință sub controlul transcripțional al elementului de inițiere a transcripției menționat. O casetă de expresie poate cuprinde, de asemenea, elemente de reglementare adecvate pentru terminarea transcripției, cum ar fi de ex. un site polyA.

"Caseta (Cas-POI)" cuprinde cel puțin o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o imunoglobulină transmembrana. ancoră sau o variantă funcțională a acesteia. De preferință, caseta (Cas-POI) este o casetă de expresie (Exp-POI).

"Caseta de expresie (Exp-POI)" definește o casetă de expresie adecvată pentru exprimarea unui polipeptid de interes (POI). Ca casetă de expresie cuprinde cel puțin un element de inițiere a transcrierii. Această casetă de expresie (Exp-POI) cuprinde fie polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes ca parte a regiunii de codificare, fie cuprinde un site adecvat pentru inserarea unei polinucleotide (Pn-POI) respective care codifică polipeptida de interes - în funcție de varianta utilizată a prezentei invenții, care sunt descrise în detaliu mai jos.

Concepția generală a prezentei invenții este de a plasa un codon de oprire între polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și polinucleotida care codifică ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia care permite ancorarea polipeptidei la suprafața celulei. Termenul "ancora transmembranară a imunoglobulinei" și "domeniul transmembranar al imunoglobulinei" sunt folosiți ca sinonime aici. Codonul de oprire constituie sau face parte dintr-un semnal de terminare a traducerii și poate fi codonul de oprire natural al polinucleotidei care codifică polinucleotida de interes și, astfel, codonul de oprire care este utilizat în mod natural pentru a termina traducerea. Proiectarea casetei (Cas-POI) rezultă la exprimarea în generarea a două polipeptide diferite atunci când prima și a doua polinucleotide sunt transcrise într-un transcript, care este procesat opțional și apoi tradus. Conform unei variante de traducere, traducerea transcrierii este întreruptă la (cel puțin un) codon de oprire situat între polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și polinucleotida care codifică o ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia. Terminarea traducerii la codonul de oprire menționat are ca rezultat un produs polipeptidic - care nu cuprinde ancora transmembranară. Conform celei de-a doua variante de traducere, traducerea se citește prin cel puțin un codon de oprire, redând astfel un produs de traducere cuprinzând polipeptida de interes și fuzionat la acesta ancora imunoglobulină transmembranară sau o variantă funcțională a acesteia care este capabilă să ancoreze polipeptida de fuziune la celulă membrană. O astfel de polipeptidă de fuziune este transferată și fixată pe suprafața celulei prin intermediul ancorei transmembranare a imunoglobulinei sau a fragmentului funcțional al acesteia. O caracteristică importantă a prezentei invenții este că, la expresia casetei (Cas-POI), terminarea traducerii la codonul de oprire a cadrului este într-o anumită măsură „scurgeri”, deoarece are loc o citire translațională, făcând astfel descris polipeptida de fuziune. Deoarece această citire translațională are loc la o proporție definită - care poate fi influențată și de alegerea și numărul codonului (codurilor) de oprire și de regiunile adiacente codonului de oprire, în special nucleotida care urmează codonului de oprire, precum și de condițiile de cultură - nivelul polipeptidei de fuziune legată la suprafață se corelează direct cu nivelul de expresie al polipeptidei de interes. Cantitatea de polipeptidă de fuziune prezentă pe suprafața celulei este astfel într-o anumită măsură proporțională cu nivelul de expresie generală a polipeptidei de interes de către celula respectivă, deoarece există o legătură puternică între expresia de suprafață a polipeptidei de fuziune și productivitatea celula gazdă în exprimarea polipeptidei de interes. Nivelul polipeptidei de fuziune legată de suprafață este, prin urmare, reprezentativ pentru productivitatea globală a celulei individuale și permite selectarea a cel puțin unei celule gazdă eucariote pe baza prezenței sau cantității de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei. Un ciclu de selecție cuprinzând pașii a), b) și c) permite identificarea și izolarea eficientă și reproductibilă a celulelor gazdă eucariote de mare producție.

Metode adecvate de detecție / selecție, cum ar fi imunocolorarea, citometria în flux, microscopia fluorescentă, MACS, metodele bazate pe afinitate, cum ar fi margele magnetice și tehnici similare, permit identificarea, selectarea și / sau îmbogățirea celulelor cu producție ridicată pe baza prezenței și nivelului de fuziune legată la suprafață. polipeptidă. Prin urmare, prezenta invenție conduce la o reducere drastică a eforturilor de screening, permițând selecția și, de asemenea, îmbogățirea a cel puțin unei celule cu producție ridicată sau a unei populații de celule cu producție ridicată dintr-o populație care nu produce, scăzut și / sau mediu celule. De asemenea, este posibil să se efectueze mai multe runde de selecție și / sau îmbogățire, de preferință două sau trei. De exemplu. o celulă gazdă eucariotă sau o populație de celule gazdă care exprimă suficient sau chiar ridicat poate fi selectată utilizând un compus de detecție cum ar fi de ex. un anticorp sau fragment al acestuia recunoscând polipeptida de fuziune ancorată pe membrană. Respectivul compus de detectare poate purta o etichetă și poate fi astfel detectat prin metode comune de detectare.

Conform învățăturilor prezentei invenții, cel puțin un fragment dintr-o ancoră / domeniu transmembranar de imunoglobulină este utilizat pentru a ancora polipeptida de interes pe suprafața celulei. În cazul în care se folosește un fragment în locul unei ancore transmembranare de imunoglobulină de lungime completă, fragmentul respectiv trebuie să permită ancorarea polipeptidei de fuziune pe suprafața celulei. Ancora / domeniul transmembranar al imunoglobulinei sau fragmentul funcțional al acestuia este încorporat în și astfel ancorat strâns la membrana celulară. Această ancorare strânsă distinge ancorele prezentei invenții de ex. o ancoră GPI. Ancora transmembranară a imunoglobulinei utilizată conform prezentei invenții asigură o ancorare foarte robustă și, astfel, durabilă a polipeptidei de fuziune pe suprafața celulei care nu este sau cel puțin mai puțin susceptibilă la vărsarea proteolitică. Acest lucru este confirmat de analiza produsului efectuată după purificare. În analiza de spectrometrie de masă efectuată nu se găsește nicio ancoră transmembranară a imunoglobulinei (sau fragment de ancoră transmembranară a imunoglobulinei) care conține specii de lanț greu. Acesta este un avantaj important față de stadiul tehnicii, deoarece este redus și riscul contaminărilor polipeptidei solubile secretate de interes prin polipeptidele de fuziune acoperite. Mai mult, în conformitate cu caracteristicile analizate ale polipeptidelor exprimate de interes, de asemenea, nu se găsesc diferențe semnificative față de material din clonele / sistemele de expresie convenționale.

Celulele obținute prin metoda prezentei invenții au un nivel mediu de expresie mai mare decât celulele donate prin diluare limitată sau metode similare. Ei au, de asemenea, un nivel mediu de expresie mai mare decât celulele donate, de exemplu, prin citometrie în flux după transfecția unui vector standard care nu cuprinde domeniul / ancora specific transmembranar conform prezentei invenții.

Celulele care sunt identificate ca urmare a procedurii de screening / selecție conform prezentei invenții vor fi în general izolate și pot fi îmbogățite din celule neselectate din populația de celule inițiale. Ele pot fi izolate și cultivate ca celule individuale. Ele pot fi, de asemenea, utilizate în una sau mai multe runde suplimentare de selecție, opțional pentru analize calitative sau cantitative suplimentare, sau pot fi utilizate e. g. în dezvoltarea unei linii celulare pentru producerea de proteine. Conform unei variante, o populație îmbogățită de celule cu producție ridicată selectate așa cum este descris mai sus este utilizată direct ca populație pentru producerea polipeptidei de interes cu randament ridicat.

În mod avantajos, comportamentul de creștere observat și productivitatea clonelor care coexprimă varianta transmembranară a polipeptidei de interes, în special anticorpii și clonele derivate dintr-o configurație vectorială clasică care nu coexprimă varianta transmembranară a polipeptidei de interes par a fi aceeași . Mai mult, stabilitatea clonală a producției pare a fi la fel de bună.

De asemenea, este furnizată o metodă pentru producerea unei polipeptide de interes cu randament ridicat, metoda cuprinzând: a) furnizarea unei pluralități de celule gazdă eucariote care cuprinde un acid nucleic heterolog cuprinzând cel puțin o casetă (Cas-POI) cuprinzând o primă polinucleotidă (Pn- POI) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau o variantă funcțională a acesteia b) cultivarea celulelor gazdă eucariote pentru a permite expresia polipeptidă de interes astfel încât cel puțin o porțiune din polipeptida de interes este exprimată ca o polipeptidă de fuziune care cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, în care polipeptida de fuziune menționată este afișată pe suprafața celulei gazdă menționate c) selectând cel puțin o celulă gazdă eucariotă bazată pe prezența sau cantitatea de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei d) cultivarea celulei gazdă eucariote selectate în mediu de cultură în condiții care permit exprimarea polipeptidei de interes.

Polipeptida exprimată de interes poate fi obținută prin perturbarea celulelor gazdă. Polipeptidele pot fi de asemenea exprimate, de ex. secretat în mediul de cultură și poate fi obținut din acesta. De asemenea, sunt posibile combinații ale metodei respective. Astfel, polipeptidele pot fi produse și obținute / izolate eficient cu randament ridicat. Polipeptidele obținute pot fi, de asemenea, supuse unor etape ulterioare de prelucrare, cum ar fi de ex. etape de purificare și / sau modificare pentru a produce polipeptida de interes în calitatea dorită. Conform unei variante, respectivele celule gazdă sunt cultivate în condiții fără ser. Așa cum este subliniat mai sus, prin introducerea a cel puțin un codon de oprire între polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și a doua polinucleotidă care codifică o ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau un fragment funcțional al acesteia, este posibilă selectarea celulelor gazdă cu expresie ridicată. permițând producerea polipeptidei de interes cu randament ridicat. Etapa de selecție / îmbogățire a prezentei invenții este astfel o componentă integrală și importantă a procesului general de producție.

Utilizarea unei ancore transmembranare a imunoglobulinei sau a unui fragment funcțional al acesteia în conformitate cu învățăturile prezentei invenții este deosebit de avantajoasă atunci când se produc molecule de imunoglobulină, deoarece ancorele transmembranare ale imunoglobulinei sunt adecvate în mod natural pentru fixarea moleculelor de imunoglobulină pe suprafața celulei. În mod surprinzător, se constată că ancora transmembranară a imunoglobulinei poate fi utilizată la exprimarea moleculelor de imunoglobulină în celule gazdă de mamifere, cum ar fi celulele CHO. Acest lucru este surprinzător, întrucât stadiul tehnicii a presupus că coexprimarea lanțurilor receptorilor Ig alfa și Ig beta este necesară în celulele menționate pentru a realiza expresia suprafeței - și, prin urmare, ancorată a membranei celulare - a anticorpilor atunci când se utilizează transmembrana Ig domeniu ca ancoră. Acești co-receptori sunt de ex. exprimate în mod natural în celule B și derivați de celule B, cum ar fi celule hibridom sau mielom (de exemplu, celule SP2 / 0), dar nu se așteaptă să fie exprimate în celule non-B, cum ar fi celule CHO. Cu toate acestea, se constată că, în ciuda expresiei lipsă a co-receptorilor, afișarea de suprafață a polipeptidelor de interes și, în special, a moleculelor de imunoglobulină a funcționat bine pe derivații non-celulari B, cum ar fi celulele CHO, atunci când se utilizează ancora / domeniul transmembranar Ig. Prin urmare, conform unui exemplu de realizare este utilizată o celulă gazdă eucariotă care nu este o celulă B sau un derivat al celulei B. În consecință, se utilizează o celulă gazdă eucariotă, de preferință mamiferă, care nu exprimă în mod natural lanțurile receptorilor Ig alfa și Ig beta. Astfel, de preferință, celula gazdă este o celulă CHO. Mai mult, în conformitate cu o variantă de realizare, nu există coexpresie artificială a lanțului receptorilor Ig alfa și Ig beta în celula gazdă eucariotă menționată.

Orice ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau fragment funcțional al acesteia poate fi utilizată în conformitate cu învățăturile prezentei invenții. În special, ancora transmembranară a imunoglobulinei este selectată din grupul constând din ancore transmembranare ale imunoglobulinei derivate din IgM, IgA, IgE, IgG și / sau IgD sau variante funcționale ale acestora. De preferință, ancora transmembranară a imunoglobulinei este derivată din IgG1, IgG2, IgG3 și / sau IgG4. Deosebit de adecvată este o ancoră transmembranară de imunoglobulină IgG1 sau o variantă funcțională a acesteia. Exemple preferate de ancoră transmembranară derivată IgG sunt prezentate în SECV ID NR: 2 și SECV ID NR: 7.

Conform unei variante de realizare, ancora transmembranară a imunoglobulinei cuprinde un domeniu citoplasmatic. Este preferată utilizarea unei ancore transmembranare de imunoglobulină care cuprinde un domeniu citoplasmatic, deoarece asigură o ancorare foarte strânsă a polipeptidei de fuziune la suprafața celulei. Deosebit de adecvată este utilizarea unui domeniu citoplasmatic al imunoglobulinei. Conform unei variante, domeniul citoplasmatic al imunoglobulinei este derivat din IgG, IgA și IgE sau variante funcționale ale celor de mai sus. Aceste domenii citoplasmatice ale imunoglobulinei sunt mai mari decât cele derivate din IgD și IgM. SECV ID NR: 4 și SECV ID NR: 6 prezintă secvențe de aminoacizi adecvate ale domeniilor citoplasmatice derivate din IgG care pot fi utilizate ca domeniu citoplasmatic. Un exemplu preferat de ancoră transmembranară derivată din IgG care cuprinde un domeniu citoplasmatic derivat din IgG este prezentat în SECV ID NR: 3.

Astfel, ancora transmembranară a imunoglobulinei poate cuprinde o secvență polipeptidică așa cum se arată în SEQ ID NO: 2 și / sau SEQ ID NO: 3 sau variante funcționale, în special fragmente funcționale ale acestora, care permit ancorarea polipeptidei de fuziune la suprafața celula gazda.

Secvența nucleotidică a unei secțiuni a unei casete adecvate (Cas-POI) este prezentată ca SECV ID NR. 1. Detaliile prezentate cuprind un codon în cadru de oprire adecvat pentru citire translațională și o polinucleotidă care codifică o transmembrană imunoglobulină (Ig) deosebit de potrivită. domeniu care poate fi utilizat în conformitate cu învățăturile prezentei invenții. Codonul de oprire este situat în cadrul aval de polinucleotida care codifică polipeptida de interes și astfel secvența polinucleotidică care este transcrisă și procesată într-o secvență de aminoacizi. Secvența codificatoare se referă la secvența care este tradusă în aminoacizi. Astfel, codonul stop nu aparține secvenței de codificare și, în consecință, polinucleotidei care codifică polipeptida de interes. Codonul stop poate fi codonul stop natural al polinucleotidei care codifică polipeptida de interes. În acest caz, nu trebuie să existe codoni de oprire suplimentari, dar pot fi prezenți (a se vedea mai sus).

A doua polinucleotidă a casetei (Cas-POI) poate codifica o ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, care cuprinde o secvență polipeptidică prezentată ca SECV ID NR: 2. SECV ID NR. domeniu, care cuprinde, de asemenea, un domeniu citoplasmatic (singurul domeniu citoplasmatic este, de asemenea, prezentat ca SECV ID NR .: 4), aminoacizii putativi corespunzători codonului de oprire cu scurgeri și codonului suplimentar (WL) și o regiune de conectare (doar regiunea de legătură este afișat și ca SECV ID NR. 5). De asemenea, alți aminoacizi pot fi prezenți în poziția corespunzătoare codului de oprire cel puțin un și codonului adiacent, în funcție de codonul de oprire ales și / sau numărul de codoni de oprire și codonul (codoni) adiacent (i) utilizat (e). Deoarece acești aminoacizi sunt prezenți doar în polipeptida de fuziune, nu modifică secvența de aminoacizi a polipeptidei de interes. În consecință, un domeniu transmembranar de imunoglobulină cuprinzând o secvență polipeptidică așa cum se arată ca SECV ID NR. metodele descrise, precum și în vectorii descriși și celulele gazdă.

"O variantă funcțională" a unei ancore transmembranare de imunoglobulină conform prezentei invenții include ancore transmembranare de imunoglobulină având unul sau mai multe schimburi de secvențe de aminoacizi (de exemplu, deleții, substituții sau adaosuri) cu privire la secvența de aminoacizi a domeniului transmembranar natural al imunoglobulinei respective și fragmente funcționale ale celor de mai sus, care permit ancorarea transmembranară a polipeptidei de fuziune pe suprafața celulei.

Ca semnal de terminare a traducerii și astfel codon de oprire se poate utiliza oricare dintre cei trei codoni de oprire care semnalează terminarea sintezei proteinelor (TAA (UAA), TAG (UAG) și TGA (UGA) - de asemenea, în diferite contexte de tetranucleotide, vezi mai jos) între polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și polinucleotida care codifică ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, în funcție de nivelul dorit de suprimare (read-through). După cum este subliniat mai sus, codonul de oprire poate fi, de asemenea, codonul de oprire natural al polinucleotidei care codifică polipeptida de interes. De preferință, respectivul semnal de terminare a traducerii are o eficiență de terminare incompletă pentru a promova citirea translațională. "Scurgerea" codonului de oprire este, de asemenea, influențată de codonul (codoni) adiacent (i) și astfel în aval de cel puțin un codon de oprire, în special primul nucleotid poate influența citirea transcripțională (vezi mai jos).

Caseta (Cas-POI) trebuie transcrisă pentru a permite exprimarea polipeptidei de interes. Conform unei variante, caseta (Cas-POI) este deci o casetă de expresie. Conform unei alte variante de realizare, caseta (Cas-POI) este integrată în genomul celulei gazdă astfel încât caseta (Cas-POI) se află sub controlul transcripțional al unui element de inițiere a transcripției celulei gazdă, cum ar fi un promotor .

Transcrierea acidului nucleic cuprins în casetă (Cas-POI) are ca rezultat un transcris cuprinzând cel puțin o primă polinucleotidă, în care traducerea primei polinucleotide menționate are ca rezultat polipeptida de interes cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă menționată o a doua polinucleotidă în aval de codonul de oprire menționat, în care traducerea celui de-al doilea polinucleotid are ca rezultat ancorele transmembranare ale imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acestuia.

Cel puțin o porțiune a transcriptului este tradusă într-o polipeptidă de fuziune cuprinzând polipeptida de interes și ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia prin citire translațională a codonului de cel puțin un stop. Citirea translațională poate apărea în mod natural datorită alegerii codonului de oprire / proiectării semnalului de terminare a traducerii sau poate fi indusă prin adaptarea condițiilor de cultivare, de ex. prin utilizarea unui agent de suprimare a terminării (vezi mai jos).

Caseta (Cas-POI) utilizată în metoda invenției poate cuprinde doar un singur codon de oprire în amonte de secvența de codare a ancorei transmembranare a imunoglobulinei sau a fragmentului acesteia. Cu toate acestea, este de asemenea posibil să se utilizeze o serie de doi sau mai mulți codoni stop, e. g. doi sau trei sau patru codoni stop, care pot fi identici sau diferiți. De asemenea, contextul codonului stop, i. e. codonul de oprire trinucleotidic în sine, precum și nucleotida (codurile) respectiv codonul imediat în aval de codonul de oprire, are o influență asupra nivelurilor de citire. Cu toate acestea, trebuie să se asigure că există încă un anumit nivel de citire translațională pentru a permite producerea polipeptidei de fuziune care poate fi realizată în conformitate cu o variantă de realizare prin ajustarea condițiilor de cultură.

Transcriptul primar poate fi un pre-ARNm care cuprinde introni. Un pre-ARNm respectiv ar fi procesat (splicat) în ARNm. Alternativ, transcrierea poate duce direct la ARNm. În timpul traducerii transcrierii ARNm există de obicei un nivel natural de citire de fond a codonului (codurilor) de oprire sau un nivel de citire respectiv poate fi indus prin adaptarea condițiilor de cultură. Acest nivel de citire are ca rezultat o anumită proporție de polipeptide de fuziune care depinde, de asemenea, de numărul și natura codonului (codurilor) de oprire utilizat, codonului de oprire din aval și, în special, contextului tetranucleotidic al codonului (codurilor) de oprire și a culturii condiții. În consecință, o anumită proporție de polipeptidă de fuziune este produsă conform învățăturilor prezentei invenții, în ciuda prezenței codonului de oprire. Aceste polipeptide de fuziune cuprind ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, ancorând strâns polipeptidele de fuziune la suprafața celulei. Ca rezultat, polipeptidele de fuziune sunt afișate la suprafața celulelor gazdă și celulele care prezintă niveluri ridicate de polipeptide de fuziune recombinate ancorate pe membrană (indicând un nivel ridicat de polipeptidă secretată) pot fi selectate de ex. prin citometrie în flux, în special prin sortarea celulelor activate cu fluorescență (FACS) atunci când este contactat cu un compus de detectare etichetat corespunzător.

Semnalele adecvate de terminare a traducerii și astfel oprirea codonilor și oprirea setărilor codonilor cu eficiență incompletă a terminării traducerii pot fi proiectate așa cum este descris în stadiul tehnicii (a se vedea, de exemplu, Li și colab. 1993, Journal of Virology 67 (8), 5062-5067 McCughan și colab. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 5431-5435 Brown și colab. 1990, Nucleic Acids Research 18 (21) 6339-6345, încorporat aici ca referință).

Conform unei variante de realizare, se utilizează următoarea setare a codonului de oprire, codonul de oprire este afișat cu caractere aldine și subliniate: secvența nucleotidică TGACTA a setării de codare a opririi pe firul de codare și, astfel, la nivelul ADN, codonul de oprire este afișat cu caractere aldine și subliniate UGACUA secvența nucleotidică a setării codonului de oprire pe aminoacizii supuși WL la nivel de ARN corespunzător codonului de oprire și codonului adiacent dacă apare citirea translațională prezentată este astfel cel mai probabil produs de citire a polinucleotidei prezentat

Aminoacizii suplimentari care sunt încorporați în polipeptida de fuziune datorită citirii codonului de oprire pot fi de orice fel atâta timp cât proteina de fuziune este afișată pe suprafața celulei. Deoarece respectivii aminoacizi suplimentari sunt încorporați numai în polipeptida de fuziune, aminoacidul polipeptidei de interes rămâne neschimbat.

În plus față de posibila utilizare a mai multor codoni de oprire ca urmare a polinucleotidei (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, va fi în mod normal avantajoasă utilizarea mai multor codoni de oprire în aval de secvența care codifică ancora transmembranară a imunoglobulinei sau fragmentul funcțional al acesteia. Utilizarea mai multor codoni de oprire în această poziție, e. g. până la aproximativ zece codoni opriți, cum ar fi până la aproximativ șase sau opt codoni opriți, cum ar fi aproximativ doi, trei, patru sau cinci codoni opriți, vor asigura terminarea eficientă a traducerii.

Cantitatea de polipeptidă de fuziune prezentă și astfel detectabilă pe suprafața celulei crește de obicei în timpul sintezei polipeptidelor pe măsură ce polipeptida de fuziune rămâne ancorată la membrana celulară și se acumulează astfel pe suprafața celulei pe măsură ce expresia continuă. Conform unei variante de realizare, caseta (Cas-POI) este construită astfel încât oprirea citirii codonilor să aibă aproximativ .ltoreq.50%, .ltoreq.25%, .ltoreq.15%, .ltoreq.10%, .ltoreq .5%, .ltoreq.2.5%, .ltoreq.1.5%, .ltoreq.1% sau mai puțin de .ltoreq.0.5% polipeptidă de fuziune. Porțiunea rămasă este produsă ca formă polipeptidică care nu cuprinde ancora transmembranară a imunoglobulinei sau fragmentul funcțional al acesteia. Așa cum este descris, nivelul codonului stop citit poate fi influențat de alegerea și numărul codonului (codurilor) stop și de regiunile adiacente codonului stop, în special nucleotida care urmează codonului stop, precum și de condițiile de cultură utilizat în timpul pasului b). În funcție de factori precum nivelul natural de citire a fundalului pentru un codon de oprire dat într-o construcție dată, în unele cazuri poate fi de dorit să se utilizeze mai mult de un codon de oprire între polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și polinucleotida care codifică ancora transmembranară a imunoglobulinei pentru a reduce în continuare nivelurile de citire a fondului (vezi mai sus). Avantajul general al unui nivel de citire destul de scăzut este o severitate mai mare în procedura ulterioară de selecție / îmbogățire și sortare, care este realizată de preferință de FACS, ducând la o rezoluție mai bună a clonelor cu producție ridicată versus clone cu producție ultra ridicată. Dacă nivelurile de citire sunt prea mari, s-ar putea produce saturația capacității suprafeței celulare pentru polipeptidele legate de membrană, ceea ce poate preveni discriminarea nivelurilor de expresie, în special a nivelurilor ridicate de expresie. Prin urmare, un nivel de citire destul de scăzut este avantajos pentru a selecta clone de exprimare ultra ridicate. În consecință, de preferință numai 0,5%, 2,5% sau chiar 0,5% din transcriere este tradus într-o polipeptidă de fuziune.

Cu toate acestea, este posibil și creșterea nivelului de citire, dacă este necesar / dorit, de ex. prin utilizarea unui agent de suprimare a terminării în timpul cultivării. Utilizarea unui agent de suprimare a terminației în mediul de cultură în timpul etapei b) este o modalitate de a influența nivelul de codon stop citit de condițiile de cultură. Un agent de suprimare a terminației este un agent chimic care este capabil să suprime terminarea translațională rezultată din prezența unui codon stop. În special, agentul de suprimare a terminării este un antibiotic aparținând grupei aminoglicozidelor. Antibioticele aminoglicozidice sunt cunoscute pentru capacitatea lor de a permite inserarea aminoacizilor alternativi la locul unui codon stop, rezultând astfel „read-through” a unui codon stop sau setare codon stop care altfel ar duce în mod normal la terminarea traducerii. Antibioticele aminoglicozidice includ G-418, gentamicină, paromomicină, higromicină, amikacină, kanamicină, neomicină, netilmicină, streptomicină și tobramicină. Cu toate acestea, întrucât un nivel redus de citire este avantajos, selecția se efectuează de preferință în absența unui agent de suprimare a terminării.

Prezenta invenție este aplicabilă oricărui tip de celulă gazdă în care citirea codonului de oprire translațională are loc cel puțin într-un procent mic sau poate fi indusă prin adăugarea unui agent de suprimare a terminării. Exemple de celule gazdă eucariote adecvate sunt celule gazdă de mamifere care includ de ex. Linii celulare de ovar de hamster chinezesc (CHO), linii celulare de maimuță verde (COS), celule de șoarece (de exemplu NS / 0), linii celulare de rinichi de hamster bebeluș (BHK) și celule umane și linii celulare. De preferință, celula gazdă este o linie de celule CHO.

În timp ce un ciclu de selecție este suficient pentru a identifica celule gazdă care produc buni, în conformitate cu o variantă de realizare, sunt efectuate două sau mai multe cicluri de selecție, în care în fiecare ciclu de selecție este selectată cel puțin o celulă gazdă eucariotă pe baza prezenței sau cantității de polipeptidă de fuziune afișată pe suprafața celulei. Rezultatele experimentale demonstrează că un al doilea ciclu de selecție duce de obicei la rezultate îmbunătățite.

Conform unei variante, etapa de selecție c) cuprinde contactarea multitudinii de celule gazdă cu un compus de detecție care leagă polipeptida de fuziune și selectarea a cel puțin unei celule gazdă pe baza prezenței sau cantității de compus de detecție legat de suprafața celulei.

Compusul de detecție utilizat pentru legarea la polipeptida de fuziune poate avea cel puțin una dintre următoarele caracteristici: respectivul compus este marcat respectivul compus este marcat fluorescent respectivul compus este un antigen respectivul compus este o moleculă de imunoglobulină sau un fragment de legare al acesteia compusul menționat este proteina- A, -G și / sau -L.

Compusul de detecție utilizat pentru legarea polipeptidei de fuziune la suprafața celulei poate fi, de exemplu, o moleculă de imunoglobulină sau un fragment al acesteia, cum ar fi un anticorp sau un fragment de anticorp, recunoscând polipeptida de fuziune. Practic toate porțiunile accesibile ale polipeptidei de fuziune pot fi detectate, sub aceasta și porțiunea corespunzătoare polipeptidei de interes care este secretată în paralel cu polipeptida de fuziune sub formă solubilă.

Conform unei variante, compusul de detectare este un antigen. Această variantă este adecvată, dacă polipeptida exprimată de interes este, de exemplu, molecula de imunoglobulină sau un fragment al acesteia, cum ar fi un anticorp, legând antigenul respectiv.

Pentru a permite detectarea și selecția, respectivul compus de detecție utilizat pentru legarea polipeptidei de fuziune poate fi marcat. Compusul de detecție marcat care leagă polipeptida de fuziune afișată pe suprafața celulei etichetează astfel colorează respectiv suprafața celulei. Cu cât este mai mare cantitatea de polipeptidă de fuziune care este exprimată de celula gazdă, cu atât este legat compusul de detecție mai marcat. Acest lucru are avantajul că selecția celulelor gazdă poate fi efectuată cu ușurință, deoarece nu numai prezența, ci și cantitatea de compus de detecție legat poate fi determinată datorită etichetei. Pentru a selecta celule gazdă cu producție mare, acele celule gazdă sunt selectate din populația de celule gazdă care sunt cel mai eficient marcate intensiv de compusul de detectare. Este preferată o etichetă fluorescentă, deoarece aceasta permite detectarea ușoară prin metode de detectare a fluorescenței, cum ar fi, de exemplu, citometria în flux. Etichetele fluorescente adecvate sunt cunoscute persoanei calificate.

Conform unei variante, unul sau mai multe cicluri de selecție, de preferință două sau trei, pot fi efectuate pentru a selecta cel puțin o celulă gazdă eucariotă pe baza gradului de legare a compusului de detecție la suprafața celulei. Conform acestui exemplu de realizare, cel puțin o celulă gazdă eucariotă este selectată în fiecare ciclu de selecție pe baza cantității de compus de detecție legat. Astfel, acele celule gazdă care au fost marcate cel mai eficient / intens sunt selectate pe baza gradului respectiv de colorare a suprafeței celulare. De exemplu. primele 5% sau primele 2% din celulele gazdă pot fi selectate.

În cazul în care mai multe celule gazdă eucariote ar trebui să fie selectate împreună ca un pool (așa-numita îmbogățire a pool-ului), mai multe celule, de ex. cel puțin 10, cel puțin 50, cel puțin 500, cel puțin 1000 sau cel puțin 50.000 sunt selectați și incluși într-un grup de celule. Această variantă de realizare este deosebit de avantajoasă pentru obținerea rapidă a unor cantități mai mari de polipeptidă de interes deoarece grupul de celule cuprinzând mai multe celule gazdă de mare producție selectate în conformitate cu învățăturile prezentei invenții pot fi extinse mai repede decât de ex. o clonă celulară.

Astfel, pe lângă aplicația pentru clonarea selectivă a celulelor, prezenta invenție poate fi utilizată și pentru îmbogățirea bazinului de celule cu producție ridicată prin care pot fi realizate titruri comparabile cu liniile celulare clonice.

Celulele gazdă cu producție mare pot fi izolate și / sau o populație de celule cu producție mare poate fi îmbogățită pe baza gradului de legare a compusului de detecție la suprafața celulei, în special a polipeptidei de fuziune. Legarea compusului de detecție la polipeptida de fuziune de pe suprafața celulei gazdă poate fi detectată prin citometrie în flux, preferabil sortarea celulelor activate cu fluorescență (FACS).

Într-un exemplu de realizare preferat, celulele gazdă cuprinzând o cantitate mare de polipeptide de fuziune care în mod corespunzător descriu un semnal ridicat sunt sortate utilizând sortarea celulelor activate de fluorescență (FACS). În contextul prezentei invenții, sortarea FACS este deosebit de avantajoasă, deoarece permite screeningul rapid al unui număr mare de celule gazdă pentru a identifica și îmbogăți acele celule care exprimă polipeptida de interes cu un randament ridicat. Deoarece, în conformitate cu varianta preferată, aproximativ 5% sau mai puțin din polipeptidă sunt produse ca polipeptidă de fuziune, o fluorescență mai mare detectată pe suprafața celulei ar corespunde unei expresii mai mari, de asemenea, a polipeptidei de interes, care poate fi de ex. secretat în mediul de cultură. Acele celule, care prezintă cea mai mare rată de fluorescență, pot fi identificate și izolate de FACS. O corelație pozitivă și semnificativă statistic între fluorescență, determinată de FACS și cantitatea de polipeptidă produsă este găsită și confirmată de exemple. Prin urmare, sortarea FACS poate fi utilizată nu numai pentru o analiză calitativă pentru identificarea celulelor care exprimă o polipeptidă de interes în general, dar poate fi utilizată cantitativ pentru a identifica acele celule gazdă care exprimă niveluri ridicate ale polipeptidei de interes. Prin urmare, celulele gazdă cu producție mare pot fi selectate / îmbogățite pe baza gradului de legare a compusului de detecție marcat la polipeptida de fuziune, care este ancorată la suprafața celulei. Astfel, pot fi selectate / îmbogățite cele mai bune celule producătoare. Rezultatele experimentale arată că utilizarea procedurii de selecție conform prezentei invenții în combinație cu analiza FACS a dus la o reducere semnificativă a clonelor neproductive în populațiile de celule selectate. Mai mult, productivitatea medie crescută a clonelor permite reducerea drastică a eforturilor de screening al clonelor, de ex. în procesul de dezvoltare a liniei celulare pentru producția biofarmaceutică. Astfel, liniile celulare pentru un număr mult mai mare de candidați sau proiecte pot fi dezvoltate cu mai puține resurse în comparație cu abordările clasice de screening. De asemenea, acest proces permite evaluarea potențialului de productivitate și a distribuției clonale a bazinelor transfectate și selectate prin colorarea suprafeței și analiza FACS în loc de teste de productivitate consumatoare de timp. Colorarea de suprafață poate fi, de asemenea, utilizată pentru a analiza stabilitatea clonală a producției în ceea ce privește omogenitatea populației de celule. Subpopulațiile care nu pot produce sau scăzut, care pot apărea, ar fi ușor de detectat.

Conform unei variante, caseta (Cas-POI) și / sau (Cas-POI ') mai cuprinde o polinucleotidă (Pn-TAG) care codifică o etichetă de afinitate situată în aval de cel puțin un codon de oprire care este situat în aval de primul polinucleotidă și în care respectiva polinucleotidă (Pn-TAG) este situată în amonte de a doua polinucleotidă care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau o variantă funcțională a acesteia și / sau o polinucleotidă (Pn-MARKER) care codifică un marker selectabil.

Pentru a furniza polinucleotida (Pn-TAG) definită mai sus între codonul de oprire și polinucleotida care codifică ancora transmembranară a imunoglobulinei are avantajul că o etichetă de afinitate este încorporată în proteina de fuziune. Deoarece eticheta de afinitate este situată în aval de cel puțin un codon de oprire, este inclusă doar în varianta de fuziune a polipeptidei de interes. O "etichetă de afinitate" se referă la o scurtă secvență de aminoacizi care poate fi detectată / legată de compuși / agenți de legare, cum ar fi anticorpi. Practic, eticheta de afinitate servește ca țintă pentru agenții de captare și / sau compuși de detectare. Deoarece este situat între polipeptida de interes și ancora transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, este afișată și pe suprafața celulei și este în consecință accesibilă de ex. pentru compuși de detectare. Eticheta de afinitate poate funcționa astfel ca țintă pentru compusul de detectare pentru a permite selectarea celulelor gazdă eucariote adecvate. A folosi de ex. o etichetă de afinitate bine caracterizată ca țintă pentru detectare / selecție este avantajoasă deoarece pot fi folosiți pentru detectare compuși de detecție existenți și bine caracterizați. Mai mult, același compus de detectare poate fi utilizat pentru a fi exprimate diferite tipuri de polipeptide de interes. Generarea de compuși de detecție specifici pentru diferitele polipeptide de interes ar fi învechită în conformitate cu acest exemplu de realizare, deoarece ar putea fi utilizat același compus de detecție specific pentru eticheta de afinitate. Deoarece eticheta de afinitate constituie o parte integrantă a polipeptidei de fuziune, este de asemenea ancorată strâns la suprafața celulei gazdă eucariote datorită prezenței ancorei transmembranare. Polipeptidele de fuziune bine ancorate nu ar trebui să fie susceptibile la vărsare (vezi mai sus).

Vărsarea proteinelor de fuziune legate de membrană poate constitui - în funcție de utilizarea intenționată a polipeptidei secretate - o problemă de contaminare, chiar dacă vărsarea este un eveniment rar atunci când se utilizează o ancoră transmembranară a imunoglobulinei. De exemplu. atunci când se exprimă polipeptide / proteine ​​terapeutice, este de dorit să se obțină produsul secretat cât mai pur posibil. Când utilizați o etichetă de afinitate, cum ar fi de ex. a Eticheta Sa, eticheta de afinitate menționată ar fi cel puțin parțial cuprinsă în proteina acoperită. Datorită prezenței etichetei de afinitate, este posibilă îndepărtarea polipeptidelor de fuziune încastrate (dacă există) din proba de polipeptide secretate utilizând proceduri convenționale de purificare a afinității (de exemplu, Ni-NTA în cazul unei etichete His). Eticheta de afinitate este, prin urmare, utilă pentru a elimina cu ușurință potențialele contaminări din probă.

Mai mult, eticheta de afinitate poate fi utilizată pentru a controla puritatea polipeptidei exprimate / obținute. Pentru aplicații în care sunt necesare proteine ​​/ polipeptide extrem de pure, poate fi, de asemenea, avantajos / obligatoriu să se furnizeze teste adecvate pentru a demonstra că produsul obținut este pur și, prin urmare, nu cuprinde contaminări datorate polipeptidelor de fuziune acoperite. O astfel de analiză s-ar putea baza pe detectarea etichetei de afinitate. Deoarece eticheta de afinitate este prezentă numai în polipeptida de fuziune, poate servi ca un marker specific pentru prezența polipeptidelor de fuziune (sau a versiunilor degradate / acoperite ale acestora) în probă. Dacă eticheta de afinitate poate fi încă detectată în produsul obținut atunci când se utilizează un compus de detectare specific pentru eticheta de afinitate, există încă urme de polipeptidă de fuziune încastrată în probă și proba poate avea nevoie - în funcție de cantitate - de purificare suplimentară. Dacă nu poate fi detectată nicio etichetă de afinitate în eșantion, nu trebuie să fie prezente în eșantionul analizat cantități foarte mici sau, respectiv, foarte mici de polipeptidă de fuziune acoperită, asigurându-se astfel că eșantionul este suficient de pur pentru aplicația dorită.

În consecință, atunci când se produce polipeptida de interes, polipeptida obținută de interes poate fi prelucrată în continuare prin îndepărtarea contaminărilor polipeptidei de fuziune închise prin purificarea afinității care vizează eticheta de afinitate și / sau detectarea prezenței sau absenței proteinei de fuziune închise prin țintirea etichetei de afinitate.

Exemple potrivite pentru etichetele de afinitate sunt de ex. V5, a His Tag, FLAG, Strep, HA, c-Myc sau altele asemenea. Etichetele de afinitate adecvate pot fi, de asemenea, create artificial.

Conform unei alte variante de realizare, caseta (Cas-POI) și / sau (Cas-POI ') cuprinde o altă polinucleotidă (Pn-MARKER) care codifică un marker selectabil. De preferință, respectivul marker selectabil este situat în aval de polinucleotida care codifică ancora transmembranară a imunoglobulinei și este astfel la expresia constructului situat pe situsul citoplasmatic al membranei celulare atunci când este afișată polipeptida de fuziune. Conform unei variante de realizare, nu există codon stop între polinucleotida care codifică ancora / domeniul transmembranar imunoglobulină sau o variantă funcțională a acesteia și polinucleotida (Pn-MARKER), deoarece se presupune că acestea sunt exprimate ca o fuziune. Codonii de oprire și semnalele de terminare a transcripției adecvate ar trebui furnizate în aval de secvența de codificare a polinucleotidei (Pn-MARKER) pentru a asigura transcrierea eficientă și terminarea traducerii după exprimarea polinucleotidei (Pn-MARKER). Respectiva polinucleotidă (Pn-MARKER) poate de ex. să fie o genă de rezistență la medicamente sau o genă reporter. Exemple adecvate sunt descrise aici. Conform unei variante, proteina de fluorescență verde (GFP) sau luciferaza este utilizată ca raportor. Acest lucru permite selectarea celulelor gazdă eucariote pe baza a două caracteristici ale proteinelor de fuziune.

Conform unei variante, caseta (Cas-POI) și / sau (Cas-POI ') este o casetă de expresie. Persoanele calificate în domeniu vor fi capabile să selecteze vectori adecvați, secvențe de control al expresiei și gazde pentru realizarea metodelor invenției. De exemplu, în selectarea unui vector, gazda trebuie luată în considerare, deoarece vectorul poate fi necesar să poată fi reprodus în el și / sau să se poată integra în cromozom. Vectorii adecvați care pot fi utilizați în metodele de selecție și producție conform prezentei invenții sunt de asemenea descriși mai jos și în revendicări.

De asemenea, este furnizat un vector acid nucleic adecvat pentru exprimarea a cel puțin unei polipeptide de interes într-o celulă gazdă eucariotă, de preferință o mamiferă, cuprinzând cel puțin o casetă (Cas-POI) cuprinzând un situs de inserție pentru o primă codificare polinucleotidică (Pn-POI) polipeptida de interes și / sau o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică o polipeptidă de interes, cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau o variantă funcțională a acestuia.

Un "acid nucleic vector" conform prezentei invenții este o polinucleotidă capabilă să transporte cel puțin un fragment de acid nucleic străin. Un acid nucleic vector funcționează ca un "purtător molecular", livrând fragmente de acizi nucleici într-o celulă gazdă. Poate cuprinde cel puțin o casetă de expresie care cuprinde secvențe reglatoare. De preferință, vectorul acid nucleic cuprinde cel puțin o casetă de expresie. Polinucleotidele străine pot fi inserate în caseta (casetele) de expresie a acidului nucleic vector pentru a fi exprimate din acestea. Vectorul acid nucleic conform prezentei invenții poate fi prezent sub formă circulară sau liniarizată. Termenul "acid nucleic vector" cuprinde, de asemenea, cromozomi artificiali sau polinucleotide respective similare care permit transferul fragmentelor de acid nucleic străine.

Un vector respectiv poate fi folosit ca vector de expresie pentru a efectua metodele de screening și producție descrise mai sus. Avantajele unui acid nucleic vector respectiv sunt, de asemenea, descrise mai sus împreună cu metoda de screening.

Acidul nucleic vector poate cuprinde în plus cel puțin o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes o casetă de expresie (Exp-MSM) care cuprinde o genă marker selectabilă de mamifer și / sau o casetă de expresie (Exp-MASM) care cuprinde un mamifer genă marker amplificabilă, selectabilă.

Caseta de expresie (Exp-MSM) definește caseta de expresie cuprinzând o genă marker selectabilă la mamifere.

Caseta de expresie (Exp-MASM) definește caseta de expresie cuprinzând o genă marker amplificabilă, selectabilă de mamifer.

Termenii „5 '” și „3’ ”este o convenție utilizată pentru a descrie caracteristicile unei secvențe de acid nucleic legate fie de poziția elementelor genetice și / sau de direcția evenimentelor (5' până la 3 '), cum ar fi de ex. transcriere prin ARN polimerază sau traducere de către ribozom care se desfășoară în direcția 5 'la 3'. Sinonimele sunt în amonte (5 ') și în aval (3'). În mod convențional, secvențele ADN, hărțile genetice, cărțile vectoriale și secvențele ARN sunt desenate cu 5 'la 3' de la stânga la dreapta sau direcția 5 'la 3' este indicată cu săgeți, în care vârful săgeții indică direcția 3 '. În consecință, 5 '(în amonte) indică elemente genetice poziționate spre partea stângă, iar 3' (în aval) indică elemente genetice poziționate spre partea dreaptă, atunci când urmați această convenție.

Aranjamentul și orientarea casetelor de expresie este, de asemenea, un aspect important. Conform unei variante de realizare, caseta de expresie (Exp-MASM) este localizată 5 'și caseta de expresie (Exp-MSM) este situată la 3' din caseta de expresie (Exp-POI). Alte casete de expresie pot fi inserate între casetele de expresie (Exp-POI) și (Exp-MSM), cum ar fi de ex. o casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') pentru exprimarea unui polipeptid suplimentar de interes (descris în detalii suplimentare mai jos). Casetele de expresie (Exp-MASM), (Exp-POI) și (Exp-MSM) sunt de preferință toate aranjate în aceeași orientare de 5 'la 3'. Inventatorii au descoperit că această configurație specială de acid nucleic vectorial permite generarea rapidă de linii celulare cu randament ridicat.

Conform unei alternative, caseta de expresie (Exp-POI) nu cuprinde polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes. Astfel, este furnizat un vector de expresie "gol" cu o casetă de expresie (Exp-POI) care nu cuprinde încă polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes. Totuși, respectiva polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes poate fi încorporată în caseta de expresie (Exp-POI) prin utilizarea metodelor de clonare adecvate, de exemplu prin utilizarea enzimelor de restricție pentru a introduce codificarea polinucleotidelor (Pn-POI) polipeptida de interes în caseta de expresie (Exp-POI). În acest scop caseta de expresie (Exp-POI) poate cuprinde de ex. un site de clonare multiplă (MCS) care poate de ex. să fie utilizat în toate cadrele de citire. Un acid nucleic vector „gol” respectiv poate de ex. să fie furnizate clienților, care apoi introduc polinucleotida specifică de interes în caseta de expresie (Exp-POI). Polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes este inserată astfel încât un codon de oprire este prezent între polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și polinucleotida care codifică ancora transmembranară sau o variantă funcțională a acesteia. Caseta de expresie (Exp-POI) poate cuprinde, de asemenea, o polinucleotidă de înlocuire sau o secvență de acid nucleic de umplutură, care poate fi excizată și înlocuită de polinucleotida (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes. Prezenta invenție furnizează, de asemenea, un acid nucleic vector, așa cum este descris mai sus, cuprinzând o casetă de expresie (Exp-POI) care cuprinde o primă polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon stop în aval de prima polinucleotidă și un a doua polinucleotidă în aval de codonul stop care codifică o ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia. Această realizare se referă în esență la expresia finală a acidului nucleic vector. Practic, același lucru se aplică în cazul în care se utilizează o casetă (Cas-POI) în locul unei casete de expresie (Exp-POI).

Conform unei variante, vectorul acid nucleic este circular și caseta de expresie (Exp-MSM) este aranjată 3 'din caseta de expresie (Exp-POI) și caseta de expresie (Exp-MASM) este aranjată 3' din caseta de expresie (Exp-MSM).

Vectorul de expresie conform prezentei invenții poate cuprinde o casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') pentru exprimarea unei polipeptide de interes.În vectorul acid nucleic final, respectiva casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') cuprinde polinucleotida suplimentară pentru exprimarea polipeptidei suplimentare de interes. În funcție de polipeptidele care trebuie exprimate, respectiva casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') poate cuprinde sau nu o polinucleotidă care codifică o ancoră de membrană (sau o peptidă de semnal pentru atașarea unei ancore respective, cum ar fi o ancoră GPI), care este separată din polinucleotida care codifică polipeptida suplimentară de interes printr-un codon stop. Prin urmare, este, de asemenea, posibil ca mai multe casete de expresie pentru exprimarea diferitelor polipeptide să fie aranjate în vectorul de expresie conform prezentei invenții. Cu toate acestea, numai caseta de expresie (Exp-POI) trebuie să aibă ansamblul de codoni de oprire scurgeri și astfel un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes și o a doua polinucleotidă în aval de codonul de oprire care codifică un ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia, casetele de expresie suplimentare (Exp-POI ') pot avea sau nu un ansamblu de codoni de oprire respectiv.

O variantă de realizare respectivă utilizând cel puțin două casete de expresie (Exp-POI) și (Exp-POI ') pentru exprimarea polipeptidelor de interes este deosebit de avantajoasă, în cazul în care este exprimată o moleculă de imunoglobulină sau un fragment funcțional al acesteia. În consecință, este furnizat un vector acid nucleic pentru exprimarea a cel puțin unei molecule de imunoglobulină sau a unui fragment funcțional al acesteia, cuprinzând o casetă de expresie (Exp-POI) cuprinzând o primă polinucleotidă care codifică lanțul greu și / sau ușor al moleculei de imunoglobulină sau o funcționalitate fragment al acestuia, cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică cel puțin o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau un fragment funcțional al acestuia și / sau o casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') care cuprinde un polinucleotid codificarea luminii corespunzătoare și / sau a lanțului greu al unei molecule de imunoglobulină sau a unui fragment funcțional al acesteia. Caseta de expresie (Exp-POI ') codifică lanțul de imunoglobulină care corespunde lanțului de imunoglobulină al casetei de expresie (Exp-POI) (adică dacă caseta de expresie (Exp-POI) codifică lanțul greu, caseta de expresie (Exp- POI ') codifică lanțul ușor și invers). Astfel, o moleculă funcțională de imunoglobulină (sau un fragment al acesteia) poate fi exprimată din vector.

Se preferă ca lanțul greu sau un fragment funcțional al acestuia să fie exprimat din caseta de expresie (Exp-POI) și să fie astfel exprimat într-o anumită măsură ca o polipeptidă de fuziune. Lanțul ușor corespunzător sau un fragment funcțional al acestuia este conform unui exemplu de realizare exprimat dintr-o casetă de expresie (Exp-POI '). Respectiva casetă de expresie (Exp-POI ') poate fi localizată pe același vector acid nucleic. Cu toate acestea, poate fi localizat și pe un acid nucleic vector separat. Cu toate acestea, este de preferat ca casetele de expresie (Exp-POI) și (Exp-POI ') să fie situate pe un acid nucleic vector. De asemenea, este posibil să se exprime ambele lanțuri (lanțul greu și lanțul ușor corespunzător) dintr-o casetă de expresie. De exemplu. ele pot fi exprimate ca o polipeptidă de fuziune cuprinzând un semnal de auto-îmbinare sau un sit sensibil la protează pentru a obține două lanțuri separate. De asemenea, este posibil un set bi- sau multicistronic, în care două sau mai multe polipeptide (POI și POI ') sunt obținute dintr-un ARNm care poate cuprinde de ex. unul sau mai multe site-uri de intrare ribozomale interne.

Conform unui exemplu de realizare, este furnizat un vector acid nucleic pentru exprimarea a cel puțin unei molecule de imunoglobulină sau a unui fragment funcțional al acesteia, cuprinzând o casetă de expresie (Exp-POI) cuprinzând o primă polinucleotidă care codifică lanțul greu al unei molecule de imunoglobulină sau un fragment funcțional al acesteia , cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau o variantă funcțională a acesteia și o casetă de expresie suplimentară (Exp-POI ') care cuprinde o polinucleotidă care codifică lanțul ușor corespunzător a unei molecule de imunoglobulină sau a unui fragment funcțional al acesteia.

De preferință, caseta de expresie (Exp-POI) cuprinde lanțul greu și ambele casete de expresie (Exp-POI) și (Exp-POI ') sunt dispuse în aceeași orientare. De preferință, caseta de expresie (Exp-POI ') este aranjată 5' din caseta de expresie (Exp-POI). Aranjarea casetei de expresie pentru lanțul ușor 5 'la caseta de expresie a lanțului greu s-a dovedit a fi benefică în ceea ce privește rata de expresie a moleculelor de imunoglobulină. Conform unei variante de realizare, este de asemenea destinat să proiecteze vectorul de expresie astfel încât caseta (casetele) de expresie să cuprindă deja ancora transmembranară a imunoglobulinei și cel puțin un codon de oprire cu scurgeri (de exemplu cuprins într-o secvență de umplere) și, opțional, la cea mai mică parte a regiunilor constante ale unei molecule de imunoglobulină. Fragmentele care codifică părțile variabile ale moleculelor de imunoglobulină pot fi apoi inserate de utilizator / client în casetele de expresie utilizând strategii de clonare adecvate pentru a obține vectorul de expresie final.

Exemple nelimitative pentru genele marker selectabile la mamifere care pot fi cuprinse în caseta de expresie (Exp-MSM) includ gene de rezistență la antibiotice, de ex. conferind rezistență la higromicină G418 (hig sau hph, disponibil comercial de la Life Technologies, Inc. Gaithesboro, MD) neomicină (neo, disponibil comercial de la Life Technologies, Inc. Gaithesboro, MD) zeocină (Sh Ble, disponibil comercial de la Pharmingen, San Diego, California) puromicină (pac, puromicină-N-acetil-transferază, disponibilă de la Clontech, Palo Alto, California), ouabain (oua, disponibil de la Pharmingen) și blasticidină (disponibil de la Invitrogen). Aceste gene marker selectabile de mamifere permit selectarea celulelor gazdă de mamifere care cuprind genele menționate și, astfel, a celulelor gazdă cuprinzând vectorul. Termenul "genă", așa cum este utilizat aici, nu se referă numai la secvența de codare a genei de tip sălbatic, ci se referă și la o secvență de acid nucleic care codifică o variantă funcțională a markerului selectabil care oferă rezistența dorită. Prin urmare, versiunile trunchiate sau mutate ale unei gene de tip sălbatic sunt cuprinse atât timp cât oferă rezistența dorită. Gena marker selectabilă la mamifere cuprinde, de preferință, elemente de reglare străine, cum ar fi de ex. un puternic promotor constitutiv. Conform unei variante preferate, caseta de expresie menționată (Exp-MSM) cuprinde o genă care codifică o neomicină fosfotransferază funcțională enzimatic (I sau II) care cuprinde, de preferință, elemente de reglare străine, cum ar fi de ex. un puternic promotor constitutiv, cum ar fi promotorul SV40. Această realizare funcționează bine în combinație cu utilizarea unei gene care codifică un DHFR funcțional enzimatic ca genă marker selectabilă amplificabilă la mamifere.

Genele marker selectabile amplificabile de mamifere încorporate în caseta de expresie (Exp-MASM) permit selectarea celulelor gazdă care conțin vectori, precum și amplificarea genei. Un exemplu nelimitativ pentru o genă marker amplificabilă, selectabilă de mamifer este gena dihidrofolat reductazei (DHFR) care codifică enzima DHFR. Gena marker selectabilă amplificabilă a mamiferelor cuprinde, de preferință, elemente de reglare străine, cum ar fi de ex. un puternic promotor constitutiv. Alte sisteme utilizate în prezent sunt, printre altele, sistemul de glutamină sintetază (gs) (Bebbington și colab., 1992) și sistemul de selecție condus de histidinol (Hartmann și Mulligan, 1988). Acești markeri amplificabili sunt, de asemenea, markeri selectabili și pot fi astfel folosiți pentru a selecta acele celule care au obținut vectorul. DHFR și glutamina sintetaza oferă rezultate bune. În ambele cazuri, selecția are loc în absența metabolitului adecvat (hipoxantină și timidină în cazul DHFR, glutamină în cazul GS), prevenind creșterea celulelor netransformate. Cu sisteme amplificabile precum sistemul DHFR, expresia unei proteine ​​recombinante poate fi crescută prin expunerea celulelor la anumiți agenți care promovează amplificarea genelor, cum ar fi de ex. metotrexat (MTX) în cazul sistemului DHFR. De exemplu. secvența de codare a genei DHFR de tip sălbatic sau a unui mutant DHFR care permite de ex. se poate folosi o selecție de linii celulare dhfr +. Un inhibitor adecvat pentru amplificarea genei care promovează GS este metionina sulfoximină (MSX). Expunerea la MSX are ca rezultat și amplificarea genelor.

Conform unei variante de realizare, caseta de expresie menționată (Exp-MASM) cuprinde o genă care codifică o dihidrofolat reductază funcțională enzimatic (DHFR) care este utilizată de preferință împreună cu promotorul SV40.

În consecință, sunt furnizați acizi nucleici vectoriali în care casetele de expresie cuprind cel puțin un promotor și / sau un element promotor / amplificator. Deși granițele fizice dintre aceste două elemente de control nu sunt întotdeauna clare, termenul „promotor” se referă de obicei la un sit de pe molecula de acid nucleic de care se leagă o ARN polimerază și / sau orice factori asociați și la care este inițiată transcripția. Îmbunătățitorii potențează activitatea promotorului, atât pe plan temporal, cât și spațial. Mulți promotori sunt activi transcripțional într-o gamă largă de tipuri de celule. Promotorii pot fi împărțiți în două clase, cele care funcționează constitutiv și cele care sunt reglementate prin inducție sau derepresiune. Promotorii utilizați pentru producerea la nivel înalt de proteine ​​în celulele mamiferelor ar trebui să fie puternici și, de preferință, activi într-o gamă largă de tipuri de celule. Promotorii constitutivi puternici care determină expresia în multe tipuri de celule includ, dar nu se limitează la, promotorul tardiv major al adenovirusului, promotorul timpuriu imediat al citomegalovirusului uman, promotorul virusului SV40 și Rous Sarcoma și promotorul murin 3-fosfoglicerat kinazei, EF1a. Rezultate bune se obțin cu vectorul de expresie al prezentei invenții atunci când promotorul și / sau amplificatorul este fie obținut din CMV și / sau SV40.

Conform unei variante de realizare, caseta (casetele) de expresie pentru exprimarea polipeptidei de interes cuprinde (i) un promotor și / sau un amplificator mai puternic decât casetele de expresie pentru exprimarea markerilor selectabili. Acest aranjament are ca efect generarea mai multor transcrieri pentru polipeptida de interes decât pentru markerii de selecție. Este avantajos faptul că producția polipeptidei de interes care este secretată este dominantă asupra producției markerilor de selecție, deoarece capacitatea celulară individuală de a produce proteine ​​heteroloage nu este nelimitată și ar trebui, prin urmare, să se concentreze asupra polipeptidei de interes.

Conform unei variante de realizare, casetele de expresie (Exp-POI) și (Exp-POI ') (dacă există) care sunt / sunt utilizate pentru exprimarea polipeptidei de interes cuprind un promotor / amplificator CMV ca elemente de reglare. Casetele de expresie (Exp-MSM) și (Exp-MASM), care exprimă de preferință genele DHFR și markerul neomicinei, cuprind un promotor SV40 sau un promotor / amplificator SV40. Promotorul CMV este cunoscut a fi unul dintre cei mai puternici promotori disponibili pentru expresia mamiferelor și duce la o rată de expresie foarte bună. Se consideră că oferă o transcriere semnificativ mai mare decât promotorul SV40.

Majoritatea ARNm eucariote născute posedă o coadă poli A la capătul lor 3 'care se adaugă în timpul unui proces complex care implică scindarea transcriptului primar și o reacție de poliadenilare cuplată. Coada poliA este avantajoasă pentru stabilitatea și transferabilitatea ARNm. Prin urmare, casetele de expresie ale vectorului conform prezentei invenții cuprind de obicei un situs de poliadenilare. Există mai multe semnale poliA eficiente care pot fi utilizate în vectorii de expresie a mamiferelor, inclusiv cei derivați din hormonul de creștere bovin (bgh), beta-globina de șoarece, unitatea de transcripție timpurie SV40 și gena timidin kinazei a virusului Herpes simplex. Totuși, sunt cunoscute și situri de poliadenilare sintetică (vezi de exemplu vectorul de expresie pCl-neo al Promega care se bazează pe Levitt el al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025). Situsul de poliadenilare poate fi selectat din grupul format din situsul SV40polyA, cum ar fi situsul poli-A tardiv și timpuriu SV40 (vezi de exemplu plasmida pSV2-DHFR așa cum este descris în Subramani și colab., 1981, Mol. Cell. Biol. 854-864 ), un site sintetic polyA (vezi de exemplu vectorul de expresie pCl-neo al Promega care se bazează pe Levitt el al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) și un site polyA bgh (hormonul de creștere bovin) .

Mai mult, casetele de expresie pot cuprinde un site adecvat de terminare a transcrierii. Aceasta, ca transcriere continuă de la un promotor din amonte printr-o a doua unitate de transcripție poate inhiba funcția promotorului din aval, un fenomen cunoscut sub numele de ocluzie a promotorului sau interferență transcripțională. Acest eveniment a fost descris atât în ​​procariote, cât și în eucariote. Amplasarea corectă a semnalelor de terminare transcripțională între două unități de transcripție poate preveni ocluzia promotorului. Siturile de terminare a transcripției sunt bine caracterizate și încorporarea lor în vectorii de expresie s-a dovedit a avea efecte benefice multiple asupra expresiei genelor.

Casetele de expresie pot cuprinde un amplificator (vezi mai sus) și / sau un intron. Conform unei variante, caseta (casetele) de expresie pentru exprimarea polipeptidei de interes cuprind un intron. Majoritatea genelor din eucariote superioare conțin introni care sunt eliminați în timpul procesării ARN. Construcțiile genomice sunt exprimate mai eficient în sistemele transgenice decât constructele identice lipsite de introni. De obicei, intronii sunt așezați la capătul 5 'al cadrului de citire deschis. În consecință, un intron poate fi cuprins în caseta (casetele) de expresie pentru exprimarea polipeptidelor de interes pentru a crește rata de expresie. Respectivul intron poate fi localizat între promotor și sau element (e) promotor / amplificator și capătul 5 'al cadrului de citire deschis al polipeptidei care trebuie exprimat. Prin urmare, este furnizat un acid nucleic vector, în care cel puțin caseta de expresie (Exp-POI) cuprinde un intron care este dispus între promotor și codonul de start al polinucleotidei pentru exprimarea polipeptidei de interes. Câteva introni adecvați sunt cunoscuți în stadiul tehnicii care pot fi utilizați împreună cu prezenta invenție.

Conform unei variante, intronul utilizat în casetele de expresie pentru exprimarea polipeptidelor de interes este un intron sintetic, cum ar fi intronul SIS sau RK. Intronul RK este un intron sintetic puternic care este plasat de preferință înainte de codonul de start ATG al genei de interes. Intronul RK constă din situsul de îmbinare donator de introni al promotorului CMV și situsul de îmbinare acceptor al regiunii variabile a lanțului greu IgG de șoarece (vezi de exemplu Eaton și colab., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger și colab., 1983 , EMBO J. 2 (8), 1373-1378 poate fi obținut din vectorul pRK-5 (BD PharMingen)).

În mod surprinzător, plasarea unui intron la capătul 3 'al cadrului de citire deschis al genei DHFR are efecte avantajoase asupra ratei de expresie / amplificare a constructului. Intronul utilizat în caseta de expresie DHFR conduce la o variantă mai mică, nefuncțională a genei DHFR (Grillari și colab., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). Prin urmare, nivelul de expresie al genei DHFR este redus. Acest lucru duce la o sensibilitate crescută pentru MTX și la condiții de selecție mai stricte. În consecință, este furnizat un acid nucleic vector, în care caseta de expresie (MASM) cuprinde un intron care este situat la 3 'din gena marker amplificabilă selectabilă. Un intron adecvat poate fi obținut din vectorul pSV2-DHFR (a se vedea, de exemplu, mai sus).

Respectivul vector poate cuprinde cel puțin o casetă de expresie suplimentară (Exp-PSM) care cuprinde o genă marker selectabilă procariotă. Această casetă de expresie (Exp-PSM) poate fi localizată între casetele de expresie (Exp-MSM) și (Exp-MASM). Acest marker selectabil poate oferi o rezistență la antibiotice, cum ar fi de ex. ampicilină, kanamicină, tetraciclină și / sau cloramfenicol. Această casetă de expresie (Exp-PSM) este de preferință aranjată în aceeași orientare de 5 'până la 3' ca și celelalte casete de expresie (Exp-POI), (Exp-MSM) și (Exp-MASM).

Conform unei variante de realizare, caseta de expresie (Exp-POI) și / sau (Exp-POI ') cuprinse în vector mai conțin (e) o polinucleotidă (Pn-TAG) care codifică o etichetă de afinitate situată în aval de cel puțin o oprire codon care este situat în aval de prima polinucleotidă și în care respectiva polinucleotidă (Pn-TAG) este situată în amonte de a doua polinucleotidă care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină și / sau o polinucleotidă (Pn-MARKER) care codifică un marker selectabil.

Avantajele sunt prezentate mai sus.

Vectorul acid nucleic poate fi transfectat în celula gazdă în forma sa circulară. Moleculele vector supraînfășurate vor fi de obicei convertite în molecule liniare în nucleu datorită activității endo- și exonucleaze. Cu toate acestea, liniarizarea vectorului acidului nucleic înainte de transfecție îmbunătățește adesea eficiența unei transfecții stabile. Acest lucru, de asemenea, ca punct de liniarizare poate fi controlat dacă vectorul este liniarizat înainte de transfecție.

Prin urmare, conform unei variante a prezentei invenții, vectorul de expresie cuprinde un sit de restricție predefinit, care poate fi utilizat pentru liniarizarea vectorului de acid nucleic înainte de transfecție. Amplasarea inteligentă a sitului de restricție de liniarizare este importantă, deoarece situl de restricție menționat determină unde este deschis / liniarizat acidul nucleic vector și determină astfel ordinea / dispunerea casetelor de expresie atunci când constructul este integrat în genomul eucariotului, în special al mamiferelor. celulă.

În consecință, vectorul acid nucleic poate cuprinde un situs de restricție de liniarizare pentru liniarizarea vectorului, în care respectivul situs de restricție de liniarizare este situat între casetele de expresie (Exp-MSM) și (Exp-MASM). De preferință, situl de restricție de liniarizare este unic și este prezent doar o dată în vectorul de expresie acid nucleic. De exemplu. se poate utiliza un situs de restricție de liniarizare care este recunoscut de o enzimă de restricție având o frecvență de tăiere scăzută pentru a admite faptul că vectorul este scindat doar la locul de restricție de liniarizare, dar nu (sau doar rar) de ex. în caseta (casetele) de expresie sau în coloana vertebrală a vectorului. Acest lucru poate de ex. să fie încurajat prin furnizarea unui sit de restricție pentru o enzimă de restricție având o secvență de recunoaștere de peste șase perechi de baze sau care recunoaște secvențe care sunt subreprezentate în ADN-ul cromozomial. Un exemplu adecvat este enzima SwaI și vectorul poate, prin urmare, să încorporeze un situs de recunoaștere SwaI ca situs unic de restricție de liniarizare. În cazul în care situl de restricție de liniarizare este prezent de mai multe ori în secvența vectorică a acidului nucleic (inclusiv polinucleotidele care codifică polipeptida de interes), sau în cazul în care se utilizează o enzimă de restricție care taie de mai multe ori în secvența vectorică a acidului nucleic, este, de asemenea, în scopul prezentei invenții de exemplu modificați / mutați site-urile de restricție în afară de site-ul de restricție de liniarizare care este situat între casetele de expresie (Exp-MSM) și (Exp-MASM), pentru a elimina acele site-uri de restricție suplimentare și pentru a obține un site de restricție de liniarizare unic sau cel puțin rar .

În cazul în care vectorul este utilizat ca vector de expresie standard destinat de ex.ca instrument pentru exprimarea mai multor polipeptide diferite, este avantajos să se furnizeze un situs de restricție de liniarizare care cuprinde mai multe situri de recunoaștere pentru enzime având o frecvență de tăiere scăzută. Enzimele de restricție alese pentru linearizare nu ar trebui, de preferință, să fie tăiate în casetele de expresie pentru markerii selectabili sau alte secvențe ale coloanei vertebrale ale vectorului, pentru a se asigura că enzima taie o singură dată pentru liniarizarea corectă a vectorului. Prin furnizarea unui sit de restricție de liniarizare care cuprinde mai multe situri de recunoaștere a enzimelor de restricție cu o frecvență redusă de tăiere, utilizatorul poate alege o enzimă de restricție adecvată pentru liniarizare din opțiunile furnizate pentru a evita restricționarea în siguranță a polinucleotidei (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes. Cu toate acestea, așa cum este subliniat mai sus, site-urile de restricție suplimentare pot fi mutate sau ar putea fi efectuat un digest de restricție parțială.

Plasarea sitului de restricție de liniarizare între caseta de expresie (Exp-MSM) și caseta de expresie (Exp-MASM) are ca efect caseta de expresie (Exp-POI) (și alte casete de expresie pentru exprimarea polipeptidelor de interes - dacă există ) este flancat 5 'de caseta de expresie (Exp-MASM). Caseta de expresie (Exp-MSM) este localizată la 3 'din caseta de expresie (Exp-POI) la liniarizare. Astfel, casetele de expresie (MSM) și (MASM) sunt separate după liniarizarea acidului nucleic vector circular. Dacă este prezentă o casetă de expresie (Exp-PSM) pentru un marker de selecție bacteriană (vezi mai jos), site-ul de restricție de liniarizare este plasat de preferință între casetele de expresie (Exp-PSM) și (Exp-MASM). Acest lucru are ca efect gena marker de selecție bacteriană să fie 3 'și astfel „în afara” părților „mamifere” ale vectorului acid nucleic liniarizat. Acest aranjament este favorabil, deoarece genele bacteriene nu sunt probabil avantajoase pentru expresia mamiferelor, deoarece secvențele bacteriene pot duce la metilare crescută sau la alte efecte de reducere a zgomotului în celulele mamiferelor.

Polipeptida de interes nu se limitează la nicio proteină particulară sau grup de proteine, ci poate fi dimpotrivă orice proteină, de orice dimensiune, funcție sau origine, pe care cineva dorește să o selecteze și / sau să o exprime prin metodele descrise aici. În consecință, pot fi exprimate / produse mai multe polipeptide diferite de interes. Termenul de polipeptidă se referă la o moleculă care cuprinde un polimer de aminoacizi legați între ei printr-o legătură (legături) peptidică. Polipeptidele includ polipeptide de orice lungime, inclusiv proteine ​​(de exemplu, având mai mult de 50 de aminoacizi) și peptide (de exemplu, 2-49 aminoacizi). Polipeptidele includ proteine ​​și / sau peptide de orice activitate sau bioactivitate, inclusiv de ex. polipeptide bioactive, cum ar fi proteine ​​enzimatice sau peptide (de exemplu, proteaze, kinaze, fosfataze), proteine ​​sau peptide receptoare, proteine ​​sau peptide transportoare, proteine ​​bactericide și / sau de legare a endotoxinelor, proteine ​​structurale sau peptide, polipeptide imune, toxine, antibiotice, hormoni, factori de creștere, vaccinuri sau altele asemenea. Respectiva polipeptidă poate fi selectată din grupul constând din hormoni peptidici, interleukine, activatori ai plasminogenului tisular, citokine, imunoglobuline, în special anticorpi sau fragmente de anticorpi sau variante ale acestora.

Așa cum este utilizat aici, o „moleculă de imunoglobulină” ca exemplu pentru o polipeptidă de interes se referă la o proteină care cuprinde una sau mai multe polipeptide codificate substanțial sau parțial de gene de imunoglobulină sau fragmente de gene de imunoglobulină, de exemplu. g., un fragment care conține una sau mai multe regiuni de determinare a complementarității (CDR). Genele recunoscute ale imunoglobulinei includ genele regiunii constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon și mu, precum și nenumărate gene ale regiunii variabile ale imunoglobulinei. Lanțurile ușoare sunt de obicei clasificate e. g. fie ca kappa, fie ca lambda.

Lanțurile grele sunt de obicei clasificate e. g. ca gama, mu, alfa, delta sau epsilon, care la rândul lor definesc clasele de imunoglobulină, IgG, IgM, IgA, IgD și, respectiv, IgE. Respectiva imunoglobulină poate fi de orice izotip. Foarte des moleculele IgG (de exemplu IgG1) sunt produse / necesare ca proteine ​​terapeutice. O unitate structurală tipică de imunoglobulină (anticorp) cuprinde un tetramer. În natură, fiecare tetramer este compus din două perechi identice de lanțuri polipeptidice, fiecare pereche având un lanț „ușor” (aproximativ 25 kD) și un lanț „greu” (aproximativ 50-70 kD). Capătul N-terminal al fiecărui lanț definește o regiune variabilă de aproximativ 100 până la 110 sau mai mulți aminoacizi responsabili în principal de recunoașterea antigenului. Termenii lanț ușor variabil (VL) și lanț greu variabil (VH) se referă la aceste lanțuri ușoare și respectiv grele.

Anticorpii există ca imunoglobuline intacte sau ca un număr de fragmente bine caracterizate care pot, de ex. să fie produs prin digestie cu diferite peptidaze. Un fragment de anticorp este orice fragment al unui anticorp care cuprinde cel puțin 20 de aminoacizi din anticorpul menționat întreg, de preferință cel puțin 100 de aminoacizi care cel puțin încă au o capacitate de legare a antigenului. Fragmentul de anticorp poate cuprinde regiunea de legare a anticorpului, cum ar fi un fragment Fab, un fragment F (ab) 2, multicorpi cuprinzând mai multe domenii de legare, cum ar fi diabozii, triabocii sau tetocorpii, anticorpii cu un singur domeniu sau anticorpii. O variantă de anticorp este un derivat al unui anticorp sau fragment de anticorp având aceeași funcție de legare, dar de ex. o secvență de aminoacizi modificată. Respectivul anticorp și / sau fragment de anticorp poate cuprinde un lanț ușor murin, lanț ușor uman, lanț ușor umanizat, lanț greu uman și / sau lanț greu murin precum și fragmente active sau derivați ai acestora. Prin urmare, poate fi de ex. murin, uman, himeric sau umanizat. În timp ce diferite fragmente de anticorpi sunt definite în termeni de digestie a unui anticorp intact, un specialist va aprecia că astfel de fragmente Fab 'sau F (ab) 2 pot fi sintetizate de novo fie chimic, fie utilizând metodologia ADN-ului recombinant, afișarea peptidelor sau asemenea. Astfel, termenul anticorp, așa cum este utilizat aici, include și fragmente de anticorpi fie produse prin modificarea anticorpilor întregi, fie sintetizate de novo utilizând metodologii de ADN recombinant. Anticorpii includ, de asemenea, anticorpi monoclonali compuși cu un singur braț, anticorpi cu un singur lanț, inclusiv anticorpi cu un singur lanț Fv (scFv) în care un lanț variabil greu și unul ușor variabil sunt uniți împreună (direct sau printr-un linker peptidic) pentru a forma un polipeptid continuu, ca precum și diabetici, triboduri și tetrabodies (vezi de exemplu Pack și colab. J Mol Biol. 1995 10 februarie 246 (1): 28-34 Pack și colab. Biotehnologie (NY). 1993 11 noiembrie (11): 1271-7 Pack & amp Plueckthun Biochemistry. 1992, 18 februarie 31 (6): 1579-84). Anticorpii sunt e. g., policlonal, monoclonal, himeric, umanizat, cu lanț unic, fragmente Fab, cu lanț unic Fab (Hust și colab., BMC Biotechnol (2007) 7:14), fragmente produse de o bibliotecă de expresie Fab sau altele asemenea.

Polipeptidele produse în conformitate cu invenția pot fi recuperate prin metode cunoscute în domeniu. De exemplu, polipeptida poate fi recuperată din mediul nutritiv prin proceduri convenționale care includ, dar nu se limitează la, centrifugare, filtrare, ultra-filtrare, extracție sau precipitare. Purificarea poate fi efectuată printr-o varietate de proceduri cunoscute în domeniu, inclusiv, dar fără a se limita la, cromatografie (de exemplu schimb de ioni, afinitate, hidrofob, cromatofocus și excludere de dimensiuni), proceduri electroforetice (de exemplu, focalizare izoelectrică preparativă), solubilitate diferențială ( de exemplu, precipitație cu sulfat de amoniu) sau extracție. Mai mult, polipeptida poate fi obținută din celulele gazdă prin întreruperea celulelor.

De asemenea, este furnizată o metodă pentru producerea unui acid nucleic vector, așa cum este descris mai sus, cuprinzând etapa de asamblare a cel puțin unei casete (Cas-POI), de preferință o casetă de expresie (Exp-POI), într-un vector astfel încât caseta menționată cuprinde un prim polinucleotid (Pn-POI) care codifică polipeptida de interes, cel puțin un codon de oprire în aval de prima polinucleotidă și un al doilea polinucleotid în aval de codonul de oprire care codifică o ancoră transmembranară de imunoglobulină sau o variantă funcțională. Această metodă poate cuprinde în plus asamblarea unei casete de expresie (Exp-MSM) cuprinzând o genă marker selectabilă de mamifer, o casetă de expresie (Exp-MASM) care cuprinde o genă marker amplificabilă, selectabilă de mamifer, de preferință astfel încât caseta de expresie (Exp-MASM) să fie situat 5 'și caseta de expresie (Exp-MSM) este situată la 3' din caseta de expresie (Exp-POI) și în care casetele de expresie (Exp-MASM), (Exp-POI) și (Exp-MSM) sunt dispuse în aceeași orientare de 5 'la 3'.

De asemenea, este furnizată o celulă gazdă eucariotă, de preferință o mamiferă, care este obținută prin metoda de screening descrisă mai sus. De asemenea, este furnizat un eucariot, de preferință o celulă gazdă de mamifer care cuprinde o casetă (Cas-POI) cuprinzând o polinucleotidă heterologă și deci străină care codifică o polipeptidă de interes, cel puțin un codon de oprire în aval de polinucleotida heterologă menționată și un polinucleotid în aval de opritor codon care codifică o ancoră transmembranară a imunoglobulinei sau o variantă funcțională a acesteia. Caseta (Cas-POI) poate fi introdusă de ex. prin vectorul acid nucleic conform prezentei invenții. De preferință, caseta (Cas-POI) și / sau caseta (Cas-POI ') este o casetă de expresie.

Alte caracteristici ale casetei (Cas-POI) și detalii despre vectori adecvați sunt descrise mai sus și se aplică și celulei gazdă a prezentei invenții. Celulele gazdă eucariote adecvate sunt descrise mai sus. De preferință, celula gazdă eucariotă este o celulă gazdă de mamifer. Conform unei variante, celula gazdă eucariotă nu este o celulă B sau un derivat al celulei B. În consecință, celula gazdă eucariotă, de preferință mamiferă, este o celulă gazdă care nu exprimă în mod natural lanțurile receptorilor Ig alfa și Ig beta. Mai mult, în conformitate cu o variantă de realizare, nu există coexpresie artificială a lanțului receptorilor Ig alfa și Ig beta în celula gazdă menționată. Celulele CHO sunt celule gazdă preferate.

De asemenea, este furnizată o metodă pentru producerea unei celule gazdă eucariote, așa cum este descris mai sus, în care celula gazdă eucariotă este transfectată cu acidul nucleic vector conform prezentei invenții și / sau un acid nucleic heterolog care cuprinde o casetă (Cas-POI) conform prezenta invenție. Există mai multe metode adecvate cunoscute în stadiul tehnicii pentru introducerea unui vector de expresie într-o celulă gazdă de mamifer. Metodele respective includ, dar nu se limitează la transfecția fosfatului de calciu, electroporarea, lipofecția, transferul de gene biolistice și polimerizate. Pe lângă metodele tradiționale bazate pe integrarea aleatorie, de asemenea, abordările mediate prin recombinare pot fi utilizate pentru a transfera caseta (Cas-POI) în genomul celulei gazdă. Astfel de metode de recombinare pot include utilizarea de recombinaze specifice site-ului, cum ar fi Cre, Flp sau .PHI.C31 (a se vedea, de exemplu, Oumard și colab., Cytotechnology (2006) 50: 93-108), care pot media inserția direcționată a transgenelor. Alternativ, mecanismul de recombinare omologă ar putea fi utilizat pentru a introduce caseta (Cas-POI) (revizuită în Sorrell și colab., Biotechnology Advances 23 (2005) 431-469). Inserarea genei pe bază de recombinare permite minimizarea numărului de elemente care trebuie incluse în acidul nucleic heterolog care este transferat / introdus în celula gazdă. De exemplu, s-ar putea folosi un locus de inserție care să ofere deja promotor și site poli-A (exogen sau endogen) astfel încât numai elementele rămase (de exemplu, polinucleotida de interes, codonul stop și polinucleotida care codifică o ancoră transmembranară a imunoglobulinei a fragmentului funcțional al acestuia) trebuie transferat / transfectat în celula gazdă. Chiar și transferul părților casetei (Cas-POI) ar fi suficient dacă părțile lipsă ar fi prezente la locul de inserare. Variante ale unui vector de expresie adecvat conform prezentei invenții, precum și celule gazdă adecvate și polipeptide de interes sunt descrise în detaliu mai sus, ne referim la dezvăluirea de mai sus.

De asemenea, este furnizată o polipeptidă obținută printr-o metodă conform prezentei invenții, definită mai sus și în revendicări. Respectiva polipeptidă este de preferință o moleculă de imunoglobulină sau un fragment al acesteia. Polipeptidele produse în conformitate cu metodele prezentei invenții prezintă proprietăți bune de stabilitate. Rezultatele arată, de asemenea, că polipeptidele sunt exprimate într-o formă funcțională și, prin urmare, în conformația corectă. În consecință, invenția furnizează, de asemenea, polipeptide obținute prin metoda de producție conform prezentei invenții utilizând vectorul de expresie descris în detaliu mai sus. După cum este subliniat mai sus, polipeptidele sunt obținute cu un randament bun datorită etapei de selecție / screening încorporate. Polipeptida este preferabil o moleculă de imunoglobulină, cum ar fi un anticorp sau un fragment al acestuia.

Invenția este ilustrată în continuare de următoarele exemple nelimitative, care, totuși, descriu realizări preferate ale invenției.

Exemplul 1: Construcția vectorială a versiunii Ig Transmembrane

Un fragment de ADN sintetic de 1113 bp care codifică o parte a regiunii constante a lanțului greu IgG1 plus obturatorul de codon oprit cu scurgeri și domeniul transmembranar Ig și citoplasmatic este inserat în pBW201 (un vector standard care conține un lanț greu IgG1 și lanț ușor kappa) prin Age1 și Asc1 generând pNT11 (vezi tabelul 1). Secvența nucleotidică a domeniului transmembranar Ig utilizat este prezentată în SECV ID nr. Desigur, de asemenea, variante ale domeniului transmembranar Ig codificat pot fi utilizate în conformitate cu principiile prezentei invenții care asigură aceeași funcție de ancorare a membranei. Variantele menționate sunt omologe domeniului transmembranar Ig codificat și pot de ex. se poate obține prin substituție conservatoare de aminoacizi. Aceștia împărtășesc de preferință cel puțin 80%, 85%, 90% omologie. Polinucleotidele care codifică variantele respective de ex. hibridizează cu secvența prezentată în condiții stricte.

Gena marker de selecție DHFR cu pNT11 și pBW201 poate fi înlocuită cu un fragment sintetic de 1252 bp care codifică un mutant punct L23P al DHFR prin SwaI și BglII, generând astfel pNT29 și pBW478. Mutantul DHFR permite selectarea liniilor celulare dhfr +.

Vectorii FACS (pNT11, pNT29) se bazează pe vectorii standard pentru expresia anticorpilor (pBW201, pBW478). pNT11 și pBW201 diferă de pNT29 și pBW478 în caseta de selectare DHFR pe care o transportă. În afară de aceasta, coloanele vertebrale sunt identice. Vectorul are o configurație „tandem” mono-cistronică și conține casete de expresie cu lanț greu și anticorp, ambele conduse de promotorul / amplificatorul CMV. Singura modificare pentru a genera vectorii FACS a fost inserarea unui transmembrana IgG1 și a unui domeniu citoplasmatic 3 'al ADNc-ului lanțului greu anticorp (HC). Un dispozitiv de umplere scurt, cu un semnal de terminare a translației, este plasat între domeniul HC și domeniul transmembranar. Se așteaptă ca mediul de secvență selectat pentru codonul de oprire să conducă la o citire de până la 5%. Toți cei patru vectori codifică același anticorp IgG uman.

Așa cum este subliniat mai sus, acizii nucleici vector utilizați pentru exprimare și în special orientarea și dispunerea elementelor vectoriale alese permit exprimarea foarte eficientă a moleculelor de imunoglobulină. Vectorii adecvați care pot fi utilizați împreună cu prezenta invenție și care sunt descriși mai sus sunt ilustrate în tabelul următor (săgețile indică orientarea 5 'la 3' a elementelor genetice):

TABLE-US-00001 TABLE 1 Vector map pNT11 - "FACS vector" CMVprom / enhan .fwdarw. RK-intron .fwdarw. mAB-LC .fwdarw. SV40polyA .fwdarw. CMV prom / enhan .fwdarw. RK-intron .fwdarw. mAB-HC .fwdarw. Stuffer + codon stop leaky Ig domeniu transmembranar și domeniu cito-plasmatic .fwdarw. SV40polyA .fwdarw. Regiunea fagului f1 .fwdarw. SV40prom / enhan .fwdarw. Neo .fwdarw. Synth polyA Amp .fwdarw. SV40prom / enhan .fwdarw. DHFR .fwdarw. SV40pA .fwdarw.

Abrevierile din tabelul 1 au semnificația regulată, evidentă pentru persoana de specialitate în domeniu și așa cum este descris mai sus, și au în special următoarele semnificații: CMVprom / enh = citomegalovirus uman promotor / amplificator timpuriu imediat RK-intron = cuprinde intronul situsul de îmbinare donator al promotorului CMV și situsul de îmbinare acceptor al șoarecelui IgG cu regiune variabilă a lanțului greu (vezi de exemplu Eaton și colab., 1986, Biochimie 25, 8343-8347, Neuberger și colab., 1983, EMBO J. 2 (8 ), 1373-1378 poate fi obținut din vectorul pRK-5 (BD PharMingen)) mAB-LC = lanț ușor anticorp monoclonal mAB-HC = lanț greu anticorp monoclonal SV40polyA = SV40 poliA site SV40prom / enhan = SV40 promotor / amplificator Neo = neomicină fosfotransferază Synth polyA = situs sintetic de poliadenilare Amp = genă de rezistență la antibiotice beta lactamază DHFR = genă dihidrofolat reductază.

Exemplul 2: Transfecția și selecția celulelor CHO

Cultivarea, transfecția și screeningul celulelor se efectuează în baloane cu agitare folosind celule CHO în creștere în suspensie într-un mediu de cultură proprietar, definit chimic. Celulele sunt fie transfectate prin lipofecție, fie prin electroporare (nucleofecție) urmând instrucțiunile producătorului. Eficiența transfecției este verificată prin transfectarea unei plasmide raportoare GFP (proteină de fluorescență verde) și analiza citometrică în flux a celulelor transfectate. În funcție de viabilitatea celulei, selecția se începe la 24-48 de ore după transfecție prin adăugarea G418 care conține mediu selectiv în celule. De îndată ce celulele se recuperează la o viabilitate de peste 80%, se aplică o a doua etapă de selecție prin trecerea celulelor către mediu fără conținut de GX18, MTX (metotrexat). După recuperarea celulelor din selecția MTX, cultivarea este continuată în mediu care conține MTX pe parcursul ciclurilor de îmbogățire FACS, clonarea FACS sau clonarea și screeningul cu diluție limitată.

Viabilitatea și creșterea celulelor sunt monitorizate utilizând un sistem automat (ViCell, Beckmann Coulter).

Exemplul 3: Analiza FACS, îmbogățirea și clonarea celulelor

Etichetarea celulelor: 2. ori.Celule 10E7 per bazin transfectat sunt centrifugate și spălate cu 5 ml de PBS răcit (soluție salină tamponată cu fosfat) și resuspendate în 1 ml de PBS rece. O cantitate adecvată de anticorp anti-IgG marcat cu FITC (izotiocianat de fluoresceină) este adăugată la celule și este incubată pe gheață timp de 30 de minute în întuneric. Ulterior, celulele sunt spălate de două ori la temperatura camerei cu 5 ml PBS, resuspendate în 1 ml PBS, filtrate și distribuite într-un tub FACS pentru analiză, sortare și donare.

Analiza, sortarea și clonarea celulelor: Sortarea celulelor se realizează cu un FACSAria (Becton Dickinson) echipat cu o unitate de depunere automată de celule (ACDU) utilizând software-ul FACSDiva. Pentru a excita coloranții fluorescenici legați de anticorpul secundar, se utilizează un laser cu stare redusă, cu răcire cu aer și solid (Coherent.RTM. Sapphire.TM. Solid state) acordat la 488 nm. Intensitatea relativă a fluorescenței FITC este măsurată pe detectorul E printr-un filtru 530/30 BP. Cinci procente din cele mai mari celule fluorescente FITC sunt închise și sortate fie în bloc, fie ca celule unice în plăci cu 96 de godeuri.

Exemplul 4: Determinarea productivității și stabilității clonale

Productivitatea clonelor este analizată în experimente în lot și în loturi folosind diferite formate. Screeningul inițial al clonei se efectuează în teste discontinue cu 24 de godeuri prin însămânțarea celulelor pentru a scutura plăcile cu 24 de godeuri.Concentrațiile de anticorpi din supernatantul culturii celulare sunt determinate de proteina-A HPLC 10d după începerea culturii. Clonele cu cea mai mare producție sunt, de asemenea, analizate în modele de baloane de agitare în mod discontinuu și alimentat în lot. Culturile în loturi sunt însămânțate într-un balon de agitare 500 cu un volum de lucru de 100 ml și sunt cultivate într-un dulap de agitare (neumidificat) la 150 rpm și 10% CO2. Viabilitatea celulelor ar trebui să fie & gt90% la începerea testului. Densitatea celulelor de însămânțare este de 2 x 10 x 5 c / mL. Concentrația produsului / numărul celulei / determinarea viabilității a avut loc în zilele 3-7, 10 și 13. Experimentele pe loturi alimentate se fac folosind aceleași condiții, dar cu o densitate celulară inițială de 4 x 10 x 5 c / mL și cu adăugarea regulată de fluxuri. Stabilitatea clonală este evaluată prin cultivarea celulelor pe o perioadă de 14 săptămâni, cu măsurători de productivitate utilizând modelul de lot de balon de agitare la fiecare două săptămâni.

Exemplul 5: Analiza celulelor transfectate tranzitoriu

Pentru a testa dacă produsele de traducere legate de membrană sunt prezente pe suprafața celulei după transfecția cu noul vector FACS (aici pNT11 sau pNT29), celulele transfectate tranzitoriu sunt analizate prin imunocolorare și citometrie în flux. La 48 de ore după transfecție, celulele sunt colorate cu un anticorp marcat cu FITC îndreptat împotriva IgG umane. Celulele transfectate cu un vector de expresie GFP sunt utilizate ca control al transfecției, eficiența transfecției este calculată la aproximativ 60%. Celulele netransfectate și celulele transfectate cu vectorul standard (care nu cuprinde un domeniu transmembranar) nu prezintă niveluri semnificative de anticorp asociat la suprafață, în timp ce 16% din celulele transfectate cu vectorul FACS sunt colorate deasupra nivelului de fond. Acest lucru arată că peptida de fuziune, aici o moleculă de anticorp, ancorată la membrana celulară, poate fi detectată pe suprafața celulei.

Exemplul 6: Analiza și îmbogățirea celulelor transfectate stabile

După ce s-a demonstrat prezența anticorpului legat de membrană pe celulele transfectate tranzitoriu, se analizează nivelul de exprimare a suprafeței și distribuția în bazine selectate de celule transfectate.

Astfel, se poate demonstra că celulele producătoare pot fi îmbogățite selectiv prin sortare FACS. Prin urmare, celulele după transfecție sunt selectate cu G418 și ulterior cu MTX. Rezervele rezultate de celule rezistente sunt colorate cu anticorp anti-IgG marcat cu FITC și analizate prin citometrie în flux. Ca martor, celulele netransfectate sunt colorate și analizate. Subpopulațiile de celule pozitive sunt detectate în grupurile selectate transfectate cu vectorul FACS. Distribuția celulelor pozitive a diferit astfel între cele două bazine analizate. Pentru a evalua dacă celulele cu producție ridicată pot fi îmbogățite pe baza semnalului lor de fluorescență (și, prin urmare, permit o selecție cantitativă), celulele cu cea mai mare intensitate de fluorescență sunt sortate (top 5%) din fiecare dintre cele două bazine și subcultivate pentru a compara productivitatea cu piscina inainte de imbogatire.

Exemplul 7: Analiza productivității celulelor îmbogățite și neîmbogățite

Analizele de productivitate ale bazinelor selectate înainte și după îmbogățirea citometriei în flux se fac în culturi în loturi de baloane de agitare pentru a compara concentrația produsului final în ziua 13. În ziua 13, supernatantul este recoltat și analizat pentru conținutul de IgG prin Proteina-A-HPLC. Ambele grupuri prezintă o creștere semnificativă a nivelului de producție deja după efectuarea unui ciclu de îmbogățire FACS în conformitate cu învățăturile prezentei invenții. În timp ce concentrația produsului pentru grupul 1 crește cu un factor de aproximativ 2, grupul 2 crește cu un factor de aproape 10, arătând că celulele cu producție mare sunt detectate selectiv în timpul colorării și sortării. Deja în primul ciclu de îmbogățire se pot obține concentrații de anticorpi de aproape 250 mg / l.

Exemplul 8: Clonarea selectivă bazată pe citometrie în flux a celulelor cu mare producție

Citometria în flux poate fi utilizată pentru sortarea și însămânțarea celulelor colorate individuale în funcție de profilul lor de colorare. Pentru a analiza dacă o astfel de clonare selectivă are ca rezultat un număr mai mare de clone cu producție ridicată decât clonarea prin diluarea limitată, clonele sunt generate folosind ambele metode și productivitatea este analizată în culturi discontinue cu 24 de godeuri. Se fac culturi în loturi în plăci cu 24 de godeuri și în ziua 10 supernatantele sunt recoltate și măsurate pentru conținutul de IgG prin Proteina-A-HPLC. Rezultatele sunt după cum urmează:

TABLE-US-00002 TABLE 2 FACS sortare versus diluție limitată (LD) 0-25 26-50 51-75 76-100 101-125 126-150 Metodă mg / l mg / l mg / l mg / l mg / l mg / l LD - 12 0 1 0 1 0 clone obținute FACS - 2 2 2 2 0 1 clone obținute

Clonele derivate din citometrie în flux au o productivitate medie mai mare în comparație cu clonele derivate din diluția de calc, care se reflectă și în distribuția clonală a gamei de productivitate.

Exemplul 9: Compararea FACS și a vectorului standard

Pentru a confirma efectul benefic al îmbogățirii citometriei în flux a celulelor transfectate și pentru a compara utilizarea vectorului FACS (pNT29) cu un vector standard, celulele sunt transfectate și selectate cu G418 și MTX. Trei bazine de celule transfectate cu vectorul FACS (probele 1, 2 și 3) și trei bazine de celule transfectate cu vectorul standard (probele 7, 9 și 9) sunt analizate prin citometrie în flux și 5% având cel mai mare semnal de colorare sunt sortate. Culturile în loturi de baloane se agită pentru a compara creșterea concentrației produsului după îmbogățire. Bazinele transfectate și selectate sunt colorate și sortate prin flux-citometrie pentru a îmbogăți topul 5% pe baza intensității fluorescenței. Înainte și după îmbogățire, se fac culturi în loturi de baloane agitate și după 13 zile supernatantele sunt analizate prin Proteina-A-HPLC. Rezultatele sunt după cum urmează (aproximativ):

TABLE-US-00003 TABLE 3 Rezultate obținute cu vectorul FACS Eșantion concentrație produs Eșantion concentrație produs Eșantion concentrație produs Eșantion 1 10 mg / l Eșantion 2 40 mg / ml Eșantion 3 15 mg / ml vector FACS, vector FACS, vector FACS, înainte îmbogățire înainte de îmbogățire îmbogățire Eșantion 1 55 mg / ml Eșantion 2 65 mg / ml Eșantion 3 95 mg / ml vector FACS, vector FACS, vector FACS, prima îmbogățire 1 îmbogățire 1 îmbogățire Eșantion 1 100 mg / ml Eșantion 2 90 mg / ml Eșantion 3 155 mg / ml FACS al doilea vector FACS, vector FACS, îmbogățire A doua îmbogățire A doua îmbogățire Eșantion 1 365 mg / ml Eșantion 2 340 mg / ml Eșantion 3 85 mg / ml vector FACS, vector FACS, vector FACS, a 3-a îmbogățire a 3-a îmbogățire A 3-a îmbogățire

TABLE-US-00004 TABLE 4 Rezultate obținute cu vectorul standard Eșantion Concentrație produs Eșantion Concentrație produs Eșantion Concentrație produs Eșantion 7 40 mg / l Eșantion 8 5 mg / ml Eșantion 9 5 mg / ml Vector standard standard standard, vector, înainte de vector, înainte de îmbogățire îmbogățire îmbogățire Eșantion 7 55 mg / ml Eșantion 8 10 mg / ml Eșantion 9 2 mg / ml Standard standard Vector standard, vector, 1 vector, 1 întâi îmbogățire îmbogățire Eșantion 7 50 mg / ml Eșantion 8 12 mg / ml Eșantion 9 10 mg / ml Vector standard standard, al doilea vector de îmbogățire, al doilea al doilea îmbogățire Eșantion 7 25 mg / ml Eșantion 8 15 mg / ml Eșantion 9 10 mg / ml Vector standard standard standard, vector, al treilea vector, al treilea al treilea îmbogățire îmbogățire îmbogățire

După cum se demonstrează prin rezultate, nivelul de producție al celulelor transfectate cu vector FACS crește semnificativ pentru cele trei grupuri testate, în timp ce în cazul vectorului standard, un singur grup a prezentat o creștere semnificativă a concentrației produsului. Media concentrațiilor produsului după îmbogățirea cu vectorul FACS este semnificativ mai mare ca la vectorul standard. Două cicluri de îmbogățire FACS secvențiale suplimentare sunt realizate pentru a îmbogăți celule cu producție ridicată, arătând că numai în cazul vectorului FACS productivitatea populațiilor de celule este crescută. În cele din urmă, concentrațiile produsului pot fi crescute de 4 până la 30 de ori.

Pentru compararea adecvării ambilor vectori pentru clonarea selectivă, clonele din bazine ne-îmbogățite cu productivitate comparabilă sunt sortate selectiv prin citometrie în flux. Ulterior, productivitatea clonelor este analizată în culturi discontinue cu 24 de godeuri. Clonele derivate din pool-urile transfectate cu FACS vector s-au dovedit a avea un nivel mediu de expresie mai mare ca clone din pool-urile standard transfectate cu vector. Distribuția clonală a productivității arată că, în cazul vectorului FACS, se obține un număr mai mare de clone bune producătoare (a se vedea tabelul 5):

TABLE-US-00005 TABLE 5 Vector standard versus FACS vector (pNT29) 0-50 51-100 101-150 151-200 201-250 251-300 301-350 Method mg / l mg / l mg / l mg / l mg / l mg / l mg / ml Stan- 31 7 0 2 0 1 0 vector dard FACS 21 20 4 4 4 2 1 vector

Exemplul 10: Comparații suplimentare între vectorii FACS și vectorii de expresie standard

Vectorii pBW201, pNT11, pBW478 și pNT29 sunt obținuți așa cum este descris în exemplul 1.

b) Transfecția, selecția și clonarea celulelor CHO

Acest lucru se face așa cum este descris în exemplul 2.

c) Analiza FACS, îmbogățirea și clonarea celulelor

Acest lucru se face așa cum este descris în exemplul 3.

d) Determinarea producției de anticorpi și a stabilității clonale

Productivitatea clonelor și a grupurilor este analizată în experimente în lot și în loturi folosind diferite formate. Bazinele înainte și după îmbogățirea FACS sunt analizate în teste de lot de baloane de agitare prin însămânțare de 1,10 x 5 celule pe ml (c / ml) în volum de lucru de 50 ml folosind flacoane de agitare cu capacitate de 250 ml. Conținutul de IgG este analizat prin Proteina-A HPLC din probe prelevate în ziua 13 a culturii discontinue. Screeningul inițial al clonelor se efectuează în teste discontinue cu 24 de godeuri prin însămânțarea celulelor în plăci agitate cu 24 de godeuri. Concentrațiile de anticorpi în supernatantul culturii celulare sunt determinate de proteina cantitativă A-HPLC la 10 zile după începerea culturii. Clonele cu cea mai mare producție sunt analizate în modele de baloane de agitare în mod discontinuu și alimentat în lot. Culturile în loturi sunt însămânțate în baloane de agitare (500 ml capacitate) cu un volum de lucru de 100 ml și sunt cultivate într-un dulap de agitare (nu umidificat) la 150 rpm, 36,5 grade. C. și 10% CO2. Viabilitatea celulelor este de & gt 90% la începerea testului. Densitatea celulelor de însămânțare este de 2 x 10 x 5 c / mL. Concentrațiile de anticorpi, numărul de celule și viabilitatea sunt determinate în zilele 3-7, 10 și 13. Experimentele pe loturi alimentate se fac folosind aceleași condiții, dar cu o durată de rulare de 17 zile și cu o densitate a celulei inițiale de 4 x 10. 5 c / mL și cu adăugarea regulată de furaje începând cu densități celulare viabile de peste 7. ori.10 x 6 c / mL. Stabilitatea clonală este evaluată prin cultivarea celulelor pe o perioadă de 12 săptămâni, cu măsurători de productivitate utilizând modelul lot de balon de agitare la fiecare două săptămâni.

e) Analiza și îmbogățirea celulelor transfectate stabile

Expresia suprafeței în populațiile de celule transfectate stabil este analizată pentru a testa dacă celulele producătoare pot fi îmbogățite selectiv prin sortare FACS. Prin urmare, celulele după transfecție sunt selectate cu G418 și ulterior cu MTX. Rezervele rezultate (10 pe vector) de celule rezistente sunt colorate așa cum este descris mai sus și analizate prin flux-citometrie. Cu protocolul de colorare utilizat, subpopulațiile pozitive de celule ar putea fi detectate în ambele grupuri de celule transfectate pBW478 și pNT29. Așa cum era de așteptat, o proporție mai mare de celule FACS pozitive se găsește cu vectorul FACS.

Pentru a arăta că celulele cu producție mare pot fi îmbogățite pe baza semnalului lor de fluorescență, celulele cu cea mai mare intensitate de fluorescență sunt sortate (top 5%) din grupurile de celule individuale și subculturate pentru a compara productivitatea cu grupul înainte de îmbogățire. Un al doilea ciclu de îmbogățire se realizează după extinderea și punerea în comun a populațiilor de celule sortate o singură dată. Procentul de colorare a celulelor pozitive a crescut în mod surprinzător cel mai mult cu vectorul standard în primul ciclu de îmbogățire. Bazinele transfectate cu vector FACS au arătat factori de îmbogățire similari cu protocolul de colorare utilizat și, în general, s-a observat o variație semnificativă a biliardului. După cel de-al doilea ciclu de îmbogățire, se obțin populații de celule FACS pozitive aproape omogene (vezi Tabelul 6a și 6b).

Tabelul 6a și 6b: Rezultate medii de colorare și productivitate înainte și după sortare

TABLE-US-00006 TABLE 6a Analiza FACS a celulelor colorate înainte și după ciclurile de îmbogățire FACS% celule deasupra pământului pBW478 (vector de referință) pNT29 (vector FACS) Colorare FITC Nu FACS 1x FACS 2x FACS Nu FACS 1x FACS 2x FACS AVG 5.9 83,2 90,4 14,2 46,6 90,5 STDD 3.396403 15.80158 1.126795 8.974284 13.51148 1.422439 Tabelul 6a: Bazele de celule transfectate și selectate au fost colorate pentru IgG de suprafață. Se arată procentul mediu de celule colorate peste nivelul celulelor netransfecționate. Înainte de îmbogățire, un procent mai mare de celule pozitive se găsește cu vectorul FACS. După primul ciclu de îmbogățire din primii 5%, proporția de colorare a celulelor pozitive a fost cea mai mare cu vectorul standard. După al doilea ciclu de îmbogățire, mai mare de 90% din toate celulele au fost pozitive cu ambele abordări. Abrevieri: AVG: medie și STDD: deviație standard.

TABLE-US-00007 TABLE 6b Productivities of in shake flask batch model before and after FACS enriching cycles pBW478 (vector de referință) pNT29 (vector FACS) mAb (mg / L) Nu FACS 1x FACS 2x FACS Nu FACS 1x FACS 2x FACS AVG 38,5 123,4 68,3 46,5 171,8 363 STDD 17,66509 101,8563 6,592926 15,30614 114,1936 70,19259 Tabelul 6b: Productivitatea bazinelor de celule este analizată din culturi în loturi de baloane de agitare prin Proteina-A HPLC în ziua 13 a culturii. Primul ciclu de îmbogățire a condus la o creștere semnificativă a productivității în ambele cazuri. După a doua îmbogățire, numai piscinele de celule transfectate cu vector FACS au prezentat o creștere suplimentară a productivității.

f) Analiza productivității celulelor îmbogățite și neîmbogățite

Analiza productivității bazinelor selectate înainte și după îmbogățirea citometriei în flux se face în culturi în loturi de baloane agitate pentru a compara titlurile finale în ziua 13. Productivitatea bazinelor înainte de îmbogățire este într-un interval foarte comparabil pentru ambii vectori utilizați. Odată cu primul ciclu de îmbogățire pe grupurile individuale, se obține o îmbunătățire semnificativă a productivității medii cu toate abordările și, din nou, există variații substanțiale între grupurile individuale (vezi Tabelul 6b). În mod surprinzător, productivitatea bazelor transfectate cu vector standard nu este mai mare în comparație cu cele transfectate cu vector FACS, deși s-a văzut înainte un nivel mult mai mare de celule pozitive cu colorare FACS. Prin sortarea a doua oară din populațiile de celule sortate grupate, nu se realizează nicio îmbunătățire a productivității cu vectorul standard. În schimb, se obține o productivitate mai mică, deși rezultatul colorării FACS a sugerat că aproape 100% din celule ar trebui să producă anticorpi (vezi Tabelul 6a). Productivitatea bazinelor transfectate cu vector FACS ar putea fi îmbunătățită semnificativ prin sortarea a doua oară. Procedura FACS utilizată duce la îmbogățirea mai selectivă a celulelor cu producție ridicată, cu o creștere a productivității de aproximativ cel puțin 8 ori comparativ cu populația nesortată și de cel puțin 2 ori comparativ cu grupurile după o sortare.

g) Clonarea selectivă a celulelor cu mare producție bazată pe citometrie în flux

Citometria în flux poate fi utilizată pentru sortarea și însămânțarea celulelor colorate individuale în funcție de profilul lor de colorare. Pentru a analiza dacă o astfel de clonare selectivă are ca rezultat un număr mai mare de clone cu producție mare atunci când se utilizează vectorul FACS în comparație cu vectorul standard, clonele sunt generate folosind ambele metode, iar productivitatea este analizată în culturi discontinue cu 24 de godeuri.

Într-o primă rundă, celulele sunt direct clonate FACS din grupurile de celule selectate de MTX fără nici o etapă de pre-îmbogățire. Trei bazine pe vector sunt alese pe baza profilului lor de colorare.

Clonele sunt generate din primele 5% din bazinele de celule colorate și în total sunt analizate aproximativ 500 de clone. În timp ce productivitatea medie a clonelor cu vectorul de referință a fost de 39 mg / L, clonele FACS-vector au produs în medie 87 mg / L. Așa cum se arată în Tabelul 7a, acest lucru este reflectat și de distribuția clonală, care confirmă că o proporție mult mai mare de clone cu producție mare se obține cu vectorul FACS. Interesant este faptul că una din cele peste 270 de clone analizate din transfecția vectorială standard a avut o productivitate de aproape 2 ori mai mare comparativ cu celelalte. Această clonă excepțională este desemnată LP. Identificarea unei astfel de clone celulare de mare producție cu setarea vectorială standard în combinație cu o procedură de screening FACS este, în general, posibilă. Cu toate acestea, este un eveniment foarte rar și, astfel, norocos. Aceasta este, de asemenea, diferența decisivă față de procesul de selecție conform învățăturilor prezentei invenții. În timp ce configurarea standard permite selectarea producătorilor (foarte) mari numai în cazuri excepționale și, prin urmare, rare, metoda conform prezentei invenții permite selectarea producătorilor (foarte) mari reproductibil și, astfel, în mod fiabil.

Un al doilea experiment de clonare FACS este efectuat pornind de la cele 10 populații grupate pe vector după primul ciclu de îmbogățire. De această dată, aproximativ 240 de clone sunt ecranate în culturi discontinue cu 24 de godeuri. Din nou, clonele obținute cu vectorul FACS au o productivitate medie mult mai mare decât vectorul standard de referință. Nu se obține nicio îmbunătățire în comparație cu clonarea fără pre-îmbogățire cu vectorul de referință la o productivitate medie a clonei de 40 mg / L. Clona LP nu a fost identificată din nou. În cazul clonelor transfectate cu vectorul FACS, s-a obținut o productivitate medie de 275 mg / L cu metoda FACS utilizată. Distribuția clonală demonstrează în mod clar superioritatea configurării vectorului FACS în ceea ce privește clonarea selectivă a producătorilor mari (vezi Tabelul 7b).

Tabelul 7a și 7b: Comparația productivității clonelor

TABLE-US-00008 TABLE 7a 24-well-Batch - Clonal distribution pBW478 pNT29 0-50 mg / L 196 163 51-100 mg / L 70 22 101-150 mg / L 8 11 151-200 mg / L 2 5 201 -250 mg / L 0 13 251-300 mg / L 2 9 301-350 mg / L 1 10 351-400 mg / L 0 6 401-450 mg / L 0 5 451-500 mg / L 0 2 501-550 mg / L 0 1 551-600 mg / L 1 0 Tabelul 7a: Clonele sunt generate prin flux-citrometrie din top 5% din cele trei bazine de celule colorate cu cel mai mare procent de colorare a celulelor pozitive după selecție. Pentru evaluarea productivității, s-au făcut culturi discontinue în plăci cu 24 de godeuri și în ziua 10 supernatantele au fost recoltate și măsurate pentru conținutul de IgG prin Proteina-A-HPLC. Aici este prezentată distribuția clonală a gamei de productivitate. O proporție semnificativ mai mare de clone cu producție mare este obținută atunci când se utilizează vectorul FACS (pNT29).

TABLE-US-00009 TABLE 7b 24-well-Batch: FACS Cloning Pooled Pooled pBW478 pNT29 0-50 mg / L 102 22 51-100 mg / L 17 21110-150 mg / L 13 5 151-200 mg / L 5 3 201-250 mg / L 2 7 251-300 mg / L 0 11 301-350 mg / L 0 11 351-400 mg / L 0 15 401-450 mg / L 0 9 451-500 mg / L 0 7 501 -550 mg / L 0 7 551-600 mg / L 0 1 601-650 mg / L 0 3 Tabelul 7b: Au fost analizate clonele obținute prin clonarea FACS din top 5% din bazinele combinate colorate după un ciclu de îmbogățire. Nu s-a găsit niciun beneficiu al pre-îmbogățirii pentru celulele transfectate cu vector de referință (pBW478), în timp ce în cazul celulelor transfectate cu vector FACS (pNT29), pre-îmbogățirea a dus la o reducere semnificativă a non-producătorilor și la o creștere a productivității medii de clone.

h) Caracterizarea clonelor

Clona LP derivată din vectorul standard, precum și 10 clone cu vector FACS de mare producție sunt extinse pentru a agita baloane și testate în loturi generice de baloane de agitare și în modele alimentate pentru a evalua potențialul lor de fabricație.

Productivitatea în culturi discontinue este aproximativ aceeași în intervalul de 1 g / L pentru toate clonele testate. Productivitatea lotului alimentat este, de asemenea, foarte comparabilă pentru toate clonele și în intervalul de 3,5-4 g / L (vezi Tabelul 8).Nu se observă nicio diferență semnificativă în parametrii de creștere atunci când se compară clonele transfectate vector FACS cu clonele transfectate vector de referință (LP și clone din experimentele anterioare). De asemenea, stabilitatea producției este ridicată pentru clonele derivate din vectorul FACS, doar una din 10 clone analizate au prezentat o scădere a productivității mai mare de 25% după 12 săptămâni în cultură, ceea ce reprezintă un raport mai mic de clone instabile așa cum sa observat cu vectorul standard de referință din experimentele anterioare (datele nu sunt prezentate).

TABELUL-SUA-00010 TABELUL 8 Productivitatea bazinului: Flacon de agitare lot discontinue (SF) model mAb (g / L) Lot SF SF lot alimentat 1 = LP 1,1 4,3 2 0,9 3,7 3 1,0 3,9 4 1,0 3,8 5 1,0 3,8 6 1,0 3,9 7 1,2 3,3 8 1,0 3,8 9 0,9 3,6 10 1,0 3,7 11 0,9 3,3 Tabelul 8: Clona cu cea mai mare producție obținută cu vectorul standard (pBW478) și 10 clone derivate din vectorul FACS (pNT29) sunt analizate în culturi în balon discontinuu și alimentat . Conținutul de IgG este analizat prin Proteina-A HPLC în ziua 13 (culturi discontinue) sau în ziua 17 (culturi discontinue alimentate). Toate conurile analizate produc într-un interval comparabil.

Exemplul 11: Producția pe scară largă a polipeptidelor cu celule CHO transfectate

Producerea polipeptidelor pe scară largă se poate face de exemplu în bioreactoare cu undă, sticlă sau oțel inoxidabil. În acest scop, celulele sunt extinse, de obicei pornind de la un singur flacon înghețat, de exemplu un flacon de la o bancă de celule master. Celulele sunt decongelate și extinse prin mai mulți pași. Bioreactoarele de scară diferită sunt inoculate cu cantități adecvate de celule. Densitatea celulei poate fi mărită prin adăugarea de soluții de alimentare și aditivi la bioreactor. Celulele sunt menținute la o viabilitate ridicată pentru o perioadă lungă de timp. Concentrațiile produsului în reactor variind de la câteva sute de miligrame pe litru până la câteva grame pe litru sunt atinse pe scară largă. Purificarea se poate face prin metodologia standard de cromatografie, care poate include afinitate, schimb de ioni, interacțiune hidrofobă sau pași de cromatografie de excludere a dimensiunii. Mărimea bioreactorului poate fi de până la câteva mii de litri de volum în scara finală (vezi și F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398).

71219ADN Secvență artificială secvență polinucleotidică a unui domeniu transmembranar IgG1 uman, inclusiv stuffermisc_feature (1) .. (7) Stuffer inclusiv stop codonmisc_feature (1) .. (3) Stop codonmisc_feature (4) .. (6) Codon suplimentar pentru a media scurgerea opririi în amonte codon 1tgactagagc tgcaactgga ggagagctgt gcggaggcgc aggacgggga gctggacggg 60ctgtggacga ccatcaccat cttcatcaca ctcttcctgt taagcgtgtg ctacagtgcc 120accgtcacct tcttcaaggt gaagtggatc ttctcctcgg tggtggacct gaagcagacc 180atcatccccg actacaggaa catgatcgga cagggggcc secvență 219225PRTArtificial Sequencepolypeptide de o regiune transmembranară putativ derivată dintr-un domeniu de IgG1 transmembranar uman 2Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val1 5 10 15Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe 20 25373PRTA Secvență artificială secvență polipeptidică a unei regiuni transmembranare Ig derivată din domeniul transmembranar IgG1 uman cuprinzând aminoacizii derivați din codonul stop și codonul adiacent, o regiune de legătură și un putativ e regiunea transmembranară MISC_FEATURE (1) .. (2) aminoacizi care sunt cel mai probabil folosiți la codonul de oprire TGA și codonul din aval în cazul citirii prin MISC_FEATURE (3) .. (20) Regiune de conectare putativă derivată din domeniul transmembranar IgG1 uman MISC_FEATURE (21) .. (45) Regiunea transmembranară putativă derivată din domeniul transmembranar IgG1 uman - regiunea menționată poate fi, de asemenea, considerată ca cuprinzând următorii doi aminoacizi MISC_FEATURE (46) .. (73) Regiune citoplasmatică putativă derivată din IgG1 uman - primul doi aminoacizi pot fi de asemenea considerați ca aparținând domeniului transmembranar 3Trp Leu Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly1 5 10 15Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe 20 25 30Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys Val Lys 35 40 45Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile Pro Asp 50 55 60Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala65 70428PRTA Secvență artificială Regiune citoplasmatică derivată dintr-o transmembrana IgG1 umană face principal 4Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile1 5 10 15Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 20 25518PRTA Secvență artificială Regiune de conectare derivată din domeniul transmembranar IgG1 uman 5Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu1 5 10 15Asp Gly626PRTA Secvență artificială Regiune citoplasmatică derivată dintr-un domeniu transmembranar IgG1 uman 6Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile Pro1 5 10 15Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 25727PRTA Secvență artificială secvență polipeptidică a unei regiuni transmembranare putative derivată dintr-un domeniu transmembranar IgG1 uman 7Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val1 5 10 15Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys Val 20 25


Priveste filmarea: Transcrição em procariotos (Ianuarie 2022).