Informație

Extracția ADN pentru testul LAMP


Încerc să setez un test LAMP (amplificare izotermă mediată prin buclă) pentru detectarea E.coli.

Mi s-a spus că EDTA poate chela Mg în reacția mea și astfel poate împiedica testul să funcționeze (în mod similar cu PCR). Prin urmare, ezit să folosesc tamponul TE. Pot să-mi pregătesc amestecul de grund și să extrag ADN (folosind metoda de fierbere) în apă fără ADNază?

va afecta asta calitatea ADN-ului și a primerilor mei în timpul depozitării?

Mulțumesc mult!

Alex


Deși aceasta este o problemă teoretică, de fapt nu este una. Să facem calculul în jurul său. EDTA complexează cantități echimolare de cationi bivalenți (de exemplu, magneziu), deci EDTA 1mM va complexa ionii de magneziu 1mM. Să presupunem că reacția PCR conține magneziu 2mM.

O reacție tipică de PCR pe care o fac are un volum total de 25ul și conține șablon de ADN 1ul în tampon TE (10mM Tris, 1mM EDTA). Reacția finală conține EDTA 1/25 mM (sau 0,04 mM sau 40 nM) care poate complexa magneziu 0,04 mM. Deci, în loc să rulați reacția cu 2mM Magneziu, o faceți cu 1,96mM, ceea ce nu va fi vizibil.

În plus, alte erori la instalare (pipetele nu sunt calibrate cu precizie, nu introduc cantități mici în lichid etc.) adaugă cu ușurință până la 5-10% eroare în total, ceea ce are un impact mult mai mare în concentrația de magneziu a reacției decât EDTA . Dacă utilizați concentrații de șablon mult mai mari (ceea ce de obicei nu este necesar), atunci puteți corecta acest lucru, dar în mod normal acest lucru nu este necesar.


Formularea convențională Eiken LAMP are un exces de Mg2 +. 5 pl de TE cu EDTA la 1 mM intrând într-o reacție de 25 pl vor avea un impact minim. În orice caz, formularea LAMP poate fi ajustată în Mg2 + pentru a compensa, dar mă îndoiesc că acest lucru este chiar necesar. În plus, erorile se vor liza mai bine în metoda de fierbere cu EDTA prezent și va împiedica nucleazele.


Amplificare izotermă mediată prin buclă (LAMP)

LAMP se caracterizează prin utilizarea a 4 primeri diferiți special concepuți pentru a recunoaște 6 regiuni distincte ale genei țintă. Cele patru grunduri utilizate sunt după cum urmează:

  1. Primer interior interior (FIP)
  2. Forward Outer Primer (FOP): FOP (numit și F3 Primer)
  3. Grund interior invers (BIP)
  4. Grund exterior înapoi (BOP)

Când gena țintă (șablon ADN) și reactivii sunt incubați la o temperatură constantă între 60-65⁰C, continuă următoarele etape de reacție. Etape în amplificarea izotermă mediată prin buclă Pasul 1 Unul dintre amorsii LAMP poate fi recuplat la secvența complementară de ADN țintă dublu catenar, apoi inițiază sinteza ADN utilizând ADN polimeraza cu activitate de deplasare a catenelor, deplasând și eliberând un ADN monocatenar.

Cu metoda LAMP, spre deosebire de PCR, nu este nevoie de denaturarea termică a ADN-ului dublu catenar într-o singură catenă. Următorul mecanism de amplificare explică de la momentul în care FIP se refractează la un astfel de ADN șablon monocatenar eliberat.


Introducere

Mai multe fitoplasme fără legătură taxonomică din cel puțin 10 subgrupuri ribozomale cauzează boli galbene ale viței de vie (GY) cu simptome aproape identice (constabil și colab., 2003). Flavescence dorée (FD) este cea mai severă dintre GYs și este răspândită în prezent în multe regiuni viticole din Franța și Italia, cu focare în Slovenia, Portugalia și Serbia și câteva cazuri înregistrate în Spania, Elveția și Austria (EPPO, 2014 ). Agentul cauzal al FD este un fitoplasma (FDp), care, pe baza asemănărilor secvenței ADNr 16S, aparține subgrupurilor 16SrV C și D (Lee și colab., 2004). FDp este listat în Directiva Consiliului UE2000 / 29 privind organismele dăunătoare și în lista de carantină EPPO A2 a dăunătorilor și distrugerea stocurilor bolnave, a plantelor cu simptome și a plantelor înconjurătoare, precum și a controlului vectorului său Scaphoideus titanus, este obligatoriu. Prin urmare, este necesară urgent o metodă pentru detectarea rapidă a FDp pentru a accelera procesul de luare a deciziilor și pentru a limita răspândirea agentului patogen fie la plantele care se deplasează în comerț, fie pe teren.

Detectarea fitoplasmelor este dificilă din cauza distribuției lor inegale în gazdă și a titrului scăzut, care poate fi afectat de sezon. Cu toate acestea, s-a demonstrat recent că, înainte de apariția simptomelor în anumite țesuturi ale viței-de-vie, și anume nervurile frunzelor și florile, concentrația de FDp poate fi suficient de mare pentru detectarea sa folosind o tehnică adecvată (Prezelj și colab., 2012). Probleme suplimentare asociate cu detectarea FDp includ o procedură laborioasă de extracție a ADN-ului (Fig. 1). În prezent, cea mai precisă și mai fiabilă detectare a FDp se bazează pe diverse abordări moleculare. Metode bazate pe PCR, inclusiv PCR imbricate și multiplex care amplifică ADN-ul fitoplasmei ribozomale sau non-ribozomale (Daire și colab., 1997 Clair și colab., 2003), metode RFLP care utilizează diferite enzime de restricție pe acele produse PCR (Lee și colab., 1998 Angelini și colab., 2001 Marzachi și colab., 2001 Martini și colab., 2002) sau secvențierea, au fost dezvoltate pentru a distinge subgrupurile FDp. Mai recent, au fost dezvoltate teste cantitative în timp real pe bază de PCR (qPCR) pentru detectarea specifică FDp (Bianco și colab., 2004 Hren și colab., 2007 Mehle și colab., 2013a). Deși sensibilitatea și specificitatea acestor teste de diagnostic sunt suficient de ridicate atunci când sunt aplicate corect, procedurile consumă mult timp, necesită echipamente costisitoare de laborator și nu pot fi efectuate pe teren din cauza lipsei instrumentelor portabile convenabile.

Recent, o metodă de amplificare izotermă (LAMP) mediată prin buclă (Notomi și colab., 2000) a fost dezvoltat. Eludează sensibilitatea PCR în timp real la inhibitori (Francois și colab., 2011) prezente în extracte de plante (Boonham și colab., 2004) și natura sa izotermă îi oferă potențialul de a fi desfășurat pe teren (Tomlinson și colab., 2010b). Datorită vitezei, robusteții și simplității sale, utilizarea LAMP câștigă popularitate pentru diagnosticarea în medicina umană (Parida și colab., 2008) și, mai recent, în sănătatea plantelor, inclusiv detectarea fitoplasmei (Tomlinson și colab., 2010a Bekele și colab., 2011 Hodgetts și colab., 2011 ).

În această lucrare este raportat dezvoltarea unui protocol de detectare rapidă a FDp la viță de vie folosind LAMP, împreună cu o tehnică pentru omogenizarea materialelor vegetale la fața locului în locul extracției ADN-ului. Întreaga procedură a fost testată și validată în conformitate cu standardele EPPO și urmând liniile directoare MIQE (Bustin și colab., 2010 ).


Dezvoltarea și evaluarea unui test de amplificare izotermă mediată prin buclă pentru detectarea rapidă și identificarea Pectobacterium carotovorum pe Țelină în câmp

Pectobacterium carotovorum este agentul cauzal al putregaiului moale bacterian într-o gamă largă de specii gazdă de legume. O singura data P. carotovorum infectează planta, răspândirea bolii este dificil de controlat. În acest studiu, a fost dezvoltată o metodă rapidă și sensibilă bazată pe amplificare izotermă mediată prin buclă (LAMP) pentru detectarea P. carotovorum în țelină cu putregai moale folosind un set de grund conceput din pmrA secvență conservată de P. carotovorum. Specificitatea setului de grund LAMP pentru P. carotovorum a fost larg validat pe ambele P. carotovorum tulpini și tulpini nevizate. Sensibilitatea a fost de 1 pg de P. carotovorum ADN genomic, care a demonstrat de 10 ori mai sensibil decât testul PCR convențional. LAMP a fost, de asemenea, utilizat pentru a detecta P. carotovorum în suspensie bacteriană. Cea mai mică concentrație de detectare a fost 10 4 CFU · mL −1. În plus, o analiză LAMP, împreună cu o metodă de extracție a ADN brut, a fost efectuată cu succes P. carotovorum-probe infectate derivate atât din plante infectate artificial, cât și natural. Pe scurt, testul LAMP stabilit în acest studiu constituie o metodă simplă, sensibilă și rapidă pentru detectarea P. carotovorum, și are o potențială aplicare în combaterea bolii putregaiului moale de țelină prin detectarea precoce.


Amplificare izotermă mediată prin buclă

Amplificarea izotermă mediată prin buclă (LAMP) utilizează 4-6 primeri recunoscând 6-8 regiuni distincte ale ADN-ului țintă pentru o reacție de amplificare foarte specifică. O ADN polimerază care deplasează catenele inițiază sinteza și 2 primeruri special concepute formează structuri & ldquoloop & rdquo pentru a facilita rundele ulterioare de amplificare prin extensie pe bucle și recoacere suplimentară a primerilor. Produsele ADN sunt foarte lungi (& gt20 kb) și sunt formate din numeroase repetări ale secvenței țintă scurte (80 & ndash250 bp), conectate cu regiuni de buclă monocatenare în concatameri lungi. Aceste produse nu sunt de obicei adecvate pentru manipulare în aval, dar amplificarea țintei este atât de extinsă încât sunt posibile numeroase moduri de detectare. Detectarea fluorescenței în timp real folosind intercalatoare sau sonde, fluxul lateral și detectarea gelului de agaroză sunt toate direct compatibile cu reacțiile LAMP. Instrumentarea pentru LAMP necesită de obicei încălzirea constantă la temperatura de reacție dorită și, acolo unde este necesar, fluorescența în timp real pentru măsurători cantitative. Setări optimizate pentru efectuarea experimentelor LAMP pe instrumente izoterme pot fi găsite aici.

Temperatura de reacție Amplicon Size Metoda (metodele) de detectare
65 ° C & lt250 nt Vizual, Flux lateral, Gel, Turbiditate

Amplificarea izotermă mediată prin buclă (LAMP) utilizează 4-6 primeri recunoscând 6-8 regiuni distincte ale ADN-ului țintă. O ADN polimerază care deplasează catenele inițiază sinteza și 2 dintre primerii formează structuri de buclă pentru a facilita rundele ulterioare de amplificare.

În plus față de metodele de detecție mai tradiționale sau complexe, LAMP este atât de prolific încât produsele și produsele secundare ale acestor reacții pot fi vizualizate și prin ochi. De exemplu, pirofosfatul de magneziu produs în timpul reacției poate fi observat ca un precipitat alb sau se pot utiliza indicatori adăugați, cum ar fi calceina sau albastru de hidroxinaftol pentru a semnaliza o reacție pozitivă. Alternativ, folosirea 2X Colorimetric LAMP Master Mix dezvoltată de NEB permite o schimbare puternică a culorii de la roz la galben pe baza unei modificări a pH-ului în timpul reacției. O versiune actualizată a acestui produs a fost formulată cu dUTP și UDG pentru a fi compatibilă cu prevenirea reportului între runde de amplificare și ndash WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix cu UDG. Tehnologia de detectare colorimetrică este o componentă cheie a setului SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP, care poate fi utilizat în analiza SARS-CoV-2, noul coronavirus care cauzează COVID-19.

Proiectarea grundurilor LAMP poate fi o provocare, dar instrumentele software facilitează foarte mult acest proces. Vă sugerăm să utilizați NEB LAMP Primer Design Tool pentru a proiecta grunduri LAMP. După introducerea unei secvențe de ADN sau ARN de interes, instrumentul LAMP Primer Design va identifica regiunile țintă adecvate și va crea primii F3 / B3 externi și primarii interni FIP / BIP într-o singură etapă. Grundele LoopF ​​/ LoopB, care accelerează reacția LAMP, sunt create într-un al doilea pas și sunt recomandate cu tărie pentru cele mai bune performanțe.

LAMP este foarte potrivit pentru diagnosticarea punctului de îngrijire și pe teren, iar testele LAMP au fost concepute pentru detectarea unei game largi de ținte de ARN și ADN din toate tipurile de probe. Exemplele includ teste pentru:

Reacția LAMP este robustă și tolerantă la inhibitori, permițând prepararea probelor brute și purificarea minimă a acidului nucleic, dacă se dorește. WarmStart & reg RTx și Bst 2.0 WarmStart au fost dezvoltate pentru performanțe optime în LAMP / RT-LAMP și sunt combinate în LAMP Master Mixes convenabile pentru a simplifica designul testului.


Abstract

Giardia duodenalis este unul dintre cei mai comuni paraziți intestinali alimentari și pe bază de apă ai oamenilor și animalelor din întreaga lume. Produsele proaspete, gata de consum, cum ar fi verdeață cu frunze și amestecuri de salată, sunt considerate vehicule potențiale de transmisie pentru Giardia infecție la om. Prin urmare, o metodă specifică, sensibilă și fiabilă pentru Giardia este necesară detectarea la verdeață cu frunze. Am optimizat procedurile de spălare pentru recuperarea Giardia chisturi din frunze verzi și adaptat și validat un test EF1α LAMP existent pentru detectarea Giardia ADN pentru a sprijini supravegherea diagnosticului de rutină și investigațiile focarului de boală. Patru tipuri cu frunze verzi (35 ± 1 g) au fost înțepenite cu 100 Giardia chisturi și am comparat spălarea prin agitare cu 1 M glicină (n = 20) sau 0,1% Alconox (n = 20). ADN-ul a fost extras din spălări, testat prin analiza LAMP și a curbei topite și s-au comparat valorile timp-pozitiv (TTP). Limita de detecție a fost determinată prin creșterea 10 (n = 40) Giardia chisturi pe aceleași tipuri de frunze verzi și procesare ca mai sus cu 0,1% Alconox. Robustețea metodei a fost evaluată prin supunerea amestecului de primăvară (n = 45 total) până la îmbătrânire (1, 3 sau 7 zile) și se spală la condiții de îmbătrânire și îngheț înainte de testare. Repetabilitatea și specificitatea testului au fost evaluate și un control pozitiv artificial (APC) diferențiat prin temperatura topirii (Tm) de ADN-ul Giardia spiked pe frunze verzi a fost conceput pentru a exclude contaminarea încrucișată de la control. Giardia ratele de detectare au fost mai mari și TTP a fost mai mică (P & lt 0,05) pentru 0,1% Alconox (19/20, 8,85 ± 0,3 min) comparativ cu 1 M glicină (15/20, 14,53 ± 7,2 min). Testul LAMP a detectat 10 Giardia chisturi cu vârfuri pe frunze verzi în 13–34 minute în 14/40 de probe testate. Evaluarea solidității a arătat că TTP a fost mai mare (P & lt 0.0001) când produsele cu țepi au fost depozitate timp de 7 zile (13,09 ± 1,14 min) comparativ cu cele proaspete (9,72 ± 0,43 min). Nici o probă neaplicată nu a fost pozitivă de LAMP, iar Tm pentru ADN de Giardia spiked pe verdeață cu frunze a fost mai mare (P & lt 0.0001, 87,43 ± 0,05 ° C) decât APC (86,43 ± 0,12 ° C). Coeficientul de variație (CV) de repetabilitate a testului în cadrul testului pentru TTP a fost de 5,4% și nu a apărut nici o contaminare încrucișată atunci când probele cu vârfuri și cu unghiuri au fost prelucrate în ordine alternativă. Procedura optimizată de prelucrare a probelor combinată cu testul EF1α LAMP este o metodă sensibilă, specifică, care economisește forță de muncă și rapidă pentru detectarea Giardia chisturi în frunze verzi.


2.3 Pregătirea nanoprobelor active Raman

Nanoprobele constau din nanoparticule de aur funcționalizate cu oligonucleotide marcate cu colorant Raman și au fost sintetizate prin etapele următoare. Nanoparticulele de aur cu capac de citrat au fost preparate prin reducerea acidului cloroauric pe bază de citrat de sodiu (HAuCl4) soluție și apoi modificată cu oligonucleotide 5'-tiolate marcate intern cu cy5. Pe scurt, s-au adăugat oligonucleotide tiolate proaspăt reduse (50 & # 956M) la 1 ml soluție de nanoparticule de aur și amestecul a fost incubat la temperatura camerei timp de 12 ore. Soluția a fost apoi adusă la 0,1 M NaCI și lăsată să stea timp de 40 de ore, urmată de centrifugare la 12.000 și # 215g timp de 30 de minute pentru a separa nanoparticulele de aur de reactivii excesivi [35]. Nan-sonde izolate Au au fost în cele din urmă spălate de două ori cu tampon fosfat 100 mM (pH 7,4) și depozitate la 4 & # 176C. Nanoparticulele de aur pregătite și Au-nanoprobele au fost caracterizate utilizând spectroscopie UV-vis, microscopie electronică de transmisie și spectroscopie Raman.


Alte fișiere și linkuri

  • APA
  • Autor
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standard
  • RIS
  • Vancouver

Test de amplificare izotermă mediată prin buclă pentru detectarea rapidă a tulpinilor comune de Escherichia coli. / Hill, Joshua Beriwal, Shilpa Chandra, Ishwad Paul, Vinod K. Kapil, Aarti Singh, Tripti Wadowsky, Robert M. Singh, Vinita Goyal, Ankur Jahnukainen, Timo Johnson, James R. Tarr, Phillip I. Vats, Abhay.

Rezultatul cercetării: Contribuție la jurnal ›Articol› evaluare inter pares

T1 - Test de amplificare izotermă mediată prin buclă pentru detectarea rapidă a tulpinilor comune de Escherichia coli

N2 - Am dezvoltat un test LAMP extrem de sensibil și specific pentru Escherichia coli. Nu necesită extracția ADN-ului și poate detecta doar 10 exemplare. A detectat toate cele 36 din cele 36 de izolate de E. coli și toate cele 22 de probe de urină (din 89 de probe testate) care au avut E. coli. Acest test este rapid, cu un cost redus și simplu de realizat.

AB - Am dezvoltat un test LAMP extrem de sensibil și specific pentru Escherichia coli. Nu necesită extracția ADN-ului și poate detecta doar 10 exemplare. A detectat toate cele 36 din cele 36 de izolate de E. coli și toate cele 22 de probe de urină (din 89 de probe testate) care au avut E. coli. Acest test este rapid, cu un cost redus și simplu de realizat.


Metode

Reactivi și aparate

Anticorpul secundar IgG de capră anti-șoarece, streptavidina și izotiocianatul de fluoresceină (FITC) Anticorp monoclonal IgG1 utilizat pentru dezvoltarea imunotestului cu flux lateral al acidului nucleic sau denumit în mod obișnuit ca jeton lateral cu flux (LFD), au fost produse Pierce Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, SUA). Soluția de aur coloidal de 40 nm utilizată a fost de la Kestrel Bio Sciences (Thailanda), reactivul de blocare occidental (WBR) a fost de la Roche (Indianapolis, SUA) și albumina serică bovină (BSA) a fost achiziționată de la Amresco (Solon, SUA). Betaină, ulei mineral, azidă de sodiu (NaN3), alcool polivinilic (PVA), polivinilpirolidonă (PVP), Triton X-100, Tween-20, zaharoză și alte substanțe chimice obișnuite provin de la Sigma (St. Louis, SUA). Toate substanțele chimice și reactivii utilizați în acest studiu au fost preparați folosind apă ultrapură (& gt18MΩ) dintr-un sistem de purificare a apei Millipore Milli-Q (Billerica, SUA). Între timp, materialele utilizate pentru construcția LFD, inclusiv tampoane din fibră de celuloză, tampoane din fibră de sticlă și cardul cu membrană de nitroceluloză HF135, au fost, de asemenea, produse Millipore.

Toate oligonucleotidele marcate și nemarcate au fost sintetizate de Integrated DNA Technologies (Singapore). Recombinant Taq ADN polimeraza (Thermo Fisher, SUA) a fost utilizată ca enzimă polimerază pentru amplificarea convențională PCR și nPCR, iar aceste reacții au fost efectuate utilizând un termociclator cu gradient de nex Mastercycler (Eppendorf, Germania). Între timp, qPCR a fost efectuat folosind QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germania) și reacția a fost efectuată utilizând CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, California, SUA). Lampa Bst ADN polimeraza a fost achiziționată de la New England Biolabs (Massachusetts, SUA) și amplificarea a fost efectuată utilizând blocul de încălzire prin răcire Cole-Parmer (Illinois, SUA). Ampliconii convenționali PCR, nPCR și LAMP au fost analizați utilizând un sistem de electroforeză pe gel de agaroză (Owl Separation Systems, SUA) și vizualizați utilizând iluminatorul UV Alpha Innotech ChemiImager 5500 și unitatea de captare a imaginilor (California, SUA). LFD a fost căptușită cu anticorp secundar IgG de capră anti-șoarece și streptavidină manual și au fost tăiate în benzi folosind un tăietor de benzi programabil Matrix 2360 de la Kinematic Automation (Twain Harte, SUA). Colorantul calceină-mangan utilizat pentru analiza post-LAMP a fost preparat folosind combinația de indicator de calceină (Merck, SUA) și clorură de mangan (II) (MnCl2) (Merck, SUA).

Entamoeba specii și alte tulpini de microorganisme

Toate izolatele de microorganisme utilizate în acest studiu sunt enumerate în Tabelul 1. Aceste izolate provin de la Departamentul de Medicină Experimentală, Facultatea de Medicină, Universitatea Națională Autonomă a Mexicului, Mexic, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londra, Marea Britanie, Departamentul de Microbiologie și parazitologie medicală, Școala de Științe Medicale, Universiti Sains Malaezia, Malaezia și Institutul de Cercetări Medicale, Malaezia. E. histolytica HM-1: IMSS a fost utilizat ca control pozitiv în timp ce liofilizat E. dispar SAW760 și E. moshkovskii Laredo au fost utilizate ca martori negativi în acest studiu. ADN de E. histolytica a fost izolat de crescut axenic E. histolytica HM-1: IMSS în timp ce ADN de E. dispar a fost izolat de liofilizat E. dispar SAW760 folosind kitul de extracție a scaunului ADN Qiagen QIAamp (Germania). Ambele organisme au fost primite de la Departamentul de Medicină Experimentală, Facultatea de Medicină, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexic. Între timp, ADN-ul de E. moshkovskii Laredo a fost acordat de London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londra, Marea Britanie. ADN-ul altor microorganisme a fost izolat din cultura bacteriilor pure folosind kitul de extracție a ADN-ului pentru țesuturi NucleoSpin (MACHEREY-NAGEL GmbH & amp Co. KG, Germania). Acești ADN-uri au fost utilizate ca martori negativi pentru verificarea specificității primarilor convenționale PCR, nPCR, qPCR și LAMP.

Proiectarea grundelor

SREHP gena a fost selectată ca genă țintă pentru detectarea E. histolytica în prezentul studiu datorită specificității sale ridicate atât în ​​silico (căutare BLAST), cât și evaluării empirice (amplificare PCR și LAMP) comparativ cu alte E. histolytica gene. Toți grundii utilizați în acest studiu au fost proiectați pe baza regiunii conservate a raportat SREHP genă (acces GenBank nr. M80910.1, M34438.1, XM_643162.2, AB253474.1, AK420158.1, AK420282.1, AK420358.1, AK420741.1). Setul de grunduri utilizat pentru aplicarea LAMP a fost adoptat dintr-un studiu anterior realizat de Foo și colab. [21] și localizarea primerilor au fost prezentate în Fig. 1. Primerii Eh-F3-SER și Eh-B3-SER au fost folosiți ca primeri externi pentru prima rundă de amplificare nPCR care ar putea genera amplicon cu dimensiunea 223 bp. Între timp, perechea de primer utilizată pentru PCR convențională, a doua rundă de amplificare nPCR și qPCR au fost adaptate din regiunea F2 a Eh-FIP-SER ca primer direct și regiunea B2 a Eh-BIP-SER ca primer invers care ar putea genera amplicon cu dimensiunea 175 bp. Primerii utilizați pentru amplificarea LAMP care cuplați cu LFD, în special Eh-BIP-SER și Eh-LB-SER au fost supuși modificării utilizând marcarea haptenelor la capătul 5 'al secvenței oligonucleotidice. Fluoresceina a fost marcată la capătul 5 'al Eh-BIP-SER în timp ce Eh-LB-SER a fost marcată cu biotină. Toate secvențele de primeri utilizate în acest studiu au fost enumerate în Tabelul 2. Specificitatea acestor primeri a fost verificată empiric folosind ADN izolat din E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii Laredo și alți 75 de agenți patogeni, așa cum se arată în Tabelul 1, înainte de efectuarea comparării sensibilității analitice între teste.

Regiuni primare pe SREHP secvența genică (acces GenBank nr. M80910.1). Grundul Eh-FIP-SER este format cu F1C și Eh-F2 în timp ce grundul Eh-BIP-SER este format cu B1C și Eh-B2

Formularea testelor LAMP, PCR convenționale, nPCR și qPCR

Raportul grundului exterior la grundul interior a fost optimizat, iar concentrația grundurilor a fost optimă cu 2 μM din fiecare grund intern înainte (Eh-FIP-SER) și grundul intern înapoi (Eh-BIP-SER), 0,167 μM din fiecare primer exterior înainte (Eh-F3-SER) și grund exterior înapoi (Eh-B3-SER) și 0,333 μM de grund buclă înapoi (Eh-LB-SER). Concentrațiile componentelor LAMP, cum ar fi amestecul de dNTP, betaină, MgSO4 și Bst ADN polimeraza a fost optimizată și determinată empiric. Reacția a fost efectuată cu un volum final de 30 μL amestec de reacție conținând 1 × tampon izoterm de amplificare [20 mM de Tris-HCI (pH 8,8), 50 mM de KCl, 10 mM de (NH4)2ASA DE4, 2 mM de MgSO4, 0,1% din Tween 20] (New England Biolabs, Massachusetts, SUA), 0,6 mM amestec dNTP (Thermo Fisher Scientific, SUA), 0,8 M betaină (Sigma, Missouri, SUA), suplimentar 6 mM MgSO4 (New England Biolabs, Massachusetts, SUA), 16 U din Bst 2.0 ADN polimerază WarmStart (New England Biolabs, Massachusetts, SUA) și 2 μL de șablon ADN. Reacția a fost efectuată la 63 ° C timp de 60 min urmată de terminare la 80 ° C timp de 5 min. Produsul LAMP a fost supus electroforezei pe gel de agaroză, LFD și colorant calceină-mangan pentru analiza post-LAMP.

PCR convențional

Primerii Eh-F2 și Eh-B2 cu concentrația de 1 μM fiecare au fost folosiți pentru amplificarea convențională a PCR. Amplificarea a fost efectuată într-un volum final de 20 μL conținând 1 × tampon PCR, 2,5 mM de MgCl2 (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, SUA), 0,16 mM amestec de dNTP (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, SUA), 1 U de Taq ADN polimerază (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, SUA) și 2 μL de șablon ADN. Reacția PCR a fost efectuată cu denaturarea inițială la 95 ° C timp de 5 min, urmată de 35 de cicluri de 95 ° C timp de 30 s, 56 ° C timp de 30 s și 72 ° C timp de 30 s și o extensie finală la 72 ° C timp de 5 minute min. Produsul a fost supus electroforezei pe gel în gel de agaroză 2% colorat cu colorant GelStain (TransGen Biotech Co, Beijing), rulat electroforetic sub 100 V timp de 60 de minute, urmat de vizualizare cu ajutorul analizorului ChemiImage 5000.

Prima rundă de PCR a fost efectuată cu perechea de primer Eh-F3-SER și Eh-B3-SER cu concentrația de 1 μM fiecare. Amplificarea a fost efectuată într-un volum final de 20 μL conținând 1 × tampon PCR, 2,5 mM de MgCl2 (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, SUA), 0,16 mM amestec de dNTP (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, SUA), 1 U de Taq ADN polimerază (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, SUA) și 2 μL de șablon ADN. Reacția PCR a fost efectuată cu denaturarea inițială la 95 ° C timp de 5 min, urmată de 30 de cicluri de 95 ° C timp de 30 s, 60 ° C timp de 30 s și 72 ° C timp de 30 s și o extensie finală la 72 ° C timp de 5 minute min. Între timp, a doua rundă de PCR a fost efectuată cu perechea de primer Eh-F2 și Eh-B2 cu concentrația de 1 μM fiecare. Compoziția de reactiv utilizată a fost similară cu prima rundă PCR. Reacția a fost efectuată cu denaturarea inițială la 95 ° C timp de 5 min, urmată de 35 de cicluri de 95 ° C timp de 30 s, 56 ° C timp de 30 s și 72 ° C timp de 30 s și o extensie finală la 72 ° C timp de 5 minute min. Produsul a fost supus electroforezei pe gel în gel de agaroză 2% colorat cu colorant GelStain, rulat electroforetic sub 100 V timp de 60 de minute apoi vizualizat cu ajutorul analizorului ChemiImage 5000.

Similar cu PCR convențional și reacția a doua rundă a nPCR, reacția qPCR a fost efectuată cu perechea de primer Eh-F2 și Eh-B2 cu concentrația de 1 μM fiecare. Amplificarea a fost efectuată într-un volum final de 25 μL conținând 1 × QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix și 2 μL șablon ADN. Reacția a fost efectuată cu condiția de ciclare termică a denaturării inițiale la 95 ° C timp de 5 min, urmată de 40 de cicluri de 95 ° C timp de 20 s și 56 ° C timp de 30 s. Analiza curbei de topire a fost efectuată la o creștere lentă de la 65 ° C la 95 ° C cu o viteză de 0,5 ° C la 5 s. Pragul de referință pentru analiza post-amplificare a fost stabilit la 50 de unități relative de fluorescență (RFU) și orice valoare a ciclului de cuantificare (Cq) sub sau egal cu 38 este considerată pozitivă.

Pregătirea analizei post-LAMP

Construcția LFD

Nanoparticulele de aur (PNB) au fost utilizate ca generator de semnal pentru LFD în acest studiu. Bio-conjugarea GNP-urilor cu anticorp monoclonal FITC IgG1 și prepararea LFD a fost efectuată așa cum a fost descris de Foo și colab. [21] cu unele modificări. Banda LFD cu dimensiunea de 5 mm × 77 mm compusă cu tampon de aplicare tampon, tampon conjugat de aur, membrană de nitroceluloză și un tampon absorbant așa cum se arată în Fig. 2. LFD a fost fixat cu 1 μg anticorp secundar de capră anti-șoarece IgG ca cromatografie linia de control (CCL) și 2 μg streptavidină ca linie de testare (TL) urmată de blocarea suprafeței de nitroceluloză neacoperită cu tampon de blocare [amestec de 0,2% WBR, 0,05% triton X-100 și 2 mM tampon fosfat (PB)]. Tamponul conjugat de aur a fost realizat cu suspensie GNP conjugată funcționalizată [5 OD522 conjugat de aur suspendat în 2 mM PB conținând 20% (g / v) zaharoză, 0,01% (v / v) PVA și 0,01% (v / v) Tween-20] în format de reactiv uscat, așa cum este descris de Foo și colab. [21].

Diagrama schemei benzii jojei de curgere laterală

Prepararea colorantului calceină-mangan

Colorantul calceină-mangan a fost făcut din 500 μM calceină care s-a dizolvat în dimetil sulfoxid (Merck, SUA) și 10 mM MnCl2 care s-a dizolvat în apă fără nuclează. Doar 1 μL de colorant calceină-mangan este necesar pentru fiecare reacție.

Principiul LFD

LFD a fost formulat pentru a recunoaște în mod specific ampliconul său de ADN dublu catenar marcat prin legarea biotinei marcate pe capătul 5 'al ampliconilor la streptavidina de pe membrana nitrocelulozică a LFD. Linia de testare a necesitat amplificoni dublu catenari amplificați dublu etichetați ca punte de legătură pentru a genera semnal care reprezintă prezența / absența ADN-ului țintă. Ampliconii dublu catenari cu etichetă dublă (produs LAMP) pentru TL au fost etichetați cu FAM la capătul 5 ′ sintetizat prin grunduri interioare în timp ce un alt capăt 5 ′ care sintetizat prin grund buclă a fost marcat cu biotină Fig. 3. Streptavidină pe proteina formată TL- legarea ligandului cu biotină pe ampliconi dublați. Între timp, CCL fixat cu anticorp secundar IgG anti-șoarece de capră a format legătura de afinitate proteină-ligand cu anticorp monoclonal FITC IgG1 de șoarece care s-a conjugat pe nanoparticule de aur.

Ilustrația schematică a formării ampliconului marcat dublu (produs LAMP) funcționează ca analit pentru detectarea LFD

Figura 4 a ilustrat un principiu schematic al produsului LAMP captat de streptavidin pe placa de detectare a LFD. Streptavidina fixată pe regiunea de detectare a imobilizat ampliconii prin legarea proteină-ligand formată cu biotina marcată pe ampliconi. Ampliconii cu catenă dublă au fost formați din secvențele de grund interior LAMP și secvențele de grund de buclă. Prin urmare, celălalt capăt 5 'al ampliconului a fost prezentat cu FAM care s-a legat cu anticorp anti-șoarece de capră conjugat pe nanoparticule de aur. Prezența liniei roșii roz pe regiunea de detecție a arătat finalizarea sandvișului de hibridizare printre GNP-urile conjugate, produsul LAMP și streptavidina prin care s-a interpretat ca rezultat pozitiv.

Ilustrație schematică a principiului LFD. Ilustrația arată că produsul LAMP este imobilizat pe membrană de streptavidină, urmat de generarea semnalului de GNP conjugați care se leagă de fluoresceină

Analiza post-LAMP

Analiza post-LAMP a fost efectuată în 3 tehnici diferite și anume electroforeza pe gel de agaroză, LFD și colorant calceină-mangan. Produsul LAMP a fost supus electroforezei pe gel în gel de agaroză 2,5% colorat cu colorant GelStain, rulat electroforetic sub 100 V timp de 80 de minute urmat de vizualizare cu ajutorul analizorului ChemiImage 5000. Prezentul model de benzi asemănătoare scării pe gelul de agaroză a indicat o amplificare pozitivă.

Detectarea produsului LAMP utilizând LFD a fost similară cu un studiu anterior [21]. Produsul amplificat cu o cantitate de 4 μL a fost amestecat cu 16 μL de tampon de rulare [1 × PBS și 1% (v / v) Tween-20] și amestecul a fost scăpat pe regiunea de detectare. LFD a fost apoi plasat vertical urmat de scufundarea tamponului de aplicare a tamponului în 250 μL de tampon de rulare. Rezultatul ar putea fi vizualizat cu ochi fără ajutor în decurs de 10 până la 15 minute pe membrana nitrocelulozică LFD. Formarea liniei punctate roșii pe TL a indicat rezultatul pozitiv, în timp ce absența TL a indicat rezultatul negativ. CCL pe LFD a servit drept control procedural și operațional pentru fiecare analiză a produsului LAMP. Formarea liniei pe CCL a indicat eficacitatea generatorului de semnal, GNP-urile funcționalizate, în timp ce absența CCL a indicat rezultatul fals negativ.

Analiza produsului LAMP utilizând colorant calceină-mangan a fost realizată prin amestecarea a 1 μl de colorant calceină-mangan în 30 μL de amestec de reactivi LAMP înainte de amplificare. Cu ajutorul luminii UV, tubul care a devenit verde fluorescent a fost considerat pozitiv, în timp ce amplificarea negativă a rămas verde slab.

Specificitatea analitică a testelor

Specificitatea analitică a primerilor utilizați pentru aplicația LAMP, PCR convențională, nPCR și qPCR au fost determinate folosind ADN izolat din E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii Laredo și alți 75 de agenți patogeni enumerați în tabelul 1. Pentru a se asigura că specificitatea sa a fost investigată în mod cuprinzător, acest studiu a fost realizat separat pe LAMP, PCR convențional, nPCR și qPCR.

Evaluarea performanței testelor

Toate cele 4 teste de amplificare au fost optimizate în acest studiu. Performanța testelor a fost evaluată pe baza sensibilității lor analitice în termen de LoD utilizând diluat de 10 ori E. histolytica trofozoizi. The diluted trophozoites in a range of 10 6 to 10 − 4 trophozoites were spiked into 200 mg of stool samples and left for 1 h at ambient temperature prior to DNA isolation. Extracted DNAs from the spiked stool samples in a range of 10 6 to 10 − 3 trophozoites were used for PCR while LoD for LAMP amplification was determined using trophozoites range up to 10 − 4 . All the evaluation tests were performed in triplicate.


Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of sesame phyllody phytoplasmas in Vietnam

Phloem-limiting phytoplasmas are known to be causal agents of phyllody, which is recognized by the abnormal development of floral structures resulting in serious yield losses in sesame plants. Currently, identification of the various groups of phytoplasmas that cause sesame phyllody (SP) is conducted by nested PCR, RFLP, and multiplex real-time qPCR assays. However, these methods require intensive labor and are costly and time-consuming so can only be undertaken in well-equipped labs. Here, diagnostic loop-mediated isothermal amplification (LAMP)–based assays allowing rapid detection of specific groups of phytoplasmas within 30 min were developed based on detection of the 16S rRNA sequence of phytoplasmas. Universal 16S rRNA phytoplasma primers and seven primer sets of different 16Sr group phytoplasmas (16SrI, 16SrII, 16SrIII, 16SrIV, 16SrV, 16SrX, 16SrXI) and universal plant cytochrome oxidase (cox) gene primers were used to detect 16S rRNA group phytoplasma sequences and the cox gene in sesame plants. The LAMP assays were carried out using a real-time fluorometer with amplification plots and annealing curves visualized directly. Results demonstrated that the 16SrI and 16SrII group phytoplasmas were causal agents of sesame phyllody in Vietnam. LAMP-based assays for in-field detection of sesame phyllody-causing phytoplasmas revealed advantages and potential applicability in comparison with conventional approaches. To the best of our knowledge, this is the first assessment of multiple phytoplasma infection associated with sesame phyllody disease in Vietnam using LAMP-based assays.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Priveste filmarea: How to perform a LAMP test. COVID-19 (Ianuarie 2022).