Informație

Secvențierea 16S: probe combinate sau individuale?


Plănuiesc să rulez secvențierea 16S pe un set de indivizi pentru a explora diversitatea microbiană. Întrebarea cu care mă confrunt este: ar trebui să le secvențez individual sau să le pun în comun (de exemplu 5 indivizi = 1 eșantion)? Mă gândeam doar la avantajele și dezavantajele ambelor metode:

1) individual. Pot obține diversitatea fiecărui individ, în felul acesta cunosc proporția de indivizi care au o anumită specie de bacterii. Costul este mai mare, deoarece am nevoie de mai multe eșantioane cu privire la modul cumulat, dar citirile / eșantionul necesar ar trebui să fie mai mici (deoarece acest număr crește odată cu diversitatea microbiană).

2) reunite. Am doar o proporție generală de diversitate în piscină (nu pot evalua câte persoane au un becteriu particular). Costul este mai mic datorită cantității mici de eșantioane, dar citirile / eșantionul ar trebui să fie mai mari datorită mai multor persoane colectate (?).

Ma poate ajuta cineva? Presupunerile mele sunt corecte sau îmi lipsește ceva?


În cele din urmă, depinde ce informații încercați să obțineți din datele dvs. de secvențiere, dar dintr-o perspectivă pur științifică, nu există aproape niciodată un motiv pentru a colecta probe în modul în care ați descris. Lista dvs. pro-con nu este departe, în ceea ce privește informațiile pierdute sau câștigate, dar cred că trece cu vederea unele dintre consecințele din aval ale pierderii acestor informații în analiza dvs. În primul rând, punerea în comun vă limitează capacitatea de a face comparații semnificative din punct de vedere biologic sau statistic. De exemplu, dacă eșantioanele dvs. individuale sunt grupate în funcție de țara de origine înainte de secvențiere, nu aveți nicio modalitate de a estima variația în aceste eșantioane grupate. Din această cauză, nu se pot spune multe despre orice diferență observată între țări dincolo de descrierile simple ale bogăției și taxonomiei. Tratat ca comunități individuale, puteți căuta tendințe diferite, puteți face comparații semnificative între diversitatea beta și le puteți analiza cu statistici. Dacă aveți date de mediu, ați putea chiar să faceți câteva analize ecologice semnificative.

În al doilea rând, după cum ați menționat, un eșantion colectat ar trebui să aibă teoretic mai multă diversitate decât eșantioanele individuale din care a fost grupat (cel puțin nu ar trebui să aibă nu mai puține variante de secvență unice decât cele mai bogate dintre comunitățile grupate), dar pooling-ul ar putea masca și diversitatea comunității. Dacă unul dintre eșantioanele colectate are o comunitate de abundență deosebit de mare, care este dominată de doar unul sau două organisme, ar putea crea apariția că unele organisme cu abundență moderată în alte comunități mai diverse sunt de fapt rare sau inexistente. Chiar și la o adâncime mult mai mare a secvențializării, valorile diversității care țin cont de abundență își pierd valoarea, deoarece orice eșantion anormal ar putea distorsiona rezultatele grupate, creând o impresie falsă a profilului general al comunității.

În cele din urmă, toate ipotezele de economisire a costurilor din postarea dvs. vor depinde de centrul de secvențiere pe care îl utilizați și de modul în care facturează probele, deci nu există cu adevărat un răspuns direct de dat. Dar voi spune că costul pe eșantion al secvențierii ampliconului Illumina 16 este destul de ieftin (mai ales în comparație cu costul colectării insectelor din 5 țări diferite). Și din cauza modului în care se realizează secvențierea, punerea în comun a eșantioanelor s-ar putea să nu vă economisească nici măcar bani. Secvențierea este adesea facturată pentru fiecare kit de secvențiere sau pentru fiecare bandă de secvențiere utilizată, nu pentru fiecare eșantion individual pe care îl trimiteți. Deci, cu excepția cazului în care aveți pe cineva care să vă împărtășească secvența, este posibil să plătiți aproximativ aceeași sumă pentru 5 eșantioane ca și pentru 95, cu doar economii minime de costuri pentru kiturile de pregătire și extracție ale bibliotecii.

Pentru a rezuma, punerea în comun a eșantioanelor vă reduce efortul efectiv de eșantionare și vă limitează potențialul domeniu de inferență. Singurul motiv valabil la care mă pot gândi pentru a pune în comun probele într-un astfel de mod ar fi dacă nu puteți izola suficient ADN bacterian pentru secvențierea de la o singură persoană (ceea ce ar putea fi cazul, în funcție de tipul de insecte cu care lucrați). Așa cum am spus la început, însă, depinde cu adevărat de ceea ce doriți să învățați din datele dvs. de 16 ani. Dacă comparația microbiomului este crucială pentru rezultatul studiului dvs., aș sugera secvențierea cât mai multor comunități individuale sau cel puțin un subset de indivizi din fiecare țară (în funcție de numărul de persoane colectate). Dacă nu intenționați să faceți multe analize dincolo de descrierea bogăției microbiene și poate a unor clasificări taxonomice, poate că eșantioanele combinate sunt suficiente pentru nevoile dvs.


Secvențierea ARNr-ului de generația următoare 16S

Multe zone ale corpului uman sunt colonizate de comunități complexe de microbi („microbiomul uman”) atât în ​​starea de sănătate, cât și în diferite stări de boală. Specimenele polimicrobiene foarte diverse sunt adesea dificil sau chiar imposibil de caracterizat pe deplin prin tehnici de utilizare clinică obișnuită:


Figura 1. Exemple de secvențiere convențională a genei ARNr 16S rezultă dintr-un izolat bacterian și un specimen polimicrobian. Pentru izolatul bacterian (partea de sus), datele secvenței Sanger produc o electroferogramă curată care poate fi utilizată pentru a furniza o clasificare taxonomică la nivel de specie. Pentru eșantionul polimicrobian (de jos), secvențierea Sanger generează o electroperogramă diferită pentru fiecare specie prezentă, rezultând un semnal mixt care este ininterpretabil.
  • Identificarea bazată pe cultură se bazează pe capacitatea organismelor de a crește și de a se replica in vitro. Prin urmare, detectarea organismelor fastidioase sau cu creștere lentă sau a celor invidiate datorită prelucrării (cum ar fi în specimene de țesut încorporate în parafină fixată în formalină) sau în timpul depozitării (cum ar fi anaerobii care au fost expuși oxigenului) este limitată. Mai mult, doar un număr limitat de specii pot fi clasificate practic prin această abordare.

Figura 2. Mărire de mare putere a unei runde de secvențiere de generație următoare. Fiecare punct fluorescent reprezintă o moleculă individuală de ADN în curs de secvențiere. Culoarea spotului indică identitatea nucleotidei care este interogată în timpul ciclului curent de secvențiere. Imagine din Shendure, Porreca și colab. Știință (2005).

Spre deosebire de abordările convenționale, secvențierea ADN-ului de generația următoare (denumită în mod alternativ „NGS”, „secvențierea cu randament ridicat”, „secvențierea masivă paralelă” sau „secvențierea profundă”) oferă date secvențiale independente de la milioane de molecule de ADN individuale (Figura 2), permițând ca fiecare fragment să fie clasificat independent.

Această abilitate unică se extinde asupra avantajelor metodelor moleculare actuale, permițându-ne să catalogăm organismele prezente chiar și în cadrul unor comunități bacteriene polimicrobiene foarte complexe, direct din specimenele pacienților.

Informații despre testele disponibile

În prezent, laboratorul nostru oferă secvențierea ADN-ului Illumina de înaltă fidelitate de următoarea generație a specimenelor clinice care conțin mai multe șabloane de ADN bacterian. Metodele sunt validate în scopul diagnosticului molecular clinic și al îngrijirii pacienților. Sunt disponibile și servicii de cercetare - vă rugăm să ne contactați pentru informații suplimentare.

Acest test este disponibil ca testare reflexă pentru eșantioane care se așteaptă a fi polimicrobiene pe baza unei PCR bacteriene cu gamă largă.

Contactați [email protected] pentru detalii sau întrebări.


Raportarea clinică

La finalizarea testării, se emite un raport care descrie rezultatele secvențierii de generație următoare 16S. Pentru a vizualiza un exemplu de raport, faceți clic aici sau miniatura din stânga.

Pentru informații suplimentare despre cum să depuneți o cerere și să primiți un raport, vă rugăm să ne contactați!


Introducere

Studiile de genetică a populației și studiile epidemiologice privind genetica bolilor multifactoriale necesită secvențierea unui număr mare de genomi cu acoperire ridicată. Acest lucru este obligatoriu atât pentru a ajunge la o putere suficientă pentru analiza caz-control, cât și pentru a compara tiparele variațiilor genetice între populații. În ciuda reducerii substanțiale a costului NGS în ultimii ani, secvențierea unui număr mare de genomi individuali cu acoperire ridicată este încă o provocare economică. O abordare alternativă rentabilă este secvențierea ADN-ului din grupurile de indivizi (Pool-seq), care are alte beneficii, cum ar fi necesitatea mai puțin ADN de la fiecare individ și reducerea muncii generale și a timpului de secvențiere a experimentelor. Combinarea permite chiar și laboratoarelor mici să efectueze studii de genetică a populației, care altfel sunt imposibile din cauza costurilor exorbitante. Cu toate acestea, punerea în comun a ADN-ului creează noi probleme și complexitate în analiza datelor. Una dintre cele mai provocatoare probleme ale Pool-seq este identificarea corectă a variantelor rare (frecvența alelelor, AF & lt 0,01), deoarece erorile de secvențiere se confundă cu alelele prezente la frecvențe joase în bazine. Variantele rare nu sunt doar abundente în populație, dar au și roluri funcționale potențiale 1,2. Sute de studii de asociere a genomului (GWAS) care vizează variante comune explică doar o fracțiune din ereditatea genetică în bolile complexe 3. Acest lucru implică faptul că trebuie să privim dincolo de ipoteza „boală comună / variantă comună (CD / CV)” și sarcina genetică a multor variante rare de dimensiuni mici ale efectului cu penetranță ridicată ar putea juca roluri cheie în explicarea lipsei eredității bolilor complexe 4,5. Astfel, determinarea corectă a variantelor rare este extrem de importantă în cercetarea bolilor genetice.

Unul dintre interesele cheie ale studiului geneticii populației este informația despre siturile polimorfe și AF corespunzătoare a variantelor alelelor din populație. Puterea multor analize genetice depinde de determinarea exactă a AF ale variantelor. În principiu, Pool-seq ar trebui să ofere o estimare mai robustă a AF datorită dimensiunii mai mari a eșantionului, care permite scăderea totalului varianță din AF estimat 6. Această ipoteză este bine susținută de modele matematice, presupunând că nu există erori de secvențiere și fiecare individ contribuie cu cantitate egală de ADN la bazinele 7,8,9. Cu toate acestea, în realitate erorile de secvențiere sunt apreciabile 10,11 și atingerea concentrației echimolare a ADN-ului fiecărui individ în bazine este, de asemenea, oarecum dificilă, ceea ce face utilă verificarea acurateței AF-urilor în experimentele Pool-seq.

În studiul de față, care implică re-secvențierea țintită a 996 de indivizi în 83 de grupuri, arătăm că Pool-seq poate fi utilizat pentru a estima cu precizie AF ale variantelor de alele. Comparând Pool-seq cu mai multe baze de date cu variante publice și date SNP-array ale persoanelor care constituie pool-urile, arătăm că AF-urile Pool-seq sunt robuste și fiabile. De asemenea, oferim un ghid general de filtrare pentru a elimina variantele false din cauza erorilor de secvențiere. Noi individual a secvențiat și identificat variante pentru toți subiecții unui singur pool și le-a comparat cu rezultatele Pool-seq, arătând că filtrele propuse oferă o rată scăzută de variante fals pozitive și false negative, dovedind astfel utilitatea și eficacitatea filtrelor.


Caracterizare moleculară cuprinzătoare a comunităților bacteriene la fecale de păsări de companie folosind secvențierea markerului 16S

Păsările și alte animale trăiesc și evoluează în contact strâns cu milioane de microorganisme (microbiota). În timp ce microbiota aviară a fost bine caracterizată la păsările domestice, microbiota altor specii de păsări a fost mai puțin investigată. Scopul acestui studiu a fost de a descrie comunitățile bacteriene fecale ale păsărilor de companie. Eșantioane de fecale grupate din 22 de turme reprezentând peste 150 de păsări individuale din trei specii diferite (Melopsittacus undulatus sau budgerigari, Nymphicus hollandicus sau cockatiels și Serinus canaria sau canari domestici) au fost utilizate pentru analiză folosind secvențierea genei 16S rRNA în platforma MiSeq (Illumina). Firmicutes a fost cel mai abundent filum (median 88,4% interval 12,9-98,4%) urmat de alte filuri slab abundente precum Proteobacteria (median 2,3% 0,1-85,3%) și Actinobacteria (median 1,7% 0-18,3%). Lactobacillaceae (mai ales Lactobacillus spp.) a fost cea mai abundentă familie (mediană 78,1% 1,4–97,5%), în special la budgerigari și canari și merită atenție datorită proprietăților benefice atribuite bacteriilor lactice. Important, fecalele de la păsări conțin microbiote intestinale, urinare și reproductive asociate, punând astfel o problemă serioasă de a studia o regiune anatomică la un moment dat. Alte grupuri de interes includ familia Clostridiaceae care a prezentat o abundență foarte scăzută (mediană globală & lt0,1%), cu excepția a două probe din cockatiels (14 și 45,9%) și un eșantion din budgerigari (19,9%). Analiza metricilor UniFrac a arătat că, în ansamblu, comunitățile microbiene din cele 22 de turme tindeau să se grupeze împreună pentru fiecare specie de păsări, ceea ce înseamnă că fiecare specie aruncă comunități bacteriene distincte în fecale. Această analiză descriptivă oferă o perspectivă asupra microbiotei fecale a păsărilor de companie.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Mostrele grupate influențează descrierile comunității fungice

Am testat acuratețea analizelor moleculare pentru recuperarea bogăției speciilor și a structurii comunităților fungice grupate cu compoziție cunoscută. Am construit grupuri de replici de 2-20 de specii și am analizat aceste bazine prin două proceduri separate de extragere a ADN-ului și trei analize moleculare diferite (Analiza distanțieră intergenică automată ribozomală (ARISA), polimorfismul de lungime a fragmentului de restricție terminal (T-RFLP) și biblioteca de clone) secvențierea). Niciuna dintre metode nu a descris corect comunitățile cunoscute. Doar secvențierea bibliotecii de clone cu secvențierea mare pe grup (∼100 clone) a recuperat estimări rezonabile ale bogăției. Datele de frecvență au fost distorsionate cu toate procedurile și analizele. Aceste rezultate indică faptul că eroarea introdusă prin colectarea probelor este semnificativă și problematică pentru studiile ecologice ale comunităților fungice.

Tabelul S1 Combinarea a 1 specie, numere de acces GenBank, identități de grup și detectare prin polimorfism de lungime a fragmentului de restricție terminal (T-RFLP) și secvențierea clonării

Tabelul S2 Combinarea a 2 specii, numere de acces GenBank, identități de pool și detectare prin clonare-secvențiere

Vă rugăm să rețineți: Wiley-Blackwell nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea materialelor suport furnizate de autori. Orice întrebări (altele decât materialul lipsă) trebuie să fie adresate autorului corespunzător pentru articol.

Nume de fișier Descriere
MEN_2743_sm_Pooling1_Final.xls53 KB Element de informații de susținere
MEN_2743_sm_Pooling2_Final.xls17,5 KB Element de informații de susținere

Vă rugăm să rețineți: editorul nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea oricăror informații de susținere furnizate de autori. Orice întrebări (altele decât conținutul lipsă) trebuie să fie adresate autorului corespunzător pentru articol.


O metodă pentru secvențierea 16S țintită a probelor de lapte uman

Un flux de lucru semiautomat este prezentat pentru secvențierea țintită a ARNr 16S din laptele uman și alte tipuri de probe cu biomasă scăzută.

Abstract

Studiile asupra comunităților microbiene au devenit răspândite odată cu dezvoltarea unei secvențieri relativ ieftine, rapide și cu randament ridicat. Cu toate acestea, la fel ca în cazul tuturor acestor tehnologii, rezultatele reproductibile depind de un flux de lucru de laborator care încorporează măsuri de precauție și controale adecvate. Acest lucru este deosebit de important în cazul probelor cu conținut scăzut de biomasă în care contaminarea ADN-ului bacterian poate genera rezultate înșelătoare. Acest articol detaliază un flux de lucru semiautomatizat pentru a identifica microbii din probele de lapte matern uman, folosind secvențierea țintită a regiunii V4 ARN ribozomal (rRNA) 16S pe o scară de producție redusă până la mijlocie. Protocolul descrie prepararea probei din lapte integral, inclusiv: liza probei, extracția acidului nucleic, amplificarea regiunii V4 a genei 16S rRNA și prepararea bibliotecii cu măsuri de control al calității. Important, protocolul și discuția iau în considerare problemele care stau la baza pregătirii și analizei probelor cu conținut scăzut de biomasă, inclusiv controale pozitive și negative adecvate, îndepărtarea inhibitorului PCR, contaminarea eșantionului prin surse de mediu, reactivi sau experimentale și bune practici experimentale concepute pentru a asigura reproductibilitate. În timp ce protocolul descris este specific probelor de lapte uman, este adaptabil la numeroase tipuri de probe cu biomasă scăzută și ridicată, inclusiv probe colectate pe tampoane, înghețate înghețate sau stabilizate într-un tampon de conservare.

Introducere

Comunitățile microbiene care colonizează oamenii sunt considerate a fi extrem de importante pentru sănătatea umană și influențarea bolii asupra metabolismului, dezvoltării imune, susceptibilității la boli și răspunsurilor la vaccinare și terapie medicamentoasă 1, 2. Eforturile de a înțelege influența microbiotei asupra sănătății umane subliniază în prezent identificarea microbilor asociați cu compartimente anatomice definite (adică, piele, intestin, oral, etc.), precum și site-urile localizate din cadrul acestor compartimente 3, 4. La baza acestor eforturi de investigație se află apariția rapidă și accesibilitatea sporită a tehnologiilor de secvențiere de generație următoare (NGS) care oferă o platformă masiv paralelă pentru analiza conținutului genetic microbian (microbiom) al unei probe. Pentru multe probe fiziologice, microbiomul asociat este atât complex cât și abundent (adică, scaun), dar, pentru unele probe, microbiomul este reprezentat de biomasă microbiană scăzută (adică, lapte uman, căi respiratorii inferioare) în care sensibilitatea, artefactele experimentale și posibila contaminare devin probleme majore. Provocările comune ale studiilor de microbiomi și proiectarea experimentală adecvată au făcut obiectul mai multor articole de revizuire 5, 6, 7, 8.

Prezentat aici este o conductă experimentală NGS robustă bazată pe secvențierea țintită a regiunii 9 a ARNr 16S V4 pentru a caracteriza microbiomul laptelui uman. Analiza microbiomică a laptelui uman este complicată nu numai de o biomasă microbiană 10 inerent scăzută, ci și de nivelurile ridicate de ADN uman de fond 11, 12, 13, 14 și potențialul report al inhibitorilor PCR 15, 16 în acidul nucleic extras. Acest protocol se bazează pe kituri de extracție disponibile comercial și pe platforme semi-automate care pot ajuta la minimizarea variabilității între loturile de pregătire a probelor. Incorporează o comunitate de bacterii bine definită care este procesată alături de probe ca un control al calității pentru a valida fiecare pas din protocol și pentru a oferi o valoare independentă a robusteții conductelor. Deși protocolul descris este specific probelor de lapte uman, este ușor de adaptat la alte tipuri de probe, inclusiv scaun, rectal, vaginal, cutanat, areolar și tampoane orale 10, 17 și poate servi drept punct de plecare pentru cercetătorii care doresc pentru a efectua analize de microbiomi.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Pentru toate etapele protocolului, trebuie purtat echipament de protecție individuală adecvat (EPI) și trebuie adoptate abordări stricte de prevenire a contaminării. Observați fluxul de lucru de la zonele de lucru pre-amplificare la zonele de lucru post-amplificare pentru a minimiza contaminarea probelor. Toate consumabilele utilizate sunt sterile, fără RNază, DNază, ADN și pirogen. Toate vârfurile pipetei sunt filtrate. Este oferită o diagramă a etapelor protocolului (figura 1).

NOTĂ: Liza eșantionului și extracția acidului nucleic se efectuează folosind un kit de extracție ADN / ARN într-un mediu de cameră curată, unde sunt stabilite atât controale tehnice, cât și procedurale, pentru a minimiza introducerea bacteriilor din mediu în probe.

  1. Pregătirea zonei de lucru
    1. Curățați zona de lucru a dulapului pentru biosecuritate (BSC) cu un agent de curățare adecvat pentru suprafețe, pentru a elimina orice contaminare cu acid nucleic.
    2. Porniți vortexerul controlat de temperatură și setați-l la 37 & # 176C.
    1. Verificați tamponul de liză pentru precipitații. Re-dizolva precipitatele prin încălzire la 37 ° C și 176 ° C.
    2. Pregătiți 600 & # 181L de tampon de liză cu 6 & # 181L & # 946-mercaptoetanol (& # 946-ME) pentru fiecare probă. Luați în considerare un volum suplimentar de 20% pe probă.
    1. Dacă laptele integral este înghețat, dezghețați-l pe gheață. Alicotați 5 ml de lapte integral într-un tub steril de 15 ml sau 5 ml în BSC și păstrați-l pe gheață.
    2. Rotiți alicota de lapte de 5 ml timp de 10 minute la 5.000 x g la 4 și # 176C pentru a celula celulele.
    3. Îndepărtați stratul de grăsime, acum stratul superior din tub, cu o spatulă de plastic sau un vârf de pipetă cu alezaj mare.
    4. Fără a deranja peleta, îndepărtați tot supernatantul, cu excepția 100 & # 181L.
    5. Se spală peleta prin resuspendarea în 1 ml de soluție salină tamponată cu fosfat steril (PBS).
    6. Pregătiți 1 martor negativ adăugând 1 ml de PBS steril într-un tub de 5 ml.
    7. Transferați suspensia într-un tub de centrifugă curat de 1,5 ml și rotiți într-o microcentrifugă timp de 1 min (5.000 x g la temperatura camerei (RT)).
    8. Utilizați un vârf de pipetă filtrat steril de 1.000 & # 181L pentru a arunca întregul strat supernatant / gras.
    9. Dacă nu extrageți în aceeași zi, înghețați rapid peleta de celule punând-o într-o suspensie de etanol / gheață uscată și transferați-o imediat în congelatorul -80 & # 176C.
    1. Adăugați 600 & # 181L de tampon de liză care conține & # 946-ME în peletă și transferați suspensia într-un tub de margele.
    2. Fiecare lot de extracție de 12 conține 10 probe, 1 martor negativ (preparat în pasul 3.7 de mai sus) și 1 martor pozitiv (preparat în pasul următor).
      1. Pregătiți 1 control pozitiv cu tampon de liză și 20 & # 181L din proba falsă bacteriană (comunitatea simulată utilizată are o concentrație, odată extrasă, de aproximativ 0,2 ng / & # 181L de ADN).
      1. Curățați toate suprafețele utilizate cu o soluție de decontaminare non-enzimatică, lăsați timp de 10 minute, apoi pulverizați cu etanol 70% și ștergeți suprafața.
      1. Pregătirea zonei de lucru
        1. Porniți blocul de căldură și setați temperatura la 70 & # 176C.
        2. Porniți vortexerul controlat de temperatură și setați temperatura la 37 & # 176C.
        3. Încălziți tamponul de eluție (EB) conținând 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, într-un tub de 50 mL la 70 și # 176C.
        4. Încălziți 350 & # 181L de lizate de probă înghețate în tuburi de 2 ml la 37 & # 176C până când sunt dezghețate complet, fără niciun precipitat (aproximativ 10 minute).
        1. Vortexați și centrifugați tuburile de 2 ml cu proba scurt (3000 x g timp de 10 s).
        2. Introduceți 2 mL tuburi în agitator urmând instrumentul automat de purificare ADN / ARN și diagrama de încărcare, conform instrucțiunilor producătorului.
        3. Obțineți adaptoarele rotorului și configurați-le pe tavă pe baza numărului de probe.
        4. Etichetați fiecare adaptor de rotor pe baza identificării (ID-ului) eșantionului.
        5. Tăiați capacele și neteziți marginile coloanelor de rotire individuale pentru ADN și ARN.
        6. Introduceți coloana de centrifugare ADN fără tubul de colectare în adaptorul rotorului. Aruncați tubul de colectare.
        7. Etichetați tuburile de colectare de 1,5 ml și introduceți-le în adaptoarele rotorului.
        8. Setați adaptoarele rotorului în centrifugă urmând instrumentul automat de purificare ADN / ARN și diagrama de încărcare # 39.
        9. Introduceți vârfurile de filtru ale producătorului & # 39s 1.000 & # 181L în rafturi.
        10. Adăugați apă fără RNase la un tub de microcentrifugă de 2 mL al producătorului, pe baza numărului de probe (conform instrucțiunilor specifice protocolului mașinii).
        11. Introduceți tubul în slotul pentru tub & # 34A & # 34 al sloturilor pentru tuburi de microcentrifugă.
        12. Aruncați orice reactiv rămas în sticlele de reactivi și umpleți cu un volum minim de 10 ml.
        13. Introduceți sticlele de reactivi în raftul pentru sticle de reactivi (cu excepția sticlei EB).
        14. Adăugați EB cald dintr-un tub de 50 ml în sticla de reactiv poziția 6.
        15. Verificați dacă tuburile de 1,5 ml sunt așezate strâns în adaptoarele rotorului.
        16. Închideți capacul instrumentului și selectați: & # 34RNA & # 34 & # 8594 & # 34extracție & # 34 & # 8594 & # 34Animal, țesuturi și celule & # 34 & # 8594 & # 34kit & # 39s nume 350 & # 181L Partea A Personalizat ADN & # 34 & # 8594 Editați volumul eluției la 100 & # 181L (implicit) sau 50 & # 181L pentru probe cu biomasă redusă & # 8594 & # 34 Începeți. & # 34
        17. După ce ați terminat, scoateți adaptoarele rotorului din centrifugă și așezați-le pe tavă.
        18. Aruncați coloana de rotire ADN din poziția 3 a adaptorului rotorului.
        19. NU aruncați adaptoarele rotorului, ARN-ul se află în poziția 2.
        20. Scoateți tuburile de colectare de 1,5 mL care conțin ADN eluat în poziția 3 și depozitați în & # 872220 & # 176C.
        21. Colectați tuburile care conțin probe din agitator și depozitați-le în & # 872220 & # 176C, dacă a rămas o probă, altfel aruncați-o.
        22. Continuați cu protocolul & # 34kit & # 39s name 350 & # 181L partea B ARN & # 34 pentru purificarea ulterioară a ARN-ului.
        23. Purificarea ARN se va face din fluxul de aproximativ 350 & # 181L care se află în poziția de mijloc a adaptoarelor rotorului.
        1. Introduceți coloana de rotire ARN fără tubul de colectare și capacul său în adaptorul rotorului.
        2. Etichetați tuburile noi de colectare de 1,5 ml și introduceți-le în adaptorul rotorului, așa cum este indicat în manual.
        3. Setați adaptorii rotorului în centrifugă urmând instrumentul automat de purificare ADN / ARN și diagrama de încărcare # 39.
        4. Închideți capacul instrumentului și selectați: & # 34RNA & # 34 & # 8594 & # 34 Producător & # 39s Kit & # 34 & # 8594 & # 34 Animale, țesuturi și celule & # 34 & # 8594 & # 34 Partea standard B ARN & # 34 & # 8594 & # 34 Începeți. & # 34
        5. După finalizare, scoateți adaptoarele rotorului din centrifugă și așezați-le pe tavă.
        6. Aruncați coloana de rotire ARN din poziția 3.
        7. Îndepărtați tuburile de colectare de 1,5 ml care conțin ARN eluat de 30 & # 181L în poziția 3 și depozitați la & # 872280 și # 176C.
        8. Îndepărtați sticlele de reactivi.
        9. Eliminați conținutul adaptorului rotorului prin canalele corespunzătoare de deșeuri periculoase.
        1. Pulverizați toate instrumentele de purificare ADN / ARN și accesoriile automate, cum ar fi rafturile pentru reactivi, tava și orice altă suprafață utilizată cu o soluție de decontaminare non-enzimatică, lăsați timp de 10 minute și clătiți cu apă deionizată (DI), apoi lăsați-le uscat.
        2. Pulverizați instrumentul automat cu soluția de decontaminare non-enzimatică aprobată de producător, ștergeți interiorul centrifugii împreună cu toate suprafețele utilizate, lăsați-l timp de 10 minute, apoi ștergeți cu etanol 70%. Nu utilizați alte tipuri de soluții de decontaminare, deoarece acestea pot deteriora instrumentul.

        NOTĂ: Configurarea pentru 16R PCR se efectuează într-un spațiu de lucru desemnat pentru pre-amplificare situat în camera curată. Reactivii și probele sunt preparate și apoi încărcate pe un dispozitiv de manipulare a lichidului pentru a efectua PCR pentru fiecare probă în triplicat (30 de probe, care includ probe reale și controale pozitive și negative de extracție, plus 2 controale de apă PCR în triplicat, pentru un total de 96 probe combinate și controale). Odată ce reacțiile PCR sunt asamblate și sigilate, placa de eșantionare este transferată la un cicler termic situat într-o zonă de post-amplificare pentru ciclism.

        1. Pregătirea zonei de lucru
          1. Curățați stația de lucru PCR. Pulverizați toate suprafețele utilizate cu un decontaminant RNază, DNază, ADN, urmat de apă DI de două ori și, în final, 70% etanol.
          2. Pregătiți foaia de lucru PCR 16S (consultați Foaia de lucru PCR 16S țintită) cu o listă exactă de eșantioane și atribuiți grunduri diferite cu cod de bare fiecărei probe 9. Imprimați foaia de lucru și hărțile plăcilor (consultați Placa 1).
          1. Lucrați în stația de lucru PCR pentru a pregăti totul.
          2. Scoateți 50 - 100 & # 181L de probe de ADN de la -20 & # 176C și toți reactivii necesari și dezghețați-i pe gheață. Vortex și scurt rotiți în jos.
          3. Primerii sunt pre-diluați până la concentrația de lucru de 5 & # 181M într-un volum minim de 20 & # 181L.
          4. Pregătiți amestecul master PCR în tubul specific de 5 ml cu numai grundul înainte în conformitate cu calculul de pe foaia de lucru.
          1. Pentru eșantioane, scoateți un instrument cu 32 de godeuri și un adaptor pentru eșantioane și încărcați 50 - 100 și # 181L de probe de ADN conform hărții plăcii cu 96 de godeuri conform instrucțiunilor producătorului.
            1. Pentru fiecare placă PCR, configurați 2 controale negative plasând 30 & # 181L de apă PCR într-un tub de probă curat.
            2. Așezați toate eșantioanele pe adaptorul pentru eșantioane cu 32 de godeuri, cu capacele blocate în poziție deschisă.
            1. Scoateți capacul fiecărui grund invers cu coduri de bare specifice # & # 39, unul câte unul (schimbați mănușile între ele pentru a evita contaminarea încrucișată).
            2. Așezați maximum 32 de grunduri pe adaptorul de reactiv al instrumentului.
            1. Așezați adaptorul de reactiv în poziția B1. Pentru a evita un efect de margine, așezați cu atenție o margine a adaptorului de partea de prindere și aduceți încet cealaltă margine în jos. Asigurați-vă că împingeți toate colțurile adaptoarelor.
            2. Așezați adaptorul de probă în poziția C1. Asigurați-vă că împingeți toate colțurile adaptoarelor.
            3. Rotiți amestecul principal de 5 ml, deschideți capacul și plasați-l în poziția A pe mixul principal al instrumentului și blocul de reactivi.
            4. Așezați placa PCR pe instrumentul cu 96 de godeuri și adaptorul # 39, care este destinat să țină plăci PCR pe jumătate.
            5. Porniți rularea și salvați ca fișier nou.
            6. Urmați instrucțiunile și bifați fiecare solicitare: una, sfaturile sunt disponibile, două, cutia pentru deșeuri este disponibilă și trei, începeți.

            4. Controlul calității 16S post-PCR țintit utilizând o platformă pe bandă pentru electroforeză pe gel

            NOTĂ: Controlul calității post-PCR (QC) și toate etapele ulterioare sunt efectuate într-o zonă desemnată post-amplificare a laboratorului. ADN-ul este analizat într-un analizor automat de fragment ADN / ARN.

            1. Pregătirea zonei de lucru
              1. Curățați stația de lucru pulverizând toate suprafețele utilizate cu un decontaminant RNase, DNase, ADN, urmat de apă DI de două ori și, în cele din urmă, 70% etanol.
              2. Adunați toate consumabilele și echipamentele necesare.
              1. Așezați tamponul de probă și scara în vortexerul controlat de temperatură la 25 și # 176C timp de minimum 30 de minute.

              5. Calcul de bibliotecă, regrupare, curățare și QC

              1. După determinarea dimensiunii ampliconului și a molarității tuturor eșantioanelor, grupați bibliotecile pentru a obține volumul final dorit și nM pentru biblioteca colectată (consultați Calculul eșantionului).
              2. Curățați și concentrați biblioteca colectată folosind un kit de purificare pe bază de membrană de siliciu pentru produsele PCR, conform protocolului producătorului și a # 39 (a se vedea Tabelul materialelor).
                1. Eluați ADN-ul cu un volum final de 50 & # 181L.
                1. Diluați 2 & # 181L din biblioteca colectată și curățată cu 198 & # 181L din tamponul de diluare plus colorant (diluare 1: 100).
                2. Înregistrați valoarea măsurată de pe dispozitivul fluorometric și convertiți-o în funcție de factorul de diluare.

                Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

                Rezultate reprezentative

                Protocolul prezentat aici include pași importanți de control al calității (QC) pentru a se asigura că datele generate îndeplinesc criteriile de referință pentru sensibilitatea protocolului, specificitatea și controlul contaminării. Primul pas QC al protocolului urmează amplificarea PCR a regiunii 16S V4 (Figura 2). Un & # 181L de produs PCR din fiecare probă a fost analizat prin electroforeză pentru a confirma că se încadra în intervalul de dimensiuni preconizat de 315 - 450 bp (Figura 2, sageata rosie). Unele probe de lapte uman au generat cantități mai mici de produs specific (Figura 2A, comparați benzile 3 și 9 - 11 cu benzile 4 - 8), sugerând fie niveluri scăzute de ADN microbian extras în probele respective, fie reportarea inhibitorilor PCR în timpul extracției. Pentru probele care produc mai puțin de 2,0 nM de produs în intervalul 315 - 450 bp (Figura 2A, banda 7), curățarea inhibitorului PCR este efectuată folosind un kit cu o singură etapă și proba este re-amplificată. Ratele de succes pentru recuperarea amplificării probei după curățare sunt de aproximativ 40%. Cuantificarea produsului specific pentru fiecare probă (Figura 2B) este esențială pentru determinarea volumului său necesar pentru gruparea molară egală a probelor pentru secvențiere. O bibliotecă colectată pentru secvențierea țintită este de obicei dominată de un anumit produs PCR (Figura 3). Dacă există o cantitate semnificativă de produs nespecific în bibliotecă, ar trebui adăugată o etapă de purificare a gelului la fluxul de lucru.

                În exemplul prezentat în Figura 2A, se observă benzi slabe pentru controlul tamponului (benzile BC 2 și 12) și controlul negativ al apei PCR (banda PC 1), indicând o posibilă contaminare a mediului sau a reactivilor. Astfel de benzi nu sunt neobișnuite și reprezintă de obicei cantități mici de produs PCR (adică, & # 601 nM) și produc puține numărări de citiri în timpul secvențierii (& # 601.000). Rezultate secvențiale reprezentative (Figura 4) confirmă că aceste eșantioane au într-adevăr un număr foarte mic de citiri de secvențiere (Figura 4A, benzile 1 și 11 Figura 4B, Tampon și benzi de apă PCR) și, important, compoziția taxonilor pentru probele martor este distinctă de probele de lapte uman (Figura 4A comparați benzile 1 și 11 cu benzile 2 - 10). High read counts in the negative controls, together with significant overlap in taxa composition between controls and samples, suggests cross-contamination and the need for improved contamination control.

                Sequencing results (Figure 4) demonstrate high diversity in the taxa associated with the human milk microbiome and variability in the number of sequencing read counts for each sample (Figure 4A, lanes 2 - 10). In contrast, the sequencing results for the bacterial mock that was processed along with the human milk samples demonstrated taxa composition and read counts that were comparable to results obtained for the mock in previous workflow runs (compare Figure 4A, lane 12 with Figure 4B, mock lanes). The consistent results for the mock lanes suggest that the observed variability for the human milk samples is an authentic experimental result, and not a function of intrinsic workflow variability.


                Figure 1: Flow chart of the Targeted 16S Sequencing Pipeline. Please click here to view a larger version of this figure.


                Figure 2: Quality control analysis of 16S V4 amplicons. (A) Gel image of 16S V4 amplicons resolved by electrophoresis using an automated DNA/RNA fragment analyzer. 16S V4 amplicons were generated according to Caporaso și colab. 9 , and one µL of each PCR product was analyzed using high sensitivity DNA reagents according to the manufacturer's guidelines. Most human milk samples (lanes 3 - 6 and 8 - 11) and the bacterial mock (lane 13) produced a primary PCR product at the expected size of approximately 400 bp (red arrow). The human milk sample in lane 7 failed to produce a significant amount of specific product and was subject to cleanup and re-amplification. Minimal product was detected for the PCR negative control (PC, lane 1), and lysis buffer negative controls (BC, lanes 2 and 12) indicated minimal contamination present in the analyzed samples. MW, molecular weight markers: upper red and lower green bars identify the 1,500 bp and 25 bp size markers, respectively, in each lane. (B) Top Electropherogram of lane 3 from gel in (A). The primary PCR product falls within the peak region defined by the red vertical bars and comprises fragments ranging in size from 299 - 497 bp resulting in an average PCR product size of 396 bp. Gating is done on a slightly wider range than the anticipated amplicon size (in this case 315 - 450 bp) to be sure to include the entire sample peak. The upper and lower peaks correlate with fragment sizes of 25 bp and 1,500 bp, respectively. Partea de jos: chart summarizing the size parameters for the peak region, the concentration in ng/µL of the PCR product within the peak region, and the molarity in nM for the specific PCR product. This information is then used to calculate how much of each sample will be pooled in an equal molar library for sequencing (see Sample Calculation). Please click here to view a larger version of this figure.


                Figure 3: Electropherogram of a pooled and concentrated sequencing library. Equal molar amounts of individual samples to be sequenced were combined into a pooled library. The library was then cleaned and concentrated to a total volume of 50 µL using a silica-membrane-based PCR clean up kit. Final preparation of the library for sequencing on the next generation sequencer was conducted according to the manufacturer's protocol. This library was successfully sequenced despite the presence of additional bands. If there is a concern about PCR products outside the expected size range, the manufacturer's protocol suggests the addition of a gel size selection step. This QC step is not usually performed. Please click here to view a larger version of this figure.


                Figure 4: Evaluation of negative and positive controls. (A) Relative abundances of bacterial taxa of an extraction batch with controls and human milk samples. As a QC measure, compositions of each extraction batch as loaded on the automated DNA/RNA purification instrument are generated immediately following a sequencing run. Numbers under each sample bar indicate the number of filtered reads for the respective sample. The compositions of the buffer controls are distinct from that of the human milk samples. (B) Relative abundances of bacterial taxa in buffer, mock, and PCR controls. Number of reads and composition are evaluated for all negative (buffer and PCR water) and positive (bacterial mock) controls. The compositions of the buffer and water vary, but the mock community remains quite stable. Please click here to view a larger version of this figure.

                Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

                Discuţie

                Targeted next-generation sequencing of 16S rRNA is a widely used, rapid technique for microbiome characterization 18 . However, many factors, including batch effects, environmental contamination, sample cross-contamination, sensitivity, and reproducibility can adversely affect experimental results and confound their interpretation 7 , 19 , 20 . To best facilitate robust 16S analyses, microbiome workflows must incorporate good experimental design, the use of appropriate controls, spatial segregation of workflow steps, and application of best practices. The protocol described here incorporates each of these parameters and provides important experimental tools to address the challenges above and implement a 16S workflow for diverse samples.

                Good experimental design is critical for 16S microbiome analyses. This includes proper collection and storage of samples, as well as selection of 16S primers appropriate for the region of interest. For example, the V4 region (515F/806R) is selected for human milk because it has good amplification of Bifidobacterium, which plays an important role in development of the neonatal gut microbiome 21 . Other primer sets (de exemplu., 27F/338R, 515F/926R) may be more appropriate for studies of other microbial communities. An important note is that the annealing temperature for the targeted 16S PCR and the expected amplicon size may vary based on primer selection.

                Other places the protocol may be modified are based on results of the QC steps incorporated in the work flow. A few options exist for troubleshooting when either no or little DNA is detected following the targeted 16S PCR amplification step. 1) The sample can be put through a PCR inhibitor removal step. Amplification following PCR inhibitor removal using a single step kit performed per the manufacturer's protocol is successful approximately forty percent of the time,ق) more extracted DNA can be added to the targeted 16S PCR, or 3) a new and potentially larger aliquot of milk can be processed if available. If there is a concern about PCR products outside the expected size range following the silica-membrane-based purification of the library, a gel purification step can be added. Finally, the QC steps are critical to determine if there is evidence of contamination, which is discussed in detail below. If significant contamination is detected, then depending on where the contamination is introduced, either the PCR can be repeated or if necessary, the sample can be re-extracted. Fortunately, with good laboratory practices, these are rare events. Finally, while this protocol is written to highlight caveats in the amplification of low biomass samples and specifically human milk, the protocol can easily be modified for the amplification of oral, rectal, vaginal, and skin swabs or sponges as well as stool. If other sample types are chosen, then consideration is given to which extraction kits are optimal for the specific sample type.

                Batch effects due to kits, reagents, or sequencing runs are important sources of variability in microbiome studies. DNA extraction kits, along with other reagents, possess low levels of bacterial DNA, which may vary substantially by lot 20 , 22 , 23 , 24 . For a large project, using a single lot of kits, reagents, selecting kits designed to minimize kit contamination may simplify analysis 7 . Samples of both subjects and controls are processed side by side. It is best if all the samples for a single study, both subject and control, can be incorporated into a single sequencing run. If a large number of samples are to be processed in batches, samples that are representative of both subjects and controls are included in each batch and processed together. It is also important to organize batch processing to minimize contamination of low-biomass samples (adică, human milk) by samples that are high biomass (adică, stool). In such cases, process low biomass sample types first, and then high biomass samples for the same study.

                Low biomass samples pose unique challenges to microbiome studies, as contamination from the environment, reagents, instruments, and the researcher can make it difficult to distinguish between authentic community members present in low abundance 7 , 25 , 26 and those that are artificially introduced to the sample through the experimental process 19 . The workflow described here incorporates important experimental negative controls at both the sample preparation step (buffer-only lysis control), and the PCR step (PCR water control) (see Figure 4). These controls help identify contamination sources and facilitate effective corrective measures at the bench or in Silicon 27 , 28 , 29 , 30 . Negative controls are carefully evaluated and reported with the study results 7 .

                To minimize contamination, spatial segregation of experimental activities into a clean pre-PCR amplification area and post-amplification area is important. Optimally, the clean room has both an area for PCR master mix preparation and a sample preparation/addition of master mix area, and may incorporate a separate dead air box or a biological safety cabinet housing dedicated consumables and small equipment needed for the master mix preparation. The clean room design incorporates a positive airflow system with high efficiency particulate air (HEPA) filtration. Use of personal protective equipment is essential to maintaining a controlled, low-microbial environment, and includes hairnets, lab coats, gloves, and shoe covers. Kits/reagents and samples are ideally stored in separate dedicated refrigerators/freezers. PCR setup is also carried out in the clean room in designated workstations clear separation of primer stocks and reagents from extracted DNA is maintained until samples are loaded on the automated pipetting platform. Once a PCR setup is complete, the plate is transferred to the post-amplification area and loaded onto a thermal cycler.

                It is important to restrict the flow of work activity from clean areas to post-amplification areas there is no retrograde movement of reagents, instruments, or supplies from post-amplification areas to the clean area. Personnel that have entered any of the post-amplification areas are barred from entry to the clean area for 24 hours (until the next day). In addition to the above workflow considerations, cleaning protocols must be implemented in both clean and post-amplification areas to minimize nucleic acid contamination of work surfaces and instrumentation. If physical barriers or separate rooms are not possible, all efforts must be taken to set up the work in areas as far apart as possible.

                In addition to contamination, microbiome studies are challenged by sensitivity, variability, and reproducibility 31 . This protocol addresses these issues by incorporating a defined bacterial mock community that is extracted, amplified, and sequenced along with each batch of samples (see Figura 4b). This control provides a constant internal reference that evaluates the reproducibility of the experimental results generated, and can be used to troubleshoot problems that arise. For example, the quality of the extracted mock DNA can provide a metric for effective sample lysis and DNA extraction, which genomic DNA controls miss. Quality control of PCR amplicons for the mock sample can also indicate PCR efficiency and specificity. Furthermore, because the mock comprises multiple bacteria types, the relative sensitivity for a processed batch of samples can be inferred by the representation of taxa in the sequencing results for the mock sample. An ideal mock community will evaluate the ability to detect key bacterial species in the compartment being analyzed, and therefore the composition of the mock community may need to vary by study. Așa cum se arată în Figura 4a, there is considerable variability among sample sequencing results, but the sequence results for the bacterial mock community is highly reproducible (see Figura 4b).

                While the mock community in Figure 4 is a unique mixture of 33 strains from a combination of commercially available and local clinical isolates, a commercially available mock community has recently been developed 32 .

                Although the workflow described here is limited in its ability to broadly address reproducibility across different microbiome studies, it does provide an important experimental approach that allows researchers to incorporate appropriate experimental controls and monitor reproducibility within their own results.


                MiSeq Applications & Methods

                Get a detailed genome view of the smallest organisms. Small genome sequencing provides comprehensive analysis of microbial or viral genomes for public health, epidemiology, and disease studies. Sequence up to 24 small genomes per MiSeq run.

                See how other researchers are using small genome sequencing on the MiSeq System for microbial genomics studies:

                Library Prep
                Nextera XT Library Prep Kit

                Prepare sequencing libraries for small genomes, PCR amplicons, and plasmids in less than 90 min, with a low DNA input requirement.

                Illumina DNA Prep

                A fast, integrated workflow for a wide range of applications, from human whole-genome sequencing to amplicons, plasmids, and microbial species.

                Sequence
                MiSeq Reagent Kit v3 600 cycles

                Optimized chemistry to increase cluster density and read length, and improve sequencing quality scores, compared to earlier kit versions.

                Analyze
                SPAdes Genome Assembler

                Open source tool for de novo sequencing, designed to assemble small genomes from MDA single-cell and standard bacterial data sets.

                Browse sample data in Basespace Sequence Hub (login required):
                MiSeq Small Genome Data

                Estimated Cost Per Sample: $98*

                *Small whole-genome sequencing on the MiSeq System estimated cost per sample calculated 2016, based on 5 Mb genome, 50-100X coverage, 2 x 300 bp read length, Nextera XT Library Prep Kit, MiSeq Reagent v3 600-cycle kit

                Targeted resequencing focuses time, expenses, and analysis on sequencing only a subset of genes or genome regions of research interest. Amplicon sequencing, the ultra-deep sequencing of PCR amplicons, enables cost-effective analysis of up to hundreds of target genomic regions in one assay. Sequence up to 96 samples and 1536 amplicons or more in a single MiSeq run.

                Assay Design & Library Prep
                AmpliSeq for Illumina Sequencing Solution

                A highly multiplexed polymerase chain reaction (PCR)-based workflow for use with targets ranging from a few to hundreds of genes in a single run.

                DesignStudio Software
                Sequence
                MiSeq Reagent Kit v2 (300 cycles)

                MiSeq sequencing reagents in pre-filled, ready-to-use cartridges. Micro and nano formats are available for low output applications.

                Analiza datelor
                Local Run Manager

                An on-premises software solution for creating sequencing runs, monitoring run status, and analyzing data.

                BaseSpace Sequence Hub

                The Illumina genomics cloud computing environment for NGS data analysis and management.

                BaseSpace Variant Interpreter

                Enables researchers to rapidly identify biologically significant variants from human genomic data.

                Sequencing the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene is a culture-free method to identify and compare bacteria from complex microbiomes or environments that are difficult to study. Our demonstrated protocol for 16S rRNA sequencing can help take the guess work out of your experiments. Multiplexing lets you sequence up to 96 samples per MiSeq run.

                See how other researchers are using the MiSeq System to power their metagenomics studies:

                Library Prep
                Nextera XT Index Kit v2

                Nextera XT index kits allow for up to 384 uniquely indexed samples to be pooled and sequenced on a single sequencing run.

                Sequence
                MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycles)

                Optimized chemistry to increase cluster density and read length, and improve sequencing quality scores, compared to earlier kit versions.

                Analyze
                16S Metagenomics BaseSpace App

                Performs taxonomic classification of 16S rRNA targeted amplicon reads using an Illumina-curated version of the GreenGenes taxonomic database.

                Estimated Cost Per Sample: $18*

                *16S rRNA sequencing on the MiSeq System estimated cost per sample calculated 2016, based on 96 samples, 2 x 300 bp read length, Nextera XT index primers, MiSeq Reagent v3 600-cycle kit

                NGS is Fueling Species Research in Australia

                High-throughput sequencing is paving the way to support agriculture, aquaculture, biodiversity, and conservation studies at the Deakin Genomics Center

                More Applications and Methods

                Gene Expression Analysis with Targeted RNA-Seq

                Targeted RNA sequencing (RNA-Seq) focuses on specific transcripts of interest, used to analyze gene expression and identify fusion genes.

                Application Note
                Researcher Interviews
                Targeted Gene Panels

                Targeted gene sequencing panels contain defined probe sets focused on specific genes of interest. Both predesigned and custom panels are available.

                Researcher Interviews
                De Novo Secvențierea

                De novo sequencing with next-generation sequencing (NGS) enables fast, accurate characterization of species without a reference genome.

                Application Note
                MiRNA & Small RNA Analysis

                Isolate and sequence small RNA species, such as microRNA, to study the role of noncoding RNA in gene silencing and posttranscriptional regulation.

                Genotyping by Sequencing

                Genotyping by sequencing provides a low-cost genetic screening method to discover novel plant and animal SNPs and perform genotyping studies.

                Application Note
                DNA-Protein Interaction Analysis with ChIP-Seq

                Combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays with sequencing, ChIP-Seq is a powerful method for genome-wide surveys of gene regulation.

                Researcher Interview
                Quality Control

                Perform quality control (QC) applications for bioproduction studies, or assess the quality of a sequencing library before committing it to a full-scale run.

                Researcher Interview
                Environmental DNA Sequencing

                Environmental DNA (eDNA) sequencing is a rapidly emerging method for studying biodiversity and monitoring ecosystem changes.

                Researcher Interview

                Methods Guide

                Access the information you need—from BeadChip arrays to library preparation for genome, transcriptome, or epigenome studies to sequencer selection, analysis, and support—all in one place. Select the best tools for your lab with our comprehensive guide designed specifically for research applications.

                Related Solutions

                Genomică microbiană

                Next-generation sequencing (NGS) is changing microbial genomics. Use NGS to discover novel microbes, monitor outbreaks, analyze food sources, and more.

                For Research Use Only

                Not for use in diagnostic procedures except as specifically noted.

                Innovative technologies

                At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.


                Re-Analysis of 16S rRNA Gene Sequence Data Sets Uncovers Disparate Laboratory-Specific Microbiomes Associated with the Yellow Fever Mosquito (Aedes aegypti)

                Host-microbiome dynamics occurring in the yellow fever mosquito (Aedes aegypti) contribute to host life history traits, and particular bacterial taxa are proposed to comprise a “core” microbiota that influences host physiology. Laboratory-based studies are frequently performed to investigate these processes however, experimental results are often presumed to be generalizable across laboratories, and few efforts have been made to independently reproduce and replicate significant findings. A recent study by Muturi et al. (FEMS Microbiol Ecol 95 (1):213, 2019) demonstrated the food source imbibed by laboratory-reared adult female mosquitoes significantly impacted the host-associated microbiota—a foundational finding in the field of mosquito biology worthy of independent evaluation. Here, we coalesce these data with two additional mosquito-derived 16S rRNA gene sequence data sets using a unifying bioinformatics pipeline to reproduce the characterization of these microbiota, test for a significant food source effect when independent samples were added to the analyses, assess whether similarly fed mosquito microbiomes were comparable across laboratories, and identify conserved bacterial taxa. Our pipeline characterized similar microbiome composition and structure from the data published previously, and a significant food source effect was detected with the addition of independent samples, increasing the robustness of this previously discovered component of mosquito biology. However, distinct microbial communities were identified from similarly fed but independently reared mosquitoes, and surveys across all samples did not identify conserved bacterial taxa. These findings demonstrated that while the main effect of the food source was supported, laboratory-specific conditions may produce inherently differential microbiomes across independent laboratory environments.

                Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


                National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship (LC, APP1130084 JP, APP1107599) National Health and Medical Research Council (JP, APP1143163 LC, APP1149029) Practitioner Fellowship (AWH) Senior Research Fellowship (AP), 1154389 Australian Research Council Future Fellowship (AP, FT140100047) Australian Research Council Discovery Project (JP, DP180101405) Stem Cells Australia – the Australian Research Council Special Research Initiative in Stem Cell Science (JP, AWH, AP, NP) Australian Research Council Development Early Career Researcher (QN, DE190100116)

                Affiliations

                Genome Innovation Hub, The University of Queensland, 306 Carmody Road, St Lucia, Brisbane, QLD 4072, Australia

                Jun Xu, Stacey Andersen, Nathan J. Palpant, Grant W. Montgomery & Lachlan J.M Coin

                Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland, 306 Carmody Road, St Lucia, Brisbane, QLD 4072, Australia

                Caitlin Falconer, Quan Nguyen, Joanna Crawford, Brett D. McKinnon, Sally Mortlock, Stacey Andersen, Han Sheng Chiu, Longda Jiang, Nathan J. Palpant, Jian Yang, Grant W. Montgomery & Lachlan J.M Coin

                UNSW Cellular Genomics Futures Institute, School of Medical Sciences, University of New South Wales, Sydney, NSW 2052, Australia

                Garvan-Weizmann Centre for Cellular Genomics, Garvan Institute, 384 Victoria St, Darlinghurst, Sydney, NSW 2010, Australia

                Anne Senabouth & Joseph E. Powell

                Department of Obstetrics and Gynaecology, Berne University Hospital, Bern, 3012, Switzerland

                Brett D. McKinnon & Michael D. Mueller

                Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, Parkville, 3010, Australia

                Department of Surgery, The University of Melbourne, Parkville, 3010, Australia

                Alex W. Hewitt & Alice Pébay

                Centre for Eye Research Australia, Royal Victorian Eye and Ear Hospital, East Melbourne, 3002, Australia

                Alex W. Hewitt & Alice Pébay

                School of Medicine, Menzies Institute for Medical Research, University of Tasmania, Hobart, 7005, Australia

                Institute for Advanced Research, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027, Zhejiang, China

                Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne, Parkville, 3010, Australia

                Department of Clinical Pathology, The University of Melbourne, Parkville, 3010, Australia

                Department of Infectious Disease, Imperial College London, London, W2 1NY, UK

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

                Contributions

                Authors’ contributions

                LC and CF initiated the project. LC and JX designed the algorithms. JX implemented the tools in Python and tested it on multiple datasets. MDM generated the endometrial stromal samples. AP and AH generated the fibroblast samples. QN, SM and AS preprocessed the sample datasets. JY and LJ provided the sibling data for simulation and helped in analysis. JP, QN, GWM, BM, SM, JC, and SA participated in important discussions and provided useful suggestions on multiple issues. JX drafted the manuscript, LC, JP, GWM, JY, QN, and JC reviewed and revised the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

                Authors’ information

                Jun Xu: Twitter(@xujun_jon) Lachlan J.M Coin: Twitter(@lachlancoin)

                Autorul corespunzator


                Materiale și metode

                Sample preparation and sequencing

                Sample collection and DNA isolation were performed as described in Costello și colab. [6] and PCR, sequencing, and quality filtering of reads were performed as described in Caporaso și colab. [14]. Samples were not collected on days 422 through 437.

                To facilitate massively parallel sequencing (1,967 samples), barcodes were reused across six lanes in a single Illumina GAIIx, with 374, 372, 364, 271, 265, and 323 samples in lanes 1 through 6, respectively (differing from Caporaso și colab. [14], where samples were pooled and run over seven lanes). Sixteen samples were ultimately excluded from the analysis as fourteen samples were identified as potentially mislabeled (discussed below), and the barcodes for two samples were not found in the sequencing output, likely indicating a problem with amplification for those two samples.

                Analiza datelor

                To directly compare these M3/F4 time series samples with the samples presented in Costello și colab. [6], which sequenced a different variable region (V2) using a different technology (454 FLX), a reference-based OTU picking protocol [18] was applied. After demultiplexing and quality filtering sequences, 97% OTUs were picked against the Greengenes database [19] (pre-filtered at 97% identity) using uclust [20]. Reads were assigned to OTUs based on their best match to a Greengenes sequence, and reads that did not match a Greengenes sequence at 97% or greater sequence identity were discarded. The Greengenes taxonomy associated with the best match in Greengenes was assigned to each OTU, and the Greengenes tree was used for phylogenetic diversity calculations. These steps and subsequent data analysis were performed using Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) on AWS.

                Identifying mislabeled samples

                To identify potentially mislabeled samples, we used the random forests classifier [21]. A 2,000-tree forest was trained on the OTU × Sample Abundance matrix after evenly sampling to 500 sequences per sample and removing OTUs present in less than 1% of samples. The posterior probability that a given sample came from each of the body habitats (gut, oral cavity, skin) was estimated using only those trees in the forest that did not contain that sample in their training sets, to avoid overfitting. The classifier considers samples to be mislabeled when their alleged environment labels have a low posterior probability (<60%). Fourteen such samples were identified, and these samples were removed from all analyses.

                Core microbiome calculation

                The temporal core microbiome across body sites and individuals (Figure 2) was computed by varying the minimum number of samples in which an OTU must be observed to be considered part of the core microbiome, and then determining the number and fraction of total OTUs observed in each site (or combination of sites) that are part of the core. To facilitate direct comparison across sample types that contained different numbers of observations (for example, M3 (all) versus M3 gut), we randomly subsampled to exactly 130 observations per sample type, corresponding to the sample type for which we had the fewest observations.

                Community membership calculations

                The number of consecutive timepoints containing an OTU (Figure 3) was calculated as the maximum number of consecutive timepoints where an OTU was observed, allowing a zero count at a single timepoint to be considered part of a continuous stretch of non-zero counts if both adjacent timepoints had a non-zero count. This controls for sampling error as, for example, a long contiguous stretch of non-zero counts for an OTU interrupted by a single zero count for that OTU would likely indicate a bad sample, rather than a biologically relevant fact about that OTU in relation to the community. Persistent taxa were defined as those observed in 20% or more of the timepoints, but with at least 90% of those observations being consecutive (that is, they appear and remain present). Transient taxa were defined as those observed in at least 60% of the samples, but with at most 75% of those observations being consecutive (that is, they appear and disappear from the community frequently).

                Animated microbial community dynamics

                Animations were created in inVUE [22] based on the principal coordinate data presented in Figure 1a, b. inVUE files can be created in QIIME from the principal coordinate matrix and associated metadata file. After installing and opening inVUE, the user can run, pause, and stop the animations associated with different metadata categories.

                Disponibilitatea datelor

                All sequence data and sample metadata are publicly available under the 'Moving Pictures of the Human Microbiome' project [MG-RAST:4457768.3-4459735.3].


                Priveste filmarea: Exista Exercitii pentru Cresterea in Inaltime? (Decembrie 2021).