Informație

Eficiența expresiei proteinelor pe bază de lizat celular eucariot


Care este eficiența medie a sistemelor de exprimare a proteinelor pe bază de lizat celular eucariot în termeni de (mg de proteină exprimată) / (mg de lizat)?


Eficiența expresiei proteinelor pe bază de lizat celular eucariot - Biologie

Produsele PCR pot fi utilizate pentru a produce proteine ​​rapid și ușor într-un sistem fără celule.

Progresele recente au extins spațiul de aplicare al acestor sisteme fără celule.

Deschiderea unor astfel de sisteme permite screeningul rapid și paralel al bibliotecilor de proteine.

Aplicațiile includ studii proteomice, producția de microarrays și screening rapid.

O metodă rapidă și versatilă de exprimare și screening a proteinelor poate facilita în mare măsură dezvoltarea viitoare a produselor biologice terapeutice, a țintelor proteomice și a biocatalizatorilor. Un candidat atrăgător este sinteza proteinelor fără celule (CFPS), pe bază de lizat celular in vitro sistem de expresie, care poate utiliza ADN liniar ca șabloane de expresie, ocolind etapele de clonare consumatoare de timp ale metodelor bazate pe plasmide. În mod tradițional, astfel de șabloane de expresie ADN liniară (LET) au fost vulnerabile la degradarea de către nucleaze prezente în lizatul celular, ducând la randamente mai mici. Această provocare a fost abordată în mod semnificativ în trecutul recent, propulsând CFPS bazat pe LET ca un instrument util pentru studierea, screeningul și ingineria proteinelor într-un mod cu randament ridicat. În prezent, CFPS bazat pe LET are promisiuni în domenii precum proteomica funcțională, microarraysul de proteine ​​și optimizarea sistemelor biologice complexe.


SCURT REZUMAT AL PREZENTĂRII

O strategie generală dezvăluită aici folosește organite într-o reacție pe bază de lizat fără celule pentru a asigura regenerarea energiei în sistemul de reacție. Această strategie este utilă în unele exemple pentru a realiza sinteza îmbunătățită in vitro a biopolimerilor (de exemplu, polinucleotide, polipeptide, polizaharide și carbohidrați complecși). În concretizări particulare, prezența mitocondriilor într-un sistem fără celule eucariote are ca rezultat un sistem de reacție îmbunătățit față de reacțiile discontinue convenționale și continue, de exemplu, prin reducerea sau eliminarea semnificativă a necesității adăugării de reactivi care furnizează energie (de exemplu, creatina fosfat și / sau creatin kinază) și / sau suplimentarea cu aminoacizi, prelungind în același timp durata reacției. În unele exemple, reacția de polimerizare fără celule dezvăluită este semnificativ mai eficientă decât reacțiile convenționale utilizate în prezent în domeniu.

Sunt descrise aici metode pentru sinteza unui biopolimer care cuprinde combinarea unui lizat celular cuprinzând un organet (de exemplu, plastide, cloroplaste și / sau mitocondrii), un șablon polimeric și unități monomerice ale polimerului într-un volum de reacție. În unele variante de realizare, volumul de reacție nu cuprinde sistemul de regenerare a energiei creatin fosfat / creatin kinază, de exemplu, astfel încât nu se adaugă fosfat sau fosfat minim la volumul de reacție. În concretizări particulare, organitul este o mitocondrie. În unele variante de realizare, lizatul celular este un lizat celular eucariot, de exemplu, un lizat dintr-o celulă de plante (de exemplu, tutun, porumb și soia). Un lizat celular în unele exemple este un lizat din celulele de tutun Bright Yellow-2 (BY-2). În unele variante de realizare, matrița de polimer este o moleculă de ADN sau o moleculă de ARN. Reacțiile care utilizează ARN ca șablon de polimer produc polipeptide ca biopolimer din aminoacizi monomerici printr-o reacție de traducere. Reacțiile care utilizează ADN ca șablon polimeric pot fi utilizate pentru a produce alte molecule de acid nucleic (de exemplu, ADN și ARN) ca biopolimer din nucleotide monomerice printr-o reacție de replicare sau transcripție in vitro sau pentru a produce polipeptide printr-o reacție de traducere care este cuplată la transcriere din șablon. În anumite variante de realizare, o metodă pentru sinteza fără energie a unui biopolimer poate cuprinde, de exemplu și fără limitare, adăugarea organului (organelor), matriței polimerice și / sau unităților monomerice la volumul de reacție și / sau izolarea biopolimerului din volumul de reacție. În unele exemple, volumul de reacție nu necesită suplimentarea cu aminoacizi pentru a susține expresia proteinelor, deoarece componentele lizatului sunt capabile să genereze aminoacizi folosind căi de biosinteză endogenă începând cu intermediari din ciclul TCA. Prin urmare, în unele astfel de exemple, aminoacizii prezenți în lizatul care cuprinde organele pot fi suficiente pentru a susține sinteza extinsă a polipeptidelor.

Sistemele de lizat celular dezvăluite pot fi completate doar cu o cantitate minimă de creatină fosfat exogen, o cantitate minimă de creatin kinază sau ambele, atât timp cât volumul de reacție cuprinde creatină fosfat exogen și / sau creatin kinază în cantități considerate nepotrivite pentru regenerarea energiei. sistem. De exemplu, un volum de reacție poate conține nu mai mult de 15 mM, nu mai mult de 10 mM, nu mai mult de 5 mM, nu mai mult de 1 mM, nu mai mult de 500 μM, nu mai mult de 100 μM, nu mai mult de 50 μM, sau nu mai mult de 10 μM creatina fosfat adăugat. Într-un alt exemplu, un volum de reacție poate conține nu mai mult de 100 μg / mL, nu mai mult de 50 μg / mL, nu mai mult de 10 μg / mL, nu mai mult de 5 μg / mL, nu mai mult de 1 μg / mL, decât S-a adăugat creatin kinază 0,5 μg / ml sau nu mai mult de 0,1 μg / ml. Aceste cantități nu sunt adecvate și, prin urmare, necesită includerea organelor celulare, cum ar fi plastidele, mitocondriile sau cloroplastele, în conformitate cu metodele și sistemele descrise aici, pentru a susține sinteza biopolimerilor (inclusiv pentru a susține sinteza biopolimerilor pentru perioadele prelungite descrise aici).

Unele variante includ sisteme pentru sinteza unui biopolimer fără a utiliza un sistem de regenerare artificială a energiei. În aceste variante, sistemul cuprinde un lizat celular apos, un organet celular (endogen sau heterolog), un șablon de polimer. În realizări particulare, sistemul include, de asemenea, unități monomerice ale polimerului. Sistemele convenționale fără celule pentru sinteza in vitro a biopolimerilor cuprind în plus fosfat de creatină și creatin kinază, care sunt utilizate pentru regenerarea energiei în sistem pe măsură ce reacția de sinteză are loc. În exemplele de realizare de aici, sistemul este în mod substanțial lipsit de fosfat de creatină, nu se adaugă sistem fosfat de creatină și creatin kinază. În anumite exemple, sistemul nu conține creatină fosfat sau creatin kinază. În concretizări particulare, un sistem pentru sinteza unui biopolimer poate cuprinde în plus, de exemplu și fără limitare, un tampon de pH, magneziu (de exemplu, Mg (C5H8NU4)2), potasiu (de exemplu, KC5H8NU4), nucleozide (de exemplu, nucleozide trifosfați, nucleozide difosfați și nucleozide monofosfați), enzime (de exemplu, ARN polimerază) și cloramfenicol. În realizări specifice, nu sunt adăugați alți aminoacizi în afară de sarea (sele) de glutamat la cei deja prezenți în sistem (adică aminoacizii prezenți în lizat și organit). În unele exemple, un sistem conform celor de mai sus poate prezenta o activitate prelungită mai mare de 20 de ore (de exemplu, aproximativ 40 de ore) și poate produce semnificativ mai mult (de exemplu, cu aproximativ 60% mai mult) proteină țintă decât un sistem convențional altfel identic care cuprinde s-au adăugat creatin fosfat și creatin kinază.

Unele variante includ un kit pentru sinteza unui biopolimer fără a utiliza un sistem de regenerare a energiei artificiale. În unele variante, un kit cuprinde componente ale unui sistem pentru sinteza unui biopolimer fără utilizarea unui sistem de regenerare artificială a energiei și instrucțiuni scrise pentru direcționarea utilizării kitului. De exemplu și fără limitare, un kit poate cuprinde unul sau mai multe dintre: un lizat celular apos, un organet celular (endogen sau heterolog), un șablon de polimer și unități monomerice ale polimerului, dispuse într-unul sau mai multe volume separate, împreună cu instrucțiuni care specifică amestecul componentelor kitului și a oricăror componente exogene fără creatină fosfat și creatin kinază. Cu titlu de exemplu suplimentar, un kit poate cuprinde în continuare unul sau mai multe dintre un tampon de pH, magneziu, potasiu, nucleozide, enzime (de exemplu, ARN polimerază) și cloramfenicol. Un kit pentru sinteza unui biopolimer conform unor variante specifice poate cuprinde un lizat celular apos (de exemplu, care cuprinde cloroplaste și / sau mitocondrii), unități monomerice ale unui polimer (de exemplu, nucleozide) și instrucțiuni scrise. În astfel de realizări specifice, instrucțiunile scrise pot îndruma un utilizator să combine aceste componente cu un șablon de polimer de interes (de exemplu, o moleculă de ADN care codifică o polipeptidă) și orice alți reactivi, fără a adăuga fosfat de creatină (cu creatin kinază pentru regenerarea energiei) la combinatia.

Realizările de aici încorporează mitocondrii active pentru regenerarea energiei într-o reacție de sinteză continuă și, prin urmare, pot fi utilizate pentru a investiga cantitativ compuși sau proteine ​​care afectează funcția mitocondrială în contextul sintezei in vitro. Mai mult, intermediarii ciclului TCA pot fi utilizați în timpul reacției de sinteză pentru a produce aminoacizi, astfel încât suplimentarea aminoacizilor nu este necesară pentru sinteza prelungită a polipeptidelor. În unele variante de realizare, un lizat celular pentru utilizare în metodele, sistemele și kiturile de aici cuprinde cloroplaste, ceea ce reduce dependența de oxigen a reacției de sinteză. De exemplu, un lizat celular poate fi preparat din celule active fotosintetice, astfel încât plastidele, cloroplastele și / sau mitocondriile să fie reținute în lizat, în timp ce materialul celular nedorit este îndepărtat. În astfel de exemple specifice, metodele, sistemele și kiturile de aici pot utiliza energia derivată din plastide, regenerarea energiei derivate din mitocondriune, regenerarea energiei derivate din cloroplast sau o combinație a ambelor.

Caracteristicile de mai sus și alte caracteristici vor deveni mai evidente din următoarea descriere detaliată a mai multor variante de realizare, care se referă la figurile însoțitoare.


Un lider pe care îl poate urma oricine

Dezvoltarea secvențelor lider care stimulează traducerea ARNm într-o manieră independentă de specie ar putea oferi noi posibilități pentru producția de proteine ​​eucariote și cercetarea proteomică.

Proteinele sunt lucruri încăpățânate, iar obținerea de randamente ridicate de polipeptide corect pliate și modificate poate deveni o sarcină cu adevărat herculeană, producția pe bază de celule fiind adesea împiedicată de probleme de eficiență și toxicitate, precum și de dificultatea de a colecta proteine ​​țintă.

Sistemele existente pe bază de lizat fără celule oferă o alternativă promițătoare, dar nu o soluție perfectă. „Puteți face pregătire fără celule în Escherichia coli la scară multilitră ”, spune Kirill Alexandrov de la Universitatea din Queensland, Australia. „Dar dacă te duci în lumea eucariotă, ceea ce trebuie să faci pentru că E coli nu pliază în mod corespunzător proteinele eucariote complexe, apoi lucrurile devin mult mai dificile. ” Sistemele preferate, cum ar fi lizatul de reticulocit de iepure și extractul de germeni de grâu, sunt scurte în ceea ce privește randamentul și scalabilitatea, iar Alexandrov a dorit să dezvolte o abordare mai eficientă și mai universală a producției de proteine ​​eucariote.

Capacitatea de a angaja în mod specific și eficient mașinile de translație lizate cu ARNm exogeni este vitală pentru producția de proteine ​​fără celule de succes, iar echipa lui Alexandrov a realizat o descoperire în acest sens prin reexaminarea secvențelor lider pe transcrierile lor de început. Dovezile anterioare au sugerat că secvențele relativ nestructurate din poli (A) stimulează asamblarea complexului translațional și, prin proiectarea unei regiuni personalizate de 5 ′ netraduse pe baza acestui concept, au sporit considerabil eficiența traducerii transcrierilor legate în practic orice sistem fără celule . „Această traducere este cu adevărat independentă de specii și a funcționat în toate organismele pe care le-am testat, incluzând atât eucariote, cât și procariote”, spune Alexandrov.

Echipa sa a lucrat îndeaproape cu un organism deosebit de interesant, tripanosomul Leishmania tarentolae, cu caracteristici care îl fac un candidat promițător pentru extracte fără celule. „Este în esență un organism de tranziție între procariote și eucariote”, spune el, „pentru că au expresie genică procariotă [mașini], dar mașini de pliat și modificare a proteinelor eucariote.” Un alt avantaj puternic al acestui organism este existența unei secvențe omniprezente lider de 35 nucleotide pe toate ARNm endogene, ca urmare, traducerea acestora ar putea fi ușor blocată cu un Leishmania-nucleotidă antisens specifică, eliminând necesitatea digestiei RNazei ca în alte metode pe bază de extracte.

Această combinație de L. tarentolae extractul și secvența lor tradițională independentă de specie s-au dovedit puternice, rezultând un randament semnificativ mai mare de proteine ​​decât extractele eucariote concurente - până la 300 micrograme de proteine ​​pe mililitru în 90 de minute - cu o gamă diversă de secvențe de codificare a proteinelor, deși eficiența plierii a variat în funcție de proteina în cauză. Ca o demonstrație suplimentară a utilității metodei lor, cercetătorii au monitorizat comportamentul de difuzie și interacțiune al proteinelor individuale direct în amestecul de traducere fără celule folosind spectroscopia de corelație a fluorescenței.

Pe baza acestor experimente inițiale, Alexandrov este încurajat că metoda sa oferă o combinație puternică de eficiență și capacitatea de a crește producția de proteine ​​eucariote la scara litrului, la o fracțiune din costul sistemelor comerciale existente - un avantaj serios pentru oamenii de știință care doresc să genereze cristale sau produc anticorpi. În contrast, există, de asemenea, avantaje importante în „a deveni mic” și a capacității de producție de proteine ​​foarte multiplexate folosind liderul secvenței tradiționale independente de specie, fie cu L. tarentolae extract sau orice alt sistem de extragere, ar putea permite studii de interacțiune puternice, cu randament ridicat sau chiar noi abordări pentru abordarea cercetării proteomice. „Puteți găsi un organism, să faceți un extract și să-i traduceți genomul”, spune Alexandrov. „Craig Venter estimează un număr total de 20 de milioane de gene pe planetă, iar cele mai multe dintre ele se află în microorganisme pe care nu le avem - și, prin urmare, aceasta ar putea fi o modalitate de a genera rapid proteomi exprimați.”


Concluzie

In vitro sinteza proteinelor a fost comparată nu numai între sistemul PURE minim și sistemul pe bază de extracte, ci și între sistemele procariote și eucariote. Avantajul in vitro abordarea ne-a permis să suplimentăm un sistem cu lizatele sau fracțiunile acestora dintr-un alt sistem, oferind astfel informații despre diferențele fundamentale dintre aceste sisteme. Deoarece ribozomii, factorii de traducere și aminoacil-ARNt sintetazele sunt printre cele mai conservate molecule de ARN și proteine, sistemul PURE poate semăna cu o formă ancestrală a mecanismului minim de traducere a proteinelor, care, așa cum sugerează acest studiu, este suficient, dar nu este eficient în sinteza proteinelor . Prin comparație, sistemul S30 conține versiunea bacteriană modernă, cu factori celulari suplimentari capabili să îmbunătățească translația și plierea proteinelor. Este posibil ca mecanismul de traducere eucariotă să fi evoluat de la omologul său procariot pentru a traduce șabloane mai complexe (dificil de tradus) în proteine ​​active.


Expresia proteinelor

Producția recombinantă de proteine ​​este una dintre cele mai puternice tehnici utilizate în științele vieții. Capacitatea de a produce și purifica o abundență de proteine ​​recombinante dorite poate permite o gamă largă de posibilități, inclusiv utilizarea sa în procese industriale sau utilizarea sa pentru diagnosticarea sau tratarea bolii.

La prima vedere, expresia recombinantă a proteinelor poate părea simplă. În esență, ADN-ul care codifică o proteină țintă este donat în aval de un promotor într-un vector de expresie. Acest vector este apoi introdus într-o celulă gazdă, iar aparatul de sinteză a proteinelor celulare și rsquos produce proteina dorită. În practică, totuși, exprimarea proteinelor poate fi foarte dificilă, deoarece atât de mulți factori pot influența procesul. De exemplu, fiecare proteină se pliază în modul său unic, un proces care poate fi influențat de alegerea gazdei de expresie. În mod similar, unele proteine ​​necesită modificări post-translaționale sau inserarea corectă într-o membrană biologică. În cele din urmă, unele proteine ​​pot avea o activitate care dăunează gazdei. Astfel, nu există o singură soluție pentru producerea cu succes a tuturor proteinelor recombinante. În schimb, este benefic să aveți acces la o gamă largă de instrumente de expresie și dorința de a explora mai multe abordări pentru a obține șanse mai bune de succes. Expresia proteinelor la NEB.

Alegeți tipul:

Articole Feature

Citiți cum să evitați obstacolele obișnuite în expresia proteinelor care împiedică interacțiunile cu mașinile celulare.

Sinteza de proteine ​​fără celule are potențialul de a deveni una dintre cele mai importante tehnologii cu randament ridicat pentru genomica funcțională și proteomică.

Treceți în revistă avantajele kitului de expresie a proteinei K. lactis pentru o expresie rapidă, cu randament ridicat, a proteinelor în drojdie.

Acest articol oferă o privire de ansamblu asupra progreselor în metodologia de exprimare și purificare a proteinelor în ultimii 40 de ani.

Broșuri

Instrumente Web

Instrumente de selecție

Afise

Acest produs este acoperit de unul sau mai multe brevete, mărci comerciale și / sau drepturi de autor deținute sau controlate de New England Biolabs, Inc (NEB).

În timp ce NEB își dezvoltă și își validează produsele pentru diverse aplicații, utilizarea acestui produs poate solicita cumpărătorului să obțină drepturi de proprietate intelectuală terță parte suplimentare pentru anumite aplicații.

Pentru mai multe informații despre drepturile comerciale, vă rugăm să contactați echipa Global Business Development NEB la [email protected]

Acest produs este destinat numai cercetării. Acest produs nu este destinat utilizării în scopuri terapeutice sau diagnostice la oameni sau animale.

Videoclipuri

Introducere în NEBExpress & reg Sistem de sinteză a proteinelor fără celule

Urmăriți acest tutorial care explică fluxul de lucru raționalizat pentru noul nostru sistem de sinteză a proteinelor NEBExpress & reg fără celule pentru a afla cum vă puteți sintetiza cu ușurință proteinele în doar 2 până la 4 ore.

Soluții pentru exprimarea proteinelor dificile

NEB are o istorie lungă în expresia recombinantă a proteinelor și a dezvoltat o gamă largă de soluții pentru proteine ​​greu de exprimat.


Concluzii și perspective

În ciuda productivității lor scăzute, amprentă mare de producție și costuri ridicate de procesare în aval în comparație cu platformele tradiționale, plantele și celulele vegetale posedă câteva puncte de vânzare unice, care le fac atractive pentru linii de produse specifice, cum ar fi proteinele care necesită glicani specifici plantelor, medicamente veterinare, vaccinuri de urgență și proteine ​​fără animale. Cu toate acestea, traducerea multor dintre aceste produse de la cercetare la piață este lentă, limitând vizibilitatea și exploatarea comercială a platformelor pe bază de plante pentru producția de proteine ​​recombinante. Traducerea comercială este mai simplă și mai rapidă pentru proteinele non-terapeutice din cauza sarcinii de reglementare mai mici. Prin urmare, aceste produse sunt mai potrivite în primul rând pentru a demonstra sustenabilitatea economică a sistemelor de producție pe bază de plante. În schimb, proteinele terapeutice promit marje de profit mai mari, dar comercializarea acestora necesită studii preclinice și clinice cuprinzătoare și costisitoare, cu sprijinul partenerilor industriali care oferă expertiză în dezvoltarea medicamentelor. Multe studii privind producerea de proteine ​​terapeutice în plante, prin urmare, nu depășesc niciodată expresia, purificarea și analiza pe bază de celule. Progresul de-a lungul lanțului valoric necesită o muncă suplimentară, inclusiv studii de toxicitate, identificarea biomarkerilor pentru stratificarea și monitorizarea terapeutică a pacienților, studii clinice și acceptarea de către agențiile de asigurări de sănătate și de reglementare. Alte considerații comerciale includ proprietatea intelectuală / libertatea de a opera portofoliul, cota de piață, potențialii concurenți și timpul până la piață. Lansarea pe piață a mai multor produse biofarmaceutice derivate din plante va necesita investiții semnificative și o cooperare mai strânsă cu industria farmaceutică, autoritățile de reglementare și clinicienii. Important, acest lucru are sens numai dacă produsul oferă avantaje unice în ceea ce privește calitatea, eficacitatea, scara de producție / calendarul și / sau costul atunci când este produs în plante, mai degrabă decât celule CHO sau microbi.


1. Introducere

Expresia funcțională a proteinelor recombinante în gazdele procariote are un interes industrial considerabil, cu aplicații variind de la proteine ​​terapeutice și producerea de enzime recombinante până la ingineria metabolică pentru sintetizarea biomoleculelor cu valoare adăugată [1,2]. Cu toate acestea, supraexprimarea proteinei recombinante la gazdele procariote are ca rezultat frecvent formațiuni de agregate proteice, denumite corpuri de incluziune [3], care depășesc cu mult capacitatea de pliere a gazdei. În consecință, procesele de repliere in vitro costisitoare și consumatoare de timp au fost aplicate pe scară largă pentru a recupera proteinele active funcțional în formele lor solubile. Mai mult, formarea corpului de incluziune este în general dăunătoare gazdei prin creșterea sarcinii metabolice celulare și a interacțiunilor intermoleculare cu alte componente celulare [4,5], reducând viabilitatea celulară și randamentul total al producției.

In vivo și in vitro strategiile de solubilizare a proteinelor recombinate la o conformație activă în timpul procesului de producție inițial [6] includ etichete de îmbunătățire a solubilității pentru a preveni intrinsec formarea de proteine ​​pliate greșit in-vivo [7,8,9], modificarea stării fizico-chimice pentru a echilibra procesele translaționale și de pliere [10] , 11] și supraexprimarea moleculară a chaperonei pentru a îmbunătăți dezagregarea gazdei și capacitatea de pliere [12,13,14]. Chaperonele moleculare, care pot ajuta celulele să facă față denaturării proteinelor induse de stres [15,16], constituie instrumente puternice pentru a produce proteine ​​recombinante funcționale active și solubile în apă. Printre opțiuni, utilizarea chaperonelor moleculare este mai eficientă din punct de vedere al costurilor și consumă mai puțin timp, deoarece nu sunt necesare procesări post-translaționale și compromisuri în condițiile de creștere a celulelor. Cu toate acestea, co-supraexprimarea directă a chaperonei native cu proteinele țintă produce o solubilizare limitată în timpul producției de proteine ​​recombinante. Deși abundente chaperone moleculare pot fi disponibile prin abordările de co-expresie a chaperonei, acestea pot să nu difuzeze în mod eficient prin citosolul aglomerat pentru a interacționa în timp util cu un polipeptid naștent înainte de apariția greșelilor [17]. Cinetica rapidă a procesului de pliere care are loc în timpul traducerii proteinelor recombinante duce cu ușurință la plierea greșită ireversibilă, agregare și degradare dacă nu sunt asistate de modulatori de pliere în timp util. Prin urmare, strategia noastră a fost să forțăm interacțiunea cu chaperonă moleculară și peptidă născută sau traducătoare pentru a preveni îndoirea și agregarea ulterioară, precum și pentru a facilita procesele de repliere mediate de chaperonă.

În consecință, am transformat regiunea netradusă 3 & # x02032 (3 & # x02032UTR) a ARNm care codifică o proteină recombinantă țintă într-o schelă pentru a ancora o chaperonă moleculară în apropierea locului de oprire translațională. Printr-un astfel de aranjament, translația proteinei este cuplată cu procesul de repliere. În mod alternativ, am plasat chaperona moleculară și gene proteine ​​țintă în tandem sau într-un aranjament suprapus pentru a cupla traducerile lor, permițând celor două proteine ​​să interacționeze rapid în timpul procesului de traducere. Fosta abordare, denumită schelă de ARNm de recrutare a chaperonei (CRAS), a fost concepută pentru a preveni agregarea și îndoirea în continuare a proteinelor nou sintetizate înainte de plierea nativă finală. Această din urmă abordare, și anume expresia co-localizată chaperonă-substrat (CLEX), a permis implicarea proteinei în traducerea celuilalt & # x02019s și a facilitat plierea co-translațională. Am ales chaperona și co-chaperonii sistemului chaperone DnaK (Hsp70) ca modulatori de pliere utilizați în proiectele noastre, deoarece joacă un rol central în rețeaua de chaperoni, recunosc o gamă largă de substraturi și lucrează direct cu plierea polipeptide incipiente [18,19]. Într-un ciclu funcțional tipic DnaK, co-chaperona DnaJ (Hsp40) se leagă de petele hidrofobe ale polipeptidelor desfăcute, transferă moleculele substratului la DnaK pentru procesul de pliere. Polipeptidele îndoite sunt eliberate din DnaK de factorul de schimb nucleotidic GrpE și pot fi livrate către alte chaperone pentru alte pliuri [20]. Deoarece holdaza care interacționează mai întâi cu polipeptidele desfăcute și previne îndoirea și agregarea ulterioară, DnaJ poate funcționa, de asemenea, într-un mod independent de DnaK [21,22]. Astfel, am selectat DnaJ ca co-chaperonă vizată de 3 & # x02032UTR în sistemul CRAS și pentru a fi co-supraexprimat cu o proteină țintă în sistemul CLEX. Pentru introducerea unei funcții de legare a ARN la DnaJ, am fuzionat DnaJ la un domeniu uman Nova-1 KH3, care se leagă în mod specific de un motiv UCAU tetranucleotidic într-o buclă cu ac de păr monocatenară a unei molecule de ARN [23].

Prin ingineria ARNm care codifică o proteină recombinantă predispusă la agregare țintă fie cu o structură suplimentară de ac de păr 3 & # x02032UTR, fie cu al doilea cistron care exprimă DnaJ, am reușit să depășim coexpresia simplă DnaJ cu proteinele țintă în ceea ce privește producerea proteinelor solubile. O proteină țintă poate fi produsă până la 90% în fracție solubilă atunci când traducerea este asistată cu concentrația locală ridicată de chaperone în CRAS / CLEX. Sistemele noastre pot produce proteine ​​țintă solubile chiar și atunci când chaperona nu este capabilă să solubilizeze orice cantitate apreciabilă de proteine ​​cu co-supraexprimarea DnaJ. Combinațiile diferiților factori implicați în mecanismele de repliere / dezagregare, cum ar fi distanțele genetice, numărul de agrafe de păr, componentele chaperone etc. ale celor două sisteme au fost examinate pentru a maximiza eficiența metodei.


Expresia proteinelor

Producția recombinantă de proteine ​​este una dintre cele mai puternice tehnici utilizate în științele vieții. Capacitatea de a produce și purifica o abundență de proteine ​​recombinante dorite poate permite o gamă largă de posibilități, inclusiv utilizarea sa în procese industriale sau utilizarea sa pentru diagnosticarea sau tratarea bolii.

La prima vedere, expresia recombinantă a proteinelor poate părea simplă. În esență, ADN-ul care codifică o proteină țintă este donat în aval de un promotor într-un vector de expresie. Acest vector este apoi introdus într-o celulă gazdă, iar aparatul de sinteză a proteinelor celulare și rsquos produce proteina dorită. În practică, totuși, exprimarea proteinelor poate fi foarte dificilă, deoarece atât de mulți factori pot influența procesul. De exemplu, fiecare proteină se pliază în modul său unic, un proces care poate fi influențat de alegerea gazdei de expresie. În mod similar, unele proteine ​​necesită modificări post-translaționale sau inserarea corectă într-o membrană biologică. În cele din urmă, unele proteine ​​pot avea o activitate care dăunează gazdei. Astfel, nu există o singură soluție pentru producerea cu succes a tuturor proteinelor recombinante. În schimb, este benefic să aveți acces la o gamă largă de instrumente de expresie și dorința de a explora mai multe abordări pentru a obține șanse mai bune de succes. Expresia proteinelor la NEB.

Alegeți tipul:

Articole Feature

Citiți cum să evitați obstacolele obișnuite în expresia proteinelor care împiedică interacțiunile cu mașinile celulare.

Sinteza de proteine ​​fără celule are potențialul de a deveni una dintre cele mai importante tehnologii cu randament ridicat pentru genomica funcțională și proteomică.

Treceți în revistă avantajele kitului de expresie a proteinelor K. lactis pentru o expresie rapidă, cu randament ridicat a proteinelor în drojdie.

Acest articol oferă o imagine de ansamblu asupra progreselor în exprimarea proteinelor și metodologia de purificare în ultimii 40 de ani.

Broșuri

Instrumente Web

Instrumente de selecție

Afise

Acest produs este acoperit de unul sau mai multe brevete, mărci comerciale și / sau drepturi de autor deținute sau controlate de New England Biolabs, Inc (NEB).

În timp ce NEB își dezvoltă și își validează produsele pentru diverse aplicații, utilizarea acestui produs poate solicita cumpărătorului să obțină drepturi de proprietate intelectuală terță parte suplimentare pentru anumite aplicații.

Pentru mai multe informații despre drepturile comerciale, vă rugăm să contactați echipa Global Business Development NEB la adresa [email protected]

Acest produs este destinat numai cercetării. Acest produs nu este destinat utilizării în scopuri terapeutice sau diagnostice la oameni sau animale.

Videoclipuri

Introducere în NEBExpress & reg Sistem de sinteză a proteinelor fără celule

Urmăriți acest tutorial care explică fluxul de lucru simplificat pentru noul nostru sistem de sinteză a proteinelor NEBExpress & reg fără celule pentru a afla cum vă puteți sintetiza cu ușurință proteinele în doar 2 până la 4 ore.

Soluții pentru exprimarea proteinelor dificile

NEB are o istorie lungă în expresia recombinantă a proteinelor și a dezvoltat o gamă largă de soluții pentru proteine ​​greu de exprimat.


Alegerea unui sistem

Procariot sau eucariot, preparat la domiciliu sau comercial, pe bază de extract brut sau reconstituit? Alegerea sistemului depinde de nevoile și constrângerile dvs. specifice.

Ce specie? Cu excepția cazului în care prototipați părți genetice sau nu aveți nevoie de mecanismele de exprimare ale unui anumit organism, un sistem fără celule bazat pe E. coli ar trebui să fie prima dvs. alegere. Cea mai veche și cea mai utilizată familie de sisteme fără celule, sistemele E. coli au fost optimizate pentru exprimarea fiabilă a genelor și producția de proteine ​​cu randament ridicat.

Mergi la comercial? Producerea propriului extract de celule necesită echipament și expertiză pentru cultivarea și lizarea volumelor mari de celule. O mână de furnizori își vând propriile sisteme fără celule, derivate din organisme model și linii celulare de cal, dar nu sunt ieftine. Așteptați-vă să plătiți cel puțin 7 USD pe reacție, față de cenți pe reacție pentru un sistem fabricat acasă.

Brut sau reconstituit? Majoritatea sistemelor de expresie fără celule sunt realizate cu lizat de celule brute, care conține mult mai multe enzime decât mașinile de exprimare a genei de bază. Acest lucru poate fi un lucru bun - sistemele moderne pe bază de lizat E. coli conțin chaperone și cea mai mare parte a metabolismului central, ceea ce crește randamentele de proteine ​​și titrurile produselor. Dacă trebuie să eliminați complet activitatea unei anumite enzime, un sistem reconstituit cunoscut sub numele de PURE (sinteza proteinelor utilizând elemente recombinate) poate fi opțiunea potrivită. În PURE, fiecare proteină necesară pentru exprimarea genelor este purificată și adăugată la reacție, oferindu-vă un control maxim asupra compoziției reacției. Protocoale simplificate au fost recent publicate pentru a produce economic ambele tipuri de sisteme, dar puteți achiziționa și un kit.


Priveste filmarea: Chimie, Clasa a XII-a, Proteinele: diversitate, compoziție, structură, rolul biologic (Ianuarie 2022).