Informație

Care este cea mai bună înțelegere actuală a modului în care funcționează transformarea drojdiei?


Aș vrea să mă pun la curent cu ceea ce știu în prezent știința despre transformarea drojdiei. Mai exact, transformarea plasmidelor și a fragmentelor de ADN liniar. Sunt interesat în special de aspecte practice, cum ar fi:

  • Pentru ce este sperma de somon? Ce se întâmplă dacă nu îl folosesc? Ce se întâmplă dacă folosesc mai mult?
  • Care este relația dintre numărul de celule, cantitatea de ADN transformat și eficiența transformării?
  • Cum afectează alegerea dimensiunii decalajului cuvei de electroporație eficiența?
  • Ce pot face pentru a obține mai multe colonii după ce mi-am transformat drojdia?
  • Ce pași pot sări pentru a face transformarea mai rapidă dacă fac o transformare ușoară?
  • Cum afectează diferite medii genetice și medii eficiența? Există unele comune care reduc eficient eficiența? Există unele neobișnuite care îl măresc substanțial?
  • Care este efectul timpului de "recuperare" post-transformare (de exemplu, cultura 12 h fără selecție și apoi placa pe mediu selectiv)?
  • Merită să faci sferoplaste?
  • Același protocol de transformare funcționează pentru diferite specii (S. cerevisiae, S. pombe, C. albicans etc.)?
  • Există un cadru teoretic coerent pentru a înțelege ce se întâmplă de fapt atunci când drojdia este transformată, spre deosebire de „amestecați câteva substanțe chimice cu ADN și aruncați celule, abra kadabra, transformanții ies”? Tipul de teorie despre care mă întreb ar fi util în prezicerea condițiilor pentru o eficiență mai bună.

Nu mă aștept să răspundeți în mod cuprinzător la aceste întrebări în răspunsul dvs. Acest lucru ar duce la un răspuns foarte lung și fiecare dintre acestea ar putea fi o întrebare aici în sine.

In schimb, Vreau ca răspunsul să numească materiale de referință care pot fi studiate pentru a afla mai multe despre punctele de mai sus. De exemplu, recenziile recente sau manualele de către experți consacrați în domenii ar fi destul de utile.


Nu am lucrat niciodată prea mult cu drojdie, dar pot totuși să dau câteva răspunsuri:

Sperma de somon este folosită ca așa-numitul „ADN purtător”. Se crede că se leagă de peretele celular al drojdiei și astfel împiedică ca ADN-ul care va fi transformat să o facă. Acest lucru crește eficiența transformării. Vezi aici pentru mai multe detalii: "Transformarea drojdiei prin metoda acetat de litiu / ADN purtător monocatenar / metoda polietilen glicol.".

Efectul timpului de recuperare: În acest timp, de obicei, dați celulelor șansa de a se recupera de la un tratament relativ grosolan și de a exprima gena de rezistență (atunci când este utilizată) înainte de a le muta într-un mediu selectiv. Acest lucru crește eficiența transformării.

Sferoblaste: Din câte îmi amintesc, sunt extrem de fragile și dureroase de manevrat. Cu toate acestea, atunci când reușești să le faci, ai celule care preiau cantități mari de ADN, ceea ce le face destul de eficiente.

Cred că aceste recenzii merită cu siguranță să fie analizate (conțin și mai multe referințe):

Dacă aveți șansa să puneți mâna pe o copie a „Metodelor în genetica drojdiei: manualul de curs al unui laborator de primăvară rece”, cred că acest lucru vă va fi de mare ajutor.


8 secrete pentru o curățare friptă și suculentă

Drojdia este forța motrice a fermentației, procesul magic care permite unei mase dense de aluat să devină o pâine bine înălțată. Și totuși drojdia nu este altceva decât o ciupercă unicelulară. Cum o face?

Drojdia funcționează consumând zahăr și excretând dioxid de carbon și alcool ca subproduse. În fabricarea pâinii, drojdia are trei roluri majore. Cei mai mulți dintre noi sunt familiarizați cu drojdia și capacitatea de dospire. Dar este posibil să nu știți că fermentația ajută la întărirea și dezvoltarea glutenului în aluat și, de asemenea, contribuie la arome incredibile în pâine.

Drojdia face ca aluatul să crească

Elementele esențiale ale oricărui aluat de pâine sunt făina, apa și, desigur, drojdia. De îndată ce aceste ingrediente sunt amestecate împreună, enzimele din drojdie și făină determină descompunerea moleculelor mari de amidon în zaharuri simple. Drojdia metabolizează aceste zaharuri simple și emană un lichid care eliberează dioxid de carbon și alcool etilic în bulele de aer existente în aluat.

Dacă aluatul are o rețea de gluten puternică și elastică, dioxidul de carbon este ținut în interiorul bulei și va începe să-l umfle, la fel ca cineva care aruncă în aer guma. Pe măsură ce tot mai multe celule mici de aer se umplu cu dioxid de carbon, aluatul crește și suntem în drum spre pâinea dospită.

Celulele de drojdie prosperă cu zaharuri simple. Deoarece zaharurile sunt metabolizate, dioxidul de carbon și alcoolul sunt eliberate în aluatul de pâine, făcându-l să crească. Scott Phillips.

Drojdia întărește aluatul de pâine

Când amestecați făină și apă, două proteine ​​din făină - glutenina și gliadina - apucă apa și una pe cealaltă pentru a forma o masă elastică de molecule asemănătoare gumei, pe care o numim gluten. În fabricarea pâinii, dorim să dezvoltăm cât mai mult gluten, deoarece întărește aluatul și se menține în gaze care vor face să crească pâinea.

Odată ce făina și apa sunt amestecate împreună, orice prelucrare ulterioară a aluatului încurajează să se formeze mai mult gluten. Manipularea aluatului în orice mod permite mai multe proteine ​​și apă să se regăsească și să se lege între ele. Dacă ai făcut vreodată paste de casă, știi că de fiecare dată când rulezi aluatul prin mașină, aluatul devine mai elastic, cu alte cuvinte, se dezvoltă mai mult gluten. Și cu aluatul de foietaj, de fiecare dată când pliați, întoarceți și rulați aluatul, acesta devine mai elastic.

Drojdia, precum frământarea, ajută la dezvoltarea rețelei de gluten. Cu fiecare explozie de dioxid de carbon pe care drojdia o eliberează într-o bulă de aer, proteinele și moleculele de apă se deplasează și au o altă șansă de a se conecta și de a forma mai mult gluten. În acest fel, o creștere a aluatului este o frământare aproape moleculă cu moleculă. Data viitoare când pui aluatul de pâine după prima creștere, observă cât de neted și puternic a devenit glutenul, parțial de la creștere.

În acest stadiu, majoritatea brutarilor întind și alungă aluatul într-o rotundă pentru a-i oferi un vârf neted și strâns, care va prinde gazele produse prin fermentare. Apoi au lăsat acest aluat foarte elastic să stea timp de 10 până la 15 minute. Acest lucru lasă legăturile de gluten să se relaxeze puțin și ușurează modelarea finală a aluatului. Acest pas de rotunjire și odihnă nu este inclus în multe rețete de copt acasă, dar este un lucru bun de făcut.

Fermentarea generează aromă în pâine

În calitate de Harold McGee, autorul Despre Gătitul alimentar și amplificator, a subliniat, moleculele mari din proteine, amidon și grăsimi nu au multă aromă, dar atunci când se descompun în blocurile lor - proteinele în aminoacizi, amidonul în zaharuri sau grăsimile în acizi grași liberi - toate au arome minunate. Fermentarea, indiferent dacă acționează asupra sucurilor de fructe pentru a face vin sau pe făină pentru a face pâine, face exact asta - descompune moleculele mari în cele mai mici și aromate.

La începutul fermentației, enzimele din drojdie încep să descompună amidonul în zaharuri mai aromate. Drojdia folosește aceste zaharuri, precum și zaharurile deja prezente în aluat și produce nu numai dioxid de carbon și alcool, ci și o serie de subproduse aromate, cum ar fi acizii organici și aminoacizii. O multitudine de enzime încurajează tot felul de reacții care rup lanțurile mari de molecule în altele mai mici - amiloză și maltoză în glucoză, proteine ​​în aminoacizi.

Pe măsură ce fermentația continuă, aluatul devine mai acid. Acest lucru se datorează, în parte, creșterii nivelurilor de dioxid de carbon, dar există și acizi organici mai aromatici, cum ar fi acidul acetic (oțet) și acidul lactic, care se formează din alcoolul din aluat. (Acest lucru este similar cu ceea ce se întâmplă cu o sticlă de vin care a fost lăsată degajată o vreme: alcoolul se combină cu oxigenul pentru a face oțet.) Aciditatea aluatului face ca mai multe molecule să se descompună. Aluatul devine un veritabil ferment al reacțiilor. În cele din urmă, cantitatea de alcool formată începe să inhibe activitatea drojdiei.

Drojdia are ajutor în producerea compușilor aromatici. Bacteriile sunt, de asemenea, importante constructori de arome. Există bacterii în aluat de la început, dar atâta timp cât drojdia este foarte activă, consumă zaharuri la fel de repede pe cât au fost produse și nu lasă alimente bacteriilor, cărora le place și zahărul. Dar când brutarii răcesc un aluat și încetinesc creșterea acestuia, frigul reduce dramatic activitatea drojdiei. Bacteriile, pe de altă parte, funcționează bine chiar și la temperaturi scăzute, așa că acum au ocazia să se dezvolte, producând mulți acizi aromatici.

Această pâine de pâine artizanală își datorează aroma complexă unei fermentații lungi, care descompune moleculele mari în cele mai mici aromate. Judi Rutz.


Introducere

  1. Pentru a demonstra utilizarea repetărilor palindromice scurte grupate în mod regulat (CRISPR) pentru editarea genelor și producerea unei mutații specifice care duce la un fenotip discernabil într-un organism eucariot.
  2. Pentru a demonstra conceptul de inginerie genetică prin genetică directă și editarea genelor.
  3. Pentru a demonstra utilitatea speciilor de drojdie fungică Saccharomyces cerevisiae ca sistem experimental model pentru analiza genetică.
  4. Pentru a introduce conceptul de mutanți ai căilor metabolice și de dezvoltare în funcția și dezvoltarea celulelor eucariote.

Cercetare

Arabidopsis găsit într-o curte din Seattle.

Lucrările noastre recente s-au bazat pe genetică moleculară, genomică, fiziologie și biologie sintetică pentru a construi noi instrumente pentru a studia dinamica semnalizării și pentru a aplica aceste instrumente la o varietate de întrebări fundamentale în biologia celulară și a dezvoltării. Mai exact, suntem:

  1. Construirea de instrumente pentru studierea și reprogramarea dinamicii de semnalizare
  2. Integrarea stării metabolice în rețelele de control al creșterii
  3. Evaluarea impactului evoluției asupra rețelelor de semnalizare

1. Construirea instrumentelor pentru studierea și reprogramarea dinamicii de semnalizare

Transcriere sintetică indusă de auxină în drojdie. Toate părțile rețelei transferate în drojdie sunt prezentate ca o schemă de circuit în partea de sus. Adăugarea de auxină la cultura de drojdie la momentul 0 declanșează degradarea represorilor (etichetați cu YFP, o proteină care fluorescă galbenul) și activarea unui reporter (CFP, o proteină care fluorescă cianul).

Construirea de rețele dinamice de la bază. Auxina este un hormon vegetal care joacă un rol cheie în aproape fiecare aspect al biologiei plantelor. Testele experimentale directe ale dinamicii de semnalizare în această cale crucială sunt confundate de ubicuitatea răspunsului auxinei în celulele plantei. În colaborare cu Eric Klavins în cadrul Departamentului de Inginerie Electrică al UW, am dezvoltat o abordare alternativă în care transplantăm sistematic calea de răspuns a auxinei din Arabidopsis în drojdia unicelulară Saccharomyces cerevisiae. O analogie cu abordarea noastră este să încercăm să înțelegem cum funcționează un radio prin eliminarea componentelor una câte una, reconectarea fiecărei părți într-o setare simplă și caracterizarea circuitelor rezultate în detaliu. Am transferat cu succes calea de răspuns a auxinei nucleare de la percepția auxinei prin activarea transcripției - o faptă destul de remarcabilă care evidențiază conservarea fundamentală a biologiei celulare eucariote. În prezent suntem încântați să aplicăm acest sistem punctelor de control fundamentale ale semnalizării, inclusiv degradarea proteinelor, reprimarea transcripțională și activarea transcripțională. De asemenea, dezvoltăm și implementăm noi instrumente pentru reparameterizarea rețelelor de bază reglementate de hormoni (inclusiv auxină, iasmonate și gibereline) folosind factori de transcripție sintetici.

2. Integrarea stării metabolice în rețelele de control al creșterii

Zaharoza favorizează transportul rădăcinii auxinice. Plantele cultivate pe medii suplimentate cu zaharoză (S) au prezentat un transport crescut de auxină în rădăcină în comparație cu plantele cultivate fără supliment de zaharoză (N). Transportul a fost vizualizat prin colorare pentru un reporter de auxină la câteva ore după aplicarea unei picături care conține auxină (IAA) pe un cotiledon (așa cum este prezentat în schemă).

Am descoperit că multe fațete ale creșterii sunt deosebit de sensibile la stadiul de dezvoltare, precum și la perturbațiile genetice și de mediu. Printre descoperirile noastre cele mai surprinzătoare a fost că disponibilitatea carbonului a avut un efect dramatic asupra mai multor aspecte ale dinamicii de creștere. În mod interesant, factorii de transcripție reglementați de lumină PIF4 și PIF5 au fost necesare pentru creșterea efectelor de creștere a CO2 ridicat și PIF-uri a acționat cel puțin parțial prin reglarea cantității de auxină livrată de la lăstari la rădăcini. Rezultatele noastre indică integrarea directă a semnalului luminos în aval atât de fotoreceptorii de fitocrom cât și de fotosinteză. Această lucrare oferă o oportunitate remarcabilă de a integra semnalizarea celulară într-un cadru organismal de control al creșterii plantelor. Progresul nostru a fost foarte accelerat de o colaborare continuă cu Soo-Hyung Kim în UW School of Environmental and Forest Sciences.

3. Evaluarea impactului evoluției asupra rețelelor de semnalizare

Brassica rapa are multe de oferit ca sistem de studiu, inclusiv un răsad mai mare.

Abordările pentru ingineria noilor soiuri de culturi sunt remarcabil de brute comparativ cu proiectarea și implementarea tehnologiei non-biologice. Un punct forte al ingineriei este capacitatea sa de a analiza sisteme complexe, cum ar fi un Boeing 787, în subrețele sau module care pot fi analizate izolat. Sistemul de răspuns auxin sintetic în drojdie, dezvoltat de laboratorul meu în colaborare cu Eric Klavins în cadrul Departamentului de Inginerie Electrică UW, face posibilă interogarea funcției modulelor de semnalizare a auxinei plantelor în mod izolat. În prezent testăm funcția componentelor auxinice ale Zea mays și Brassica rapa în sistemul nostru sintetic. Această abordare comparativă poate ajuta la răspunsul la una dintre cele mai vechi întrebări din biologia auxinei: cum face o moleculă atât de simplă atât de multe lucruri diferite?

Pentru cele mai recente publicații de la Nemhauser Lab, vă rugăm să folosiți următoarele link-uri:


Folosirea drojdiei pentru a înțelege bolile care se pliază de proteine: un interviu cu Susan Lindquist

Forma proteinelor este vitală pentru funcția sa. Procesele patologice, cum ar fi neurodegenerarea, toleranța la stres și bolile prionice, rezultă adesea din plierea greșită a proteinelor. Cine și-ar fi putut imagina că cercetările efectuate într-un organism unicelular, cum ar fi drojdia, ar produce descoperiri relevante pentru tratamentul bolilor neurologice umane complexe? Susan Lindquist și-a imaginat că acest eucariot simplu ar putea dezvălui multe despre plierea proteinelor și patologia și a avut dreptate.

Ce caracteristici v-au determinat să vă concentrați asupra drojdiei ca organism model?

Am sărit de la lucrul la Drosophila la lucrul la drojdie literalmente în momentul în care am auzit despre tehnica concepută de Terri Orr-Weaver, Jack Szostak și Rod Rothstein. Ei își dăduseră seama cum să pună o mutație într-o bucată de ADN și să o țintească înapoi în genom, înlocuind gena din cromozom cu ceea ce doriți [Orr-Weaver, TL, Szostak, JW și Rothstein, RJ Transformarea drojdiei: o sistem model pentru studiul recombinării (1981). Proc. Natl. Acad. Știință. Statele Unite ale Americii78, 6354–6358] [folosind drojdia ca organism model]. M-am gândit: „Uau! Este absolut absolut fabulos. ”

Am lucrat la proteine ​​de șoc termic și le-am folosit ca sistem pentru a studia expresia genelor, întrebându-ne „cum își schimbă rapid și complet un organism modelul de expresie genetică ca răspuns la un stimul specific?” Am făcut multe satisfacții și lucrare interesantă într-un moment în care se știa foarte puțin despre modul în care organismele pot controla ce proteine ​​vor produce. Am constatat că expresia proteinelor de șoc termic este reglementată la fiecare nivel la care vă puteți gândi. Nu este reglementat doar la nivelul transcripției, ceea ce a fost un lucru fierbinte în momentul în care este reglementat la nivelul de traducere preferențială, de rotire selectivă a ARN-ului, de îndepărtarea selectivă a poliadenilării și de transportul preferențial al ARN-urilor din nucleu. Am descoperit o mulțime de mecanisme de reglementare și am constatat că acestea funcționau într-un mod incredibil de orchestrat. A fost minunat, dar nu știam ce fac proteinele. În acel moment, trebuia să știm ce fac proteinele, iar genetica este un instrument puternic pentru asta.

Ideea mea este să folosești organismul potrivit pentru întrebarea specială la care încerci să ajungi și să te miști mult

De îndată ce am auzit despre noile metode de drojdie, m-am înscris la cursul Cold Spring Harbor de drojdie. Gerry Fink [care a dezvoltat drojdia de brutar ca model pentru studierea biologiei fundamentale a tuturor organismelor și este profesor de genetică la MIT și membru la Institutul Whitehead] a fost unul dintre profesori. Îmi amintesc că la acea vreme facultatea superioară nu petrecea mult timp consilind facultatea junioră. Singura dată când cineva s-a oprit să-mi dea sfaturi a fost după ce am auzit că voi începe să lucrez la drojdie - trei ani în funcția de profesor asistent. El a spus: „este absolut nebunesc, nu schimba organismele, nu face ceva complet diferit chiar în mijlocul ceasului.” Dar am continuat și am decis să o fac. (Ca femeie, la acea vreme, nu mă gândisem cu adevărat că era probabil că voi primi mandatul oricum. Așa că m-am gândit că este prea bine să renunț.) Sunt atât de bucuroasă că am făcut-o. Această capacitate de a intra și a elimina o genă folosind mutageneza direcționată pe site a fost doar un lucru transformator în ceea ce privește eleganța experimentală. De atunci și chiar înainte de atunci, s-au făcut multe lucruri pentru a face organismul [drojdiei] mai manipulabil. Totul a început cu producătorii de bere care doreau să facă bere mai bună acum aproximativ o sută de ani. Dar a continuat, deoarece anumite aspecte ale organismului sunt doar minunate pentru manipularea experimentală. Poate crește fie ca haploid, fie ca diploid, astfel încât să puteți acoperi sau descoperi efectele mutațiilor oricând doriți. Este foarte ușor și ieftin de cultivat. Are un genom mic, așa că sa încheiat fiind primul organism superior care are secvențiat genomul. Un alt lucru grozav este că face lucrurile într-un număr uimitor de moduri, la fel cum fac celulele umane. Este un organism simplu, mic, dar are toate compartimentele celulare - reticulul endoplasmatic, un nucleu legat de membrană, traficul de vezicule - precum și structura cromatinei, factorii de transcripție, mecanismele specifice pentru reglarea ciclului celular și multe tipuri diferite de traductoare de semnal. Toate acestea funcționează în același mod ca în organismele superioare. Bacteriile fac o mulțime de lucruri destul de diferit. Nu mă înțelegeți greșit, și bacteriile sunt minunate pentru a lucra. Cresc și mai repede! Și pentru studierea multor probleme cu adevărat fundamentale în biologie, acestea sunt grozave. Dar există multe straturi de biologie și, în special, multe probleme legate de mecanismele specifice bolii umane, care nu pot fi studiate la bacterii. Dar în drojdie, traficul de proteine ​​- în și în afara nucleului, prin calea secretorie, în organite - controlul creșterii și al diviziunii, răspunsuri la stimuli diferiți, respirație mito-condrială, toate acestea sunt foarte similare.

Există, evident, multe diferențe între oameni și drojdie. Este de la sine înțeles: o celulă de drojdie nu este un neuron. Dar puteți studia o mare parte din biologia de bază a celulelor eucariote în drojdie. De exemplu, studiem bolile neurodegenerative. De ce s-ar gândi cineva să studieze o boală neurodegenerativă în drojdie? Multe dintre problemele acestor boli derivă din problemele legate de plierea și traficul de proteine ​​și aceasta este în mare parte aceeași în drojdie ca și în neuroni. În măsura în care problemele sunt aceleași [între drojdie și alte organisme], este cu adevărat minunat să poți să o studiezi în drojdie, deoarece sunt atât de rapide de lucrat cu ele și pentru că o serie de oameni foarte inteligenți au creat astfel de instrumente uimitoare pentru lucrează cu ei. Am reușit apoi să trecem de la drojdie la neuroni, în mare parte prin ajutorul colaboratorilor, care au fost minunați. Este minunat să ai un grup de oameni cu care să interacționezi, care au experiență în domenii foarte diferite.

Cum abordați distanța mare dintre o celulă de drojdie și un mamifer?

Modul principal în care am făcut-o este cu colaboratorii. Cu una dintre bolile cu care lucrăm, care este boala Parkinson, liniile celulare neuronale nu par a fi foarte bune pentru studierea [mecanismelor bolii]. Cred că neuronii nu trebuie să aibă o replicare continuă și atunci când aveți o linie celulară neuronală în cultură derivată dintr-o tumoare, nu este chiar normal. Au pierdut multe dintre mecanismele lor apoptotice. Deci, liniile celulare neuronale nu au fost la fel de utile pe cât s-ar spera pentru studierea unor probleme. Asta nu înseamnă că nu există unele lucruri fabuloase făcute cu liniile celulare! Au existat, dar unele răspunsuri la greșelile de proteine ​​și la traficarea greșită pot fi de fapt mai asemănătoare la drojdie decât la celulele tumorale cultivate. În orice caz, am tradus unele dintre rezultatele drojdiei noastre în modele neuronale în alte moduri. De exemplu, am colaborat cu Chris Rochet pentru a utiliza neuroni primari diferențiați preluați din creierul șobolanilor embrionari și cu Guy Caldwell pentru a studia neuronii dopaminurgici în nematode. Luăm gene pe care le găsim în drojdie pentru a servi ca supresori genetici sau potențatori și clonează omologii lor umani. Trimitem [colaboratorilor noștri] clone de expresie sau viruși, care sunt apoi clonați în aceste alte sisteme. [Acest proces] a validat efectele unora dintre genele noastre asupra toxicității datorate α-sinucleinei. Deci, cred că acest lucru este cu adevărat interesant - asta înseamnă un miliard de ani de conservare pentru un proces biologic celular de bază.

Cum credeți că progresele tehnice recente, de exemplu genomica, vor influența viitoarele organisme model?

Tehnologiile sunt incredibil de active. Cu siguranță, secvențierea genomului care a fost făcută a deschis multe alte organisme de studiat, este absolut extrem de puternică. Invertebratele, vertebratele și alte ciuperci devin puternice și aveți acces la a face lucruri cu agenți patogeni care [anterior] erau foarte dificili. Cred că acum trebuie să dezvoltăm alte instrumente pentru a lucra cu aceste organisme. Există multe lucruri pe care ați putea dori să le studiați într-un alt organism. De exemplu, [să luăm] un organism patogen. Ne-am uitat la ceva Plasmodium falciparum, unul dintre organismele care provoacă malarie. Este foarte dificil de manipulat genetic. Este greu să crești [și] are un ciclu de viață foarte complicat. Dar există anumite aspecte ale biologiei P. falciparum că cineva ar putea fi capabil să studieze prin transpunerea proteinelor sale într-o celulă de drojdie. De exemplu P. falciparum are un proteom foarte ciudat. Are o mulțime de proteine ​​bogate în asparagină și multe alte secvențe simple repetă proteine, de asemenea. Cred că acest lucru poate crea o anumită vulnerabilitate în ceea ce privește plierea proteinelor care ar putea potențial (aceasta este cu adevărat o „plăcintă pe cer”) să ne conducă la strategii terapeutice complet noi. Se întâmplă ca laboratorul meu să știe multe despre plierea proteinelor și, mai ales, despre problemele de pliere ale proteinelor de secvență simplă. Deci, ne gândim să luăm o parte din P. falciparum proteine ​​care arată că ar fi greu să se plieze și să le pună în celule de drojdie pentru a le studia.

Un alt lucru pe care ne gândim să îl facem este să lucrăm cu Rudolf Jaenisch la realizarea IPS [celule pluripotente induse] și, pe măsură ce începem să dezlegăm unele dintre procesele genetice care cauzează PD [boala Parkinson], folosim de fapt celulele de la pacienți pentru a descoperi ce strategii sunt cele mai potrivite pentru acel individ. [Deoarece] diferiți pacienți vor avea predispoziții genetice diferite, sperăm să luăm astfel de celule și să încercăm să testăm diferite combinații de strategii terapeutice derivate inițial din analiza genetică în drojdie, nematode și neuroni de șobolan.

Acestea sunt lucrurile de schemă mare pe care aș dori să le fac și sunt permise de faptul că a apărut această tehnologie a pluripotenței [capacitatea de a manipula celulele în linii discrete mature]. Ne permite să facem un salt larg. Noile tehnici de imagistică sunt, de asemenea, fabuloase. Nu am fost încă în fruntea imaginii, dar aș vrea să ajung acolo. Unul dintre postdoctorii mei încearcă câteva lucruri uimitoare în colaborare cu grupul lui Matt Lang aici, la MIT.

Un alt lucru grozav este intrarea diferitelor tipuri de oameni în acest domeniu. Fizicienii au adus tot felul de idei interesante în ceea ce privește tehnologiile. Și inginerii - ingineria țesuturilor și microfabricarea - astfel încât să puteți studia procesele în paralel în număr mare mult mai rapid. Gândindu-se la circuitele celulei, inginerii aduc o perspectivă complet diferită. Este un moment fenomenal pentru biologie chiar acum și este atât de rușinos încât noi - și prin aceasta mă refer la întreaga comunitate științifică - suntem atât de ciupiți în ceea ce privește finanțarea.

Dacă ar fi să începeți un proiect complet nou, care ar fi acesta?

Aș vrea să abordez problema malariei despre care tocmai v-am spus, deoarece este o boală atât de îngrozitoare. Și odată cu încălzirea globală, cred că se va înrăutăți. O incursiune proaspătă și unică în el ar putea fi natura neobișnuită a problemelor sale de pliere a proteinelor, deoarece genomul său codifică proteinele care sunt pur și simplu atât de ciudate. Dar dacă voi face asta sau nu, nu știu încă.

Ce aș intra în mine dacă aș începe cu adevărat proaspăt - dacă aș fi un student postdoc sau absolvent care încearcă să decidă ce să fac? Descoper că iubesc atât de multe aspecte diferite ale biologiei încât aș încerca doar să găsesc ceva care să mă entuziasmeze și să mă mut de acolo.

Cu siguranță, unul dintre marile mistere și marile frontiere este creierul. Cum funcționează creierul nostru și stochează toate amintirile noastre? Avem un pic de vârf în acest sens și lucrăm la asta cu Eric Kandel și Kausik Si. Nebun pe cât pare, de fapt lucrăm la asta în drojdie. Acest lucru provine din alte lucrări pe care le facem despre biologia prionică. Numele provine de la această boală îngrozitoare, oribilă, în care o proteină își schimbă forma și apoi creează o reacție în lanț conformațională în care o proteină după alta suferă o schimbare de formă. Este aceeași proteină, dar poate avea forme diferite. Și una dintre acestea merge și reacționează cu o altă proteină de același tip și face ca și ea să-și schimbe forma. Provoacă o boală oribilă printr-un proces pe care încă nu îl înțelegem. Un proces similar poate avea loc în celulele de drojdie, dar în acest caz nu provoacă o boală oribilă, ci doar schimbă funcția proteinei. Foarte important, această schimbare de formă și funcție se perpetuează, de la proteină la proteină. Deci schimbarea funcției este transmisă de la o generație la următoarea generație în celula de drojdie. De fapt, aveți un element ereditar care se bazează pe o modificare a formei proteinelor, nu pe o modificare a acidului nucleic.

Este un mecanism interesant de a crea o „memorie moleculară” într-un anumit sens, deoarece odată ce schimbați conformația, există o buclă auto-perpetuantă pentru ao menține. Schimbarea de formă propagată este asociată cu o schimbare a funcției care trece de la generație la generație în drojdie. Dar este un mod interesant de a gândi cum ar putea fi codificate alte tipuri de memorie - chiar și memoria neuronală. Toți cei despre care am menționat acest lucru credeau că sunt nebun [pentru această idee a unui proces de memorie derivat din proteine] până când Eric Kandel a intrat în biroul meu și a întrebat: „Credeți că prionii ar putea fi implicați în învățare și memorie”. Aproape că am căzut de pe scaun. Avea în laboratorul său un om de știință înzestrat, Kausik Si, care găsise o proteină care este implicată în învățare și memorie și se află la sfârșitul sinapsei. Avea secvențe care arătau exact ca prionii noștri de drojdie. Am colaborat cu ei pentru a studia capacitatea sa de formare a prionilor și pentru a încerca să identificăm regiunile proteinei care sunt implicate în efectuarea schimbării conformaționale a acesteia. Vedem [proteina lor de interes] suferă o schimbare conformațională atunci când o privim în drojdie și, de asemenea, ea perpetuează această schimbare. Și asta perpetuează o schimbare a funcției care ar fi de așteptat să ajute la menținerea sinapselor.

Acum căutăm alți prioni de drojdie și credem că am găsit mai mulți care sunt proteine ​​complet fără legătură. Următoarea fază ar putea fi căutarea lor în alte organisme, cum ar fi oamenii, acum că am învățat cum să lucrăm cu ei folosind un sistem de debit mare - sau de debit moderat - în drojdie.

Aveți o gamă neobișnuită de experiență atât în ​​roluri administrative cât și științifice la nivel înalt și ați câștigat o reputație de cineva care creează medii de lucru pozitive. În opinia dumneavoastră, există o infrastructură identificabilă sau un tip de organizație care oferă cel mai favorabil mediu pentru cercetarea științifică?

Cred că există mai multe lucruri [care permit oamenilor să-și facă cea mai bună treabă]. În ceea ce privește propriul laborator, am două tipuri de criterii. În primul rând, ca oamenii să fie luminoși, creativi și riguroși ... Buni oameni de știință. Dar, la fel de important, o prioritate foarte mare în a aduce pe cineva este să știe că este generos, deschis, vrea să împărtășească informații, îi place să ajute alte persoane și sunt dispuși și gata să accepte sfaturi de la alte persoane. Oamenii nu mai intră în laboratorul meu decât dacă sunt așa. Totuși, există o mulțime de neînțelegeri care se vor întâmpla și sincer cred că unul dintre cele mai importante lucruri este să fii deschis despre lucruri. Întreb oamenii când vor intra în laboratorul meu să fie [deschiși]. Am un manager de laborator minunat și atunci când cineva are o problemă, trebuie să vorbească mai întâi cu ea și dacă nu poate fi rezolvat într-un mod ușor, atunci poate veni să vorbească cu mine. Am avut o mamă italiană și un tată suedez și erau stereotipici în felul lor de a trata cu lumea. Se înțelegeau greșit în mod constant. I-am iubit atât de mult pe amândoi și i-am văzut cu aceste neînțelegeri care erau simple și m-au înnebunit. A trebuit să mediez între ei când eram copil și cred că mai am ceva din asta acum în mine. Pot să înțeleg că oamenii spun lucrurile în moduri diferite și trebuie doar să le scoată la iveală și să vorbească despre asta. De obicei, constat că dificultățile care apar în laborator sunt doar simple neînțelegeri.

În ceea ce privește instituțiile, cred că unele dintre aceste lecții se aplică și unei instituții. Nu poți, în calitate de director al Whitehead, să-i verifici pe toți pentru a vedea dacă vor fi colegi buni, ceea ce pur și simplu nu se întâmplă. Puteți încerca să puneți în aplicare structuri de sprijin care să le permită oamenilor să știe că vă pasă cu adevărat de ele și vă pasă de crearea unui mediu în care să își poată face cea mai bună muncă. Unul dintre primele lucruri pe care le-am făcut când am fost director Whitehead a fost să ridic stipendia postdoc pentru că am crezut că este prea scăzut și să creez un sistem de recompensare a persoanelor care au obținut propriile burse, oferindu-le puțină finanțare suplimentară pe care să o poată folosi la discreția lor. pentru a le sprijini cariera. Sunt foarte bucuros să spun că David Page, care este actualul director, și-a asumat acest lucru drept una dintre prioritățile sale majore. De fapt, el a reușit să facă mult mai bine decât mine. Postdoctorii simt că oamenilor le pasă de ei și că noi [facultatea] ne amintim când am fost acolo.

Avem o tradiție minunată, îndelungată, la Capul Alb al unui refugiu. We go up to New Hampshire for a few days, all of the students, all of the postdocs, many of the technicians and, importantly, every single faculty member. There are many places that have retreats, University of Chicago used to have one and I attended about half the time. Terri Orr-Weaver, when she was away on sabbatical in Greece, came back for the [Whitehead] retreat. That kind of commitment to having a community, and realizing that the whole is much greater than the sum of its parts, is really important. At our retreat the faculty are there the whole time, talking to people, looking at their posters. It really takes that level of commitment. Last year two people in my lab didn’t go, both were having babies. Now that is a good reason not to come. People take it very seriously and they do so because they know the faculty does too and that they will be there.

While at an institutional level, we cannot go around to see how collegial every student and postdoc is but what we do is make very careful decisions about our faculty. The Whitehead faculty has lunch together every Thursday afternoon. We really know each other, we talk to each other and we interact a lot. When we hire a new faculty member, we are looking for the most brilliant minds we can find but we are also looking for people that we want to interact with and who we think will be part of the community. You really can establish a community by creating a set of operating principles.

Another thing that an institution can do, if they have any financial resources at all to do it, is to provide seed funding for crazy ideas that would be high risk, high payoff ideas. The Whitehead has a tradition of doing that and it is very central to its mission.

The DMM staff greatly appreciates Susan Lindquist’s candor in relating her interesting personal story and sharing her insight about creating lab and institutional environments that enable productive science. Her creative research demonstrates the value of model organisms in understanding and treating human disease. We feel that her work and personal example provide a fitting subject for the first ‘Model for Life’ article in this new journal.

Susan Lindquist was interviewed by Kristin Kain, Associate Reveiws Editor.

Susan Lindquist is a Professor at the Massachusetts Institute of Technology and Whitehead Institute of Biomedical Research, and an investigator in the Howard Hughes Medical Institute


Protein Interaction Networks

One of the great promises of functional analysis on the genomic scale was always the possibility of advancing beyond analysis of gene and protein functions one by one. Soon after the publication of the yeast genome sequence, a number of such technologies emerged. Each of these technologies identifies interactions among proteins or genes, which typically are visualized as a network. It is in the arena of understanding these networks of functional relationship that the main opportunities and challenges for understanding cellular biology at the system level lie. Yeast biology has led the way into this arena, and this appears to us to be the path forward for the future.

The first of these studies to appear was based on the two-hybrid method for detecting protein interactions ( Fields and Song 1989). A number of large-scale efforts using variants of this approach have produced a large body of data. Although lower throughput versions of the two-hybrid method have been successfully employed to identify a great variety of protein–protein interactions, on a large scale the method has been plagued by large numbers of false-positive and false-negative signals, resulting in disappointingly little overlap between the most prominent of the published genome-scale networks ( Uetz și colab. 2000 Ito și colab. 2001 reviewed by Fields 2009).

A much more reliable approach turned out to be a conceptually straightforward biochemical method that can nevertheless be implemented at high throughput. An epitope tag attached to every open reading frame enables precipitation of protein complexes. The identities of the coprecipitating proteins are determined by mass spectrometry. The method is reliable, and the proportion of false-positive signals is low, although it is clear that interactions below a threshold of affinity are unlikely to be detected ( Krogan și colab. 2006). Of course, care must be taken to ensure that the tagged protein is fully functional biologically, which can usually be ascertained by testing it for the ability to complement the cognate deletion mutation. Several large protein interaction data sets obtained by this method are in general agreement with each other and with other information. Like the other methods, affinity precipitation can, with some effort, be used to follow protein interactions dynamically.


COMPUTATION AND DATA MANAGEMENT: CAD AND REPOSITORIES

One of the main difficulties of genetically altering microorganisms for the production of native and non-native high-value compounds is the identification of the appropriate metabolic pathways capable of transforming raw materials into the targeted compound. With the advent of whole-genome sequencing, and the metabolic networks and genome-scale models derived from the genome sequences (Österlund și colab., 2013 Chumnanpuen și colab., 2014), computer-aided design (CAD) tools have been developed to generate heterologous pathways predicted to produce the compound of interest in Silicon (for a recent review on CAD tools, readers are referred to (Fernández-Castané și colab., 2014). Such tools are important to build novel biosynthetic pathways and to improve flux through existing pathways, and were recently adopted by Misra și colab. ( 2013), to elucidate both intuitive and nonintuitive gene targets for improving production of the artemisinin precursor dihydroartemisinic acid. Also, Otero și colab. ( 2013), benefitted from CAD tools for improving succinic acid production.

Even with good CAD tools, it will be difficult to predictably engineer complex biological systems without collections of well-characterized parts, whose descriptions can be used in CAD programmes. To this end, nascent biological parts registries have been developed, including the Registry of Biological Parts (http://parts.igem.org/Main_Page) and the Inventory of Composable Elements (JBEI-ICE) (Ham și colab., 2012). Unfortunately, parts are often poorly characterized (Kwok, 2010), making it difficult to rationally design even the simplest genetic circuit. To improve usability, Wang și colab. ( 2013) recently provided a lookup table to demonstrate the organization of parts used in engineered systems (Wang și colab., 2013). As some parts (e.g. RNA aptamers, fluorescent reporters) are orthogonal and can be applied universally, that is host-unspecific, such tables facilitate bottom-up design approaches in synthetic biology. Ultimately, the emphasis on both parts and systems conditionality, and the access to experimentally validated data should maximize our future understanding of the principles of genetic circuit design and minimize time-demanding trial and error experiments metabolic engineers often face.


EVALUATION OF STUDENT PERFORMANCE

As indicated in the syllabus in supplemental materials, groups are evaluated based on the completeness of their on-line weekly lab notebook entries (20%), experimental design (8%), effort (12%), and the poster (60%). Notebooks are regularly graded with feedback topics ranging from suggested information to calculations. Posters are evaluated based on hypothesis and background (13%), experimental design and methods (13%), results (40%), conclusion (6.5%), answering of questions at the oral presentation (6.5%), and poster layout (20%). Detailed feedback of the posters is provided to each group as a Word document.


Lecții învățate

Through 11 iterations of the course, we have revised the curriculum based on both student and instructor feedback. Below are some important lessons that we have learned.

  1. It is helpful to have a full-time team-member who can work during periods when the course is not offered to prepare laboratory materials (new yeast strains and plasmids), introduce new protocols or optimize current ones, and update written materials. It is also helpful to have a technical support person(s) to prepare and set-up weekly lab materials.
  2. Having students work as pairs on course assignments (post-lab assignments and final poster) leads to improved performance on those assignments. Assessing individual understanding can be done with quizzes that are completed independently.
  3. Requiring that students submit a spreadsheet with their data analysis allows TAs to more readily assess quantitative analyses in conjunction with instructor-provided templates.
  4. Color coding all student materials (racks, tubes, tape, etc.) by mutant (i.e. mut1 = orange, mut2 = blue, mut3 = pink, mut4 = yellow, mut5 = green) facilitates their distribution and organization.
  5. Mistakes (by both staff and students) will happen, but it is often possible to make these into good learning opportunities.
  1. We have found that p53 proteins (particularly the mutant versions) are highly susceptible to proteolysis. Hence, it is essential that once students lyse their yeast cells, they keep their samples at 4°C and work efficiently to minimize the time before they aliquot and freeze their protein extracts.
  2. The DNA-binding assay is prone to high variability. We have found that the following tips help, but do not eliminate this variability: (A) do not leave wash buffer in wells, and do not to allow wells to dry, as both have the potential to increase background (B) do not scrape the bottom of the wells with pipet tips as this can remove the avidin coating holding the biotinylated DNAs to the well (C) the assay must be done at room temperature as the background increases dramatically when performed at 30°C and (especially) 36°C and (D) when there is little or no specific DNA binding, background subtraction will sometimes yield “negative” binding activity students should be reminded of this possibility.
  3. In Week 3, Bradford Assay data should be checked by instructors to confirm that they fall within the linear range of the standard curve students should repeat the analysis if the R 2 < 0.95 or one or more data points are not within the linear range of the standard curve.
  4. The major source of experimental error throughout the course has been inaccurate pipetting. We have found it helpful to emphasize proper pipettor technique and establish quantitative criteria for duplicates, i.e. they should not differ by >50%, that students must meet for their data to be included in further analysis.

We teach this course in a 10-week quarter format. For instructors who are considering this curriculum for a semester-long lab course, additional lab experiments could be added. For example, students could make their own GFP-tagged p53 mutant constructs, using homologous recombination in vivo, and confirm by sequence analysis students studying the putative oligomerization mutants could assess oligomerization state using native gel electrophoresis students could test more parameters of DNA-binding, such as other DNA elements or extracts and all students could have one or two periods to repeat an experiment of choice. Having students repeat experiments might be the most productive use of the extra weeks to help solidify student understanding of the inherent “messiness” of data and the need for multiple replicates it would also increase the probability of getting publication-quality data.


Abstract

Building on recombinant DNA technology, leaps in synthesis, assembly, and analysis of DNA have revolutionized genetics and molecular biology over the past two decades ( Kosuri and Church, 2014). These technological advances have accelerated the emergence of synthetic biology as a new discipline ( Cameron et al., 2014). Synthetic biology is characterized by efforts targeted at the modification of existing and the design of novel biological systems based on principles adopted from information technology and engineering ( Andrianantoandro et al., 2006 Khalil and Collins, 2010). As in more traditional engineering disciplines such as mechanical, electrical and civil engineering, synthetic biologists utilize abstraction, decoupling and standardization to make the design of biological systems more efficient and scalable. To facilitate the management of complexity, synthetic biology relies on an abstraction hierarchy composed of multiple levels ( Endy, 2005): DNA as genetic material, “parts” as elements of DNA encoding basic biological functions (e.g. promoter, ribosome-binding site, terminator sequence), “devices” as any combination of parts implementing a human-defined function, and “systems” as any combination of devices fulfilling a predefined purpose. Parts are designated to perform predictable and modular functions in the context of higher-level devices or systems, which are successively refined through a cycle of designing, building, and testing.

Within the past two decades, the synthetic biology approach has produced several notable successes, especially in microbial systems. These include, for example, the design of a minimal bacterial genome ( Hutchison et al., 2016) and a highly modified yeast genome ( Richardson et al., 2017), as well as the metabolic engineering of yeast for the biosynthesis of the antimalarial drug precursor artemisinic acid ( Ro et al., 2006) and the opioid compounds thebaine and hydrocodone ( Galanie et al., 2015). Compared to synthetic biology in bacteria and yeast, synthetic biology in algae and plants is still lagging behind. While the potential of photoautotrophic organisms for environmentally sustainable bioproduction has long been recognized ( Georgianna and Mayfield, 2012 Fesenko and Edwards, 2014 Liu and Stewart, 2015 Boehm et al., 2017), their relatively slow growth, scarcely available tools for genetic manipulation, and the physiological as well as genomic complexity of plant systems have delayed their widespread adoption as synthetic biology chassis. However, especially the small genome of the plastid (chloroplast) represents a highly promising platform for engineering the sophisticated metabolism and physiology of the eukaryotic cell it is embedded in ( Fig. 1).

Biological properties and existing technical capacities for synthetic biology of plastids compared to bacteria, yeast and the plant nucleus. The number of asterisks roughly illustrates the relative degree of (top) presence of a biological feature, (middle) availability of a tool or technique, and (bottom) current implementation of a type of application across the different chassis.

Biological properties and existing technical capacities for synthetic biology of plastids compared to bacteria, yeast and the plant nucleus. The number of asterisks roughly illustrates the relative degree of (top) presence of a biological feature, (middle) availability of a tool or technique, and (bottom) current implementation of a type of application across the different chassis.

The chloroplast originated through the endosymbiotic uptake of a cyanobacterium by a heterotrophic eukaryote more than a billion years ago ( Palmer, 2003). Following this event, the endosymbiont evolved mechanisms for facilitated exchange of metabolites with the host cell, underwent radical streamlining of its genome (by gene loss and large-scale transfer of genes to the host nuclear genome) and established an import machinery for the uptake of nucleus-encoded proteins. The resulting organelle serves as the major biosynthetic compartment in photoautotrophic organisms, and has been exploited as a platform for metabolic engineering and molecular farming since the successful development of transformation technologies in the late 1980s ( Boynton et al., 1988 Svab et al., 1990). Compared to nuclear genetic engineering, plastid transformation offers several notable advantages relevant to plant biotechnology. These include (1) the high precision of genetic engineering enabled by efficient homologous recombination, (2) the possibility of transgene stacking in synthetic operons, (3) the potential for high-level expression of gene products, (4) the absence of epigenetic transgene silencing, and (5) the reduced risk of unwanted transgene transmission due to maternal inheritance of plastid DNA ( Bock, 2015).

In this article, we provide an update on tools and technologies available for extending the synthetic biology approach to plastids and highlight key challenges to be addressed through future research. Guided by an abstraction hierarchy of biological design, we identify a scarcity of well-characterized genetic parts, tightly controlled expression devices, and quantitative knowledge of plastid gene expression as current key limitations to plastid synthetic biology. We highlight recent technological developments narrowing the existing complexity gap between bacterial and plastid synthetic biology and provide an outlook to the implementation of complex systems such as synthetic metabolic feedback loops, designer subcompartments and tailor-made genomes in chloroplasts.

Părți

The Registry of Standard Biological Parts (http://parts.igem.org) currently contains over 20,000 genetic elements which can be requested by researchers for use in synthetic biology applications. From this collection, approximately 100 parts each have been designed for use in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and in multicellular plants (e.g. the seed plants Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana, the moss Physcomitrella patens and the liverwort Marchantia polymorpha). The majority of these parts are designated for nuclear engineering, with only about two dozen suitable for gene expression from the chloroplast genome. One explanation for the relative paucity of plastid genetic elements in the Registry of Standard Biological Parts lies in the half-year timeframe of projects pursued as part of the international Genetically Engineered Machine (iGEM) competition ( Smolke, 2009), which is barely compatible with the generation and characterization of stable plastid-engineered (transplastomic) organisms. Beyond iGEM, the repertoire of regulatory sequences routinely used for transgene expression in plastids has remained similarly small: it is comprised of a few preferred promoters (e.g. from the plastid rRNA operon, Prrn the gene for the large subunit of Rubisco, PrbcL and the gene for the D1 protein of photosystem II, PpsbA) and a handful of 5′-and 3′-UTRs ( Jin and Daniell, 2015). In addition, the bacterial hybrid promoter Ptrc ( Newell et al., 2003) and several bacteriophage-derived expression elements ( McBride et al., 1994 Kuroda and Maliga, 2001 Yang et al., 2013) have been successfully used for plastid transgene expression. A greater variety of parts available for controlled expression of plastid transgenes is desirable for several reasons. First, multiple use of the same genetic element within the chloroplast genome is problematic due to the risk of unwanted homologous recombination between sequence stretches as short as 50 bp ( Dauvillee et al., 2004 Rogalski et al., 2006). Second, synthetic genetic circuits commonly require precise tuning of the activity of their constitutive parts for optimal function ( Brophy and Voigt, 2014).

For synthetic biology applications in plastids to catch up in versatility and complexity with those already demonstrated in bacteria, gene expression elements covering a wider activity range will be required. Natural plastid genomes represent an obvious source of such elements. The small size and low coding capacity of chloroplast genomes (in most seed plants, approximately 130 genes in an ∼ 150 kb genome) should allow refactoring of all coding and regulatory regions into standardized genetic parts. The sequences of over 800 chloroplast genomes have been determined ( Daniell et al., 2016), and the functions of most of their (widely conserved) genes are known ( Scharff and Bock, 2014). Plastid genetic elements contained within this wealth of sequence data can be domesticated according to a recently proposed common syntax for plant synthetic biology ( Patron et al., 2015). This scheme promises to facilitate sharing of genetic resources among the community and, although developed for a eukaryotic system, is also compatible with GoldenBraid-based modular cloning of chloroplast transformation vectors ( Vafaee et al., 2014). Plastid parts containing internal recognition sites for type IIS restriction enzymes (e.g. BsaI, BsmBI, BbsI) that cannot be synonymously changed (e.g. because they constitute essential sequence motifs in a promoter or UTR sequence) may alternatively be assembled using long-overlap-based methods such as Gibson Assembly ( Gibson et al., 2009).

Gene Expression Devices

Gene expression devices send or receive signals in the form of levels of gene expression. A basic device of this kind may be composed of four parts: a promoter, a ribosome-binding site, a coding sequence and a terminator. This device architecture is commonly used for the quantification of part performance to inform the rational design of genetic circuits. Hundreds of prokaryotic gene-expression elements (including promoters, ribosome-binding sites and terminators) have been characterized in bacterial hosts using reporter gene-based assays ( Salis et al., 2009 Cambray et al., 2013 Chen et al., 2013 Kosuri et al., 2013 Mutalik et al., 2013), and standards have been formulated for quantifying their activities ( Canton et al., 2008 Kelly et al., 2009 Rudge et al., 2016). To reduce the context dependence of part activity, standardized flanking sequences ( Mutalik et al., 2013), strong terminators ( Chen et al., 2013) and enzymatic cleavage of UTRs ( Lou et al., 2012 Qi et al., 2012) have been successfully employed as insulators in bacteria. In plastids, not more than two dozen combinations of regulatory elements (i.e. promoters, 5′-UTRs and 3′-UTRs) have been systematically characterized for their impact on transgene expression using GFP ( Barnes et al., 2005 Caroca et al., 2013), GUS ( Eibl et al., 1999 Herz et al., 2005 Gerasymenko et al., 2017) or other reporter proteins ( Ruhlman et al., 2010 Zhang et al., 2012).

Compared to part characterization in microbes, that in plastids involves several notable challenges. First, relatively long timescales are required to generate transplastomic organisms ready for characterization. While only a few days are needed for transformation of the microbial models Escherichia coli sau Saccharomyces cerevisiae by a genetic part, several months of selection are needed to recover homoplasmic plastid transformants (i.e. transplastomic cells or plants that are devoid of residual copies of the wild-type plastid genome). In theory, the establishment of homoplasmy could be accelerated through inducible expression of endonucleases that selectively target the wild-type chloroplast genome, but it remains to be tested how much time this approach can save. Alternatively, measurement fidelity can be traded for high-throughput, transient assays to quantify part performance within days of particle bombardment of algal cells or plant tissues. Such assays will require (1) high transient transformation frequencies, (2) high sensitivity, and (3) a robust way of normalizing the primary reporter signal to the copy number of transformed plastomes. The latter could be achieved by using a ratiometric approach ( Rudge et al., 2016 Boehm et al., 2018). If a suitable reporter system can be developed, the activities of hundreds of plastid parts could rapidly be measured in algal cells or plant protoplasts using microtiter plate-based assays ( Schaumberg et al., 2016) or microfluidic devices ( Yu et al., 2018).

Second, the plastome exhibits abundant read-through transcription due to inefficient termination ( Stern and Gruissem, 1987 Rott et al., 1996 Legen et al., 2002 Shi et al., 2016). Consequently, part behavior is, by default, poorly insulated from its specific genetic context: both upstream promoters and downstream antisense promoters may significantly affect the expression level of a target gene ( Quesada-Vargas et al., 2005 Sharwood et al., 2011). However, some sequences such as the endogenous tRNA genes trnS și trnH ( Stern and Gruissem, 1987) or the heterologous E coli Thr attenuator (thra Chen and Orozco, 1988) have been shown to terminate plastid transcription with at least 85% efficiency. Use of insulators based on these parts or new synthetic terminators can potentially enhance the robustness of gene expression levels generated by plastid synthetic biology devices.

Third, plastid transgene expression has been shown to be primarily determined by posttranscriptional control and protein stability rather than by the accumulation of mRNA ( Eberhard et al., 2002 Birch-Machin et al., 2004 Bellucci et al., 2005 Kahlau and Bock, 2008 Valkov et al., 2009 Zoschke and Bock, 2018). Chloroplast transcripts are subject to a series of complex processing steps which include intercistronic cleavage, 5′-and 3′-end maturation, intron splicing and mRNA editing ( Stern et al., 2010). These steps are largely mediated by nucleus-encoded and organelle-targeted factors, including a large family of modular proteins known as pentatricopeptide repeat (PPR) proteins that site-specifically bind to one or several premRNAs ( Barkan and Small, 2014). Plastid gene expression levels can, therefore, vary considerably between different transgenes even if the same promoter and 3′-UTR are used, limiting the informative value of part characterization based on standard reporter protein assays. While the amino acid sequence of the N-terminus is thought to substantially influence protein stability in the chloroplast ( Apel et al., 2010 De Marchis et al., 2012), our general knowledge of plastid proteostasis remains limited. A better understanding of the molecular determinants of plastid protein (in)stability may in the future allow the design of protective amino acid sequences ( Elghabi et al., 2011) that level the stabilities of different plastid-expressed proteins and make transgene expression from the plastid genome more predictable.

Metabolic Devices

Metabolic devices send or receive signals in the form of levels of metabolites. Accordingly, a synthetic metabolic pathway represents a metabolic device carrying out a specific series of enzyme-catalyzed reactions. A variety of metabolic devices have been successfully implemented in plastids for the production of molecules such as polyhydroxybutyrate ( Bohmert-Tatarev et al., 2011), carotenoids ( Wurbs et al., 2007 Hasunuma et al., 2008 Apel and Bock, 2009), fatty acids ( Madoka et al., 2002 Craig et al., 2008), artemisinic acid ( Fuentes et al., 2016), vitamin E ( Lu et al., 2013) and dhurrin ( Gnanasekaran et al., 2016). These applications have been reviewed in more detail elsewhere ( Bock, 2015 Fuentes et al., 2018). While heterologous pathways composed of 20 genes or more have been expressed in bacteria and yeast ( Temme et al., 2012 Galanie et al., 2015 Li et al., 2018), no more than seven transgenes have to date been simultaneously expressed from the plastome ( Krichevsky et al., 2010). The complexity of plastid-based metabolic devices has primarily been limited by a scarcity of available expression signals (see Gene Expression Devices) rather than by the physical size of the introduced DNA ( Adachi et al., 2007). Recently, the complexity and number of pathway variants accessible to experimental interrogation has been expanded through combinatorial supertransformation of transplastomic recipient lines (COSTREL). Using this approach, an up to 77-fold increase in artemisinic acid production has been demonstrated in transplastomic tobacco plants combinatorially supertransformed by five additional nuclear transgenes ( Fuentes et al., 2016). There is no in-principle limitation to the number of transgenes that can be simultaneously introduced into the plant nucleus using combinatorial transformation ( Naqvi et al., 2009). However, handling hundreds to thousands of plants resulting from combinatorial transformation with several dozen transgenes will require an effective screening pipeline.

In plastid-based metabolic devices containing multicistronic operons, intercistronic expression elements (IEEs) can be used to facilitate correct processing of polycistronic transcripts into monocistronic mRNAs and their efficient translation ( Fig. 2A Zhou et al., 2007). To avoid defects in mRNA stabilization upon repeated use of the same IEE, more complex future metabolic devices may feature a variety of different such elements and/or additionally overexpress their cognate RNA-binding proteins ( Legen et al., 2018).

Design of plastid-based metabolic devices. A, Intercistronic expression elements (IEEs Zhou et al., 2007) can be used to design synthetic operons composed of n genes of interest (GOIs) under the control of a single promoter. Alternatively, each transgene can be controlled by its own promoter. SD, Shine-Dalgarno sequence SMG, selectable marker gene. B, Expression of a GOI can be controlled by a synthetic 5′-UTR that is specifically stabilized by a designer PPR protein (that recognizes a different binding sequence than all other RNA-binding proteins present in the plastid).

Design of plastid-based metabolic devices. A, Intercistronic expression elements (IEEs Zhou et al., 2007) can be used to design synthetic operons composed of n genes of interest (GOIs) under the control of a single promoter. Alternatively, each transgene can be controlled by its own promoter. SD, Shine-Dalgarno sequence SMG, selectable marker gene. B, Expression of a GOI can be controlled by a synthetic 5′-UTR that is specifically stabilized by a designer PPR protein (that recognizes a different binding sequence than all other RNA-binding proteins present in the plastid).

Genetic Circuits

Genetic circuits mimic logical functions commonly found in their electronic counterparts. A genetic circuit can be used to control the activity of other devices (such as the gene expression devices or metabolic devices discussed above) in response to external stimuli. A wide range of genetic circuits implementing Boolean logic functions such as yes , not , and , or , nand , nor , xor and n-imply has been reported for bacteria, yeast and mammalian cells ( Miyamoto et al., 2013). In plastids, only the simplest logic function yes has been implemented in the form of chemically inducible transgene expression.

Chloroplast transcription is natively controlled by two different types of RNA polymerases in seed plants. The nucleus-encoded RNA polymerase (NEP) is a chloroplast-targeted bacteriophage-type single subunit enzyme, while the plastid-encoded RNA polymerase (PEP) is a eubacteria-type multisubunit enzyme ( Barkan, 2011 Börner et al., 2015). The promoter specificity of PEP is modulated by nucleus-encoded and plastid-targeted sigma factors in response to light, hormones and biotic as well as abiotic stresses. However, due to their important role in plant growth, development and survival (and the pervasive transcription of essentially all plastid genes), NEP and PEP are poorly suited as stringent controllers of synthetic genetic circuits in plastids.

As an alternative to transgene control by the endogenous transcription machineries, plastid transgene expression has been controlled through nucleus-encoded and plastid-targeted bacteriophage RNA polymerases or processing factors that are responsive to chemical inducers such as salicylic acid ( Magee et al., 2004), ethanol ( Lössl et al., 2005), copper ( Surzycki et al., 2007) or thiamine ( Ramundo et al., 2013). To avoid (pollen-transmissible) nuclear transgenes and increase transgene containment, inducible expression systems encoded solely in the plastid genome are particularly desirable. Plastid-only inducible circuits responsive to isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG Mühlbauer and Koop, 2005) or theophylline ( Verhounig et al., 2010 Emadpour et al., 2015) have been shown to be functional, yet fall short of binary behavior due to the pronounced transcriptional leakiness present in plastids (see Gene Expression Devices). To achieve a signal-to-noise ratio sufficient for the implementation of more complex logic gates, future plastid-based genetic circuits may employ synthetic RNA-binding proteins of the PPR class (see Gene Expression Devices Coquille et al., 2014 Gully et al., 2015) to selectively control the maturation of target mRNAs in the chloroplast ( Fig. 2B Stern et al., 2010 Barkan and Small, 2014).

Sisteme

Beyond hard-wired logic gates, synthetic biologists have explored dynamic feedback mechanisms to enhance the efficiency of engineered metabolic pathways in bacteria and yeast ( Venayak et al., 2015 Del Vecchio et al., 2016). Translation of this approach to plastids is currently hampered by our limited quantitative understanding of chloroplast gene expression, though new tools for analysis of the metabolic network shared between the chloroplast and its host cell are emerging ( Gloaguen et al., 2017). Metabolic engineering in plastids may further be supported by expression of synthetic subcompartments for substrate concentration, metabolite channeling and the prevention of unwanted reactions between subcompartmentalized and endogenous plastid metabolites and enzymes ( Winkel, 2004 Ort et al., 2015 Hanson et al., 2016). Synthetic subcompartments have already been introduced in bacteria and yeast ( Bonacci et al., 2012 Lau et al., 2018), and carboxysomal shell proteins transiently expressed in leaves of Nicotiana benthamiana have been shown to be capable of assembling into carboxysome-like structures within chloroplasts ( Lin et al., 2014), encouraging further efforts in this area.

Among the most complex systems proposed for implementation in plastids are entire synthetic genomes, inspired by recent successes in microbial synthetic genomics ( Hutchison et al., 2016 Richardson et al., 2017). A minimum-size plastid genome composed of the smallest possible number of components will be of great value for two reasons: it will advance our understanding of the regulatory network underlying plastid function, and it will serve as a template for engineering synthetic plastomes to be used in biotechnological applications. We have previously proposed a design for a synthetic minimal plastome of N. tabacum that is free of all genes nonessential under heterotrophic growth conditions ( Fig. 3), intergenic spacers, introns, and isoaccepting tRNA genes that are dispensable or become dispensable after genome-wide modification of codon usage ( Scharff and Bock, 2014). Such a synthetic chloroplast genome can be assembled from linear DNA fragments in yeast ( O’Neill et al., 2012) and, prior to plant transformation, can be amplified in vitro using rolling circle amplification ( Jansen et al., 2005). The major hurdle to the successful implementation of fully synthetic plastomes in planta is the high probability of homologous recombination between the (largely nonrecodeable) rRNA and tRNA genes and their counterparts in the resident plastid genome, leading to chimeric genomes of unpredictable structure and function ( O’Neill et al., 2012). In addition, the effects of synthetic lethality (i.e. the combined knock-out of two nonessential genes being lethal e.g. Ehrnthaler et al., 2014) cannot currently be excluded to occur in a synthetic minimal plastome.

Physical map of the N. tabacum chloroplast genome with all genes classified by essentiality. Genes shown in blue are essential for both heterotrophic and autotrophic growth. Genes shown in green are essential for autotrophic growth only. Light green indicates borderline cases where knock-out plants survive under carefully controlled growth conditions. Genes shown in gray are nonessential under both heterotrophic and autotrophic growth conditions, in that their knock-out causes no or only a mild phenotype ( Scharff and Bock, 2014). Origins of replication are highlighted in red. Gray arrows indicate the direction of transcription for the two DNA strands. The map was drawn using the OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW) software ( Lohse et al., 2013) based on the complete plastome sequence of N. tabacum ( Shinozaki et al., 1986 GenBank accession number Z00044.2). LSC, large single-copy region IRA, inverted repeat A IRB, inverted repeat B SSC, small single-copy region.

Physical map of the N. tabacum chloroplast genome with all genes classified by essentiality. Genes shown in blue are essential for both heterotrophic and autotrophic growth. Genes shown in green are essential for autotrophic growth only. Light green indicates borderline cases where knock-out plants survive under carefully controlled growth conditions. Genes shown in gray are nonessential under both heterotrophic and autotrophic growth conditions, in that their knock-out causes no or only a mild phenotype ( Scharff and Bock, 2014). Origins of replication are highlighted in red. Gray arrows indicate the direction of transcription for the two DNA strands. The map was drawn using the OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW) software ( Lohse et al., 2013) based on the complete plastome sequence of N. tabacum ( Shinozaki et al., 1986 GenBank accession number Z00044.2). LSC, large single-copy region IRA, inverted repeat A IRB, inverted repeat B SSC, small single-copy region.

Despite numerous technical advances made over the past 30 years, the number of algal and plant species whose plastids can reliably be transformed has remained small ( Bock, 2015). Transplantation of transgenic plastids from a species amenable to transformation to a species recalcitrant to transformation represents an attractive alternative to painstakingly developing specialized transformation protocols for the latter. Plastomes can be horizontally transferred across graft junctions with relative ease ( Stegemann and Bock, 2009 Stegemann et al., 2012 Thyssen et al., 2012 for review, see Bock, 2017) and this process has been exploited for transplanting a plastid-encoded synthetic metabolic device into a currently nontransformable species ( Lu et al., 2017). The graft-mediated horizontal transfer of transgenic plastid genomes may not be feasible between distantly related species due to the close coevolution of nuclear and plastid genomes, and the probability of nuclear-cytoplasmic incompatibilities that increases with phylogenetic distance and can cause deleterious phenotypes ( Schmitz-Linneweber et al., 2005 Greiner and Bock, 2013). However, the transfer will certainly facilitate the expansion of transplastomic technologies from model species and cultivars used in research to related species and elite cultivars grown commercially.


Priveste filmarea: Drojdie de casa-Homemade yeastEverything for everyone (Noiembrie 2021).