Informație

De unde pot obține probe de virofag Sputnik?


Lucrez la un proiect în care încerc să folosesc virofagii ca vectori virali în introducerea proteinelor CRISPR-Cas în alte virusuri. Mă întrebam unde aș putea găsi virofagi Sputnik cu deficiențe de replicare sau alți virofagi pentru acest tip de experiment?


Virofagul Zamilon

Virusul dependent de Mimivirus Zamilon, sau Zamilon, este un virofag, un grup de viruși ADN mici care infectează protiștii și necesită un virus ajutor pentru a replica că sunt un tip de virus satelit. [2] Descoperit în 2013 în Tunisia, infectând Acanthamoeba polyphaga amoebae, Zamilon seamănă cel mai mult cu Sputnik, primul virofag descoperit. Numele este în arabă pentru „vecinul”. [3] Particulele sale sferice au un diametru de 50-60 nm și conțin un genom ADN dublu catenar circular de aproximativ 17 kb, despre care se preconizează că codifică 20 de polipeptide. O tulpină înrudită, Zamilon 2, a fost identificat în America de Nord.

Toți virofagii cunoscuți sunt asociați cu ajutoare din familia gigantică a virusului ADN Mimiviridae. Zamilon este restricționat în gama sa de viruși helper din care poate fi susținut de viruși Mimivirus-ca Mimiviridae linii B și C, dar nu din linia A. Aceasta pare a fi o consecință a unui sistem imunitar rudimentar al virusului helper, denumit MIMIVIRE (element de rezistență la virofagii mimivirus), asemănător cu calea CRISPR-Cas. [4] Spre deosebire de virofagul Sputnik, Zamilon nu pare să afecteze replicarea virusului său de ajutor.


Articol de CERCETARE ORIGINALĂ

A spus Mougari 1, Meriem Bekliz 1, Jonatas Abrahao 1,2, Fabrizio Di Pinto 1, Anthony Levasseur 1 * și Bernard La Scola 1 *
  • 1 MEPHI, APHM, IRD 198, Departamentul de Medicină, Infecția IHU-M & # x00E9diterraniană și # x00E9e, Universitatea Aix-Marseille, Marsilia, Franța
  • 2 Laborat & # x00F3rio de V & # x00EDrus, Instituto de Ci & # x00EAncias Biol & # x00F3gicas, Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazilia

Virofagii sunt regulatori critici ai dinamicii populației virale și potențiali actori în stabilitatea rețelelor microbiene. Aceste entități biologice mici precedă ciclul replicativ al virușilor uriași, cum ar fi membrii Mimiviridae familie sau rudele lor îndepărtate, care produc în citoplasma celulelor gazdă o fabrică virală care adăpostește o biochimie complexă propice creșterii paraziților mai mici. În această lucrare, descriem izolarea și caracterizarea unui nou virofag, al optulea, pe care l-am numit guarani. Am observat că Guarani prezintă un ciclu de replicare târziu în comparație cu virusul său gazdă gigant. În plus, la fel ca toate tulpinile Sputnik, guaranii sunt capabili să infecteze cele trei linii A, B și C ale Mimiviridae familiei și afectează replicarea și infectivitatea virusului gazdă. În ceea ce privește conținutul genetic, Guarani are un genom ADN bicatenar lung de 18.967 bp care codifică 22 de gene prezise foarte asemănătoare cu genele Sputnik, cu excepția ORF19 și ORF12. Primul este mai mult legat de Zamilon, în timp ce acesta din urmă pare a fi nou. Arhitectura genomului Guarani este strâns legată de tulpinile Sputnik și Zamilon, sugerând o origine comună pentru toți acești virofagi.


La Scola, B. și colab. Virofagul ca un parazit unic al gigantului mimivirus. Natură 455, 100–104 (2008).

Fischer, M. G. & amp Suttle, C. A. Un virofag la originea transpozonilor ADN mari. Ştiinţă 332, 231–234 (2011).

Desnues, C. & amp Raoult, D. În stilul de viață al virofagului. Intervirologie 53, 293–303 (2010).

Jones, I. M. & amp Reichmann, M. E. Proteinele sintetizate în frunzele de tutun infectate cu virusul necrozei tutunului și virusul necrozei satelite a tutunului. Virologie 52, 49–56 (1973).

Parks, W. P. și colab. Interferența virusului satelit adeno-asociat cu replicarea adenovirusului său de ajutor. J. Exp. Med. 127, 91–108 (1968).

Murant, A. F. & amp Mayo, M. A. Sateliți ai virusurilor vegetale. Annu. Pr. Fitopatol. 20, 49–70 (1982).

Claverie, J. M. & amp Abergel, C. Mimivirus și virofagul său. Annu. Pr. Genet. 43, 49–66 (2009).

Kassanis, B., Vince, D. A. & amp Woods, R. D. Microscopie ușoară și electronică a celulelor infectate cu necroză a tutunului și virusuri satelitare. J. Gen. Virol. 7, 143–151 (1970).

den Boon, J. A., Diaz, A. & amp Ahlquist, P. Complexe de replicare virală citoplasmatică. Microbi gazdă celulară 8, 77–85 (2010).

Dodds, J. A. Virusul mozaicului din tutun prin satelit. Annu. Pr. Fitopatol. 36, 295–310 (1998).

Bringloe, D. H., Pleij, C. W. & amp Coutts, R. H. Mutația analizei cis-elemente în regiunile 3'- și 5'-netraduse ale virusului necrozei tutunului satelit tulpina ARN C. Virologie 264, 76–84 (1999).

Fischer, M. G. și colab. Virusul gigant cu o remarcabilă completare de gene infectează zooplanctonul marin. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 107, 19508–19513 (2010).

Sun, S. și colab. Studii structurale ale virofagului Sputnik. J. Virol. 84, 894–897 (2010).

Krupovic, M. & amp Bamford, D. H. Evoluția virusului: cât de departe se extinde linia virală dublă β-baril? Nature Rev. Microbiol. 6, 941–948 (2008).

Rice, G. și colab. Structura unui virus arheologic termofil prezintă un tip de capsidă virală cu ADN dublu catenar care se întinde pe toate domeniile vieții. Proc. Natl Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 101, 7716–7720 (2004).

Comeau, A. M. și colab. Explorarea virosferei procariote. Rez. Microbiol. 159, 306–313 (2008).

Krupovic, M. & amp Bamford, D. H. Ordinea către universul viral. J. Virol. 84, 12476–12479 (2010).


Discuţie

Virofagele sunt entități virale descoperite recent, care necesită viruși gigantici pentru a co-infecta microbii eucarioti. Interacțiunile lor complexe le fac foarte greu de izolat în laborator și există doar câțiva reprezentanți izolați derivați din experimente de co-cultură. Pentru a ocoli obstacolele identificării experimentale a virofagilor și a explora gama diversității filogenetice și a habitatelor lor, am dezvoltat o abordare de calcul care să valorifice informațiile disponibile în peste 14.000 de probe metagenomice. Abordarea noastră s-a bazat pe disponibilitatea unei gene de semnătură virofagice unice și conservate care codifică proteina capsidei majore (MCP). Printr-un proces iterativ, au fost dezvoltate modele HMM specifice MCP care au condus la identificarea și caracterizarea a sute de genomi de virofag de înaltă calitate (HQ) într-o mare diversitate de habitate. Deși rezultatele ar putea fi părtinitoare datorită supra-reprezentării MCP-urilor de la virofagele publicate găsite în habitate acvatice și a metadatelor eșantioanelor din bazele de date analizate (de exemplu, distribuția habitatului și tehnologia de secvențiere / asamblare utilizată), studiul global al virofagilor permis de acest lucru abordarea poate duce la o mai bună înțelegere a biologiei virofagilor, diversității habitatelor, taxonomiei și evoluției.

Înainte de această lucrare, doar 33 de genomi virofagi HQ din ambele izolate și din genomii derivați din metagenom au fost identificați și clasificați ca membri ai Lavidaviridae familie. Sub nivelul familial, clasificarea virofagilor s-a bazat pe prezența „cel puțin a unor gene morfogenetice conservate în virofage (MCP, mCP, ATPaza, PRO)” și „dependența sau asocierea virusului cu un NCLDV”. Această clasificare a dus la două genuri separate (gen Sputnikvirus și genul Mavirus) [10]. În plus, s-a propus că alți virofagi cunoscuți din metagenom (OLV, YSLV și virofagi rumenici) ar putea fi clasificate în diferite genuri, dar absența izolatelor de replicare a limitat clasificarea lor de către ICTV. Studiile de biogeografie au folosit anterior MCP parțiale de la virofagi cunoscuți pentru căutări bazate pe omologie pentru a propune o distribuție globală între microbiomi [13]. Cu toate acestea, identificarea genomilor virofagilor HQ a fost foarte limitată și orientată spre mediile acvatice [13, 15,16,17].

Acest studiu a arătat că marea majoritate a clusterelor de proteine ​​virofage (VpPC) au fost împărțite de mai puțin de 5% din genomi, indicând o diversitate genetică enormă care ar putea fi atribuită poziției evolutive a virofagului și frecvenței ridicate a schimbului de gene orizontale cu alte virale. entități și celule microbiene [43]. Cu toate acestea, cele patru familii de gene propuse anterior au fost prezente printre toate genomurile complete nou identificate, inclusiv genomurile de virofage asociate rumegătoarelor în care anterior s-a raportat că mCP lipsea [18]. Această constatare este esențială pentru noua schemă de clasificare propusă pentru virofagii HQ derivați de microbiomi care s-au bazat pe omologia secvenței și pe sintezia genică a VpPC-urilor conservate. Abordarea noastră a dezvăluit că 17 din cele 27 de clade propuse sunt noi, în timp ce restul de 10 (asociate cu virofagele publicate și în acord cu clasificarea anterioară) au fost extinse cu noi secvențe. Această clasificare a fost susținută în continuare de tipul MCP, de distribuția tipului de habitat și de conținutul general al genelor membrilor cladei (Fig. 3) și a relevat o creștere mare a diversității diferitelor grupuri taxonomice definite de secvențele genomului virofagului HQ.

Probele de apă dulce au continuat să fie habitatul cu cel mai mare număr de virofagi recuperate și încă rezervoarele cu cel mai mare număr de secvențe MCP în clade fără genomi HQ. De exemplu, 80% și 75% din virofagii din cladele 19 și 24 (764 și respectiv 2455 membri MCP) au fost recuperați din probe de apă dulce (Fig. 2a). În plus, pentru prima dată, am găsit genomuri virofage HQ în alte habitate diverse, inclusiv plante asociate, izvoare termale, subteran profund, rumen de vacă și probe de intestin uman. Deosebit de interesant a fost cazul virofagelor asociate intestinului uman, care au fost caracterizate de modele MCP destul de distincte (Fig. 4c). Patru din cele cinci genome de virofage HQ asociate cu omul au fost identificate în probe de fecale recuperate de la indivizi cu un stil de viață rural, cu restul genomului găsit la un individ cu colită ulcerativă. În consecință, acești virofagi ar putea fi conectați la aportul de eucariote unicelulare cu alimente sau apă. Această observație a fost susținută și de distribuția modelelor MCP găsite în probe fecale de la indivizi cu stil de viață rural, care au fost împărtășite în principal cu animale (babuin, vacă, oaie și artropode) și cu surse de apă dulce (Fig. 2c).

În ciuda variabilității imense a conținutului de proteine ​​codificate de genomii virofagici preziși, această filiație se caracterizează prin prezența unui bloc sintenic de 4-5 gene găsite în genomi multipli din părți îndepărtate ale arborelui virofagic, sugerând că aceste gene au fost moștenite vertical dintr-un strămoș comun. Cu toate acestea, variația sinteziei în acest bloc între cladele propuse de virofage este indicativă pentru o reorganizare semnificativă a genomului.

Un număr de VpPC-uri (de exemplu, integraze, metilaze, recombinaze și ADN polimeraze) au omologi în viruși în afara liniei virofagilor, în special în polintoni și viruși de tip polinton. Acest lucru sugerează transferuri frecvente de gene între aceste diferite tipuri de elemente genetice mobile, după cum sa presupus anterior [22, 44]. Acest lucru a fost, de asemenea, susținut de filogenii ale ADN polimerazei de tip B și integră rve care prezintă clade mixte care adună virofagi, polintoni și viruși de tip polinton (Fișier suplimentar 2: Figura S2). Din acest grup de gene, un interes deosebit este prezența integrazelor, recombinazelor și ARN-urilor de transfer în virofage. Integrazele și recombinazele au fost identificate în majoritatea cladelor de virofage propuse (Fișier suplimentar 1: Tabel S4 Fișier suplimentar 1: Tabel S5), oferind probabil acestor viruși capacitatea de a-și încorpora ADN-ul în genomul gazdă ca provirofage. Integrarea a fost descrisă anterior pentru Mavirus și Bigelowiella natans virofage [7, 42, 45] și ar putea oferi protecție potențială gazdei eucariote împotriva NCLDV-urilor [42]. Pe de altă parte, aceasta este prima dată când secvențele de ARNt au fost identificate în genomii virofagilor (Fișa suplimentară 2: Figura S6). Prezența lor ar putea ajuta virofagii să completeze utilizarea codonului sau a aminoacizilor gazdei lor [32, 33] sau ar putea fi un rezultat al achiziției din genomul gazdei, deoarece ARNt sunt cunoscuți ca puncte fierbinți pentru integrarea virusului [32, 34, 35].

În cele din urmă, o nouă abordare de calcul bazată pe MIMIVIRE pentru a prezice asocierea virofagilor cu virușii gigantici a dezvăluit noi linii de virusuri gigant potențial vizate de virofagi. În plus, analiza transcriptomilor protozoarelor a permis detectarea triplei asocieri între a Mavirus-virofag înrudit, un virus gigant legat de CroV și un dinoflagelat marin A. tamarense. Anticipăm că aceste date vor conduce la proiectarea și validarea experimentală suplimentară a previziunilor de calcul ale tripletelor virofage-virus gigant-microeucariote și vor elucida evoluția și ecologia acestor sisteme biologice remarcabile.


Recenzori și rapoarte # x02019

Recenzent 1

Mart Krupovic, Institutul Pasteur

În această Notă de descoperire, Yutin și colab. descrie un nou grup de virofagi supuși, pe care l-au descoperit în metagenomul rumenului de oaie. Aceste elemente noi diferă considerabil de virofagii descriși anterior și par să conțină un genom himeric. Modulul de morfogeneză a virionului este similar cu cel împărtășit de toți virofagii, în timp ce ADN polimeraza familiei B este mai strâns legată de proteinele corespunzătoare ale transpozonilor ADN mari, de tip virus, din superfamilia Polinton / Maverick. Autorii au reușit să adune mai multe genome aproape complete ale acestor noi virofagi. Metagenomul care conține virofage a fost pozitiv pentru prezența mimivirusurilor, după cum se judecă prin apariția citirilor care codifică proteina capsidă majoră mimivirus. Acest rezultat este în concordanță cu concluzia că virofagii nou identificați parazitează asupra virușilor uriași. Manuscrisul este scris foarte clar și logic.

Folosind secvențele majore de proteine ​​capsidiene prezentate în fișierul suplimentar 1, aș putea confirma relația dintre proteinele capsidice ale virofagelor din rumen și cele ale virofagilor descriși anterior. Cu toate acestea, nu am putut accesa contigurile genomice ale metagenomului intestinal. Ar fi de dorit să le prezentați ca fișiere GenBank arhivate în informațiile suplimentare.

Modulul morfogenetic al virofagilor și al polintonilor include o proteină capsidară minoră. Virofagii din rumen codifică un omolog al acestei proteine? Acest lucru trebuie menționat în text.

Autori & # x02019 răspuns: Acesta este un punct important care este abordat în mod explicit în manuscrisul revizuit. Se pare că RVP lipsește cu adevărat de proteina capsidă minoră.

A doua jumătate a celei de-a treia teze ar putea fi o exagerare.

Autori & # x02019 răspuns: Da, al doilea recenzent a făcut și un comentariu similar. Am modificat propoziția pentru a indica faptul că virusurile himerice & # x0201cmight & # x0201d sunt componente majore ale viromilor.

& # x0201cof două familii distincte & # x0201d schimbați în & # x0201cfamilies & # x0201d.

Autori & # x02019 răspuns: corectat

& # x0201adoptă o faldă derivată de jelly-roll & # x0201d schimbă în? adoptă o faldă dublă derivată de jelly-roll & # x0201d.

Autori & # x02019 răspuns: modificat după cum este sugerat.

În ultimul paragraf al constatărilor (înainte de concluzii), ar putea fi demn de menționat faptul că, deși genomul Mavirus a fost raportat ca o moleculă circulară, acesta conține repetiții inversate de 50 & # x000a0bp (separate prin 15 și # x000a0bp) (ref 12 în actualul lista de referință), care ar putea corespunde repetărilor inversate terminale găsite în polintoni, PGV și RVP.

Autori și răspuns # x02019: Având în vedere formatul Biology Direct, credem că este suficient să includem aici acest detaliu. Apreciem recenzorul care a subliniat-o.

Etichetele unora dintre ORF-urile din fișierul suplimentar 3 sunt răsturnate.

Autori și răspunsul # x02019: corectat.

Recenzent 2

Kenneth Stedman, Universitatea de Stat din Portland

Yutin și colab., În & # x0201cDiscovery Note & # x0201d au efectuat căutări foarte sensibile ale seturilor de date de secvențe metagenomice disponibile pentru secvențe similare genelor majore ale proteinelor capsidice (MCP) ale virofagilor cunoscuți. Apoi au folosit aceste secvențe ca ancore pentru a obține date de secvență asociate din seturile de date metagenomice. Astfel, autorii descoperă un nou grup de secvențe, ale căror MCP putative sunt similare cu virophage MCPs, dar constau dintr-o cladă separată bine susținută din punct de vedere filogenetic. Interesant este că unele dintre aceste MCP sunt asociate cu gene supuse ADN-polimerazei supuse proteinelor, care sunt similare cu unele gene ADN polimerază Polinton. Autorii propun o nouă familie de virofagi pe baza acestei analize.

Este regretabil faptul că acest manuscris este constrâns de formatul notei de descoperire, deoarece consider că figurile suplimentare sunt integrate în interpretarea rezultatelor prezentate în manuscris. Mai exact, consider că arborii filogenetici pentru genele ATPazei virale supuse și proteazelor sunt cel puțin la fel de convingători ca arborele filogenetic prezentat în Figura & # x000a0 1. Hărțile genomului din fișierul suplimentar 3 sunt, de asemenea, extrem de utile pentru înțelegerea manuscrisului și susținerea ipotezelor autorilor.

Autori & # x02019 răspuns: Apreciem aceste gânduri, dar susținem că formatul Discovery Note este cel mai potrivit pentru aceste descoperiri. Motivul principal este acela că nu avem secvențe genomice complete confirmate ale RVP și nu am avut ocazia de a efectua nicio secvență confirmativă, așa cum a subliniat revizuitorul de mai jos. Prin urmare, formatul scurt de comunicare pare a fi alegerea corectă. Suntem de acord că arborii pentru ATPaze și proteaze sunt la fel de convingători ca arborele pPolB și ar putea fi chiar mai ușor de interpretat. Am ales polimeraza pentru corpul principal al articolului, deoarece, în general, această genă este mai frecventă între diverse elemente genetice decât oricare dintre celelalte două. Din câte înțelegem, fișierele suplimentare fac parte integrantă din lucrarea publicată și sunt accesibile din articol printr-un singur clic. Astfel, sperăm și avem încredere că nu există nicio problemă pentru cititori în evaluarea întregii dovezi prezentate aici.

Figura & # x000a0 2 cu arborele filogenetic de ADN polimerază amorsat cu proteine ​​este confuză, datorită diversității pPolB-urilor din polintoni. Vă sugerez cu tărie o introducere mai largă la Polintons și diversele lor pPolBs. De asemenea, cred că acest lucru ar ajuta la interpretarea figurii.

Autori & # x02019 răspuns: Nu suntem foarte siguri de sursa confuziei. Potențial, problema ar putea sta în faptul că diferite grupuri de viruși eucariote și alte elemente egoiste apar din diversitatea polinton. adică aparent a evoluat din diferite grupuri de polintoni. Subliniem această tendință în două locuri în manuscrisul revizuit. Dincolo de aceste clarificări care, așa cum sperăm, sunt suficiente pentru a evita orice confuzie, nu pare să existe spațiu în acest scurt manuscris pentru a introduce polintonele mai detaliat..

Eu și cred că majoritatea cititorilor Biology Direct, aș dori mai multe detalii cu privire la unele dintre metode și o clarificare a unora dintre afirmațiile din manuscris. Acestea sunt detaliate mai jos:

În primul rând, chiar dacă laboratorul nostru a fost primul care le-a recunoscut, nu sunt sigur dacă ADN-ul himeric și & # x02009 + & # x02009 virușii ARN-cadru sunt componente majore ale viromilor și # x0201d. Aș vrea să cred că sunt. Cu toate acestea, deoarece majoritatea viromilor citați, și cu siguranță a noastră, au fost amplificați folosind Phi29DNA polimerază, care amplifică preferențial genomii mici ai virusului ssDNA, nu se poate fi sigur de cuantificare. Poate că acest lucru este discutat în Krupovic și colab., Genome Biology and Evolution, 2015, dar nu am putut accesa acest manuscris.

Autori & # x02019 răspuns: acesta nu este în niciun caz un punct cheie al articolului. Este posibil să fi depășit în versiunea originală. Declarația a fost atenuată în revizuirea în urma acestui comentariu și a unui comentariu similar al recenzorului 1.

În a doua teză a celui de-al doilea paragraf din & # x0201cFindings & # x0201d, vă sugerăm să adăugați & # x0201cknown & # x0201d după & # x0201c și & # x0201d și înainte de & # x0201cvirophages & # x0201d și schimbarea & # x0201ckilobases & # x020 & # x020 .

Autori și răspuns # x02019: modificat după cum este sugerat.

Al treilea paragraf al constatărilor: Luați în considerare includerea unei referințe la transpozonii Maverick la prima mențiune a lui Polintons pentru a clarifica acest lucru pentru cercetătorii care nu au reușit să țină pasul cu literatura recentă a autorilor (și a altor persoane) despre Polintons.

Al cincilea paragraf din & # x0201cFindings & # x0201d: Definiția & # x0201chits & # x0201d trebuie făcută aici sau parametrii exacți utilizați pentru căutări și criteriile de selecție date. Am făcut o căutare tBLASTn cu prima secvență MCP listată (Mavirus MCP) folosind identificatorul taxonomic metagenom și am găsit & # x0201chits & # x0201d cu valori electronice ridicate și scoruri scăzute. Aș lista, de asemenea, ID-urile metagenomilor găsiți aici, mai degrabă decât abrevierile. Nu sunt de acord că această analiză & # x0201cconfirmată & # x0201d este probabilă, aș spune că & # x0201ccidentificat & # x0201d.

Autori & # x02019 răspuns: Indicăm în revizuire că, în prima etapă, am folosit valoarea implicită BLAST, adică valoarea E & # x02009 & # x0003c & # x0200910 (nu este necesară nicio semnificație statistică). & # x0201cConfirmat & # x0201d schimbat în & # x0201cidentificat & # x0201d după cum a fost sugerat. Cu toate acestea, credem că aici id-ul taxonomic ar aglomera inutil textul, abrevierile ar trebui să fie suficiente. Valorile electronice, scorurile și ID-urile cu cel mai bun succes, precum și ID-urile secvențelor metagenomice, se află în fișierul Adițional1.

Al șaselea paragraf din & # x0201cFindings & # x0201d: Afinitatea MCP-urilor virofage asemănătoare cu Sputnik față de MCP-urile virofagului putativ de rumen pare foarte slabă din Figura & # x000a0 1. Este corectă valoarea (39) listată la punctul de ramificare din arborele dintre aceste două grupuri? În interpretarea mea, aceasta înseamnă o grupare diferită 61% din timp, posibil înțelegerea mea despre această valoare ELW este incorectă. Au fost analizate aici toate contigurile lungi din metagenomul rumenului de oaie sau doar cele care conțineau gene de MCP virofage putative? Dacă toate contigurile lungi corespundeau RVP-urilor, atunci ele pot fi extrem de frecvente în mediul rumenului de oaie.

Autori & # x02019 răspuns: interpretarea ELW este practic corectă. Cu toate acestea, copacii au fost refăcuti cu o altă metodă și, pe baza rezultatelor incluse în versiunea revizuită, nu mai pretindem o afinitate cu familia Sputnik. Am analizat toate contigenele metagenome ale rumenului de oaie depuse în GenBank la momentul depunerii acestui manuscris (BioProject PRJNA202380 5.8 gbp 8.786.927 contigs <"type": "entrez-nucleotide", "attrs": <"text": "AUXO000000000.1", "term_id": "608786013", "term_text": "AUXO000000000.1" >> AUXO000000000.1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=AUXO01#contigs), și contigurile detaliate în fișierul suplimentar3sunt singurele care codifică proteinele legate de virofag. Astfel, RVP nu sunt deosebit de frecvente în rumenul de oaie.

Al șaptelea paragraf: ansamblurile contigurilor metagenomice prezentate în fișierul suplimentar 3 sunt foarte interesante și destul de convingătoare. Cu toate acestea, trebuie descrise metode cu privire la modul în care au fost asamblate aceste contiguri. Se pare că au fost asamblate în mai multe moduri diferite.

Autori & # x02019 răspuns: Ansamblurile raportate aici au fost obținute folosind căutări BLASTN, așa cum au fost implementate în Censor. O legendă detaliată a figurii este inclusă în fișierul suplimentar revizuit3. fiecare contig care codifică un omolog MCP a fost folosit ca o interogare într-o căutare de Cenzor împotriva setului complet al tuturor contigenilor de metagenom ai rumenului de oaie (8.786.927 contig, 5,8 Gbp). Folosind Censor, nu am găsit suprapuneri semnificative ale capetelor virofagelor asamblate cu alte contiguri.

Al optulea paragraf: nu sunt de acord că grupul RVP al virofagilor putativi este în mod clar legat & # x0201d de virofagii asemănători cu Sputnik (bazat pe Figura & # x000a0 1, dacă se adaugă fișierul suplimentar 2, acest lucru ar face argumentul mult mai puternic).

Autori & # x02019 răspuns: Am refăcut copacii și am eliminat declarația menționată. Ceea ce este într-adevăr clar este relația modulului morfogenetic al RVP cu cel al virofagilor (în general). RVP sunt o nouă familie distinctă de virofagi. Textul a fost modificat în consecință.

Al nouălea paragraf: Relația posibilă între RVP-urile și secvențele asemănătoare mimivirusului în metavirom este în mod clar speculativă, dar ar trebui menționate aici dacă este posibil ca acești viruși să fie endogeni sau ceva consumat de oi. Declarația & # x0201deosebit de numeroasă & # x0201d este imprecisă, o anumită cuantificare, cel puțin relativă la ceilalți metagenomi, ar trebui dată aici.

Autori & # x02019 răspuns: Având în vedere că s-a demonstrat că până acum virofagii parazitează doar virușii uriași din familia Mimiviridae, considerăm că relația dintre RVP și mimivirusurile care par a fi prezente în același habitat, judecată din analiza metagenomului, este foarte plauzibilă, deși, cu siguranță , încă o presupunere. Posibilitatea ca mimivirusurile să provină din alimente și să nu se reproducă în rumen este greu de înțeles, având în vedere dieta oilor care este greu bogată în amoebă. & # x0201c În special numeroase & # x0201d se referă la raportul dintre MCP-uri asemănătoare cu Mimiviridae în metagenomul rumen comparativ cu alți metagenomi analizați pentru această chestiune, așa cum se arată în fișierul suplimentar1. Nu credem că numerele trebuie incluse în articol. Un cititor interesat în mod special poate calcula folosind fișierul suplimentar1.

Al zecelea paragraf: analiza TIR-urilor ar trebui să includă și analiza IR-urilor interne, dacă există, în secvențe. Dacă sunt disponibile citiri secvenței metagenomice originale, acest lucru ar putea aborda dacă IR-urile identificate sunt de fapt terminale. Aș descrie virofagul putativ PGV mai detaliat, are doar TIR, dar niciuna dintre celelalte gene? La sfârșitul paragrafului, cred că autorii înseamnă & # x0201cin trans & # x0201d în loc de & # x0201cin-trance & # x0201d.

Autori & # x02019 răspuns: Nu au existat IR-uri interne. S-a adăugat o clarificare a proteinelor codificate cu virofage PGV. Tipul corectat.

Concluzii: Sunt complet de acord cu potențialul incredibil al metagenomilor ca surse de noi genomi ai virusului. Trebuie menționat faptul că, în cazul virusurilor himerice ssDNA, multe dintre acestea au fost reconfirmate prin amplificare și resecvențiere din probele originale, ceea ce nu cred că s-a făcut pentru aceste RVP-uri.

Autori & # x02019 răspuns: Nu a existat într-adevăr nici o amplificare și resecvențiere implicate aici. Cu toate acestea, nu credem că această responsabilitate aparține Concluziilor. Este suficient să fie aici pentru a vedea cititorul interesat.

Metode: Pentru căutările în baza de date nr, au fost căutate toate hiturile MCP putative individual sau ca o secvență consensuală sau HMM? Vă rugăm să specificați. Cum au fost calculate valorile suportului sucursalei?

Autori & # x02019 răspuns: Secvențe individuale au fost folosite ca interogări pentru căutări în baze de date. Nici Tblastn, nici Blastp nu funcționează cu profiluri, deci acest lucru este clar așa cum este scris. Sentința privind sprijinul sucursalelor a fost modificată.

& # x0201cContribuțiile autorului & # x0201d și & # x0201cRecunoștințe & # x0201d par a fi duplicate în manuscris.

Autori & # x02019 răspuns: Corectat.

Legendele figurii: vă sugerez să eliminați & # x0201c Proveniența evoluționară a virofagelor rumenice & # x0201d din ambele titluri ale figurilor.

Autori & # x02019 răspuns: gata, cu o modificare suplimentară.

De asemenea, vă sugerez să împărțiți legenda în loc să puneți toate în Figura & # x000a0 1, deoarece Figura & # x000a0 1 nu are multifuncții sau ramuri prăbușite.

Un număr de abrevieri lipsesc în această legendă, cum ar fi ALM, YSLV, ATP, PRO, MCP și pPOLB (și E8 din Figura & # x000a0 2).

Autori & # x02019 răspuns: inclus

Nu îmi este clar că valorile bootstrap mai mici de 50% sunt transformate în multiforații, întrucât sunt listate 18, 31, 37 și 39. Dacă ELW-urile nu sunt bootstraps, acest lucru trebuie clarificat în legendă sau text sau ambele.

Autori & # x02019 răspuns: Multifurcațiile au fost menționate în mod eronat și # x02013 au fost eliminate. ELW-urile pot fi interpretate ca bootstrap.

Nu este clar care sunt ORF-urile în secvențele YSLV, aș include numere de acces pentru toate secvențele individuale prezentate în copaci.

Autori & # x02019 răspuns: inclus

Orientarea desenelor animate pentru RVP pare aleatorie, le-aș orienta pe toate în același mod, cu excepția celor care sunt clar diferite datorită orientării relative a genelor pPolB. Aș identifica, de asemenea, care dintre acestea conțin TIR-uri.

Autori & # x02019 răspuns: Da, acestea sunt sugestii foarte bune. Desenele animate s-au reorientat pe baza orientării genei MCP. TIR nu sunt adiacente acestor gene conservate și, în consecință, sunt prezentate în fișierul suplimentar3.

Fișier suplimentar 1: Adnotarea din acest tabel este din acest studiu?

Autori și răspunsul # x02019: da, este

Fișier suplimentar 2: Includeți în manuscris și fiți foarte atenți la definirea tuturor abrevierilor și listarea numerelor de acces.

Autori & # x02019 răspuns: Tsugestia nu este pe deplin clară. Dacă este vorba despre transformarea acestuia într-o figură principală în locul unui fișier suplimentar, motivele pentru care nu ați făcut acest lucru sunt explicate mai sus. Abrevierile și aderările au fost verificate și modificate de două ori.

Fișier suplimentar 3: fie includeți ORF în A, fie împărțiți în Figura & # x000a0 1 (sau ambele).

Autori & # x02019 răspuns: Am inclus ORF-uri selectate în virofagul A (fișier suplimentar3): POLB, ATPaza, cisteina protează, MCP și o proteină neclasificată (& # x0201c24 & # x0201d), alte 15 proteine ​​neclasificate nu sunt prezentate (nu sunt prezente în alte virofage).


Sputnik a fost mai întâi izolat dintr-o probă obținută de la oameni, a fost recoltat din lichidul de lentile de contact al unei persoane cu cheratită. [3] Cu toate acestea, în mod natural, sa descoperit că virofagul Sputnik se înmulțește în interiorul speciilor de Acanthamoeba, dar numai dacă acea amibă este infectată cu mamavirusul mare. Sputnik valorifică proteinele mamavirusului pentru a produce rapid noi copii ale sale. [1]

Sputnik are un genom ADN dublu catenar circular format din 18.343 perechi de baze. [4] Conține gene capabile să infecteze toate cele trei domenii ale vieții: Eukarya, Archaea și Bacteria. Dintre cele douăzeci și unu de gene care codifică proteinele, trei sunt aparent derivate din APMV în sine, una este omologul unui virus arheologic, iar alții patru sunt omologi ai proteinelor din bacteriofagi și virusuri eucariote. Treisprezece sunt fanii OR, adică nu au omologi detectabili în bazele de date secvențiale curente. Genomul Sputnik are un conținut ridicat de AT (73%) similar cu cel al APMV.

Câțiva alți omologi, cum ar fi cei ai unei primase-helicaze, a unei ATPaze de ambalare, a unei subunități de legare a ADN-ului de transpunere a secvenței de inserție și a unei proteine ​​cu panglică Zn, au fost detectați în setul de date de mediu al Global Ocean Survey, sugerând că virofagii ar putea fi un familie necunoscută de viruși.

S-a descoperit că Sputnik conține gene care au fost partajate de APMV. Aceste gene ar fi putut fi dobândite de Sputnik după asocierea APMV cu gazda și apoi interacțiunea dintre virofag și gazda virală. Recombinarea în cadrul fabricii virale ar fi putut duce la schimbul de gene. Sputnik este una dintre cele mai convingătoare dovezi pentru amestecarea genelor și potrivirea dintre viruși.

Prezența acestor gene omoloage cu mimivirusul în Sputnik sugerează că transferul de gene între Sputnik și mimivirus poate avea loc în timpul infecției Acanthamoeba. Prin urmare, se presupune că virofagul ar putea fi o sursă de vehicul care mediază transferul de gene laterale între virușii gigantici, care constituie o parte semnificativă a populației de virus ADN din mediile marine. Moreover, the presence of three APMV genes in Sputnik implies that gene transfer between a virophage and a giant virus is crucial to viral evolution. [6]


INTRODUCERE

Virophages, a group of circular double-stranded DNA (dsDNA) viruses, are icosahedral in shape and approximately 50 to 100 nm in size (1𠄴). Virophages have three unique features (2). First, the nuclear phase is absent during the infection cycle of virophages. Second, the replication of virophages takes place in a viral factory of the giant host DNA viruses. Third, they depend on enzymes from host viruses instead of host cells. Accordingly, virophages are considered to be parasites of giant DNA viruses, e.g., mimiviruses and phycodnaviruses (1𠄳). Giant DNA viruses possess huge genome sizes (up to 𢒁,259 kb), some of which are even larger than those of certain bacteria (5𠄷). The infection and propagation of virophages lead to a significant decrease in host virus particles and, consequently, an increase in host cell survival (1𠄳). Additionally, exchanges of genes may occur between virophages and giant DNA viruses (1𠄳, 8, 9). Therefore, virophages are potential mediators of lateral gene transfer between large DNA viruses (8, 9).

Thus far, four virophages have been identified in distinct locations ( Table 1 ). The first reported virophage, Sputnik, was isolated from an Acanthamoeba species infected with the large mamavirus in a water-cooling tower in Paris, France (2). The second virophage, Mavirus, was observed in a marine phagotrophic flagellate (Cafeteria roenbergensis) in the presence of the host virus, Cafeteria roenbergensis virus, originating from the coastal waters of Texas (1, 10). The third virophage, Organic Lake virophage (OLV), discovered in a hypersaline meromictic lake in Antarctica, is thought to parasitize large DNA viruses infecting microalgae (3, 11). At the time of this report, a fourth virophage, Sputnik 2, together with its host virus, Lentille, has been detected in the contact lens solution of a patient with keratitis in France (12). The fact that virophages exist in a wide range of virus and eukaryotic hosts, as well as in a variety of unique habitats, implies the possibility that they are more widely distributed and diverse than previously thought.

Tabelul 1

VirophageLocațieHost Genomul
VirusEukaryoteSize (bp)No. of ORFsC+G content (%)
SputnikA cooling tower in Paris, FranceAcanthamoeba polyphaga mimivirusA. polyphaga18,3432127.0
MavirusCoastal waters of TexasCafeteria roenbergensis virusMarine phagotrophic flagellate (C. roenbergensis)19,0632030.3
OLVOrganic Lake, a hypersaline meromictic lake in AntarcticaLarge DNA virusesPrasinophytes (phototrophic algae)26,4212639.1
Sputnik 2Contact lens fluid of a patient with keratitis, FranceLentille virusA. polyphaga18,3382028.5
YSLV1Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?27,8492633.4
YSLV2Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?23,1842133.6
YSLV3Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?27,0502334.9
YSLV4Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?28,3063437.2
ALMAce Lake in Antarcticamimiviruses?Phagotrophic protozoan?17,7672226.7

To obtain greater insight into the unusual diversity of the global distribution and abundance of virophages, in this study, metagenomic databases on the Community cyberinfrastructure for Advanced Microbial Ecology Research and Analysis (CAMERA) 2.0 Portal (https://portal.camera.calit2.net/) (13) were analyzed comprehensively. Four complete genomic sequences of virophages and one nearly complete sequence were assembled based on the metagenomic DNA sequences of Yellowstone Lake, Wyoming, and Ace Lake, Antarctica. Comparative genomics and phylogenetic analyses were performed in order to better understand the genomic sequence features, phylogeny, and evolution of virophages.


Materiale și metode

Water samples from Organic Lake were collected December 2006 and November and December 2008, and microbial biomass was collected onto 3.0-, 0.8-, and 0.1-μm membrane filters as described previously (14, 36). DNA extraction, sequencing, phylogenetic analyses, generation of metagenomic assemblies and annotation of OLPV and OLV mosaic genomes, and protein extraction and metaproteomic analyses were performed as previously described (14, 36). Unfiltered Organic Lake water samples from 2006 were fixed in formalin 1% (vol/vol), negatively stained, and visualized by TEM for VLPs. A modified Lotka-Volterra model was used to describe algal host, virus, and virophage dynamics, on the basis of approaches previously described (14). Full details are provided in Materiale și metode SI.


Rezultate si discutii

Overall Structure of the Sputnik Virus.

A 3.5-Å resolution, icosahedrally averaged map (Fig. 1 A–D) was determined by image reconstruction using approximately 12,000 cryo-EM particles. In addition, a 3.8-Å resolution map of empty capsids was calculated using approximately 13,000 empty particles. There are 4 and 1/3 hexon capsomers in each icosahedral asymmetric unit of the virus, where the 1/3 hexon is from a hexon sitting on the icosahedral threefold axis. In addition there is 1/5 of a penton capsomer adjacent to the fivefold vertex in the asymmetric unit. After the hexon and penton densities had been interpreted there remained three similar uninterpreted densities, each representing nine amino acids, presumably corresponding to the same sequence of a minor capsid protein. These densities were located on the inside of the capsid, at the boundary between pairs of hexons (Fig. S1), but are absent in the empty capsids and must have been associated with the DNA so as to be able to exit along with the DNA.

Reconstruction of Sputnik at 3.5-Å resolution. (A) Reconstruction of the whole virus, colored according to radius. (B) Fourier shell correlation (FSC) coefficient plot showing the resolution of Sputnik reconstruction to be 3.5 Å (FSC = 0.143) according to the criterion defined by Rosenthal and Henderson (42). (C) Cryo-EM density of a β-strand in the MCP. (D) Cryo-EM density of selected residues, Phe, Arg, Trp, and Tyr (from left to right), showing the quality of the reconstruction.

Major Capsid Protein.

The structures of the 13 MCPs in the icosahedral asymmetric unit were built independently and then refined with the program CNS (27). The refined structure had an R-factor of 0.26 and 3.8% of residues in disallowed regions of the Ramachandran plot. Root-mean-square deviation of bond lengths from ideal values was 0.012 and that of angles was 1.7. The structure of the first 508 amino acids of each of the MCPs could be easily built using the amino acid sequence corresponding to gene V20 (Fig. 2 A și B). Residues 497–508 form an α-helix that is inserted into a hydrophobic pocket located in the center of each hexon. There is not enough space for amino acids that follow residue 508 to exit this pocket (Fig. 2C). Furthermore, an SDS/PAGE gel (Fig. 2D) shows that the molecular mass of the MCP is approximately 55 kDa, whereas the calculated molecular mass of the whole protein is 65.4 kDa. Therefore, the last 87 residues of the MCP must have been cleaved off probably during assembly. The overall structure of the MCP is a double jelly-roll fold with the BC, DE, FG, and HI loops pointing toward the quasi-sixfold axis of the capsomer, as in other jelly-roll–containing viral capsomers. Amino acids 1–279 of V20 form the first jelly-roll, and amino acids 280–507 form the second jelly-roll. As in the MCPs of PBCV-1 (Vp54), PRD1 (p3), and the adenovirus hexon, there is a “tower” structure created from the usual large insertions between strands D to E and F to G in both jelly-rolls (Fig. 2B). However, in Sputnik and PRD1 the insertion between strands H and I of the first jelly-roll also contributes to the tower structure. Furthermore, in Sputnik the insertion between strands F and G of the second jelly-roll contributes to the tower of the neighboring molecule.

Double jelly-roll structure of MCP. (A) Ribbon diagram of the Sputnik MCP. The first and second jelly-roll domains are colored green and red, respectively. (B) Diagrammatic representation of the arrangement of β-strands and residue numbers at the ends of the β-strands. (C) Stereo diagram showing the C-terminal region of the MCP. Residues 502–508 are colored orange. These residues bind into a hydrophobic pocket. There is no density or space for the remaining 87 C-terminal residues of the MCP sequence, suggesting that these residues had been cleaved. (D) Molecular mass of the MCP is estimated to be approximately 55 kDa by SDS/PAGE gel.

PBCV-1, PRD1, and vaccinia virus have a viral membrane, and their MCPs have highly positively charged surfaces facing the membrane (Fig. 3A). For Sputnik the surface of the MCP facing the inside of the virus has both negatively and positively charged patches (Fig. 3B) at neutral pH, similar to the charge distribution of the inside surface of the adenovirus hexon protein. Thus, the charge distribution of Sputnik’s MCP indicates that Sputnik probably does not have a viral membrane. The absence of a lipid membrane was further confirmed using paper spray mass spectroscopy (Figs. S2 and S3 Materiale și metode SI). The ease with which the genome can be persuaded to be ejected from the capsid by changes of pH (see below) also speaks to the absence of a barrier, were a membrane present.

Comparison of the inner surface charge distribution of dsDNA virus MCPs with a double jelly-roll fold. (A) Viruses that have a lipid membrane envelope. (B) Viruses that do not have a lipid membrane envelope.

The region immediately inside the capsid protein appears as three parallel layers, each approximately 25 Å thick, in a 20-Å resolution low-pass filtered map (Fig. S4A). The reconstruction of the empty virus does not have these layers (Fig. S4B). Therefore, the three consecutive density layers within the capsid probably represent ordered or semiordered dsDNA, as is observed for many dsDNA bacteriophages (28, 29). The outermost layer is more intense, presumably because the DNA structure is closely associated with the icosahedral capsid structure. This conclusion contradicts the earlier results (9), based on a 10.7-Å resolution map and mass spectroscopic results, that the density in this region corresponds to a membrane. Although the cause of this discrepancy is unclear, the present mass spectroscopic results have been confirmed by both positive and negative controls using viruses with and without a lipid membrane, respectively (Figs. S2 and S3).

The earlier 10.7-Å resolution study (9) had shown that the external surface of the capsid was decorated with occasional, approximately 100-Å-long, mushroom-like fibers. These features were not visible in the 3.5-Å resolution map, demonstrating that these features are essentially disordered at a resolution of better than 11 Å. It is unknown whether these features are proteins or glycans.

Penton Protein.

The Sputnik cryo-EM density representing the pentons and especially the insertion loops is slightly poorer than that of hexon densities, probably caused by greater flexibility of the penton loops. A Cα atom model was built into the electron density map, identifying the location of approximately 350 amino acids. Because the sequence of the Sputnik penton protein was unknown, a program was designed to align the protein sequences given by the Sputnik genome, expressed in terms of amino acid sizes, with the sizes of the amino acids in the cryo-EM density map (Materiale și metode SI). A satisfactory alignment was obtained for the approximately 150 N-terminal amino acids of gene product V18 and for the alignment of gene products V19 with the remaining C-terminal residues of the Cα atom penton structural model. In the gene sequencing results (2), there was a frame shift between the V18 and the initial bases of the V19 gene. However, according to the electron density map, the penton structure was only one polypeptide chain. Therefore, when the Sputnik genome was resequenced near the junction of these genes, it was found that the original sequence had one additional erroneous base that created a stop codon for V18. Thus, in the absence of the erroneous base, V18 and the whole V19 sequence were in the same frame without a stop codon between them, making V18 and V19 one V18/19 fusion gene, coding for 379 amino acids. The amino acid sequence was then built into the cryo-EM density except for 11 disordered amino acids at the N terminus and 5 disordered amino acids at the C terminus.

The penton protein folds into two domains: a “lower” domain that has a 184 amino acid jelly-roll structure located toward the interior of the virus, and an “upper” domain consisting of 195 amino acids (amino acids 66–261) located on the surface of the virus around the fivefold vertex (Fig. 4 A și B). The orientation of the five jelly-roll domains is roughly similar to the orientation of the VP1 subunits in picornaviruses. In Sputnik the β-strands are roughly radial, whereas in picornaviruses the β-strands are somewhat more tangential, but in both cases the BC, DE, FG, and HI loops are closest to the outside of the virus. The upper domain is primarily a β-barrel inserted between β-strands D and E of the lower jelly-roll domain. If the inserted β-strands along the polypeptide are named IA, IB, IC, ID, and IE, then the two β-sheets would consist of strands IB, IC, IE and of IA, ID. An α-helix, lying parallel to the β-strands, links β-strands IA and IB. The mean center position of the upper domain is rotated counterclockwise (seen from outside the virus) by approximately 60° around the fivefold axis, relative to the lower domain, placing the upper domain almost above the lower domain of the neighboring monomer. The penton has a pore along the fivefold axis with a diameter of 7–10 Å near the outside of the virus that is blocked near the base of the lower domain by residues 318–320. The closest structure found in a Dali search (30) was the penton protein of human adenovirus (31). The adenovirus penton structure has the same counterclockwise twist between the upper domain and lower domain as occurs in Sputnik. Like Sputnik, the upper domain of the adenovirus penton protein has the same fold as the upper domain of the Sputnik penton protein and is an insertion of 307 amino acids between β-strands D and E of the adenovirus lower domain. However, the adenovirus penton protein upper domain has an additional insertion of 53 amino acids between β-strands G and F. The adenovirus upper domain of the penton protein contains an Arg-Gly-Asp sequence that binds to the cellular αvβ3 receptor (32, 33). Only the nonenveloped viruses adenovirus and Sputnik have an insertion domain in their penton proteins. Sputnik, unlike adenovirus, does not have an Arg-Gly-Asp sequence or a fiber and attachment protein emanating from the fivefold vertices.

Single jelly-roll structure of sputnik penton protein. (A) Ribbon diagram of the Sputnik penton protein. The jelly-roll domain is colored green, and the insertion domain is colored red. (B) Diagrammatic representation of the arrangement of β-strands in the penton protein and the residue numbers at the ends of the β-strands.

Capsomer Interactions.

Any pseudohexameric capsomer formed by three double jelly-roll monomers has six edges (Fig. 5A). Each double jelly-roll monomer within a capsomer contributes to two edges, with each edge having an interaction with a neighboring capsomer. The interaction between neighboring capsomers can be divided into three classes. The first two classes form a pseudo-twofold axis between the first (f) edge of one capsomer (dominated by the CHEF sheet of the first jelly-roll) and the first (f) edge of a neighboring capsomer (ff), or between the second (s) edge of a capsomer (dominated by the CHEF sheet of the second jelly-roll) with the second (s) edge of another capsomer (ss). A third class of interaction (fs) is between the first (f) edge of one capsomer and the second (s) edge of a neighboring capsomer. This classification has similarities to that used to describe contacts between capsomers of PRD1 (34).

Asymmetric unit of Sputnik. (A) Capsomers are identified by Roman numerals I to V. Thirteen independent monomers are identified by Arabic numerals 1 to 13. Each MCP is shown by a green line (the first jelly-roll domain) followed by a blue line (the second jelly-roll domain). The independent minor proteins in the asymmetric unit are colored red. Icosahedrally related positions are indicated in the same manner but with corresponding faded colors. (B) The backbone of the MCP was colored according to the root mean square deviation of each Cα position from the mean of the superimposed 13 independent MCPs, ranging from blue (<0.6 Å) to red (>0.6 Å). (C) Number of times a given residue in the 13 independent MCPs is involved in capsomer to capsomer contacts ranging from blue (<8) to red (>8).

Each type of capsomer in one icosahedral asymmetric unit of Sputnik was identified by the Roman numerals I, II, III, IV, and V and the MCP monomers by Arabic numerals 1 to 13 (Fig. 5A). The rotational relationships between neighboring capsomers (Table S1) can be divided into a bend and twist component. The curvature of the viral capsid is determined by the bend angle. If all of the bend angles between neighboring capsomers were zero, then the capsomers would form a plane. The variation of bend angle was found to be limited to approximately 10°, 20°, and 40° degrees in the fs, ff, and ss classes, respectively.

Hydrogen bonds between capsomers were identified by visual inspection. The three classes of interactions, ff, ss and fs, could be subdivided into two or three subclasses depending on the conservation of hydrogen bonds (Table S1). Although there are five examples of class fs in the Sputnik structure, only three of these contact regions are associated with density probably representing the binding site of a minor capsid protein (see above). These three contact regions all belong to the same subclass fs-1, whereas the other two examples of fs contacts are associated with a different set of hydrogen bonds.

The root mean square deviation between equivalence Cα atoms is less than 0.43 Å on superimposing any pair of the 13 MCP structures on each other. However, there are specific regions where the MCP structure has greater variability (Fig. 5B), with displacements of the Cα atoms as much as 3.5 Å. These regions are mostly the loops at the top of each “tower” and in the CHEF β-sheets of the second jelly roll that make contacts with neighboring capsomers (Fig. 5C).

Empty Virus.

During the purification procedure of Sputnik (Materiale și metode), the virus separated into two bands while sedimenting through a cesium chloride gradient. The two bands corresponded to the full and empty virus. Subsequent work showed that empty particles can be produced from full particles either by raising the pH to 9 or lowering the pH to 5.5. It is therefore possible that the purified empty Sputnik particles were produced in a low-pH virus factory (35) during Mimivirus production. The purified empty particles were used in the reconstruction of a 3.8-Å resolution cryo-EM map (Materiale și metode and Fig. S5A). The empty Sputnik particles had a diameter that was approximately 5.2 Å larger than the diameter of the full infectious virus when measured along the threefold axes. However, there was no expansion along the fivefold axes. Presumably the expansion was made possible by the loss of interaction between the packaged DNA and the capsid structure.

The height of the penton density in the empty virus was approximately half of the hexon density, suggesting that some of the penton proteins were missing in the empty particles (Fig. 6A). Presumably the DNA had escaped from one of the vertices where there was no penton protein. Indeed, two particles that had been emptied by lowering the pH of the environment showed a feature that is probably DNA-like density spilling out from one of the vertices (Fig. S5B). A similar loss of the penton structure occurs for adenovirus, which can lose some pentons in the low-pH environment of an endosome (36). Similarly a mutant of the bacteriophage PRD1 can lose some pentons in the presence of a detergent, although PRD1, unlike Sputnik and Adenovirus, has a membrane (34). In the empty particle reconstruction of Sputnik, the electron density for residues 476–508 was missing in the MCP of monomer #1, the monomer adjacent to the penton (Fig. 6B). These residues are in the interface between the penton and hexon. However, it is not clear why these residues are completely disordered when only some of the pentons are missing, which would require disorder only in the #1 MCPs close to one of the missing penton sites. Thus, possibly the pH or other stress disorders these residues, resulting in only the loss of some pentons. The loss of pentons in double jelly-roll dsDNA viruses may be a general phenomenon for genome delivery.

Structure of the empty Sputnik. (A) Cross-section through the empty Sputnik cryo-EM map, showing where the density is at a higher level. The density of the penton protein is lower than that of the MCPs. (B) Electron density (red) of the hexon capsomer, adjacent to the penton protein in the empty virus (Stânga) and full virus (Dreapta). The Cα backbone structure (green) of MCP #1, closest to the penton. The electron density from residue 476 to residue 508 of MCP #1 is missing in the empty virus. The Cα backbone structure of penton protein is colored blue.

Evoluţie.

Single and double jelly-roll MCP structures have been observed in ssRNA, ssDNA, and dsDNA icosahedral viruses (19, 20, 34). In all these cases the jelly-roll is assembled into threefold symmetric capsomers that have quasi-sixfold symmetry. These capsomers are assembled into hexagonal arrays as predicted by Caspar and Klug (37), separated by approximately 75 Å center-to-center (19, 38). However, a double jelly-roll assembly is not feasible around the pentameric vertices. Hence, a single jelly-roll protein fold has been retained in all such viruses to complete the assembly around the pentameric vertices. For example, in picornaviruses the pentamer is formed by five copies of VP1 (13) in adenoviruses (39), PRD1 (40), PM2 (21, 22), and Sputnik the pentamer is formed by five copies of the penton molecule.

Many, but not all, dsDNA viruses that have a double jelly-roll capsid fold also have a lipid membrane envelope. Thus, the mode of genome delivery will be quite different for these viruses, even if the assembly process might be similar. Both Sputnik and adenovirus, neither of which have a membrane envelope, have a similarly structured inserted “upper” domain at the pentameric vertex that participates in viral entry for adenovirus (33, 41) and possibly therefore also in Sputnik. However, in contrast, PRD1 has a membrane and the penton is missing the “upper” insertion domain (22), suggesting a different genome delivery system.


Andrews, S. (2010). FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. Available online at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

Bellas, C. M., Anesio, A. M., and Barker, G. (2015). Analysis of virus genomes from glacial environments reveals novel virus groups with unusual host interactions. Față. Microbiol. 6:656. doi: 10.3389/fmicb.2015.00656

Blanc, G., Gallot-Lavallພ, L., and Maumus, F. (2015). Provirophages in the Bigelowiella genome bear testimony to past encounters with giant viruses. Proc. Natl. Acad. Știință. U.S.A. 112, E5318�. doi: 10.1073/pnas.1506469112

Breitbart, M., and Rohwer, F. (2005). Here a virus, there a virus, everywhere the same virus? Trends Microbiol. 13, 278�. doi: 10.1016/j.tim.2005.04.003

Campos, R. K., Boratto, P. V., Assis, F. L., Aguiar, E. R., Silva, L. C., Albarnaz, J. D., et al. (2014). Samba virus: a novel mimivirus from a giant rain forest, the Brazilian Amazon. Virol. J. 11:95. doi: 10.1186/1743-422X-11-95

Darling, A. C., Mau, B., Blattner, F. R., and Perna, N. T. (2004). Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements. Genomul Res. 14, 1394�. doi: 10.1101/gr.2289704

Desnues, C., La Scola, B., Yutin, N., Fournous, G., Robert, C., Azza, S., et al. (2012). Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses. Proc. Natl. Acad. Știință. U.S.A. 109, 18078�. doi: 10.1073/pnas.1208835109

Edgar, R. C. (2004). MUSCLE: alinierea secvenței multiple cu precizie ridicată și randament ridicat. Acizi nucleici Res. 32, 1792�. doi: 10.1093/nar/gkh340

Fischer, M. G., and Suttle, C. A. (2011). A virophage at the origin of large DNA transposons. Ştiinţă 332, 231�. doi: 10.1126/science.1199412

Gaia, M., Benamar, S., Boughalmi, M., Pagnier, I., Croce, O., Colson, P., et al. (2014). Zamilon, a novel virophage with Mimiviridae host specificity. Plus unu 9:e94923. doi: 10.1371/journal.pone.0094923

Guindon, S., Lethiec, F., Duroux, P., and Gascuel, O. (2005). PHYML Online𠄺 web server for fast maximum likelihood-based phylogenetic inference. Acizi nucleici Res. 33, W557–W559. doi: 10.1093/nar/gki352

Ignacio-Espinoza, J. C., Solonenko, S. A., and Sullivan, M. B. (2013). The global virome: not as big as we thought? Curr. Opin. Virol. 3, 566�. doi: 10.1016/j.coviro.2013.07.004

Jones, P., Binns, D., Chang, H. Y., Fraser, M., Li, W., McAnulla, C., et al. (2014). InterProScan 5: genome-scale protein function classification. Bioinformatica 30, 1236�. doi: 10.1093/bioinformatics/btu031

King, A. M., Adams, M. J., and Lefkowitz, E. J. (2011). Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier.

Krupovic, M., Bamford, D. H., and Koonin, E. V. (2014). Conservation of major and minor jelly-roll capsid proteins in Polinton (Maverick) transposons suggests that they are bona fide viruses. Biol. Direct 9:6. doi: 10.1186/1745-6150-9-6

Krupovic, M., and Koonin, E. V. (2015). Polintons: a hotbed of eukaryotic virus, transposon and plasmid evolution. Nat. Pr. Microbiol. 13, 105�. doi: 10.1038/nrmicro3389

Krupovic, M., Kuhn, J. H., and Fischer, M. G. (2016). A classification system for virophages and satellite viruses. Arc. Virol. 161, 233�. doi: 10.1007/s00705-015-2622-9

La Scola, B., Desnues, C., Pagnier, I., Robert, C., Barrassi, L., Fournous, G., et al. (2008). The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. Natură 455, 100�. doi: 10.1038/nature07218

Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., Deweese-Scott, C., et al. (2011). CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Acizi nucleici Res. 39, D225�. doi: 10.1093/nar/gkq1189

Patel, R. K., and Jain, M. (2012). NGS QC Toolkit: a toolkit for quality control of next generation sequencing data. Plus unu 7:e30619. doi: 10.1371/journal.pone.0030619

Roux, S., Tournayre, J., Mahul, A., Debroas, D., and Enault, F. (2014). Metavir 2: new tools for viral metagenome comparison and assembled virome analysis. BMC Bioinform. 15:76. doi: 10.1186/1471-2105-15-76

Yau, S., Lauro, F. M., DeMaere, M. Z., Brown, M. V., Thomas, T., Raftery, M. J., et al. (2011). Virophage control of antarctic algal host-virus dynamics. Proc. Natl. Acad. Știință. U.S.A. 108, 6163�. doi: 10.1073/pnas.1018221108

Yutin, N., Kapitonov, V. V., and Koonin, E. V. (2015). A new family of hybrid virophages from an animal gut metagenome. Biol. Direct. 10, 19. doi: 10.1186/s13062-015-0054-9

Zablocki, O., van Zyl, L., Adriaenssens, E. M., Rubagotti, E., Tuffin, M., Cary, S. C., et al. (2014). High-level diversity of tailed phages, eukaryote-associated viruses, and virophage-like elements in the metaviromes of antarctic soils. Aplic. Mediu Microbiol. 80, 6888�. doi: 10.1128/AEM.01525-14

Zhang, Q., Ding, C., Achal, V., Shan, D., Zhou, Y., Xu, Y., et al. (2014). Potential for nutrient removal by integrated remediation methods in a eutrophicated artificial lake - a case study in Dishui Lake, Lingang New City, China. Water Sci. Tehnologie. 70, 2031�. doi: 10.2166/wst.2014.453

Zhang, W., Zhou, J., Liu, T., Yu, Y., Pan, Y., Yan, S., et al. (2015). Four novel algal virus genomes discovered from Yellowstone Lake metagenomes. Știință. Reprezentant. 5:15131. doi: 10.1038/srep15131

Zhou, J., Sun, D., Childers, A., McDermott, T. R., Wang, Y., and Liles, M. R. (2015). Three novel virophage genomes discovered from yellowstone lake metagenomes. J. Virol. 89, 1278�. doi: 10.1128/JVI.03039-14

Zhou, J., Zhang, W., Yan, S., Xiao, J., Zhang, Y., Li, B., et al. (2013). Diversity of virophages in metagenomic data sets. J. Virol. 87, 4225�. doi: 10.1128/JVI.03398-12

Keywords: virophage, genome, metagenomics, freshwater lake, diversity

Citation: Gong C, Zhang W, Zhou X, Wang H, Sun G, Xiao J, Pan Y, Yan S and Wang Y (2016) Novel Virophages Discovered in a Freshwater Lake in China. Față. Microbiol. 7:5. doi: 10.3389/fmicb.2016.00005

Received: 02 November 2015 Accepted: 05 January 2016
Published: 22 January 2016.

Bernard La Scola, Aix Marseille Université, France

Christelle Desnues, URMITE Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7278, France
Matthias Fischer, Max Planck Society, Germany

Copyright © 2016 Gong, Zhang, Zhou, Wang, Sun, Xiao, Pan, Yan and Wang. Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit în conformitate cu condițiile Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. Nu este permisă nicio utilizare, distribuție sau reproducere care nu respectă acești termeni.


Priveste filmarea: Amostras Grátis (Decembrie 2021).