Informație

Ce determină dacă o proteină mică / o peptidă mare este imunogenă?


Mă întreb dacă există un anumit prag de mărime sau o proprietate structurală specifică care determină dacă o proteină mică sau o peptidă mare ar provoca o reacție imună.

Context: există o serie de medicamente în curs de dezvoltare bazate pe anticorpi mimetici (schele mici de proteine ​​cu pliere stabilă). Acestea tind să aibă o dimensiune de aproximativ 50-60 aminoacizi (6-7 kD). Acestea tind să fie mult mai ușor de proiectat decât anticorpii umani / umanizați. Cu toate acestea, nu este neobișnuit ca acestea să provoace anafilaxie, mai ales dacă sunt administrate în mod repetat. Ar putea fi bine să concepeți cumva o versiune a unui mic anticorp mimetic care în sine nu provoacă o reacție imună.

Sunt peptidele în jur de 10-20 aminoacizi de obicei imunogene? Dar cele puțin mai mari până la 30 de aminoacizi? Contează dacă au o structură secundară sau terțiară stabilă?


Editat pentru a șterge secțiunea off-topic:

Majoritatea proteinelor (toate?) Sunt în cele din urmă imunogene. Nu vă puteți concepe cu adevărat calea în jurul imunogenității, ceea ce este un lucru bun, pentru că altfel am fi toți morți de viruși.

Evident, nu toate proteinele sunt la fel de imunogene, dar practic toate proteinele terapeutice sunt imunogene într-un anumit ritm. Un lucru care pare asociat pozitiv cu imunogenitatea în această analiză este structura cuaternară, dar este cantitativă, nu calitativă.

Unele dintre antigenele sintetice utilizate în mod obișnuit utilizate în biochimie, cum ar fi capătul HA C (24 reziduuri) sau FLAG (8 reziduuri) sunt destul de mici.

Mai general, acest studiu constată că chiar și 3-5 peptide reziduale pot fi suficiente pentru a crește răspunsurile imune. Asa de probabil orice polipeptidă este potențial imunogenă.

Este puțin probabil ca astfel de peptide mici să aibă o structură secundară / terțiară semnificativă. Cred că ar trebui să aveți o proteină destul de ciudată din punct de vedere structural pentru a evita orice potențial răspuns imun. Cu toate acestea, dacă ați avut o proteină insolubilă sau sechestrată cumva s-ar putea să o puteți evita, dar nu sunt un expert, așa că nu pot spune cum.


Mărimea și forma moleculelor de proteine ​​la nivelul nanometric determinat de sedimentare, filtrare cu gel și microscopie electronică

O parte importantă a caracterizării oricărei molecule proteice este determinarea dimensiunii și formei acesteia. Sedimentarea și filtrarea gelului sunt tehnici hidrodinamice care pot fi utilizate pentru această analiză structurală cu rezoluție medie. Această revizuire colectează o serie de calcule simple care sunt utile pentru a gândi structura proteinelor la nivel nanometric. Cititorilor li se amintește că ecuația Perrin nu este, în general, o abordare validă pentru a determina forma proteinelor. În schimb, este prezentat un ghid simplu, bazat pe coeficientul de sedimentare măsurat și un maxim calculat S, pentru a estima dacă o proteină este globulară sau alungită. Se reamintește că o coloană de filtrare pe gel fracționează proteinele pe baza razei lor Stokes, nu a greutății moleculare. Greutatea moleculară poate fi determinată prin combinarea sedimentării în gradient și a filtrării pe gel, tehnici disponibile în majoritatea laboratoarelor de biochimie, așa cum au propus inițial Siegel și Monte. În cele din urmă, umbrirea rotativă și microscopia electronică cu pete negative sunt tehnici puternice pentru rezolvarea dimensiunii și formei moleculelor și complexelor proteice unice la nivel nanometric. O combinație de hidrodinamică și microscopie electronică este deosebit de puternică.


Concluzie

Stabilitatea, eficacitatea biologică, profilul farmacocinetic și imunogenitatea sunt parametrii cei mai critici pentru a dezvolta o peptidă ca agent terapeutic. În ultimii ani, unele companii farmaceutice au contribuit la creșterea rapidă a interesului pentru peptide ca potențiali candidați la medicamente. Se presupune că peptidele sunt, în general, slabe candidate la medicamente, din cauza înclinației lor mai mari de a fi metabolizate rapid, precum și de biodisponibilitate orală scăzută. Conceptul că aceste medicamente nu sunt disponibile pe cale orală determină întotdeauna aceste companii să dezvolte noi strategii de producție diverse. Aceste strategii au avut ca scop reducerea metabolismului acestor peptide împreună cu dezvoltarea diferitelor căi alternative de administrare pentru a crește numărul de medicamente pe bază de peptide pe piață.


Fără job prea mare și fără proteine ​​prea mici pentru Cryo-EM

Cercetătorii UT Southwestern au folosit microscopie crio-electronică (crio-EM) pentru a determina structura aproape atomică a celei mai mici proteine ​​de membrană rezolvată până în prezent. Munca lor ar putea duce la imunoterapii mai bune în cancer și la tratamente îmbunătățite pentru bolile autoimune, cum ar fi lupusul.

Cryo-EM - tehnologia creditată cu „revoluția rezoluției” în curs de desfășurare în biologia structurală - folosește un microscop masiv pentru a trage un flux îngust de electroni prin probe subțiri, congelate rapid. Proteina STING (Stimulator of Interferon Genes) studiată în instalația de microscopie crio-electronică 24/7 a UT Southwestern este de aproximativ jumătate din dimensiunea celei mai mici proteine ​​de membrană determinate, au spus cercetătorii.

Dr. Zhijian "James" Chen al UT Southwestern este autorul corespunzător a trei studii publicate online de către Natură care descriu această lucrare. Două studii au dezvăluit prima structură completă a proteinei evazive STING atașată la diferite molecule din cale. STING este un membru cheie al unei căi importante în imunitatea înnăscută - prima linie de apărare a organismului împotriva infecțiilor. Al treilea studiu oferă o perspectivă asupra funcției primitive a căii cGAS-STING și subliniază importanța înțelegerii structurii sale proteice.

"Având structura proteinei STING de lungime completă la o rezoluție aproape atomică este foarte important pentru înțelegerea imunității înnăscute. Este, de asemenea, important pentru dezvoltarea medicamentelor care activează STING pentru imunoterapia cancerului sau inhibă proteina pentru tratamentul bolilor autoimune, cum ar fi lupusul și artrita ", a declarat dr. Chen, director al Centrului pentru Cercetarea Inflamatiei, profesor de biologie moleculara, si un investigator al Institutului Medical Howard Hughes la UT Southwestern.

Dr. Chen a primit recent Premiul Breakthrough 2019 în științe ale vieții de 3 milioane de dolari - unul dintre cele mai prestigioase premii biomedicale din lume - pentru descoperirea enzimei cGAS. Acest senzor ADN lansează apărarea imună a organismului împotriva infecțiilor și cancerelor într-o cale în care proteina STING este esențială. Enzima cGAS patrulează interiorul celulei și declanșează un răspuns imun atunci când întâlnește ADN străin. De asemenea, poate declanșa autoimunitatea atunci când găsește auto-ADN în zone ale celulei în care acel material genetic nu ar trebui să existe. cGAS produce o moleculă mică numită cGAMP (GMP-AMP ciclic), care se leagă de STING și lansează un răspuns imun.

„Calea cGAS-cGAMP-STING duce la producerea de interferon la mamifere ca răspuns la invazia ADN”, a spus dr. Chen. Interferonii - proteine ​​de semnalizare - spun celulelor să își mărească apărarea împotriva invadatorilor străini.

Unul dintre cele două studii structurale raportează prima structură a STING în complex cu TBK1 (Kinase de legare la tancuri 1), molecula care o activează și duce la producerea de interferoni specifici și a altor molecule de semnalizare. Experimentele, care au folosit atât proteine ​​STING umane, cât și de pui, dezvăluie și capătul cozii STING, care era invizibil în structurile anterioare.

Această coadă lipsește în STING de anemonele marine, subiectul celei de-a treia lucrări a Dr. Chen. Anemonele marine fac parte dintr-un grup de nevertebrate (creaturi cărora le lipsește o coloană vertebrală) despre care se crede că există de sute de milioane de ani înainte ca primii oameni să existe. Acest studiu constată că STING în anemonele marine pot activa un răspuns imun prin autofagie. Adesea numită menaj celular, autofagia elimină moleculele nedorite - în acest caz agenții patogeni - din celulă, prin descompunerea lor pentru reciclare. Oamenii au calea imună c-GAS-STING-la-autofagie, precum și calea c-GAS-STING-la-interferon de care anemonele marine nu au.

Această descoperire l-a determinat pe Dr. Chen să sugereze că, la fel ca într-un scorpion, „STING este în coadă”. Mai serios, el a spus că studiul sugerează că autofagia este o cale primordială (primitivă) pentru imunitate care s-a dezvoltat mai devreme decât calea interferonului găsită la om.

„STING este de departe cea mai mică proteină de membrană care a fost rezolvată până la o rezoluție aproape atomică folosind crio-EM”, a spus dr. Xiaochen Bai, un autor corespondent al celor două lucrări de structură STING. Prin urmare, aceasta realizare reprezinta o alta piatra de hotar in istoria determinarii structurale a crio-EM si indica faptul ca crio-EM a devenit un instrument puternic pentru a studia macromoleculele biologice mici incorporate in membrana. Dr. Bai este profesor asistent de biofizică și biologie celulară și un cercetător Virginia Murchison Linthicum în cercetare medicală.

Al treilea autor corespunzător, dr. Xuewu Zhang, profesor asociat de farmacologie și biofizică, a subliniat unele beneficii ale crio-EM.

"Tehnologia preferată de mult timp pentru biologia structurală - cristalografia cu raze X - necesită cristalizarea moleculelor pentru a le determina structurile. Proteinele de membrană au fost notoriu greu de cristalizat", a explicat dr. Zhang, un cercetător Virginia Murchison Linthicum în cercetare medicală. „Chiar și atunci când cristalizează, adesea difracționează un fascicul de raze X foarte slab, ceea ce face dificilă obținerea de structuri de înaltă rezoluție din datele de difracție. Aceste noi studii demonstrează avantajele speciale ale crio-EM în eliminarea necesității creșterii cristalelor Un alt avantaj al crio-EM este că este posibil să capturăm mai multe conformații - sau structuri dinamice - dintr-un eșantion, ceea ce ne permite să generăm „filme” pentru a înțelege cum acționează macromoleculele ”, a spus el.

Acest articol a fost republicat din materialele furnizate de UT Southwestern. Notă: este posibil ca materialul să fi fost editat pentru lungime și conținut. Pentru informații suplimentare, vă rugăm să contactați sursa citată.


Rezultate

Clasificarea pMHC imunogene

Pentru a investiga preferințele peptidice în recunoașterea celulelor T, este nevoie de seturi bine definite de pMHC imunogene și neimunogene. Prin urmare, au fost stabiliți parametri stricți pentru a clasifica numai acele pMHC pentru care imunogenitatea sau absența acestora a fost puternic arătată la infecție sau vaccinare. Clasificarea pMHC imunogene din răspunsurile imune pozitive la infecție sau vaccinare este relativ simplă. În schimb, clasificarea pMHC-urilor neimunogene (adică nerecunoscute de celulele T) la infecțiile naturale este dificilă, deoarece mulți alți factori ar putea provoca lipsa unui răspuns imun pe lângă non-imunogenitate (vezi Introducere). Prin urmare, pentru clasificarea pMHC neimunogen, am necesitat un studiu de imunizare peptidică în combinație cu o afinitate de legare ridicată a peptidei-MHC-I, pentru a ne asigura că prezentarea MHC-I a peptidei testate la celulele T a fost fezabilă. Cu toate acestea, această definiție strictă exclude oamenii ca gazdă pentru identificarea pMHC neimunogene, deoarece studiile de imunizare peptidică au fost rareori efectuate la om. Chiar dacă pMHC imunogene ar putea fi derivate de la oameni, am decis inițial să colectăm doar date de la șoareci, pentru a evita orice prejudecată cauzată de eșantionarea diferită de la diferite gazde. În plus, am comparat doar peptidele prezentate pe molecule MHC-I de la aceeași specie (H-2 sau HLA, unde datele provin de la șoareci HLA-transgenici), de aceeași lungime (9meri), iar o metodă de reducere a redundanței a fost aplicată la evitați efectele de eșantionare (a se vedea Metode pentru o descriere detaliată a procesului de colectare și clasificare a datelor).

Au fost utilizate patru surse de date, baza de date a epitopului imun (IEDB) [45] și trei studii de imunogenitate la șoareci (a se vedea metodele și [43], [44]). 600 de imunogeni și 181 imunogeni non-redundanți de 9mer pMHC care au îndeplinit criteriile noastre stricte, au fost selectați pentru caracterizare ulterioară (vezi Figura 1). Acest set relativ mare de pMHC imunogene și neimunogene au fost analizate în continuare pentru a determina ce proprietăți pot explica diferența de imunogenitate.

Datele au fost colectate din patru surse diferite (vezi Metode). Primul panou arată câte pMHC au fost derivate din fiecare set de date și restricțiile MHC respective și starea lor de imunogenitate. Datele din toate seturile au fost combinate, numărul de 9mers non-redundanți în raport cu gazda în care au fost obținute datele este afișat în al doilea panou.

Proprietăți de aminoacizi ale pMHC imunogene

PMHC imunogene și neimunogene, clasificate mai sus, pot fi comparate pentru a vedea ce proprietăți se asociază cu imunogenitatea. Ipotezăm că anumiți aminoacizi sunt mai susceptibili de a interacționa cu TCR și, prin urmare, cresc imunogenitatea unui pMHC. În schimb, unii aminoacizi ar putea aboli interacțiunile TCR. Pentru a testa această ipoteză, pe aminoacid s-a testat asocierea cu imunogenitatea și s-a făcut o comparație cu frecvențele aminoacizilor de fond. Pentru a preveni orice prejudecată care ar putea crește din cauza motivului de legare a moleculelor MHC-I, reziduurile la poziții cu influență asupra afinității de legare au fost excluse din analiză (vezi Metode). În plus, toate peptidele din setul nostru de date, adică cele imunogene și neimunogene, au fost necesare pentru a avea o afinitate de legare prevăzută mai mare de 500 nM (vezi Metode). Deoarece majoritatea peptidelor clasificate au fost restricționate prin HLA (Figura 1) și, din cauza interesului pentru sistemul imunitar uman, am decis să restricționăm analiza la aceste pMHC. Asocierea pozitivă cu imunogenitatea fenilalaninei mari și aromatice (testul de permutare: p & lt0.01) și asocierea negativă a serinei mici (testul de permutare: p & lt0.001) au fost cele mai proeminente (Figura 2). În plus, s-au observat asociații semnificative cu imunogenitatea pentru izoleucină, lizină, metionină și triptofan (test de permutare: p & lt0.05 Rată de descoperire falsă (FDR) pentru testări multiple determinate ca în [46]: q & lt0.05). Aceleași asociații au fost găsite atunci când pMHC-urile au fost selectate pe baza predicțiilor de afinitate de legare cu un predictor de legare alternativ MHC-I (Spearman rank test: c = 0.91 p & lt0.001, detaliile sunt date în metode), sau un predictor de ligand MHC-I care ia în considerare procesarea peptidelor (testul Spearman rank: c = 0,89 p & lt0.001, detaliile sunt date în metode), sau când au fost selectate pMHC cu afinități de legare MHC prevăzute potrivite (testul Spearman rank: c = 0,95 p & lt0.001, detaliile sunt date în Metode).

Fracția unui aminoacid din peptidele imunogene (bara stângă, umplute) și neimunogene (bara dreaptă, neumplute) prezentată pe molecule HLA clasa I este prezentată. Distribuții semnificativ diferite sunt indicate cu o stea (testul permutării, vezi Metode: p & lt0.05 Rată de descoperire falsă (FDR) pentru testări multiple determinate ca în [46]: q & lt0.05). Frecvența de fond pentru fiecare aminoacid din secvențele de proteine ​​care au fost o sursă a peptidelor imunogene sau ne-imunogene este prezentată printr-o linie gri.

Pentru a testa dacă asocierile observate ar putea fi rezultatul unei preferințe fundamentale pentru anumite caracteristici ale aminoacizilor, s-a determinat îmbogățirea fiecărui aminoacid în peptide imunogene față de neimunogene și îmbogățirile au fost comparate cu proprietățile fizico-chimice și biochimice descrise în AAindex. baza de date [47] (vezi Metode). Niciuna dintre proprietățile aminoacizilor descrise în AAindex (n = 505) nu a fost similară cu îmbogățirea noastră (Tabelul suplimentar S2). Astfel, preferințele celulelor T nu par să urmeze o proprietate cunoscută a aminoacizilor, eventual este preferată o combinație de proprietăți care contribuie la o interacțiune mai bună cu receptorii celulelor T. Pentru a încerca să dezlegăm această combinație, a fost efectuată o analiză a aminoacizilor grupați în funcție de caracteristici largi precum dimensiunea, încărcătura și aromaticitatea (vezi Metode). Pentru grupuri de aminoacizi cu caractere opuse, de ex. aminoacizi mici și mari, s-a comparat numărul de reziduuri din peptidele imunogene față de cele neimunogene. Această analiză a arătat că reziduurile mari și aromatice au fost supra-reprezentate în peptidele imunogene prezentate pe HLA (testul Fisher: p & lt0.02 vezi Tabelul 1). În plus, s-a observat o tendință de supra-reprezentare a reziduurilor acide la peptidele imunogene (p = 0,06). Din păcate, este dificil să se descopere dacă dimensiunea și / sau aromaticitatea au fost cele mai importante pentru imunogenitate, deoarece aminoacizii împărtășesc combinații de astfel de caracteristici.

Rezultatele noastre ar putea fi influențate de setul mare de peptide HLA-A * 0201 prezentate. Prin urmare, am exclus toate peptidele prezentate de HLA-A * 0201 și ne-am repetat analiza. Acest lucru nu a afectat mult profilul aminoacidului în peptidele imunogene și neimunogene, pentru fiecare aminoacid care a fost asociat în mod semnificativ cu imunogenitatea pe baza tuturor pMHC (F, I, K, M, S și W în Figura 2, indicat de stele ), aceeași tendință (adică supra- sau subreprezentare) a fost observată pentru peptidele prezentate non-HLA-A * 0201 (Figura suplimentară S1). În plus, s-a observat o supra-reprezentare a reziduurilor mari și aromatice în pMHC imunogene. Mai mult, aceleași rezultate au fost obținute într-o analiză bazată doar pe peptidele prezentate HLA-A * 0201 (Figura suplimentară S1). Astfel, preferințele de celule T observate pentru anumiți aminoacizi au fost solide fie pentru a exclude, fie pentru a selecta peptidele prezentate HLA-A * 0201.

Recunoașterea celulelor T a pozițiilor peptidice

Setul de date al pMHC imunogene și neimunogene ne-a permis să investigăm un alt aspect al imunogenității: importanța diferitelor poziții în peptida prezentată. Studiile structurale, precum și studiile de imunogenitate ale clonelor specifice de celule T cu liganzi peptidici modificați, sugerează că unele poziții într-o peptidă prezentată, în special pozițiile 4-6, sunt în contact strâns cu TCR [40], [48], [ 49] și important pentru răspunsurile specifice ale celulelor T [38], [50] - [54]. Dacă o anumită poziție are un efect mare asupra recunoașterii celulelor T, se așteaptă ca profilul aminoacizilor din acea poziție să fie diferit pentru pMHC-uri imunogene (adică celule T recunoscute) comparativ cu pMHC neimunogene (adică celule T nerecunoscute). Această diferență a fost determinată pe poziție, folosind doar poziții non-ancoră pentru a evita orice efect al legării HLA (vezi Metode), adică prin excluderea pozițiilor P1, P2 și P9 pentru majoritatea moleculelor HLA, dar de ex. P2, P5 și P9 pentru HLA-B * 0801. Diferența dintre profilurile de aminoacizi ale pMHC imunogene și neimunogene a fost măsurată utilizând măsura divergenței Kullback-Leibler. Această măsură permite estimarea cât de bine poate fi descris un profil folosind celălalt profil, divergența este mai mare dacă profilurile sunt mai diferite între ele. Cea mai mare diferență între pMHC imunogene și neimunogene a fost observată la pozițiile 4, 5 și 6 (testul Fisher: p & lt0.01 Tabelul 2) și o diferență mai mică, mai puțin semnificativă, a fost observată la poziția 7 (testul Fisher: p = 0.06 Tabelul 2).Aceste rezultate sunt în conformitate cu studiile anterioare privind interacțiunile TCR-pMHC și confirmă faptul că seturile noastre de date de peptide imunogene și neimunogene poartă semnături cunoscute de recunoaștere a celulelor T.

Prezicerea imunogenității

Apoi, am testat dacă asociațiile observate ale anumitor aminoacizi cu imunogenitatea și importanța pozițiilor diferite, au fost valabile în alte seturi de date. Prin urmare, rezultatele prezentate până acum au fost combinate într-un model pentru a prezice imunogenitatea noilor pMHC. În acest model, îmbogățirea unui aminoacid în peptide imunogene, ponderată de importanța poziției în care a fost găsit, a fost utilizată pentru a marca peptidele HLA clasa I prezentate (a se vedea metodele și tabelul de susținere S1). Într-un experiment de validare încrucișată de 3 ori, adică în care două treimi din date au fost utilizate pentru construirea modelului și o treime pentru testare, acest model ar putea distinge peptidele imunogene de cele neimunogene pe molecule HLA clasa I cu o precizie semnificativă : în medie, 66% din pMHC imunogene au obținut un scor pozitiv, comparativ cu 44% din pMHC neimunogene (testul Wilcoxon cu sumă de rang: p & lt0.001 ASC = 0,65 Figura 3). Performanțe de predicție comparabile au fost obținute într-o validare încrucișată de 10 ori utilizând seturi de pMHC imunogene și neimogene care au fost selectate pentru a avea afinități de legare MHC potrivite (testul Wilcoxon de sumă de rang: p & lt0,05 ASC = 0,61, detaliile sunt date în Metode ) sau legarea MHC plus afinitățile de procesare (testul Wilcoxon la sumă de rang: p & lt0,05 AUC = 0,63, detaliile sunt date în metode). Astfel, îmbogățirile cu aminoacizi și importanța poziției au fost suficient de generale pentru a prezice, într-o oarecare măsură, imunogenitatea unui pMHC.

Două treimi din date au fost utilizate pentru realizarea modelului de imunogenitate (a se vedea metodele) și o treime pentru validarea încrucișată. ROC-ul mediu (linie gri groasă) a 25 de astfel de validări încrucișate (linii subțiri) sunt reprezentate grafic. ASC medie a fost de 0,65.

Recent, Weiskopf și colab. a analizat direcționarea imună a unui număr mare de peptide derivate din Dengue prezentate pe diferite molecule HLA, la infectarea șoarecilor HLA-transgenici cu virusul Dengue [55]. În acest studiu s-au raportat 22 de epitopi 9mer non-redundanți și 110 nonepitopi 9mer non-redundanți cu o afinitate de legare estimată mare (& lt500 nM) [55]. Acest set de date nou a oferit o oportunitate de a testa dacă observațiile noastre ar putea fi extinse la un set de date independent. În timp ce epitopii sunt de așteptat să fie imunogeni, unii non-epitopi pot fi imunogeni în experimentele de imunizare, dar lipsesc direcționarea imună în experimentele de la Weiskopf și colab. datorită altor factori precum lipsa procesării sau exprimării peptidei în timpul infecției. În ciuda acestei probleme și a depășit așteptările noastre, modelul de imunogenitate a marcat epitopii mult mai mari decât non-epitopii (testul Wilcoxon rang-sum: p & lt0.01 ASC = 0.69 vezi Figura 4A). Astfel, această analiză susține în continuare că anumiți aminoacizi se asociază cu imunogenitatea. În plus, această analiză demonstrează modul în care s-ar putea aplica predicții de imunogenitate pentru a îmbogăți epitopii în proiectele de descoperire a epitopului prin excluderea pMHC neimunogene. Dacă 38% din peptidele derivate din Dengue (epitopi plus non-epitopi) nu ar fi testate deoarece modelul de imunogenitate le-a dat un scor negativ, totuși 86% din epitopi ar fi identificate, deoarece acestea au un scor pozitiv. Într-un studiu amplu în care trebuie testate multe peptide, acest lucru înseamnă că o fracțiune semnificativă din muncă și / sau resurse pot fi salvate atunci când se utilizează modelul de imunogenitate pentru a îmbogăți pMHC care sunt mai bine recunoscute de celulele T.

Scorurile de imunogenitate au fost determinate pentru epitopii non-redundanți (n = 22) și non-epitopii (n = 110) identificați la șoareci de Weiskopf și colab. [55] (A) și pentru epitopii non-redundanți (n = 42) și non-epitopii (n = 477) identificați de Weiskopf și colab. la oameni [56] (B). Media și variația mediei sunt afișate ca linii groase cu bare de eroare, scorurile individuale sunt afișate ca puncte. Atât la șoareci, cât și la bărbați, epitopii au avut un scor de imunogenitate semnificativ mai mare decât non-epitopii (date murine (A): p & lt0.01 (test Wilcoxon rank-sum) ASC = 0,69. Date umane (B): p = 0,014 (Testul sumei de rang Wilcoxon) ASC = 0,61).

Imunogenitate: Extrapolarea de la șoareci la oameni

Așa cum s-a menționat anterior, puține studii de imunizare peptidică sunt efectuate la om și doar un singur pMHC ar putea fi clasificat ca neimunogen la om, nepermițând o comparație directă a îmbogățirii aminoacizilor și a scorurilor de importanță a poziției. Cu toate acestea, pMHC imunogene umane au putut fi identificate (Figura 1), iar profilul de aminoacizi al acestor pMHC a fost comparat cu profilul de aminoacizi al pMHC imunogene și neimunogene murine (Figura 1). PMHC-urile imunogene umane au fost mai asemănătoare cu pMHC-urile imunogene la șoarecii HLA-transgenici (divergența Kullback-Leibler = 0,024), decât la pMHC-urile neimunogene la șoarecii HLA-transgenici (divergența Kullback-Leibler = 0,069). Astfel, se pare că pMHC imunogene au un profil similar de aminoacizi la șoareci și bărbați.

Pentru a testa în continuare dacă proprietățile de imunogenitate care au fost identificate în sistemul șoarecilor ar putea fi extinse la oameni, am folosit un mare studiu de descoperire a epitopului care a fost realizat recent la donatorii seropozitivi Dengue de către Weiskopf și colab. [56]. În acest studiu, răspunsurile celulelor T au fost măsurate la donatorii seropozitivi Dengue, la liganzii MHC prezisi pe moleculele HLA ale acestor donatori. În total, din acest studiu au fost derivate 42 de epitopi 9mer non-redundanți și 477 nonepitopi 9mer non-redundanți (a se vedea Metode pentru criterii de selecție și reducere a redundanței). Similar cu rezultatul nostru bazat pe date murine (Figura 4A), epitopii umani au avut un scor mult mai mare în modelul de imunogenitate decât non-epitopii (testul Wilcoxon de sumă de rang: p = 0,014 vezi Figura 4B). Această constatare confirmă faptul că studiile efectuate pe șoareci transgenici HLA oferă date utile pentru a înțelege recunoașterea celulelor T la om, în acord cu alte studii care au comparat răspunsurile imune la șoareci HLA-transgenici și bărbați [57].

Imunogenitatea pMHC virale și auto

Preferințele privind celulele T observate ar putea fi rezultatul evoluției neutre, unde mutațiile aleatorii au condus la anumite segmente V-D-J care codifică receptorii celulelor T cu o anumită preferință. Alternativ, celulele T cu un TCR care recunosc mai bine peptidele derivate din agenți patogeni ar fi putut fi selectate în timus, prin selecția negativă a celulelor T care preferă puternic pMHC-uri auto sau segmentele VDJ ar fi putut fi selectate prin evoluție care codifică pentru TCR cu o preferință pentru peptidele derivate din agenți patogeni, similar cu ceea ce se observă pentru moleculele HLA-A [58]. Modelul de imunogenitate (Tabelul suplimentar 1) ne-a permis să investigăm aceste scenarii. Pentru 13 molecule HLA-A și 15 HLA-B, liganzii de legare au fost preziși folosind predictori de legare a MHC și de prelucrare a proteinelor precursoare, pentru un set mare de viruși și proteomul uman (selecția datelor și predicțiile ligandului au fost descrise anterior în [40]). Apoi, pentru fiecare moleculă HLA, s-au comparat liganzii virali și umani prevăzuți. Fracțiunea scorurilor pozitive a fost mai mare pentru liganzii virali decât pentru liganzii umani în 27 din cele 28 de molecule HLA (semn-test: p & lt0.001, vezi Figura 5). Imunogenitatea îmbogățită a liganzilor virali a fost cea mai mare pentru HLA-A * 3001, HLA-B * 0702 și HLA-B * 4501, unde fracția scorurilor pozitive a fost cu 11% mai mare pentru liganzii virali versus umani. Numai pentru HLA-A * 2301 fracția scorurilor pozitive a fost ușor mai mare la liganzii umani. Astfel, indiferent de molecula HLA prezentă, liganzii virali s-au prezis a fi mai imunogeni decât liganzii umani, sugerând că preferințele celulelor T au fost selectate, fie în timpul selecției timice, fie prin evoluție, pentru a favoriza recunoașterea peptidelor străine.

Pentru moleculele comune de HLA (13 HLA-A și 15 HLA-B), liganzii virali și umani au fost preziți folosind legători MHC și predictori de prelucrare a proteinelor precursoare (ca în [40]). Se arată fracțiunea pMHC virale (axa y) și a pMHC umane (axa x) cu un scor pozitiv în modelul nostru de imunogenitate. Diagonala denotă linia y = x, moleculele HLA cu o fracțiune mai mare de pMHC virale cu scor pozitiv cad peste această linie, ceea ce a fost cazul pentru 27 din cele 28 de molecule HLA (semn-test: p & lt0.001). Trei molecule HLA în care diferența dintre liganzii virali și umani a fost cea mai mare (B * 0702, A * 3001, B * 4501) și o moleculă HLA în care diferența dintre liganzii virali și umani a fost cea mai mică (A * 2301) , și HLA-A * 0201 sunt indicate în figură.


Design peptidic

Peptidele pot fi proiectate de novo sau pe baza secvențelor de peptide din proteine ​​native, în funcție de aplicația dorită. Peptidele sintetice pot fi modificate pentru a-și schimba proprietățile sau conformația, etichetate pentru purificare sau detectare, conjugate cu imunogeni pentru producerea de anticorpi sau marcate izotopic pentru cuantificarea proteinelor. Peptidele sunt biomolecule complexe care au proprietăți chimice și fizice unice, care sunt rezultatul direct al compoziției lor de aminoacizi. Această pagină se concentrează pe elementele cheie ale proiectării peptidelor care influențează sinteza, puritatea și stabilitatea și modul în care acestea pot fi modificate.

Află mai multe

Selectați produse

Lungimea peptidei este variabilă și depinde de aplicația pentru care sunt utilizate. De exemplu, peptidele cu lungimea de 10-20 aminoacizi sunt ideale pentru prepararea anticorpilor, în timp ce peptidele utilizate pentru studii de structură / funcție pot fi mai variabile. Deși progresele tehnologice au permis strategiilor actuale de sinteză a peptidelor să fie considerabil mai eficiente ca niciodată, puritatea peptidelor brute sintetizate este limitată de lungimea peptidei propuse. Pe măsură ce lungimea peptidei crește, crește și cantitatea de impurități care trebuie îndepărtate din peptidele în creștere după fiecare ciclu de deprotejare-cuplare. În plus, secvențele peptidice mai lungi necesită mai multe reacții de cuplare între peptida în creștere și următorul aminoacid din secvență. Cu fiecare ciclu de cuplare, un număr mic de reacții de cuplare pe peptide individuale din amestecul de reacție eșuează, rezultând o concentrație crescândă de peptide trunchiate (deleții) în reacție pe măsură ce lungimea peptidei care este sintetizată crește. Concentrația peptidei de lungime completă sintetizată într-o reacție este invers corelată cu lungimea peptidei propuse, prin urmare, pe măsură ce lungimea peptidei crește, randamentul este redus din cauza dificultății crescânde în purificarea produsului cu conținut redus de abundență din brut amestec în timp ce peptidele cu lungimea de 75 aminoacizi pot fi sintetizate, randamentul în reacția de sinteză va fi slab în comparație cu randamentul atunci când se sintetizează peptide mai scurte.

Reprezentarea grafică a relației dintre lungimea peptidei și randamentul peptidei pe toată lungimea. Datorită naturii ciclice a metodelor de sinteză a peptidelor, concentrația peptidei de lungime completă sintetizată într-o reacție dată este invers corelată cu lungimea peptidei propuse.

Peptidele pot fi proiectate de novo sau pe baza secvențelor de peptide din proteine ​​native, în funcție de aplicația dorită. Peptidele sintetice pot fi modificate pentru a-și schimba proprietățile sau conformația, pot fi marcate pentru purificare sau detectare, conjugate cu imunogeni pentru producerea de anticorpi sau marcate izotopic pentru cuantificarea proteinelor. Peptidele sunt biomolecule complexe care au proprietăți chimice și fizice unice, care sunt rezultatul direct al compoziției lor de aminoacizi. Această pagină se concentrează pe elementele cheie ale proiectării peptidelor care influențează sinteza, puritatea și stabilitatea și modul în care acestea pot fi modificate.

Află mai multe

Selectați produse

Aminoacizii sunt grupați în funcție de hidropatia lor, iar includerea sau excluderea aminoacizilor hidrofobi sau hidrofili într-o secvență peptidică influențează capacitatea de a sintetiza peptida sau de a solubiliza produsul final în soluții apoase.

Clasificări ale aminoacizilor.
Hidrofob (nepolar)Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val
Neîncărcat (polar)Asn, Cys, Gly, Gln, Pro, Ser, Thr, Tyr
Acid (polar)Asp, Glu
De bază (polar)Lui, Lys, Arg

Peptidele cu o proporție mare de aminoacizi hidrofobi vor afecta negativ solubilitatea în soluții apoase. O regulă de bază în proiectarea peptidelor solubile este de a se asigura că 1 din fiecare 5 aminoacizi este încărcat. Dacă acest lucru nu poate fi realizat, atunci aminoacizii din secvența peptidică care nu sunt critici pentru funcția peptidei pot fi înlocuiți cu reziduuri încărcate. Acest lucru, desigur, poate influența natura peptidei, prin urmare, substituțiile ar trebui luate în considerare cu atenție.

Deși este dificil să se determine solubilitatea exactă a peptidelor fără testare empirică, există linii directoare generale care pot fi utilizate pentru a prezice solubilitatea peptidelor:

  • Peptidele mai scurte de 5 reziduuri sunt de obicei solubile în soluții apoase, cu excepția cazului în care întreaga secvență constă din aminoacizi hidrofobi.
  • Peptidele hidrofile care conțin & gt25% reziduuri încărcate și & lt25% aminoacizi hidrofobi sunt de obicei solubile în soluții apoase.
  • Peptidele hidrofobe care conțin 50% sau mai multe reziduuri hidrofobe pot fi insolubile sau numai parțial solubile în soluții apoase. Aceste peptide trebuie mai întâi dizolvate în solvenți organici precum dimetilsulfoxid (DMSO), dimetilformamidă (DMF) sau acetonitril înainte de o diluare atentă în soluții apoase.
  • Peptidele care conțin o proporție foarte mare (& gt75%) de D, E, H, K, N, Q, R, S, T sau Y sunt capabile să construiască legături de hidrogen intermoleculare (legături încrucișate) și astfel formează geluri în soluții apoase. Aceste peptide trebuie fie solubilizate în solvenți organici, fie pH-ul tamponului trebuie modificat.

Pe lângă lungimea peptidei, anumiți aminoacizi sau combinații de aminoacizi pot afecta negativ sinteza, purificarea, solubilitatea sau stabilitatea peptidelor. Acești aminoacizi pot fi înlocuiți cu aminoacizi conservatori precum alanina sau glicina, eliminați sau înlocuiți cu un analog, în funcție de aminoacidul specific. În funcție de aplicație, peptida se poate baza pe proteine ​​native și, adesea, secvențele conțin atât aminoacizi care sunt esențiali pentru funcția sa într-un test dat, cât și cei care nu sunt esențiali și acționează exclusiv într-o capacitate structurală. Cu aceste tipuri de peptide, regula generală este de a face orice modificări sau substituții asupra reziduurilor neesențiale. O altă metodă de abordare a aminoacizilor dificili sau a combinațiilor nefavorabile în secvențe native este fie să schimbați ușor secvența aliniată cu secvența nativă pentru ao face mai favorabilă, fie să rupeți combinații nefavorabile.

Reprezentare grafică a deplasării secvenței peptidice pentru a evita aminoacizii nefavorabili. Pe lângă substituirea aminoacizilor conservatori cu cei care pot interfera cu o aplicație dată sau pot afecta negativ sinteza sau purificarea, secvențele bazate pe proteine ​​native pot fi uneori deplasate ușor pentru a exclude aminoacizii (indicați de săgeata roșie) sau pentru a rupe secvențe nefavorabile.

Următoarele puncte sunt îndrumări în proiectarea peptidelor de novo sau pe bază nativă care au o compoziție care favorizează sinteza, purificarea, depozitarea și solubilitatea.

Cisteina și metionină sunt susceptibile la oxidare rapidă, care poate influența negativ clivajul grupurilor protectoare în timpul sintezei și purificarea ulterioară a peptidelor. Pentru a evita acest lucru, cisteina poate fi înlocuită cu serină și metionină înlocuită cu norleucină (Nle). Cisteinele multiple pe o peptidă sunt susceptibile să formeze legături disulfidice, cu excepția cazului în care un agent reducător, cum ar fi ditiotreitol (DTT), este adăugat la tampon sau cisteinele sunt înlocuite cu reziduuri de serină. Reziduurile de cisteină din peptidele utilizate pentru producerea de anticorpi pot afecta aviditatea anticorpului, deoarece cisteinele libere sunt mai puțin frecvente in vivo și, prin urmare, pot să nu fie recunoscute de structura peptidică nativă.

Glutamina N-terminală este instabil, deoarece formează piroglutamat ciclic în condiții acide în timpul scindării grupului de protecție. Acest lucru poate fi prevenit prin acetilarea glutaminei N-terminale sau prin substituirea glutaminei cu acid piroglutamic pre-format sau un aminoacid conservator.

Asparagină N-terminală trebuie evitată, deoarece grupa de protecție a asparaginei N-terminale poate fi dificil de îndepărtat în timpul decolteului. Prin urmare, fie îndepărtați, fie înlocuiți aminoacidul N-terminal.

Acid aspartic poate suferi hidroliză și poate provoca clivajul peptidic în condiții acide atunci când este asociat cu glicină, prolină sau serină. Evitați aceste combinații, dacă este posibil, prin înlocuire sau separarea acestora prin schimbarea secvenței.

Serină multiplă sau prolină reziduurile dintr-o secvență pot provoca deleții semnificative în timpul sintezei, în special reziduurile de prolină, care pot suferi izomerizare cis / trans și pot reduce puritatea peptidelor.

O serie de glutamină, izoleucină, leucină, fenilalanină, treonină, tirozină sau valină poate provoca plăci β, care determină o solvatare incompletă în timpul sintezei peptidice, rezultând deleții. Înlocuirea conservatoare a asparaginei cu glutamină sau serină cu treonină, adăugând o prolină sau glicină la fiecare al treilea aminoacid sau schimbând secvența poate rupe foile β.


Cuprins

Structura primară Edit

Structura primară a unei proteine, secvența sa liniară de aminoacizi, determină conformația sa nativă. [9] Reziduurile specifice de aminoacizi și poziția lor în lanțul polipeptidic sunt factorii determinanți pentru care porțiuni ale proteinei se pliază strâns între ele și formează conformația sa tridimensională. Compoziția de aminoacizi nu este la fel de importantă ca secvența. [10] Faptul esențial al plierii, totuși, rămâne că secvența de aminoacizi a fiecărei proteine ​​conține informații care specifică atât structura nativă, cât și calea pentru a atinge acea stare. Aceasta nu înseamnă că secvențele de aminoacizi aproape identice se pliază întotdeauna în mod similar. [11] Conformările diferă în funcție de factorii de mediu, precum și proteinele similare se pliază diferit în funcție de locul în care se găsesc.

Structură secundară Edit

Formarea unei structuri secundare este primul pas în procesul de pliere pe care o proteină îl ia pentru a-și asuma structura nativă. Caracteristic structurii secundare sunt structurile cunoscute sub numele de helice alfa și foi beta care se pliază rapid, deoarece sunt stabilizate prin legături de hidrogen intramoleculare, așa cum a fost caracterizat mai întâi de Linus Pauling. Formarea legăturilor de hidrogen intramoleculare oferă o altă contribuție importantă la stabilitatea proteinelor. [12] Helicele α sunt formate prin legarea hidrogenului a coloanei vertebrale pentru a forma o formă spirală (consultați figura din dreapta). [10] Foaia plisată β este o structură care se formează cu coloana vertebrală îndoită peste ea însăși pentru a forma legăturile de hidrogen (așa cum se arată în figura din stânga). Legăturile de hidrogen sunt între hidrogenul amidic și oxigenul carbonilic al legăturii peptidice.Există foi anti-paralele β plisate și foi paralele β plisate în care stabilitatea legăturilor de hidrogen este mai puternică în placa β anti-paralelă, deoarece se leagă cu unghiul ideal de 180 de grade comparativ cu legăturile de hidrogen înclinate formate din foi paralele. [10]

Structura terțiară Edit

Helicele alfa și foile plisate beta pot fi de natură amfipatică sau conțin o porțiune hidrofilă și o porțiune hidrofobă. Această proprietate a structurilor secundare ajută la structura terțiară a unei proteine ​​în care se îndoaie astfel încât părțile hidrofile să fie orientate către mediul apos care înconjoară proteina, iar părțile hidrofobe să fie orientate către nucleul hidrofob al proteinei. [13] Structura secundară ierarhic face loc formării structurii terțiare. Odată ce structura terțiară a proteinei este formată și stabilizată de interacțiunile hidrofobe, poate exista, de asemenea, o legătură covalentă sub formă de punți disulfură formate între două reziduuri de cisteină. Structura terțiară a unei proteine ​​implică un singur lanț polipeptidic, cu toate acestea, interacțiunile suplimentare ale lanțurilor polipeptidice pliate dau naștere la formarea structurii cuaternare. [14]

Structura cuaternară Edit

Structura terțiară poate da loc formării structurii cuaternare în unele proteine, care implică de obicei „asamblarea” sau „asamblarea” subunităților care s-au pliat deja cu alte cuvinte, mai multe lanțuri polipeptidice ar putea interacționa pentru a forma o proteină cuaternară complet funcțională. [10]

Forțele motrice ale plierii proteinelor Edit

Plierea este un proces spontan care este ghidat în principal de interacțiunile hidrofobe, formarea de legături de hidrogen intramoleculare, forțele van der Waals și se opune entropiei conformaționale. [15] Procesul de pliere începe adesea co-translațional, astfel încât capătul N-terminal al proteinei începe să se plieze în timp ce porțiunea C-terminală a proteinei este încă sintetizată de ribozom, totuși, o moleculă de proteină se poate plia spontan în timpul sau după biosinteză. [16] În timp ce aceste macromolecule pot fi privite ca „pliante în sine”, procesul depinde și de solvent (bistrat de apă sau lipide), [17] de concentrația sărurilor, pH-ul, temperatura, prezența posibilă a cofactorilor și a chaperoni moleculari.

Proteinele vor avea limitări în ceea ce privește abilitățile lor de pliere prin unghiurile de îndoire restricționate sau conformațiile posibile. Aceste unghiuri permise de pliere a proteinelor sunt descrise cu un grafic bidimensional cunoscut sub numele de grafic Ramachandran, descris cu unghiuri psi și phi de rotație admisibilă. [18]

Efect hidrofob Edit

Plierea proteinelor trebuie să fie favorabilă termodinamic într-o celulă pentru a fi o reacție spontană. Deoarece se știe că plierea proteinelor este o reacție spontană, atunci trebuie să își asume o valoare negativă a energiei libere Gibbs. Energia liberă Gibbs în plierea proteinelor este direct legată de entalpie și entropie. [10] Pentru ca un delta G negativ să apară și pentru ca plierea proteinelor să devină favorabilă termodinamic, atunci fie entalpia, entropia sau ambii termeni trebuie să fie favorabili.

Minimizarea numărului de lanțuri laterale hidrofobe expuse la apă este o forță motrice importantă din spatele procesului de pliere. [19] Efectul hidrofob este fenomenul în care lanțurile hidrofobe ale unei proteine ​​se prăbușesc în miezul proteinei (departe de mediul hidrofil). [10] Într-un mediu apos, moleculele de apă tind să se agregeze în jurul regiunilor hidrofobe sau lanțurilor laterale ale proteinei, creând coji de apă din molecule de apă ordonate. [20] O ordonare a moleculelor de apă în jurul unei regiuni hidrofobe crește ordinea într-un sistem și, prin urmare, contribuie la o schimbare negativă a entropiei (mai puțină entropie în sistem). Moleculele de apă sunt fixate în aceste cuști de apă care determină prăbușirea hidrofobă sau plierea în interior a grupurilor hidrofobe. Prăbușirea hidrofobă introduce entropia înapoi în sistem prin spargerea cuștilor de apă care eliberează moleculele de apă comandate. [10] Multitudinea grupurilor hidrofobe care interacționează în nucleul proteinei pliate globulare contribuie o cantitate semnificativă la stabilitatea proteinei după pliere, datorită forțelor van der Waals extrem de acumulate (în special forțelor de dispersie din Londra). [10] Efectul hidrofob există ca forță motrice în termodinamică numai dacă există prezența unui mediu apos cu o moleculă amfifilică care conține o regiune hidrofobă mare. [21] Puterea legăturilor de hidrogen depinde de mediul lor, astfel, legăturile H învăluite într-un miez hidrofob contribuie mai mult decât legăturile H expuse mediului apos la stabilitatea stării native. [22]

La proteinele cu pliuri globulare, aminoacizii hidrofobi tind să fie dispersați de-a lungul secvenței primare, mai degrabă decât distribuiți aleatoriu sau grupați împreună. [23] [24] Cu toate acestea, proteinele care s-au născut recent de novo, care tind să fie intrinsec dezordonate, [25] [26] prezintă modelul opus al aminoacizilor hidrofobi care se grupează de-a lungul secvenței primare. [27]

Editare Chaperones

Chaperonele moleculare sunt o clasă de proteine ​​care ajută la plierea corectă a altor proteine in vivo. Chaperonele există în toate compartimentele celulare și interacționează cu lanțul polipeptidic pentru a permite formarea conformației tridimensionale native a proteinei, însă chaperonele nu sunt incluse în structura finală a proteinei în care asistă. [28] Chaperones poate ajuta la pliere chiar și atunci când polipeptida naștentă este sintetizată de ribozom. [29] Chaperonii moleculari funcționează prin legare pentru a stabiliza o structură altfel instabilă a unei proteine ​​în calea sa de pliere, dar chaperonii nu conțin informațiile necesare pentru a cunoaște structura nativă corectă a proteinei pe care o ajută mai degrabă, chaperonii funcționează prin prevenirea pliării incorecte. conformații. [29] În acest fel, chaperonii nu cresc de fapt rata pașilor individuali implicați în calea de pliere către structura nativă, ci funcționează prin reducerea posibilelor agregări nedorite ale lanțului polipeptidic care altfel ar putea încetini căutarea intermediarului adecvat și oferă o cale mai eficientă pentru ca lanțul polipeptidic să își asume conformațiile corecte. [28] Chaperonele nu trebuie confundate cu proteinele catalizatoare care se pliază, care catalizează reacțiile chimice responsabile de pașii încet în căile de pliere. Exemple de catalizatori pliabili sunt izomerazele disulfidice ale proteinelor și izomerazele peptidil-prolilice care pot fi implicate în formarea legăturilor disulfidice sau interconversia dintre stereoizomerii cis și trans ai grupului peptidic. [29] S-a dovedit că șaperonele sunt critice în procesul de pliere a proteinelor in vivo deoarece oferă proteinei ajutorul necesar pentru a-și asuma aliniamentele și conformațiile adecvate suficient de eficient pentru a deveni „relevante din punct de vedere biologic”. [30] Acest lucru înseamnă că lanțul polipeptidic s-ar putea plia teoretic în structura sa nativă fără ajutorul chaperonelor, așa cum a demonstrat experimentele de pliere a proteinelor efectuate in vitro [30] cu toate acestea, acest proces se dovedește a fi prea ineficient sau prea lent pentru a exista în sistemele biologice, prin urmare, chaperonele sunt necesare pentru plierea proteinelor in vivo. Împreună cu rolul său de a ajuta la formarea structurii native, se arată că chaperonele sunt implicate în diferite roluri, cum ar fi transportul proteinelor, degradarea și chiar permit proteinelor denaturate expuse anumitor factori denaturanți externi o oportunitate de a se reîntoarce în structurile lor native corecte. [31]

O proteină complet denaturată lipsește atât de structura terțiară, cât și de cea secundară și există ca așa-numita bobină aleatorie. În anumite condiții, unele proteine ​​se pot replia, cu toate acestea, în multe cazuri, denaturarea este ireversibilă. [32] Celulele își protejează uneori proteinele împotriva influenței denaturante a căldurii cu enzime cunoscute sub numele de proteine ​​de șoc termic (un tip de chaperonă), care ajută alte proteine ​​atât în ​​pliere, cât și în restul îndoite. Proteinele de șoc termic au fost găsite la toate speciile examinate, de la bacterii la oameni, sugerând că acestea au evoluat foarte devreme și au o funcție importantă. Unele proteine ​​nu se pliază deloc în celule decât cu ajutorul chaperonelor care fie izolează proteinele individuale astfel încât plierea lor să nu fie întreruptă de interacțiunile cu alte proteine ​​sau să ajute la desfășurarea proteinelor nepliate, permițându-le să se reîntoarcă în structura nativă corectă. [33] Această funcție este crucială pentru a preveni riscul precipitațiilor în agregate amorfe insolubile. Factorii externi implicați în denaturarea proteinei sau întreruperea stării native includ temperatura, câmpurile externe (electrice, magnetice), [34] aglomerarea moleculară, [35] și chiar limitarea spațiului (adică închiderea), care poate avea o influență mare pe plierea proteinelor. [36] Concentrațiile mari de substanțe dizolvate, extremele pH-ului, forțele mecanice și prezența denaturanților chimici pot contribui și la denaturarea proteinelor. Acești factori individuali sunt clasificați împreună ca stresuri. S-a demonstrat că șaperonele există în concentrații crescânde în perioadele de stres celular și ajută la plierea corectă a proteinelor emergente, precum și a celor denaturate sau pliate greșit. [28]

În anumite condiții, proteinele nu se vor plia în formele lor funcționale biochimic. Temperaturile peste sau sub intervalul în care celulele tind să trăiască vor face ca proteinele instabile termic să se desfășoare sau să se denatureze (de aceea fierberea face ca albusul să devină opac). Stabilitatea termică a proteinelor este departe de a fi constantă, cu toate acestea, de exemplu, s-au găsit bacterii hipertermofile care cresc la temperaturi de până la 122 ° C, [37] ceea ce, desigur, necesită completarea lor completă de proteine ​​vitale și ansambluri de proteine ​​să fie stabile la această temperatură sau deasupra.

Bacteria E coli este gazda bacteriofagului T4, iar proteina gp31 codificată de fag (P17313) pare a fi omologă structural și funcțional cu E coli proteină chaperonă GroES și capabilă să o substituie în asamblarea particulelor de virus bacteriofag T4 în timpul infecției. [38] La fel ca GroES, gp31 formează un complex stabil cu chaperonină GroEL, care este absolut necesar pentru plierea și asamblarea in vivo a bacteriofagului T4 proteină capsidă majoră gp23. [38]

Comutare fold Edit

Unele proteine ​​au structuri native multiple și își schimbă faldul pe baza unor factori externi. De exemplu, proteina KaiB se întrerupe pe tot parcursul zilei, acționând ca un ceas pentru cianobacterii. S-a estimat că aproximativ 0,5–4% din proteinele PDB (Protein Data Bank) schimbă pliurile. [39]

O proteină este considerată a fi greșită dacă nu își poate atinge starea nativă normală. Acest lucru se poate datora mutațiilor din secvența de aminoacizi sau întreruperii procesului normal de pliere de către factori externi. [40] Proteina pliată greșit conține de obicei foi β care sunt organizate într-un aranjament supramolecular cunoscut sub numele de structură β încrucișată. Aceste ansambluri bogate în foi de β sunt foarte stabile, foarte insolubile și, în general, rezistente la proteoliză. [41] Stabilitatea structurală a acestor ansambluri fibrilare este cauzată de interacțiuni extinse între monomerii proteici, formați de legături de hidrogen coloanei vertebrale între catena lor β. [41] Plierea greșită a proteinelor poate declanșa plierea greșită și acumularea altor proteine ​​în agregate sau oligomeri. Nivelurile crescute de proteine ​​agregate din celulă duc la formarea unor structuri asemănătoare amiloidului care pot provoca tulburări degenerative și moartea celulelor. [40] Amiloidele sunt structuri fibrilare care conțin legături de hidrogen intermoleculare care sunt extrem de insolubile și obținute din agregate proteice transformate. [40] Prin urmare, calea proteazomului poate să nu fie suficient de eficientă pentru a degrada proteinele pliate greșit înainte de agregare. Proteinele pliate greșit pot interacționa între ele și pot forma agregate structurate și pot câștiga toxicitate prin interacțiuni intermoleculare. [40]

Proteinele agregate sunt asociate cu boli legate de prioni, cum ar fi boala Creutzfeldt – Jakob, encefalopatia spongiformă bovină (boala vacii nebune), bolile asociate amiloidului, cum ar fi boala Alzheimer și cardiomiopatia sau polineuropatia amiloidă familială [42], precum și bolile de agregare intracelulară, cum ar fi ca boala Huntington și Parkinson. [4] [43] Aceste boli degenerative cu debut de vârstă sunt asociate cu agregarea proteinelor pliate greșit în agregate insolubile, extracelulare și / sau incluziuni intracelulare, inclusiv fibrile amiloide β încrucișate. Nu este complet clar dacă agregatele sunt cauza sau doar o reflectare a pierderii homeostaziei proteinelor, a echilibrului dintre sinteză, pliere, agregare și rotație a proteinelor. Recent, Agenția Europeană a Medicamentului a aprobat utilizarea Tafamidis sau Vyndaqel (un stabilizator cinetic al transtiretinei tetramerice) pentru tratamentul bolilor transtiretinei amiloide. Acest lucru sugerează că procesul de formare a fibrilelor amiloide (și nu fibrilele în sine) determină degenerarea țesutului post-mitotic în bolile amiloide umane. [44] Plierea greșită și degradarea excesivă în loc de pliere și funcție conduc la o serie de boli de proteopatie, cum ar fi emfizemul asociat antitripsinei, fibroza chistică și bolile de stocare lizozomală, unde pierderea funcției este originea tulburării. În timp ce terapia de înlocuire a proteinelor a fost folosită în mod istoric pentru a corecta aceste din urmă tulburări, o abordare emergentă este de a utiliza chaperone farmaceutice pentru a plia proteinele mutante pentru a le face funcționale.

În timp ce inferențe despre plierea proteinelor pot fi făcute prin studii de mutație, în mod obișnuit, tehnicile experimentale pentru studierea plierii proteinelor se bazează pe desfășurarea sau plierea treptată a proteinelor și pe observarea modificărilor conformaționale utilizând tehnici standard necristalografice.

Cristalografie cu raze X Edit

Cristalografia cu raze X este una dintre metodele mai eficiente și mai importante pentru încercarea de a descifra configurația tridimensională a unei proteine ​​pliate. [45] Pentru a putea efectua cristalografia cu raze X, proteina investigată trebuie localizată în interiorul unei rețele de cristal. Pentru a plasa o proteină într-o rețea de cristal, trebuie să existe un solvent adecvat pentru cristalizare, să se obțină o proteină pură la niveluri suprasaturate în soluție și să precipite cristalele în soluție. [46] Odată ce o proteină este cristalizată, fasciculele de raze X pot fi concentrate prin rețeaua de cristal, care ar difracta fasciculele sau le arunca în exterior în diferite direcții. Aceste fascicule de ieșire sunt corelate cu configurația specifică tridimensională a proteinei închise în interior. Razele X interacționează în mod specific cu norii de electroni care înconjoară atomii individuali din rețeaua cristalină proteică și produc un model de difracție discernibil. [13] Numai prin raportarea norilor de densitate electronică cu amplitudinea razelor X, acest model poate fi citit și poate duce la presupuneri ale fazelor sau unghiurilor de fază implicate care complică această metodă. [47] Fără relația stabilită printr-o bază matematică cunoscută sub numele de transformată Fourier, „problema de fază” ar face foarte dificilă prezicerea tiparelor de difracție. [13] Metodele emergente, precum înlocuirea izomorfă multiplă, utilizează prezența unui ion de metal greu pentru a difracta razele X într-un mod mai previzibil, reducând numărul de variabile implicate și rezolvând problema fazei. [45]

Spectroscopie de fluorescență Edit

Spectroscopia fluorescenței este o metodă extrem de sensibilă pentru studierea stării de pliere a proteinelor. Trei aminoacizi, fenilalanina (Phe), tirozina (Tyr) și triptofanul (Trp), au proprietăți de fluorescență intrinseci, dar numai Tyr și Trp sunt utilizate experimental, deoarece randamentele lor cuantice sunt suficient de mari pentru a da semnale bune de fluorescență. Atât Trp, cât și Tyr sunt excitați de o lungime de undă de 280 nm, în timp ce numai Trp este excitat de o lungime de undă de 295 nm. Datorită caracterului lor aromatic, reziduurile Trp și Tyr se găsesc adesea îngropate complet sau parțial în nucleul hidrofob al proteinelor, la interfața dintre două domenii proteice sau la interfața dintre subunitățile proteinelor oligomerice. În acest mediu apolar, acestea au randamente cuantice ridicate și, prin urmare, intensități de fluorescență ridicate. După întreruperea structurii terțiare sau cuaternare a proteinei, aceste lanțuri laterale devin mai expuse mediului hidrofil al solventului, iar randamentele lor cuantice scad, ducând la intensități scăzute de fluorescență. Pentru reziduurile de Trp, lungimea de undă a emisiilor lor maxime de fluorescență depinde și de mediul lor.

Spectroscopia de fluorescență poate fi utilizată pentru a caracteriza desfășurarea echilibrului proteinelor prin măsurarea variației intensității emisiei de fluorescență sau a lungimii de undă a emisiei maxime ca funcții de o valoare denaturantă. [48] ​​[49] Denaturantul poate fi o moleculă chimică (uree, clorhidrat de guanidiniu), temperatură, pH, presiune, etc. prin urmare, valoarea denaturantă, semnalul global de fluorescență al amestecului lor de echilibru depinde și de această valoare. Se obține astfel un profil care leagă semnalul global al proteinei de valoarea denaturantă. Profilul desfășurării echilibrului poate permite detectarea și identificarea intermediarilor desfășurării. [50] [51] Hugues Bedouelle a dezvoltat ecuații generale pentru a obține parametrii termodinamici care caracterizează echilibrele de desfășurare pentru proteinele homomerice sau heteromerice, până la trimeri și potențial tetrameri, din astfel de profiluri. [48] ​​Spectroscopia de fluorescență poate fi combinată cu dispozitive de amestecare rapidă, cum ar fi fluxul oprit, pentru a măsura cinetica plierii proteinelor, [52] generează un grafic de chevron și derivă o analiză a valorii Phi.

Dichroism circular Edit

Dichroismul circular este unul dintre instrumentele cele mai generale și de bază pentru a studia plierea proteinelor. Spectroscopia cu dicroism circular măsoară absorbția luminii polarizate circular. În proteine, structuri precum helice alfa și foi beta sunt chirale și astfel absorb o astfel de lumină. Absorbția acestei lumini acționează ca un marker al gradului de pliere a ansamblului proteic. Această tehnică a fost utilizată pentru a măsura desfășurarea echilibrului proteinei prin măsurarea modificării acestei absorbții în funcție de concentrația denaturantă sau de temperatură. O topire denaturantă măsoară energia liberă de desfășurare, precum și valoarea m a proteinei sau dependența de denaturant. O temperatură topită măsoară temperatura de denaturare (Tm) a proteinei. [48] ​​În ceea ce privește spectroscopia de fluorescență, spectroscopia cu dicroism circular poate fi combinată cu dispozitive de amestecare rapidă, cum ar fi fluxul oprit, pentru a măsura cinetica de pliere a proteinelor și pentru a genera parcele de chevron.

Dichroismul vibrațional circular al proteinelor Edit

Dezvoltările mai recente ale tehnicilor de dicroism circular vibrațional (VCD) pentru proteine, care implică în prezent instrumente de transformată Fourier (FT), oferă mijloace puternice pentru determinarea conformațiilor proteice în soluție chiar și pentru molecule de proteine ​​foarte mari. Astfel de studii VCD ale proteinelor pot fi combinate cu date de difracție cu raze X pentru cristale de proteine, date FT-IR pentru soluții de proteine ​​în apă grea (D2O), sau calcule cuantice.

Spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară proteică Edit

Rezonanța magnetică nucleară a proteinelor (RMN) este capabilă să colecteze date structurale proteice prin inducerea unui câmp magnetic prin probe de proteine ​​concentrate. În RMN, în funcție de mediul chimic, anumite nuclee vor absorbi frecvențe radio specifice. [53] [54] Deoarece modificările structurale ale proteinelor funcționează pe o scară de timp de la ns la ms, RMN este special echipată pentru a studia structurile intermediare în intervalele de timp de la ps la s. [55] Unele dintre principalele tehnici pentru studierea structurii proteinelor și a modificărilor structurale proteice care nu se pliază includ COZY, TOCSY, HSQC, relaxare în timp (T1 și amp T2) și NOE. [53] NOE este util mai ales deoarece se pot observa transferuri de magnetizare între hidrogenii proximal spațial. [53] Diferite experimente RMN au grade diferite de sensibilitate la scară temporală, care sunt adecvate pentru diferite modificări structurale ale proteinelor. NOE poate prelua vibrațiile de legătură sau rotațiile lanțului lateral, cu toate acestea, NOE este prea sensibil pentru a prelua plierea proteinelor, deoarece apare la un interval de timp mai mare. [55]

Deoarece plierea proteinelor are loc în aproximativ 50 până la 3000 s -1 CPMG Dispersia de relaxare și schimbul chimic Transferul de saturație au devenit unele dintre tehnicile primare pentru analiza RMN a plierii. [54] În plus, ambele tehnici sunt utilizate pentru a descoperi stări intermediare excitate în peisajul de pliere a proteinelor. [56] Pentru a face acest lucru, dispersia de relaxare CPMG profită de fenomenul de ecou Spin. Această tehnică expune nucleele țintă la un impuls de 90 urmat de unul sau mai multe 180 de impulsuri. [57] Pe măsură ce nucleele se reorientează, o distribuție largă indică faptul că nucleele țintă sunt implicate într-o stare excitată intermediară. Privind graficele de dispersie de relaxare, datele colectează informații despre termodinamică și cinetică între excitat și sol. [57] [56] Transferul de saturație măsoară modificările semnalului din starea fundamentală pe măsură ce stările excitate se perturbă. Folosește iradiere de frecvență radio slabă pentru a satura starea excitată a unui anumit nucleu, care își transferă saturația la starea de bază. [54] Acest semnal este amplificat prin scăderea magnetizării (și semnalului) stării de bază. [54] [56]

Principalele limitări în RMN este că rezoluția sa scade cu proteinele mai mari de 25 kDa și nu este la fel de detaliată ca cristalografia cu raze X. [54] În plus, analiza RMN a proteinelor este destul de dificilă și poate propune mai multe soluții din același spectru RMN. [53]

Într-un studiu axat pe plierea unei sclerozei laterale amiotrofice implicate proteina SOD1, intermediarii excitați au fost studiați cu dispersie de relaxare și transfer de saturație. [58] SOD1 a fost legat anterior de multe mutante cauzatoare de boli, despre care se presupunea că sunt implicate în agregarea proteinelor, totuși mecanismul era încă necunoscut. Folosind experimente de dispersie de relaxare și transfer de saturație, multe stări intermediare excitate au fost descoperite îndoite în mutanții SOD1. [58]

Interferometrie cu polarizare duală Edit

Interferometria cu polarizare duală este o tehnică bazată pe suprafață pentru măsurarea proprietăților optice ale straturilor moleculare. Când este utilizat pentru a caracteriza plierea proteinelor, măsoară conformația prin determinarea dimensiunii globale a unui monostrat al proteinei și a densității acesteia în timp real la rezoluția sub-Angstrom, [59] deși măsurarea în timp real a cineticii plierii proteinelor este limitată la procese care au loc mai lent decât

10 Hz. Similar cu dicroismul circular, stimulul pentru pliere poate fi un denaturant sau o temperatură.

Studii de pliere cu rezoluție ridicată în timp Edit

Studiul plierii proteinelor a fost mult avansat în ultimii ani prin dezvoltarea unor tehnici rapide, rezolvate în timp. Experimentatorii declanșează rapid plierea unui eșantion de proteine ​​desfășurate și observă dinamica rezultată. Tehnicile rapide folosite includ împrăștierea neutronilor, [60] amestecarea ultrarapidă a soluțiilor, metodele fotochimice și spectroscopia cu salt de temperatură laser. Printre numeroșii oameni de știință care au contribuit la dezvoltarea acestor tehnici se numără Jeremy Cook, Heinrich Roder, Harry Gray, Martin Gruebele, Brian Dyer, William Eaton, Sheena Radford, Chris Dobson, Alan Fersht, Bengt Nölting și Lars Konermann.

Proteoliză Edit

Proteoliza este utilizată în mod obișnuit pentru a testa fracția desfășurată într-o gamă largă de condiții de soluție (de exemplu, proteoliza paralelă rapidă (FASTpp). [61] [62]

Spectroscopie de forță cu o singură moleculă Edit

Tehnici cu o singură moleculă, cum ar fi penseta optică și AFM, au fost utilizate pentru a înțelege mecanismele de pliere a proteinelor proteine ​​izolate, precum și proteine ​​cu chaperone. [63] Pensetele optice au fost folosite pentru a întinde molecule proteice singulare de la capetele lor C și N și le desfășoară pentru a permite studierea replierii ulterioare. [64] Tehnica permite măsurarea ratelor de pliere la nivelul unei singure molecule, de exemplu, pensetele optice au fost recent aplicate pentru a studia pliarea și desfășurarea proteinelor implicate în coagularea sângelui. Factorul von Willebrand (vWF) este o proteină cu rol esențial în procesul de formare a cheagurilor de sânge. Acesta a descoperit - folosind măsurarea pensetelor optice cu o singură moleculă - că vWF legat de calciu acționează ca un senzor de forță tăietoare în sânge. Forța de forfecare duce la desfășurarea domeniului A2 al vWF, a cărui rată de îndoire este îmbunătățită dramatic în prezența calciului. [65] Recent, s-a arătat, de asemenea, că domeniul simplu src SH3 accesează mai multe căi de desfășurare în forță. [66]

Pictura cu biotină Edit

Pictura cu biotină permite instantanee celulare specifice unor proteine ​​(ne) îndoite. „Pictura” biotinei arată o tendință față de proteinele prezente dezordonate intrinsec. [67]

Studiile computaționale ale plierii proteinelor includ trei aspecte principale legate de predicția stabilității proteinelor, cineticii și structurii. O recenzie recentă rezumă metodele de calcul disponibile pentru plierea proteinelor. [68]

Paradoxul lui Levinthal Edit

În 1969, Cyrus Levinthal a menționat că, din cauza numărului foarte mare de grade de libertate într-un lanț polipeptidic desfășurat, molecula are un număr astronomic de posibile conformații. O estimare de 3 300 sau 10 143 a fost făcută într-una din lucrările sale. [69] Paradoxul lui Levinthal este un experiment de gândire bazat pe observația că, dacă o proteină ar fi pliată prin eșantionarea secvențială a tuturor conformațiilor posibile, ar fi nevoie de o cantitate astronomică de timp pentru a face acest lucru, chiar dacă conformațiile ar fi eșantionate la o viteză rapidă ( pe scară nanosecundă sau picosecundă). [70] Bazându-se pe observația că proteinele se pliază mult mai repede decât aceasta, Levinthal a propus apoi că nu are loc o căutare conformațională aleatorie și, prin urmare, proteina trebuie să se plieze printr-o serie de stări intermediare meta-stabile.

Peisajul energetic al plierii proteinelor Edit

Spațiul de configurare al unei proteine ​​în timpul plierii poate fi vizualizat ca peisaj energetic. Potrivit lui Joseph Bryngelson și Peter Wolynes, proteinele urmează principiul frustrării minime ceea ce înseamnă că proteinele evoluate în mod natural și-au optimizat peisajele de energie pliabile [71] și că natura a ales secvențe de aminoacizi astfel încât starea pliată a proteinei să fie suficient de stabilă. În plus, achiziționarea stării pliate trebuia să devină un proces suficient de rapid. Chiar dacă natura a redus nivelul de frustrare în proteine, un anumit grad al acestuia rămâne până acum, așa cum se poate observa în prezența minimelor locale în peisajul energetic al proteinelor.

O consecință a acestor secvențe selectate în mod evolutiv este că se crede că proteinele au în general „peisaje de energie canalizate” la nivel global (inventate de José Onuchic) ​​[72], care sunt în mare parte direcționate către starea nativă. Acest peisaj de „pâlnie de pliere” permite proteinei să se plieze la starea nativă prin oricare dintre un număr mare de căi și intermediari, mai degrabă decât să fie limitată la un singur mecanism. Teoria este susținută atât de simulări de calcul ale proteinelor model, cât și de studii experimentale [71] și a fost utilizată pentru a îmbunătăți metodele de predicție și proiectare a structurii proteinelor. [71] Descrierea plierii proteinelor prin peisajul de nivelare a energiei libere este, de asemenea, în concordanță cu legea a 2-a a termodinamicii. [73] Din punct de vedere fizic, gândirea la peisaje în termeni de potențial vizualizabil sau suprafețe de energie totală pur și simplu cu maxime, puncte de șa, minime și pâlnii, mai degrabă ca peisaje geografice, este probabil puțin înșelătoare. Descrierea relevantă este într-adevăr un spațiu de fază de înaltă dimensiune în care varietățile ar putea lua o varietate de forme topologice mai complicate. [74]

Lanțul polipeptidic desfășurat începe în partea de sus a pâlniei, unde poate presupune cel mai mare număr de variații desfăcute și se află în starea sa cea mai înaltă de energie. Peisaje energetice precum acestea indică faptul că există un număr mare de posibilități inițiale, dar este posibilă doar o singură stare nativă, însă nu dezvăluie numeroasele căi de pliere posibile. O moleculă diferită din aceeași proteină exactă poate fi capabilă să urmeze căi de pliere marginal diferite, căutând intermediari de energie mai mici, atâta timp cât se ajunge la aceeași structură nativă. [75] Căile diferite pot avea frecvențe diferite de utilizare în funcție de favorabilitatea termodinamică a fiecărei căi. Aceasta înseamnă că, dacă o cale este mai favorabilă termodinamic decât alta, este probabil să fie folosită mai frecvent în urmărirea structurii native. [75] Pe măsură ce proteina începe să se plieze și să își asume diferitele conformații, ea caută întotdeauna o structură mai favorabilă termodinamic decât înainte și continuă astfel prin pâlnia energetică. Formarea structurilor secundare este un indiciu puternic al stabilității crescute în cadrul proteinei și o singură combinație de structuri secundare asumate de coloana vertebrală polipeptidică va avea cea mai mică energie și, prin urmare, va fi prezentă în starea nativă a proteinei. [75] Printre primele structuri care se formează odată ce polipeptida începe să se plieze se află spirele alfa și rotirile beta, în care spirele alfa se pot forma în doar 100 de nanosecunde și beta se transformă în 1 microsecundă. [28]

Există un punct de șa în peisajul pâlniei de energie în care se găsește starea de tranziție pentru o anumită proteină. [28] Starea de tranziție din diagrama pâlniei energetice este conformația care trebuie asumată de fiecare moleculă a proteinei respective dacă proteina dorește să asume în cele din urmă structura nativă. Nici o proteină nu poate asuma structura nativă fără a trece mai întâi prin starea de tranziție. [28] Starea de tranziție poate fi denumită o variantă sau o formă prematură a statului nativ, mai degrabă decât un alt pas intermediar. [76] Îndoirea stării de tranziție se dovedește a fi determinantă a ratei și, chiar dacă există într-o stare energetică mai mare decât pliul nativ, seamănă foarte mult cu structura nativă. În starea de tranziție, există un nucleu în jurul căruia proteina este capabilă să se plieze, format printr-un proces denumit „condensare de nucleație” în care structura începe să se prăbușească pe nucleu. [76]

Modelarea plierii proteinelor Edit

De novo sau ab initio tehnicile pentru predicția de calcul a structurii proteinelor pot fi utilizate pentru simularea diferitelor aspecte ale plierii proteinelor. Dinamica moleculară (MD) a fost utilizată în simulări de pliere a proteinelor și dinamică in silico. [77] Primele simulări de pliere în echilibru au fost făcute folosind modelul implicit de solvent și eșantionarea umbrelă. [78] Din cauza costului de calcul, simulările de pliere ab initio MD cu apă explicită sunt limitate la peptide și proteine ​​foarte mici. [79] [80] Simulările MD ale proteinelor mai mari rămân limitate la dinamica structurii experimentale sau la desfășurarea acesteia la temperaturi ridicate. Procesele de pliere pe termen lung (peste aproximativ 1 milisecundă), cum ar fi plierea proteinelor de dimensiuni mici (aproximativ 50 de reziduuri) sau mai mari, pot fi accesate folosind modele cu granulație grosieră. [81] [82] [83]

Mai multe proiecte computaționale la scară largă, cum ar fi Rosetta @ home, [84] Folding @ home [85] și Foldit, [86] vizează plierea proteinelor.

Simulări lungi cu traiectorie continuă au fost efectuate pe Anton, un supercomputer masiv paralel proiectat și construit în jurul ASIC-urilor și interconectărilor personalizate de D. E. Shaw Research. Cel mai lung rezultat publicat al unei simulari efectuate folosind Anton este o simulare de 2.936 milisecunde a NTL9 la 355 K. [87]


Introducere

Acest articol descrie o procedură generală pentru dezvoltarea analizelor de polarizare a fluorescenței (FP) care poate detecta legarea unei mici peptide sau oligonucleotide marcate fluorescent la o proteină de interes pe baza proprietății prin care o moleculă marcată fluorescent este excitată de lumina polarizată, emite lumină cu un grad de polarizare care este invers proporțional cu rata de rotație moleculară. Principiul de bază al polarizării fluorescenței este descris în Figura 1. Când un fluorofor care este atașat covalent la un ligand mic (tipic & lt1500 Da), cum ar fi o peptidă în soluție, este excitat de lumina polarizată, lumina emisă va fi în mare parte depolarizată. Acest lucru se datorează reorientării fluoroforului pe durata vieții stării sale excitate (de ordinul nanosecundelor pentru majoritatea fluoroforilor) cauzată de rotația moleculară rapidă browniană a speciilor marcate. Dacă acest ligand marcat este legat de o proteină cu greutate moleculară mare (de obicei & gt10 kDa), fluoroforul se reorientează într-un grad mult mai mic, datorită vitezei de rotație semnificativ reduse a complexului. Astfel, lumina emisă va fi în continuare polarizată într-un grad semnificativ. Această proprietate a FP îi permite să fie utilizată ca tehnică de măsurare a legării ligandului, polarizarea observată într-un amestec de ligand și receptor marcat fiind proporțională cu fracțiunea ligandului legat (Jameson și Seifried, 1999 Jameson și Croney, 2003) . Mai mult, este simplu să se stabilească un test de legare a competiției prin măsurarea scăderii semnalului FP produs atunci când un inhibitor al interacțiunii este adăugat la amestecul de ligand și receptor marcat.

Schema care descrie principiul de bază al polarizării fluorescenței. Când un ligand mic de peptidă sau acid nucleic (cercul întunecat) cu o etichetă fluorescentă atașată (cercul alb) este excitat de lumina polarizată la lungimea de undă de excitație a fluoroforului, ligandul se reorientează într-un grad semnificativ, datorită căderii moleculare în timpul vieții stării excitate a fluoroforului. Acest lucru face ca lumina emisă să fie în mare parte depolarizată. Dacă ligandul este legat de o proteină (elipsă gri), complexul rezultat se prăbușește mult mai lent, iar lumina emisă își păstrează polarizarea.

FP are o serie de avantaje cheie ca tehnologie de testare. Se efectuează în fază de soluție, este non-radioactiv, nu necesită nicio separare a ligandului legat de cel liber și este ușor de adaptat la volume mici (de ordinul a 10 pl). Acest lucru îl face foarte potrivit pentru aplicații de screening cu randament ridicat, iar testele FP au fost utilizate cu succes pentru a studia o mare varietate de ținte, inclusiv kinaze, fosfataze, proteaze, receptori cuplați la proteina G (GPCR) și receptori nucleari (Owicki, 2000 Burke și colab., 2003). O aplicație importantă a acestui tip de test este identificarea inhibitorilor de interacțiuni proteină-acid nucleic și proteine-proteine. Chiar dacă aceste interacțiuni pot implica interfețe extinse, în multe cazuri există „puncte fierbinți”, secvențe mici de peptide sau nucleotide care sunt disproporționat de importante pentru afinitatea interacțiunii. Aceste caracteristici ale interfețelor pot fi exploatate pentru a proiecta sonde de polarizare a fluorescenței pentru teste de legare competitivă. Compușii noi identificați folosind teste de acest tip au devenit importante nu numai ca instrumente pentru biologia chimică de bază, ci și ca potențiali potențiali medicamente. Un număr semnificativ de antibiotice și alte medicamente se leagă de interfețele proteină-acid nucleic (Pommier și Marchand, 2005), iar interacțiunile proteină-proteină au devenit din ce în ce mai recunoscute ca ținte terapeutice cheie (Arkin, 2005).


Introducere

Celulele dendritice (DC), poate cele mai puternice și versatile dintre APC, captează antigene străine întâlnite în țesuturile periferice, procesează antigenele în peptide legate de moleculele MHC și migrează către organele limfoide pentru prezentarea complexelor MHC-peptide în limfocitele T 1 , 2. În concordanță cu acest rol critic în stimularea celulelor T naive antigenic, activitatea imunostimulatoare a DC este reglementată cu atenție, celulele prezentând cel puțin două stări funcțional distincte. DC-urile în repaus sau imature, corespunzătoare celor găsite în periferie, au în general o capacitate ridicată de endocitoză și deci de absorbție a antigenului 3,4,5,6, dar o capacitate redusă de legare și stimulare a celulelor T. DC maturi, pe de altă parte, sunt generate de celulele imature prin expunerea la agenți proinflamatori (TNF, LPS), traume fizice sau molecule de suprafață a celulelor T (ligand CD40 [CD40L] referințe 7-10). DC maturi prezintă o capacitate limitată de endocitoză, dar sunt excepționale la stimularea celulelor T 3,4,5,6,7,8,9,10, prezentând în mod tipic peptide imunogene derivate din antigene întâlnite anterior. Capacitatea DC-urilor mature de a activa celulele T naive reflectă mai multe schimbări reglementate de dezvoltare. Acestea includ reglarea în sus a moleculelor costimulatoare CD40, CD80 și CD86 11,12, eliberarea citokinelor precum IL-12 13,14, rezistența la imunosupresia mediată IL-10 15 și expresia noilor receptori de chemokine precum CCR7 care ghidează DC-urile către Zonele celulelor T 16,17,18,19. Important, DC maturi reglează MHC de suprafață clasa II și complexe funcționale MHC clasa II – complexe peptidice care angajează TCR 20,21.

Se știe că această expresie crescută a moleculelor de clasă II MHC reflectă cel puțin două modificări 20,21. În primul rând, moleculele MHC clasa II nou sintetizate devin redirecționate intracelular. În loc să fie transportat la lizozomi pentru sechestrare sau degradare, MHC clasa II este direcționată către membrana plasmatică. Un mecanism de bază implică activarea proteazei APC-restricționată catepsina S, care, la rândul său, mediază clivajul complexului post-Golgi al lanțului invariant (Ii) asociat MHC clasa II. Aceste evenimente facilitează eliberarea timpurie a lanțului Ii din dimerii H / β MHC clasa II, permițând transportul de suprafață mai degrabă decât retenția intracelulară datorită semnalizării lizozomale / endocitoză găsite în domeniul citoplasmatic al lanțului Ii 22.Scindarea Ii ar putea elibera, de asemenea, situsul de legare MHC clasa II pentru legarea antigenului 23,24, dar acest nivel de reglare nu a fost încă demonstrat în maturizarea DC. În al doilea rând, din cauza reglării descendente a endocitozei care apare concomitent cu maturarea, există o creștere a timpului de rezidență la suprafață, timpul de înjumătățire și, prin urmare, expresia generală a oricăror complexe MHC clasa II – peptide care ajung la membrana plasmatică 20,21.

Pentru a delimita în continuare mecanismul care stă la baza conversiei critice a DC-urilor de la sentinelele imature la celulele imunostimulatoare mature, am folosit un anticorp monoclonal, C4H3, care permite vizualizarea directă a unui complex peptidă-MHC clasa II format dintr-un lizozim de ouă de găină (HEL ) peptidă și un dimer IA k α / β 25,26. De asemenea, am identificat condiții care permit menținerea in vitro și manipularea rapidă a DC-urilor imature derivate din măduva osoasă. Împreună, aceste abordări au relevat un nivel suplimentar și mai fundamental la care dezvoltarea capacității de prezentare a antigenului este controlată în timpul maturării DC, formarea efectivă a complexelor MHC clasa II-peptide din compartimentele lizozomale bogate în clasa II MHC. Arătăm că această maturare este un control major pentru amorsarea celulelor T de către DC in vivo, o nouă constatare care are impact asupra utilizării lor optime pentru imunoterapie la om 27,28,29,30.


Introducerea lucrurilor în celule, Pt. 1: Peptide

O idee pe care am avut-o pentru această platformă a fost organizarea și formalizarea recenziilor mele de literatură și împărtășirea lor aici. Acestea vor fi probabil posturi incredibil de plictisitoare pentru cei mai mulți (îmi pare rău), dar sper că vor fi de ajutor celor care învață despre conceptele de bază ale științelor translaționale și celor fără acces facil la literatura academică.

De ce ne pasă: Medicamentele peptidice pot fi o strategie terapeutică interesantă pentru unele indicații. A intra lucrurile în celule este greu. Țintele de droguri reci sunt în interiorul celulelor.

Ia notițe acasă: Pe mareele au un timp de înjumătățire scurt în corp și sunt greu de intrat în celule. Acest lucru poate fi adresabil. Peptidele cu penetrare celulară se află în clinică și se apropie de aprobarea pieței.

- CUPRINS -

(I) Bazele

O introducere în proteine.

(II) Peptidele ca terapie

O introducere în starea actuală a peptidelor în clinică și avantajele și dezavantajele acestora.

(III) Membrane celulare

O introducere rapidă la membranele celulare și constantele de permeabilitate ale moleculelor.

(IV) Permeabilitate: Dezvoltarea peptidelor penetrante celulare

Evoluții istorice importante, caracteristici, mecanisme de intrare celulară și utilizarea peptidelor celulare care pătrund în clinică și o introducere în peptidele macrociclice.

(V) Îmbunătățirea timpului de înjumătățire in vivo

Cum să îmbunătățim timpul de înjumătățire al terapiilor peptidice din organism pentru a îmbunătăți farmacodinamica acestor medicamente.

(VI) Aplicații în longevitate și îmbătrânire

Studii de caz privind utilizarea peptidelor în inhibarea FOXO4, dezvoltarea terapeutică împotriva cancerului, conjugații botulinici și boala Alzheimer.

(VII) Referințe

- (I) DE BAZĂ -

Un aminoacid este un compus organic caracterizat prin amina (-NH2), carboxil (-COOH) și gruparea R (structuri variate). Grupul R determină caracteristicile aminoacidului specific. Peptidele sunt lanțuri scurte de aminoacizi conectați prin legături peptidice. Proteinele sunt lanțuri mari de unul sau mai multe polipeptide, considerate în general mai mari de 50 de aminoacizi.

Aminoacizii sunt codificați de trei nucleotide și combinația lor în peptide și proteine ​​este încapsulată în genomul uman. Dogma centrală a biologiei moleculare este proteina ADN - & gt ARN - & gt.

Peptidele joacă roluri în fiziologia umană ca neurotransmițători, factori de creștere, hormoni și, în general, ca molecule de semnalizare.

- (II) PEPTIDE CA TERAPEUTICĂ -

Există peste 200 de substanțe terapeutice pe bază de peptide și proteine ​​aprobate de FDA. [2] Usmani și colaboratorii CSIR-Institute of Microbial Technology din India au dezvoltat o bază de date cu acces deschis a acestor terapii (THPdb: link).

Dacă presupunem că această listă este reprezentativă pentru majoritatea medicamentelor peptidice de pe piață, aceasta ilustrează câteva puncte cheie:

  • Medicamentele peptidice, cel puțin unele, sunt suficient de ușoare pentru a fi utilizate pentru indicații care nu sunt severe și chiar ca instrument de diagnosticare
  • Toate sunt livrate non-oral
  • Ele vizează în mare măsură receptorii legați de membrană - prin urmare este foarte probabil ca niciunul dintre aceste medicamente să nu poată traversa membrana celulară
  • Timpul de înjumătățire variază de la aproximativ 1 minut (oxitocină) la 15 ore (liraglutidă)
  • Acestea sunt în mare măsură analogi produși recombinant ai peptidelor existente în mod natural

Unele dintre aceste medicamente au un succes masiv: liraglutidă (denumirea comercială Victoza), leuroprolidă (Lupron), glatiramer (Copaxonă) și goserelină (Zoladex) sunt / au fost blockbustere sau sunt aproape de ea! [3]

Dacă vrem să dezvoltăm terapii peptidice pentru ținte intracelulare, vor fi două provocări semnificative permeabilitatea membranei celulare și jumătate de viață. Înainte să aprofundez aceste probleme și modul în care unii o abordează, un rezumat rapid:

Beneficiile terapiilor peptidice

  • Foarte selectiv pentru obiectivele lor
  • Aplicabil pe larg la multe indicații
  • Sunt stabilite protocoale de fabricație
  • În general sigur și tolerabil
  • Eficacitate demonstrată în unele utilizări
  • Teoretic susceptibil de modificare
  • Poate combina și co-sintetiza cu alte tipuri de medicamente
  • Sunt instabili atât din punct de vedere chimic, cât și fizic
  • Predispus la reacții chimice
  • Timp de înjumătățire scurt in vivo și eliminare rapidă
  • Permeabilitate redusă a membranei
  • Nu bioactiv pe cale orală
  • Potențial de imunogenitate
  • Specificitatea și capacitatea de a le viza către țesuturi specifice
  • Cost mai mare decât moleculele mici

(cele de mai sus sunt modificate dintr-o diagramă SWOT pentru medicament proteic găsită în [2] și [8])

- (III) MEMBRANE CELULARE -

Nu pot rezista unei scuze pentru a revizui membrana celulară. (AKA - să vedem câtă biologie de bază mi-a scurs din creier din primul an!) Cea mai mare parte a acestei secțiuni este distilată din [4], cu excepția cazului în care se menționează altfel, ceea ce am găsit a fi o imagine de ansamblu excelentă asupra permeabilității medicamentelor.

Membrana celulară eucariotă este compusă din lipide și proteine ​​de membrană. Lipidele sunt aceste mici molecule amuzante care au caracter hidrofob (înfricoșător de apă) și hidrofil (îndrăgit de apă). Aceste lipide formează un strat strat cu capetele hidrofile orientate spre exterior și hidrofobul în interior. Stratul stratificat lipidic are o grosime de doar 5 nm (0,000000005 metri), totuși este o barieră eficientă și un control al porții pentru celulă. Proteinele de membrană le includ pe cele cum ar fi receptorii medicamentelor peptidice din tabelul de mai sus. Aceste proteine ​​de membrană joacă o mulțime de rulouri, inclusiv pomparea și ieșirea ionilor critici și a altor molecule, inclusiv peptide, primirea de semnale de la alte celule și trimiterea de semnale către alte celule.

Metode de laborator selectate pentru a testa dacă o moleculă a traversat membrana:

  • Straturile lipidice artificiale
  • Monostratele celulare (pot fi modificate pentru a regla în sus sau în jos anumite transportoare)
  • Fracționarea celulară pentru identificarea reziduurilor din citosol
  • Analize de fluorescență pentru a vizualiza localizarea
  • Efect biologic care apare numai dacă molecula este endocitată

Permeabilitatea unei molecule specifice de către difuzie pasivă se măsoară prin coeficientul său de permeabilitate în unități de cm / s. Pentru a da scară acestui fapt: o moleculă foarte permeabilă, O2, are o constantă de permeabilitate de 2,3 * 10¹ cm / s, iar molecula care nu este foarte permeabilă, Na +, are o constantă de la 10 ^ -14. (Canalele proteice de sodiu din membrană facilitează intrarea acestor ioni care sunt critici pentru multe procese celulare, inclusiv potențialele de acțiune neuronală). Titlul „foarte permeabil” este asociat cu coeficienți de permeabilitate de 10 ^ -5 sau mai mari. În general, moleculele polare mari și toate moleculele încărcate au dificultăți de a trece singure prin membrană. Moleculele mici, nepolare, neîncărcate, au cel mai bun efect de a traversa membrana. Această sursă afirmă că aceste valori nu sunt adesea calculate pentru medicamentele peptidice, deși nu este clar dacă acest lucru se datorează faptului că testarea penetrării membranei a peptidelor este inerent mai dificilă decât a altor molecule sau pentru că majoritatea peptidelor până în prezent nu pot traversa membrana celulară. Moleculele care nu pot difuza pasiv prin membrană pot pătrunde prin receptorii de proteine ​​din membrană. Unele toxine și viruși au evoluat pentru a profita de aceste căi pentru a le provoca patologia, iar oamenii le folosesc pentru a introduce lucrurile în celule. Un exemplu este virusul adeno-asociat, care a avut succes clinic ca vector pentru terapia genică în ochi și alte indicații.

- (IV) PERMEABILITATE: DEZVOLTAREA PEPTIDELOR PENETRATE CELULARE -

Peptidele care pătrund în celule au domenii de transducție care facilitează traversarea lor de membrană. Acestea nu sunt încă o tehnologie perfecționată, dar există un mare potențial aici pentru a permite utilizarea peptidelor terapeutice și a altor molecule intracelular. Din câte știu, în prezent nu există pe piață medicamente mediate de CPP.

Referința [5] face o treabă fantastică de a contura statutul actual și potențialul CPP în medicina translațională. O mare parte din cele de mai jos este adaptată din această lucrare.

(IV.a) Dezvoltări istorice importante

1988 - transactivatorul proteinei de transcripție (Tat) a fost izolat de HIV și s-a dovedit că poate intra în celule in vitro de Frankel și colab. și Green și colab

1991 - homeodomeniul Antennapedia, o proteină găsită în Drosophila melanogaster, se arată că poate intra în celule in vitro de Joliot și colab.

1994 - este definită penetratina 16 CPP AA, care este derivată din Antennapedia, de Derossi și colab.

(IV.b) Caracteristicile peptidelor penetrante celulare

CPP-urile au în general cinci până la treizeci de aminoacizi și pot traversa membrana celulară într-un mod independent de receptor. [6] Pot fi cationici, amfipatici sau hidrofobi:

Cationic: încărcare netă pozitivă. Adesea bogat în reziduuri de arginină și lizină. Include Tat și penetratin. Arginina este considerată a fi un factor principal al capacității acestor CPP de a traversa membrana

Amfipatic: conține atât regiuni polare (hidrofile, iubitoare de apă), cât și non-polare (hidrofobe, temătoare de apă). Bogat în reziduuri hidrofobe.

Hidrofob: reziduuri nepolare. Afinitate mare pentru domeniile hidrofobe ale membranei. Se crede că sunt capabili să traverseze membrana într-un mod independent de energie, de care primii nu sunt capabili.

CPP-urile pot transporta o mare varietate de mărfuri care pot fi atașate covalent sau non-covalent. Legarea covalentă, deși puternică, poate schimba proprietățile încărcăturii și, prin urmare, legarea non-covalentă poate fi preferabilă în unele cazuri. [6] Interacțiunile non-covalente pentru CPP pot servi, de asemenea, pentru a promova un timp de înjumătățire mai lung prin inhibarea degradării enzimatice a conjugatului.

CPP-urile pot fi, de asemenea, clasificate după originea lor: produse naturale, produse naturale care au fost într-un fel proiectate sau modificate, fragmente de proteine ​​și peptide noi complet concepute. [7]

(IV.c) Endocitoza

CPP-urile pot intra în linii mari în celule fie prin endocitoză (dependentă de energie), fie prin transducție membranară (independentă de energie), prima fiind mai frecventă decât cea din urmă.

După endocitoză, CPP și încărcătura lor trebuie să scape de endozomi, care utilizează un pH ridicat pentru a degrada lucrurile pe care celula nu le dorește în interior. Se crede că acesta este un pas major care limitează rata. Metode de facilitare a evadării endosomului CPP:

  • Inserarea unei secvențe peptidice care este sensibilă la caracteristicile de pH ridicat ale endozomilor, care funcționează apoi pentru a destabiliza membrana lipidică a endozomilor
  • Adăugarea fragmentelor de histidină în secvența CPP, care acceptă protoni la pH-ul ridicat menționat anterior și crește presiunea osmotică în celulă (face ca energia peptidelor să iasă din endozom este mai favorabilă energiei)
  • PepFects, o serie de peptide care au reziduuri speciale pentru a facilita evadarea endosomală din grupul Langel de la Universitatea din Stockholm

(IV.d) Peptidele celulare care pătrund în clinică

CPP sunt deja în clinică, cu doi candidați de Xigen SA și Sarepta Therapeutics care au ajuns la studii de fază III indicate pentru durerea intraoculară cu inflamație și respectiv distrofie musculară Duchenne.

Am de gând să abordez acest subiect în mod semnificativ într-o postare ulterioară. Înțelegerea condițiilor care înconjoară succesele și eșecurile CPP în clinică este importantă pentru evaluarea capacității de traducere a platformei în ansamblu.

(IV.e) Peptide macrociclice

O peptidă ciclică este una în care peptida nu este complet liniară, dar are o structură ciclică sau circulară datorită legăturilor suplimentare dintre aminoacizi. Un reziduu de aminoacizi dintr-o peptidă liniară are doar până la două legături (legăturile amidice cu cei doi vecini ai săi). Un exemplu de mai jos este linaclotida, care demonstrează legături disulfurice:

Ciclizarea peptidelor se poate îmbunătăți in vivo stabilitatea și permeabilitatea peptidei prin afectarea capacității unei enzime de a recunoaște și atinge secvența sa de aminoacizi țintă acolo unde are activitate catalitică.

Există unele peptide ciclice naturale care sunt permeabile la celule. Acestea au o serie de caracteristici comune: metilarea N-terminală (o modificare post-translațională), legături de hidrogen intramoleculare și grupări hidrofobe care funcționează pentru a reduce suprafața polară a peptidei, scăzând energia de desolvare inerentă moleculei. [9] (Amintiți-vă, apa este foarte polară și interacționează bine cu moleculele foarte polare (hidrofile), în timp ce moleculele hidrofobe sunt nepolare. Dacă reduceți suprafața polară a unei molecule, „vrea” să părăsească apa (extracelulară) mediu) mai mult, deci este mai favorabil din punct de vedere energetic să interacționăm cu membrana celulară și cu receptorii).

Acest site web oferă o bună prezentare generală a interacțiunilor moleculare și a impactului acestora asupra farmacodinamicii medicamentelor: legătură

- (V) CREȘTEREA JUMĂȚII ÎN VIVO—

Timpul de înjumătățire al unei molecule este cantitatea de timp necesară pentru ca cantitatea acestei molecule să scadă la jumătate din valoarea sa inițială. Timpul de înjumătățire al unui medicament este un factor critic în activitatea sa biologică.

Peptidele au în general timp de înjumătățire foarte scurt datorită activității enzimatice și a clearance-ului renal. Acest lucru nu este ideal din perspectivă farmacodinamică. Timpul de înjumătățire scurt poate inhiba biodisponibilitatea medicamentelor, iar în clinică ar putea fi nevoie ca pacientul să primească medicamentul de mai multe ori pe zi pentru a obține beneficiul terapeutic - ceva care este unideal în general și face utilizarea peptidelor în indicațiile non-critice mai puțin atrăgătoare. Biodisponibilitatea orală este favorabilă, deoarece este minim invazivă, poate fi făcută acasă și, în general, are complianță crescută a pacientului.

O metodă interesantă utilizată pentru creșterea timpului de înjumătățire indirectă este utilizată de leuprolidă, agonistul hormonului care eliberează gonadotrofina și medicamentul blockbuster. O cantitate mare de peptidă este depusă IM în pacient, din care peptida se eliberează lent timp de peste o lună, asigurând activitate farmacologică pe termen lung.

Proteoliza este degradarea peptidelor și proteinelor de către enzime care rup legătura amidică dintre fiecare aminoacid. Reziduul N-terminal al unei proteine ​​poate da un indiciu despre timpul de înjumătățire așteptat al unei peptide specifice. (Proteinele și peptidele au un capăt C-terminal și un capăt N-capăt. Capătul C-capăt este capătul proteinei în care -COOH liber și capătul N-capăt este capătul grupului -NH2 liber). Rezistența la proteoliză poate fi conferită prin protecția acestor capete, unde multe enzime își au activitatea proteolitică, prin înlocuirea L-aminoacizilor cu D-aminoacizi și prin modificarea nefirească a unor reziduuri în siturile de legare a enzimei. [7] Aminoacizii au doi izomeri (Acești aminoacizi sunt identici din punct de vedere structural, dar reflectă imagini reciproce. Puteți vizualiza acest lucru uitându-vă la mâini, care sunt enantiomeri unul față de celălalt). Izomerul L este utilizat de celule în timp ce izomerul D nu este.

Stabilitatea renală îmbunătățită a fost demonstrată prin legarea medicamentului peptidic de alte proteine ​​care rezistă degradării și filtrării, în special marcomoleculelor și proteinelor plasmatice endogene. [7]

- (VI) APLICAȚII ÎN LONGEVITATE ȘI ÎMBĂTRÂNIRE -

Da! Piesa interesantă. Cum este relevant pentru terapie care vizează mecanismele de îmbătrânire și longevitate? Acest subiect al acestui post a fost parțial inspirat de anunțul Cleara Therapeutics (link), o nouă companie de biotehnologie lansată de Peter de Keizer și Apollo Ventures (link). Cleara va dezvolta terapii peptidice pentru senescenta celulara asociata cu FOXO4. Am rezumat rapid câteva domenii legate de îmbătrânire în care terapiile peptidice au fost contemplate sau explorate.

(VI.a) Inhibarea FOXO4 [10]

S-a demonstrat că inhibarea FOXO4 cu o construcție peptidică-CPP induce selectiv apoptoza în celulele senescente și restabilește fitnessul șoarecelui.

Celulele senescente sunt celule care au ieșit definitiv din ciclul replicativ. Se crede că au un impact negativ asupra micromediului lor și au fost asociate cu multiple boli ale îmbătrânirii. Senoliticele sunt o clasă nouă de terapeutice candidate care elimină selectiv aceste celule, acestea funcționând printr-o varietate de căi moleculare. FOXO4 este crescut în celulele senescente și se crede că leagă p53 și inhibă apoptoza mediată de p53. În această lucrare, autorii au folosit FOXO4-DRI, o peptidă, pentru a concura cu interacțiunea FOXO4-p53. (DRI înseamnă D-retro-inverso, reflectând utilizarea D-aminoacizilor în loc de L-aminoacizi. A se vedea Creșterea timpului de înjumătățire in vitro pentru o explicație succintă a izomerilor L versus D). FOXO-DRI a fost fuzionat cu Tat, CPP derivat din HIV discutat anterior, pentru a facilita permeabilitatea celulelor.

(VI.b) Cancer [11]

Terapiile cu peptide sunt explorate pentru a fi utilizate în cancer. Acestea sunt explorate într-o mare varietate de căi.

Peptidele antimicrobiene formează pori pe membrana bacteriană prin interacțiuni electrostatice și induc apoptoza. Acestea pot viza, de asemenea, celulele canceroase, perturbând membrana celulelor într-un mod similar și inducând apoptoză sau necroză. Peptidele cu penetrare celulară au fost explorate ca un mecanism de administrare a agenților citotoxici către celula canceroasă. Peptidele care vizează tumorile sunt peptide care vizează receptori specifici de pe membrana celulei canceroase. Acestea pot fi utilizate pentru a inhiba căile moleculare specifice sau pentru a facilita livrarea de încărcătură mediată de peptide specifice tumorii în celulele canceroase. Căile de interes deosebit sunt calea MAPK, care este activă în mod constitutiv în multe tipuri de cancer. Peptidele terapeutice pot fi, de asemenea, capabile să vizeze ciclul celular, în special factorii determinanți ai proliferării celulare hiperactive, așa cum este caracteristic celulelor canceroase, și să blocheze inhibarea supresoarelor tumorale. FOXO4-DRI este un exemplu în acest sens, deoarece blocarea interacțiunii p53-FOXO4 eliberează p53, un supresor tumoral, de inhibare.

(VI.c) Botulinum conjugates

Ok - acesta nu este puternic legat de vârstă, dar mi s-a părut o utilizare interesantă a unui CPP.Revance Therapeutics dezvoltă toxina botulinică A conjugată cu CPP (ingredientul activ din Botox) pentru indicații terapeutice și cosmetice multiple, inclusiv ridurile. (CPP este denumit sistemul peptidic purtător TransMTS de către companie) Botoxul nu vizează mecanismul îmbătrânirii pielii, acționează ca un paralitic local. Cu toate acestea, acest mecanism s-a dovedit util în indicațiile non-cosmetice, cum ar fi migrenele și vezica hiperactivă.

Conjugatul CPP-toxina botulinică A de la Revance Therapeutics se află în faza II și intră în studiile clinice de faza III pentru distonie cervicală (contracție involuntară și dureroasă a gâtului) și fasciită plantară (durere de călcâie).

(VI.d) Boala Alzheimer [12]

Boala Alzheimer este o boală notoriu de dificilă pentru care se dezvoltă medicamente și este infamă pentru numeroasele medicamente care au eșuat în faza III pentru această indicație. Cu aceasta, trebuie să subliniez că succesul la modelele animale Alzheimer nu este un predictor foarte puternic al succesului clinic. Unele peptide s-au dovedit capabile să traverseze bariera hematoencefalică (lucrurile care pot traversa bariera hematoencefalică sunt impresionante! Această membrană foarte selectivă dintre sistemul nervos central și sistemul circulator al corpului este notoriu dificil de traversat).

Peptida explorată în această lucrare este R8-A-beta (25-35) conjugată cu polietilenimină (PEI), care a fost utilizată anterior pentru transducția proteinelor prin membrană, livrată INN la șoareci transgenici APP / PS1 și in vitro. Acești șoareci au o producție crescută de beta-amiloid în neuroni. Conjugatul terapeutic conține, de asemenea, un segment de polyR, o peptidă care pătrunde celula. Marfa a fost destinată să inhibe agregarea și propagarea A-beta prin intrarea în celulă și legarea peptidelor A-beta, prevenind amiloidoza. La șoareci transgenici tineri, livrarea zilnică de IN a acestui conjugat a redus nivelurile de A-beta și a îmbunătățit performanța la testele de memorie la șoareci după 4 luni de tratament. La șoarecii mai în vârstă cu plăci amiloide stabilite, numărul plăcilor a rămas constant, dar dimensiunea și abundența acestora în SNC a scăzut cu aproximativ 20%. Nu este clar dacă acești șoareci au prezentat îmbunătățiri în testele de memorie. Nu a fost prezentată nicio imunoreactivitate la peptidă.

Sper că acest lucru va fi de folos pentru alții. Vă rugăm să nu ezitați să-mi trimiteți un ping dacă am ratat un fapt crucial sau am afirmat ceva greșit! De asemenea, vă rog să-mi spuneți dacă aceste postări de stil sunt prea plictisitoare pentru a sta în picioare, deși nu pot promite că asta mă va împiedica să scriu mai multe dintre ele ...

- (VII) REFERINȚE -

[1] Fosgerau K și Hoffmann T. Terapia peptidică: direcții actuale și viitoare. Drug Discovery Today. 2015 20(1): 122–128.

[2] Usmani și colab. THPdb: Baza de date a peptidelor și proteinelor terapeutice aprobate de FDA. Plus unu. 2017 12(7).

[3] Editori de tehnologie farmaceutică. Peptidele câștigă tracțiune în dezvoltarea medicamentelor. 02 iunie 2012. Accesat: 19 martie 2018. Disponibil la: http://www.pharmtech.com/peptides-gain-traction-drug-development?id=&pageID=1&sk=&date=

[4] Yang N și Hinner M. Noțiuni de bază asupra membranei celulare: o prezentare generală pentru molecule mici, peptide și proteine. Metode Mol Bio. 20151266: 29–53.

[5] Guidotti G, Brambilla L, Rossi D. Peptide penetrante celulare: de la cercetarea de bază la clinici. Tendințe în științe farmacologice. 201738(4): 406–424.

[6] Guo Z, Peng H, Kang K și Sun D. Peptide cu penetrare celulară: Posibile mecanisme de transducție și aplicații terapeutice (Revizuire) Rapoarte biomedicale. 20164: 528–534.

[7] Walport L, Obexer R și Suga H. Strategii pentru tranziția peptidelor macrociclice la conducte permeabile la medicamente celulare. Opinia curentă în biotehnologie. 201748: 242–250.

[8] Li Di. Abordări strategice pentru optimizarea proprietăților ADME ale peptidelor. Jurnalul AAPS. 201517(1): 134–143.

[9] Qian Z, Dougherty P și Pei D. Direcționarea interacțiunilor proteine-proteine ​​intracelulare cu peptide ciclice permeabile la celule. Opinia curentă în biologia chimică. 201738: 80–86.

[10] Baar și colab. Apoptoza țintită a celulelor senescente restabilește homeostazia țesuturilor ca răspuns la chimiotoxicitate și îmbătrânire. Celulă. 2017169: 132–147.

[11] Marcus S, Pirogova E, Piva T. Evaluarea utilizării peptidelor terapeutice pentru tratamentul cancerului. Journal of Biomedical Science. 201724: 1–15.

[12] Cheng Y și colab. Un medicament peptidic administrat intranazal ameliorează declinul cognitiv la șoarecii transgenici Alzheimer. EMBO Medicină moleculară. 20179(5): 703–715.


Priveste filmarea: PROTEÍNAS - COMPOSTOS ORGÂNICOS - BIOQUÍMICA. Biologia com Samuel Cunha (Noiembrie 2021).