Informație

Măsurarea concentrației de proteine, Bradford vs. Nanodrop?


Știu că testul Bradford este un mod foarte standard de măsurare a concentrației de proteine ​​după, de ex. o purificare. Cu toate acestea, în laboratorul în care lucrez acum, ei folosesc în mod normal doar picături nano la lungimea de undă de 280nm.

Cât de demnă este această concentrare? Spune că eu de ex. primesc 2,5 mg / ml, aș putea avea încredere în asta?


Acest lucru depinde puternic de proteinele dvs. și de cât de exact aveți nevoie de această concentrație. Ambele teste (Bradford și măsurarea la 280 nm) fac doar o aproximare.

Măsurarea la 280 nm se bazează pe interacțiunea aminoacizilor aromatici cu lumina UV. Dacă aveți o proteină cu puțini sau deloc aminoacizi aromatici, măsurarea dvs. va fi greșită.

Același lucru este valabil și pentru testul Bradford. Aici formați un complex între Coomassie Blue Brilliant și lanțurile laterale nepolare și cationice ale aminoacizilor. Acest test este mai precis, deoarece include mai multe lanțuri laterale posibile, dar depinde în continuare de compoziția proteinei.

Mai precisă este analiza BCA, deoarece folosește reducerea ionilor de cupru prin legătura peptidică a proteinei. Ceea ce ați putea face este să efectuați un test BCA (sau cel puțin un test Bradford) din proba dvs. și măsurați același eșantion pe Nanodrop la 280 nm și comparați rezultatele.

Puteți găsi o prezentare generală a metodelor aici și aici.


Nanodrop ar trebui să aibă o opțiune care vă permite să introduceți un „coeficient de extincție”. Aceasta este o măsurare a cât de mult va absorbi un mol de proteină la 280nm. Nanodrop va folosi această valoare pentru a vă oferi o citire exactă a concentrației.

Pentru a găsi coeficientul de dispariție pentru proteina dvs., introduceți întreaga sa secvență pe acest server http://web.expasy.org/protparam/.

Câteva sfaturi:

  • Utilizați tamponul exact în care se află proteina dvs. ca un spațiu liber.

  • Repetați citirea nanodrop de câteva ori folosind de fiecare dată un nou vârf de pipetă pentru a asigura reproductibilitatea

  • Cu cât proteina dvs. este mai pură, cu atât mai precisă va fi citirea concentrației! Dacă există un contaminant major acolo, nu veți obține o citire exactă a concentrației.

Dacă aveți de-a face cu o proteină pură în care nu este nimic altceva prezent care să se absoarbă la 280 nm și dacă E (1%, 280) a proteinei pure este cunoscută sau poate fi calculată din secvența de aminoacizi, atunci măsurarea A-280 este o metodă foarte precisă, rapidă, nedistructivă de determinare a concentrației de proteine.

Este cu siguranță mult mai fiabil decât orice metodă care utilizează o curbă standard, în care culoarea produsă poate depinde de proteina standard utilizată.

De asemenea, are avantajul suplimentar că proteina poate fi recuperată complet după efectuarea măsurătorii, de multe ori o considerație atunci când se tratează probe prețioase.

Trebuie subliniat faptul că proteina trebuie să fie pură pentru ca această metodă să funcționeze. Când se tratează probe de proteine ​​impure, „regula generală” este că o soluție de 1 mg / ml va avea un A-280 de 1 sau E (0,1%, 280) = 1. Dar, desigur, alte substanțe, cum ar fi ADN sau toluen (într-un extract de drojdie, poate) poate absorbi la 280 nm și poate face ravagii cu citirile dvs.

Măsurătorile A-280, fiind nedistructive, sunt de obicei considerate adecvate pentru monitorizarea eluatelor din coloanele cromatografice.

Dacă secvența de aminoacizi este cunoscută și doriți să utilizați metoda Perkins (1986) pentru a calcula E (1%, 280), probabil că merită să aveți în vedere faptul că această metodă nu ține cont de un grup protetic legat (cum ar fi hem sau NAD strâns legat), care ar putea contribui în mod semnificativ la valoarea E (1%, 280).

Câțiva arbitri buni

Perkins, S. J. (1986). Volumele de proteine ​​și efectele de hidratare. Calculul volumelor specifice parțiale, punctelor de împrăștiere a neutronilor și a coeficienților de absorbție de 280 nm pentru proteine ​​și glicoproteine ​​din secvențe de aminoacizi. Euro. J. Biochem. 157, 169 - 180. [Pubmed] [pdf]

Gill, S. C. și von Hippel, P. H. (1989). Calculul coeficienților de extincție a proteinelor din datele secvenței de aminoacizi. Anal. Biochimie. 182, 319 - 326. [eroarea publicată apare în Anal. Biochimie. (1990) 189, 283].

Sober, E. K. și Sober, H. A. (1970). Coeficienții de extincție molară și valorile E (1%, 280) pentru proteine ​​la lungimi de undă selectate ale regiunii ultraviolete și vizibile. În Manualul de biochimie. Date selectate pentru biologie moleculară, edn II. Sober, H. A., Ed. pp. C-71 - C-98. The Chemical Rubber Company, Cleveland, Ohio.

Editați | ×

Pot da un exemplu al metodei Perkins, dacă cineva este interesat.


Alegerea între cuantificarea colorimetrică și cea directă la A280 depinde atât de proteina care trebuie cuantificată, cât și de tamponul utilizat. În general, A280 funcționează bine atunci când aveți o soluție de proteină purificată și proteina este bine caracterizată. Introducerea coeficientului de stingere corect va îmbunătăți precizia calculului concentrației. Dacă utilizați A280, merită, de asemenea, să verificați dacă tamponul dvs. nu absoarbe foarte mult în intervalul 280nm. Puteți face acest lucru prin golirea cu apă și rularea tamponului ca probă. Dacă tamponul dvs. absoarbe foarte mult, este posibil să alegeți o altă metodă.

Pentru lizatele celulare și proteinele necaracterizate vă este mai bine cu o analiză colorimetrică, cum ar fi Bradford, BCA sau Pierce 660. Acestea pot fi rulate în microvolume, dar aveți grijă la preparare, în special cu teste precum Bradford care pot avea o mulțime de particule.

De asemenea, pe măsură ce măsurați o curbă standard pentru testele colorimetrice, cu cât standardele dvs. sunt mai similare cu eșantionul, cu atât rezultatele sunt mai bune.

Andy


Concentrația de proteine ​​Bradford vs Lowry oferă rezultate dramatice diferite - (10 decembrie 2012)

Vreau să împărtășesc cazul meu pentru a primi feedback dintre voi.
Recent am aflat o mare discrepanță în analiza concentrației totale de proteine ​​pe care o conduc între două sisteme foarte bine stabilite: Bradford și Lowry.
Bradford provine de la Sigma (http://tinyurl.com/d8y969f), Lowry este kitul Bio-Rad DC (http://tinyurl.com/c7uszdh). Acest forum a discutat pe larg aceste două sisteme, dar nu le-a comparat niciodată pe cele două. Îmi recâștigă așteptarea, pentru un preparat proteic, cele două sisteme oferă rezultate foarte diferite, așa cum se indică în imagine.

de la 0,1 la 3,2 Am standarde BSA (g / L) în 20% glicerol / PBS. Concluzia este eșantionul meu în același tampon ca și standardele. Fiecare măsurare vine în duplicat.
Ca o notă, îmi rulez SDS-PAGE + Wester Blot al probelor și nu a apărut niciun Ponceau S în linia probelor (alte probe au fost în regulă). De asemenea, detectarea anticorpilor nu a reușit să dezvăluie vreo bandă la care mă așteptam.
Drept urmare, acum spun mai degrabă că dintre cele două opțiuni, Bradford pare a fi adevărat.

Cum pot avea o diferență atât de dramatică?
Cineva experimentează ceva similar?
'href = "http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4378" target = "_ blank">

afișarea unei imagini a testului nu ne spune rezultatul.

spui că Bradford arată o concentrație mai mică a eșantionului tău decât lowry? dacă da, motivul probabil este standardul pe care l-ați selectat (bsa).

generarea culorii testului Bradford este

2x cu bsa decât cu bgg. biorad recomandă utilizarea bgg ca standard atunci când se determină majoritatea proteinelor (vezi secțiunea privind selectarea standardului).

Îmi pare rău dacă explicația mea nu a fost clară. În Lowry, intensitatea eșantionului este mai mare decât cel mai recent punct din curba mea standard (& gt3,2 g / l BSA). În Bradford, intensitatea eșantionului este mai mică decât 0,1 standard. Sunt de acord cu tine, ar fi trebuit să efectuez analiza colorimetrică în acest sens, dar eu diferența a fost atât de clară încât o omit.
Pot încerca BGG dacă îl am în casă. Cu toate acestea, dacă Bradford este de aproximativ 2 ori mai intens cu BSA, nu spune de ce am o diferență de cel puțin 10 ori: - /

structura primară a proteinei de interes poate fi de vină.

o a treia metodă ar trebui să rezolve problema a cărei metodă de analiză este corectă.

după cum ați spus, colorarea ponceau indică faptul că Bradford se află în stadion (poate fi mai precis cu standardul BGG).

aveți acces la alte metode de testare a proteinelor (poate ceva precum fluorescamina sau detectarea directă)?

Am un NanoDrop care ar putea să-mi ofere cantitatea totală de proteine ​​purificate pe baza absorbției UV. Dar, din nou, este recomandat pentru proteinele pure. Voi întreba despre BGG (nu-l am) și voi încerca cu aceste standarde.

Unul dintre ei este sensibil la detergent și la alți agenți care interferează.
Verifică.


Determinarea spectrofotometrică a concentrației de proteine

Această unitate descrie metode spectrofotometrice și colorimetrice pentru măsurarea concentrației unei probe de probă în soluție. Absorbanta masurata la 280 nm (A280) este utilizat pentru a calcula concentrația de proteine ​​prin comparație cu o curbă standard sau valorile de absorbție publicate pentru acea proteină (A280). Alternativ, absorbanța măsurată la 205 nm (A205) este utilizat pentru a calcula concentrația de proteine. The A280 și A205 metodele pot fi utilizate pentru a cuantifica proteina totală în lizatele brute și proteina purificată sau parțial purificată. Se poate utiliza un spectrofluorometru sau un fluorometru cu filtru pentru a măsura emisia de fluorescență intrinsecă a unei soluții de probă, această valoare este comparată cu emisiile din soluțiile standard pentru a determina concentrația probei. Metoda de emisie a fluorescenței este utilizată pentru a cuantifica proteina purificată. Această metodă simplă este utilă pentru probele de proteine ​​diluate și poate fi completată într-un timp scurt. Există două metode colorimetrice: metoda colorimetrică Bradford, bazată pe legarea colorantului albastru strălucitor de proteina de interes și metoda Lowry, care măsoară reacția colorimetrică a reziduurilor de tirozil din proba de proteine.


Determinați concentrația de anticorpi - (26 februarie 2009)

Sunt nou aici. Am vrut să stabilesc concentrația anticorpului meu. crezi că pot folosi nanodrop și măsoară absorbția la 280nm. dacă folosesc testul BCA, pot folosi BSA ca standard proteic sau ar trebui să folosesc gamma globulină bovină ca standard. bugetul meu este limitat, așa că mă gândeam să folosesc BSA. este bine?

Anticorpii sunt în mare parte IgG și solicitați unui laborator de chimie clinică să măsoare conținutul de IgG.

sueanne pe 27 februarie 2009, 06 & # 5846 AM a spus:

Sunt nou aici. Am vrut să stabilesc concentrația anticorpului meu. crezi că pot folosi nanodrop și măsoară absorbția la 280nm. dacă folosesc testul BCA, pot folosi BSA ca standard proteic sau ar trebui să folosesc gamma globulină bovină ca standard. bugetul meu este limitat, așa că mă gândeam să folosesc BSA. este bine?


De obicei folosesc absorbanță la 280 nm pentru a cuantifica imunoglobulinele cu condiția să fie pure (de exemplu, fără proteine ​​purtătoare). Majoritatea anticorpilor au un coeficient de extincție de 1% de 13-15. Se poate aștepta ca o soluție de 1 mg / ml de IgG să dea o absorbanță de aproximativ 1,36 într-o cuvă de 1 cm cu cale luminoasă. O valoare similară poate fi utilizată cu echipamentul nanodrop. Astfel absorbanta la 280 / 1,36 = mg / ml. Dacă Ab-ul dvs. are o concentrație mare, poate fi necesar să faceți o diluare înainte de a citi absorbanta.
Determinarea concentrației de Ab prin spectrofotometrie este o practică standard în imunologie. Dacă sunteți interesat, puteți găsi liste de coeficienți de extincție în manualele standard.

sueanne pe 27 februarie 2009, 03 & # 5816 PM a spus:

Sunt nou aici. Am vrut să stabilesc concentrația anticorpului meu. crezi că pot folosi nanodrop și măsoară absorbția la 280nm. dacă folosesc testul BCA, pot folosi BSA ca standard proteic sau ar trebui să folosesc gamma globulină bovină ca standard. bugetul meu este limitat, așa că mă gândeam să folosesc BSA. este bine?

Dacă anticorpul dvs. este un preparat Ig purificat, nanodrop pe BCA sau chiar OD280 (care nu mănâncă aproape nimic din bugetul dvs., dar este mult mai puțin sensibil) ar fi bine. Dacă aveți nevoie de precizie, desigur, IgG bovin este un standard mai bun decât BSA, dar dacă aveți nevoie mai degrabă de o estimare relativă a concentrației de Ig de la un preparat Ig la un alt BSA ar fi bine.
Dacă preparatul anticorpului conține alte proteine, poate fi necesar să vă trimiteți proba la un laborator de chimie clinică pentru cuantificarea IgG specifică, de ex. prin imuno-neflometrie.
Mult noroc & # 33

Am o întrebare cu privire la IgG. Atunci când rulează abs pe un gel proteic, lanțul greu oferă o bandă puternică, în timp ce lanțul ușor dă doar o bandă slabă. Este normal?

În al doilea rând, am folosit chipsurile de proteine ​​de la Agilent pentru a utiliza Bioanalyzer (Agilent) pentru a-mi face o idee despre puritate, precum și despre concentrație. Tot aici, lanțurile grele constituie aproximativ 80% din cantitatea totală de IgG, în timp ce lanțurile ușoare doar aproximativ 16%. Mă confund aici, nu ar trebui să existe un raport 1: 1 sau îmi lipsește ceva evident?

Folosind bioanalizatorul, lanțul greu și lanțurile ușoare oferă concentrații separate (deoarece sunt separate și măsurate individual), de exemplu într-o probă de lanțuri grele de 130ug / ml și lanțuri ușoare de 25ug / ml. Ar trebui apoi să combin cele două concentrații și apoi să obțin concentrația totală de IgG?

manuelo pe 4 martie 2009, 06 și # 5841 AM a spus:

Am o întrebare cu privire la IgG. Atunci când rulează abs pe un gel proteic, lanțul greu oferă o bandă puternică, în timp ce lanțul ușor dă doar o bandă slabă. Este normal?

În al doilea rând, am folosit chipsurile de proteine ​​de la Agilent pentru a utiliza Bioanalyzer (Agilent) pentru a-mi face o idee despre puritate, precum și despre concentrație. Tot aici, lanțurile grele constituie aproximativ 80% din cantitatea totală de IgG, în timp ce lanțurile ușoare doar aproximativ 16%. Mă confund aici, nu ar trebui să existe un raport 1: 1 sau îmi lipsește ceva evident?

Folosind bioanalizatorul, lanțul greu și lanțurile ușoare oferă concentrații separate (deoarece sunt separate și măsurate individual), de exemplu într-o probă de lanțuri grele de 130ug / ml și lanțuri ușoare de 25ug / ml. Ar trebui apoi să combin cele două concentrații și apoi să obțin concentrația totală de IgG?

raportul molar poate fi 1: 1, dar cantitatea reală de proteine ​​va fi diferită, deoarece acestea nu au aceeași dimensiune.

ceea ce ați găsit sună bine și, da, puteți adăuga totalurile (nu concentrațiile) împreună.

klinmed pe 2 martie 2009, 09 și # 5840 AM a spus:

sueanne pe 27 februarie 2009, 06 & # 5846 AM a spus:

Sunt nou aici. Am vrut să stabilesc concentrația anticorpului meu. crezi că pot folosi nanodrop și măsoară absorbția la 280nm. dacă folosesc testul BCA, pot folosi BSA ca standard proteic sau ar trebui să folosesc gamma globulină bovină ca standard. bugetul meu este limitat, așa că mă gândeam să folosesc BSA. este bine?


De obicei folosesc absorbanță la 280 nm pentru a cuantifica imunoglobulinele cu condiția să fie pure (de exemplu, fără proteine ​​purtătoare). Majoritatea anticorpilor au un coeficient de extincție de 1% de 13-15. Se poate aștepta ca o soluție de 1 mg / ml de IgG să dea o absorbanță de aproximativ 1,36 într-o cuvă de 1 cm cu cale luminoasă. O valoare similară poate fi utilizată cu echipamentul nanodrop. Astfel absorbanta la 280 / 1,36 = mg / ml. Dacă Ab-ul dvs. are o concentrație mare, poate fi necesar să faceți o diluare înainte de a citi absorbanta.
Determinarea concentrației de Ab prin spectrofotometrie este o practică standard în imunologie. Dacă sunteți interesat, puteți găsi liste de coeficienți de extincție în manualele standard.


Mulțumesc mult. aceasta este prima dată când mă ocup de anticorpi și nu am experiență în imunologie. incercand inca sa invete

sueanne pe 26 februarie 2009, 10 și # 5846 PM a spus:

Sunt nou aici. Am vrut să stabilesc concentrația anticorpului meu. crezi că pot folosi nanodrop și măsoară absorbția la 280nm. dacă folosesc testul BCA, pot folosi BSA ca standard proteic sau ar trebui să folosesc gamma globulină bovină ca standard. bugetul meu este limitat, așa că mă gândeam să folosesc BSA. este bine?


Din experiența mea, Nanodrop nu funcționează fiabil cu proteina 280nm și pentru BCA, Bradford etc. ar trebui să utilizați oricum cuvete, deoarece probele nu sunt potrivite pentru volume mici.

Dacă doriți să lucrați în volume mici (puteți face asta cu proteine ​​purificate, cum ar fi anticorpii), ar trebui să utilizați un NanoPhotometer de la Implen, este perfect pentru probele de proteine, deoarece tehnologia lor nu depinde de tensiunea superficială a probelor. BCA, Lowry etc. este, de asemenea, posibil, deoarece instrumentul funcționează și cu cuvete.


Deveniți conștienți de contaminarea pe care o puteți vedea

Un alt punct de interes este valoarea dvs. A260 / 230, care la fel ca omologul său A260 / 280 ar trebui să aterizeze la 1,8 sau mai mult ca regulă generală și peste 2,0 pentru probe de ADN și ARN relativ pure.

Nanodrop pictează o imagine grafică frumoasă pentru a vă ajuta să vedeți exact unde poate fi necesară atenția

  • A260 / 280 scăzut, vârf mare la A280: contaminare cu proteine
  • A230 mare: fenol din nou, EDTA sau contaminare cu carbohidrați
  • Vârfuri mici sau absorbanță mai mare decât cea așteptată de-a lungul părții din dreapta-dreaptă a graficului: contaminare rezultată din transferul interfeței în timpul etapei de separare a fazelor în extracție.
  • Din sursă, iată cum poate arăta pe ecran: Rapoartele 260/280 și 260/230 (ThermoScientific / Nanodrop).

O modalitate de a asigura o probă mai curată este să o trimiteți la re-precipitare, urmată de o spălare cu etanol, uscare extinsă la aer și resuspendare într-un volum proaspăt de TE sau apă pură. Da, concentrația raportată poate fi semnificativ mai mică decât înainte, dar asta pentru că ați eliminat cu succes orice contaminare care vă afectează datele de absorbție în bine sau în rău.


Metode de cuantificare a proteinelor bazate pe mai multe volume


Proteinele sunt esențiale pentru înțelegerea noastră despre biologie. În celule, acestea sunt multifuncționale: de la actină care oferă suport structural proteinelor care acționează ca enzime pentru modularea căilor de transducție a semnalului, cum ar fi kinazele, proteazele și fosfatazele la proteinele transmembranare care permit interacțiuni extracelulare, cum ar fi GPCR-urile și canalele ionice. Deși aproape toate proteinele sunt fabricate din același set de 20 de aminoacizi, structurile și funcțiile lor sunt incredibil de diverse prin diferitele interacțiuni care pot apărea prin intermediul aminoacizilor care le compun, capacitatea lor de a-și asuma structura cuaternară și modificările post-translaționale care pot modulează-le activitatea. Multe dintre studiile care analizează structura și funcționarea proteinelor se bazează pe cuantificarea în amonte pentru a asigura rezultate adecvate. Aceste studii din aval includ spectrometria de masă pentru a elucida structura primară și modificările post-tradiționale, dicroismul circular și cristalografia cu raze X pentru a testa structura secundară, terțiară și cuaternară, electroforeza pe gel 2-D și western blot pentru a monitoriza expresia relativă a proteinelor și matricele de proteine ​​pentru studii de expresie a proteinelor multiplexate.

Fluorescența și spectroscopia de absorbanță sunt ambele metode comune de cuantificare a proteinelor, deși prima este preferată atunci când se utilizează probe de proteine ​​diluate (adică în mod tipic & lt100 & mug / ml). În general, metodele de cuantificare a absorbanței oferă performanțe analitice suficiente și sunt convenabile pentru multe studii și laboratoare datorită disponibilității pe scară largă a spectrofotometrelor de absorbanță. Confortul prin creșterea volumului eșantionului se realizează atunci când aceste metodologii sunt realizate în microplăci și prin fluxuri de lucru simplificate folosind cantități mici de eșantion în formate de micro-volum. În acest ghid de aplicare, sunt discutate în detaliu metodele de cuantificare a proteinelor bazate pe absorbanță adecvate pentru analiza microplăcilor și a micro-volumului.

Legea Beer-Lambert

Cuantificarea este posibilă prin absorbția luminii UV-Vis de către cromofori conținuți în proteine ​​sau prin utilizarea de reactivi colorimetrici. Legea Beer-Lambert corelează proprietatea fizică a absorbției luminii de către molecule la concentrația din probă prin următoarea ecuație:

În cazul în care A se referă la Absorbanță, Io este intensitatea luminii de excitație înainte de trecerea prin eșantion, I este intensitatea luminii de excitație după trecerea prin eșantion, și epsilon la absorbția molară sau coeficientul de stingere al analitului, l este lungimea căii (cm) și c este concentrația analitului. Spectrofotometrele oferă mijloacele pentru măsurarea Io și I. Vasele utilizate pentru păstrarea eșantionului în spectrofotometru sunt de obicei la o lungime de traiectorie fixă, astfel, dacă se cunoaște coeficientul de extincție al proteinei, concentrațiile pot fi pur și simplu determinate folosind ecuația de mai sus. Dacă nu se cunoaște coeficientul de extincție (adică folosind reactivi colorimetrici), atunci pot fi generate curbe de calibrare astfel încât concentrațiile să poată fi interpolate.

Instrumentație și nave

În esență, există trei tipuri de bază de instrumente utilizate pentru determinarea spectrofotometrică a proteinelor. Există spectrofotometre de absorbanță dedicate care utilizează cuvete pentru a ține probe individuale, spectrofotometre pe bază de microplăci (cititoare de microplăci) care utilizează microplăci pentru a procesa rapid multe probe și dispozitive dedicate pentru analiza micro-volumului. Aceste dispozitive, precum seria ThermoScientific & rsquos NanoDrop, sunt deosebit de utile în sensul că numai cantități mici de proteine ​​trebuie utilizate pentru cuantificare. Mai mult, nu necesită nicio navă pentru analiză, deoarece probele sunt pipetate direct pe un piedestal de pe instrument. Recent, BioTek Instruments a furnizat un accesoriu de microplacă pentru a fi utilizat cu cititoarele sale de microplacă, care permite analiza micro-volumului similar cu aceste dispozitive dedicate. Avantajul cititorului și al accesoriului de microplacă este că multe aplicații pot fi realizate și cu cititorul de microplăci (de exemplu, ELISA). Tabelul 1 oferă o prezentare generală a caracteristicilor tipurilor de nave utilizate de aceste instrumente, în special numărul de probe pe care le pot prelucra, lungimea traseului utilizat pentru analiză și volumul de probă necesar.

Tabelul 1. Caracteristicile tipurilor de vase utilizate în mod obișnuit pentru cuantificarea proteinelor.

BioTek Instruments oferă o gamă de cititoare de microplăci care pot măsura nu numai absorbanța potrivită pentru cuantificarea proteinelor, ci și multe alte moduri de detectare, inclusiv fluorescența, fluorescența rezolvată în timp, polarizarea fluorescenței și luminescența. Fiecare dintre aceste cititoare de microplăci este capabil de cuantificare a mai multor volume de proteine ​​într-o gamă largă de vase, inclusiv cuve standard (Figura 1), BioTek & rsquos brevetat BioCell și cuvă comercială, care are o lungime fixă ​​de 1 cm, microplăci de 96 și 384 de godeuri și micro- analiza volumului folosind accesoriul Take3 & trade sau Take3 & trade Trio.

Figura 1. Capabilități multi-volum ale cititoarelor de microplăci BioTek.

Metodele pe bază de cuvetă sunt tradiționale și implică de obicei diluarea eșantionului. În timp ce instrumentele sunt de obicei ieftine, ușor de utilizat și oferă măsurători precise, acestea oferă un debit limitat, în care măsurătorile sunt luate pe un eșantion la un moment dat. În unele cititoare de microplăci BioTek, un port dedicat pentru cuvetă este o caracteristică opțională, alternativ, fie o BioCell, fie o cuvetă poate fi utilizată cu accesoriul Take3 & trade.

Microplăcile sunt de unică folosință, fabricate în mod obișnuit din materiale plastice, inclusiv versiuni cu un nivel scăzut de proteine. Lumina specifică lungimii de undă de la un spectrofotometru de microplacă se mișcă vertical (Figura 1) prin sondă și probă. Deoarece volumul eșantionului poate varia în format de microplacă, trebuie aplicat un factor de corecție a lungimii căii pentru a standardiza rezultatele la cea a unei lungimi a căii de 1 cm. Software-ul de analiză a datelor BioTek & rsquos Gen5 & trade poate calcula automat lungimea traseului eșantionului măsurând vârful de absorbanță al apei la 977 nm și 900 nm. Diferența este apoi împărțită la 0,18, care este absorbanța apei la 1 cm, egal cu lungimea căii probei & rsquos. Procedura pas cu pas Gen5 este după cum urmează:

Corecția și cuantificarea automată a lungimii traseului BioTek & # 39 (exemplu de proteină):
1. A977 & ndash A900 OD eșantion / 0,18 OD = lungimea căii probei (în cm)
2. A280 proba & ndash A280 gol / lungimea traseului eșantionului = DO corectat la 1 cm
3. DO corectat la 1 cm * coeficient de extincție = concentrația de proteine ​​în sondă (în & cană / ml)

Cuantificarea proteinelor pe bază de microplăci oferă o cantitate crescută de probe și capacitatea de a citi probe de concentrație mai mare datorită capacității de a citi la lungimi mai scurte ale traseului în raport cu măsurătorile cuvei de 1 cm. În plus, semifabricatele, curbele de calibrare și probele pot fi pregătite și citite pe aceeași placă, aproape simultan, minimizând timpul de incubație și variațiile de temperatură, rezultând o precizie crescută.

Placa de micro-volum Bio3 și rsquos Take3 (Figura 2) prezintă 16 micro-spoturi pe diapozitive de sticlă personalizate, potrivite pentru analiza micro-volumului. La încărcarea probelor, placa formează o cale optică verticală fixă ​​de 0,5 mm, evitând necesitatea diluării probelor foarte concentrate. După citirea probelor în cititoarele de microplăci BioTek, acestea pot fi recuperate sau lamele curățate, deoarece suprafața rezistă în general la legare. Rețineți, de asemenea, capacitatea de a efectua determinări ale lungimii traseului de 1 cm cu cuve standard sau BioCells.

Figura 2. Accesoriu pentru microplacă Take3 care ilustrează cele 16 micro-spoturi, 2 BioCells și o cuvă standard cu capac.

Metode de cuantificare a proteinelor

Reziduurile de aminoacizi conținute într-o proteină oferă mijloacele de cuantificare prin spectrofotometrie de absorbanță. Unele resturi de aminoacizi conțin cromofori naturali, cum ar fi inelele fenilice conținute în triptofan, tirozină și fenilalanină, altele oferă grupări funcționale care pot fi vizate cu reactivi colorimetrici. Numărul acestor aminoacizi variază foarte mult de la proteină la proteină, prin urmare, absorbtivitatea molară dintre proteine ​​poate varia foarte mult. În plus, preparatele de probă pot conține agenți de interferență cu spectre de absorbție similare, cum ar fi ADN, sau detergenți și tampoane care pot afecta derivatizarea cu reactivi colorimetrici. Fiecare poate face inexacte măsurătorile eșantionului. Ca rezultat, formatul de testare trebuie ales în funcție de debitul dorit, cantitatea de probă disponibilă, precizia necesară și luarea în considerare a prezenței potențialilor contaminanți. Tabelul 2 include cele mai frecvente analize de cuantificare a proteinelor bazate pe absorbanță utilizate în prezent.

masa 2. Metode comune de cuantificare a proteinelor cu intervale tipice de cuantificare.

Absorbanta de proteine ​​native

Cea mai rapidă și simplă metodă de cuantificare a proteinelor este prin măsurarea absorbției ultraviolete (UV) la 280 nm (A280), prin care lumina absorbită de proteină se corelează direct cu concentrația proteinelor în conformitate cu legea Beer-Lambert. Majoritatea proteinelor au o absorbanță maximă la această lungime de undă datorită prezenței aminoacizilor aromatici triptofan, tirozină și fenilalanină. Măsurătorile A280 rămân populare, deoarece sunt rapide, nu necesită reactivi suplimentari, sunt nedistructive și oferă un interval dinamic liniar bun. De asemenea, în unele cazuri, dacă o probă conține o proteină foarte purificată (adică pentru analiza structurală prin dicroism circular sau cristalografie cu raze X) și se cunoaște absorbția sa molară, concentrațiile pot fi determinate fără a fi necesare curbe de calibrare.

Figura 3 demonstrează capacitățile multi-volum ale cititoarelor de microplăci BioTek & rsquos. În figură, se fac comparații între vasele tradiționale de 1 cm lungime a căii, cum ar fi BioCell cu capacitățile de micro-volum (0,05 cm) ale accesoriului pentru microplacă Take3. Acest lucru a fost efectuat cu două instrumente diferite: un cititor de microplacă de absorbanță (Epoch & trade) și, de asemenea, un cititor de microplacă multi-mod cu capacitatea de a detecta mai multe moduri de detecție, cum ar fi fluorescența, luminescența etc. (Synergy & trade 4). Linia dreaptă nu se potrivește cu punctul de date, ci reprezintă o pantă de 1 prin origine. Astfel, punctele de date care cad pe linie demonstrează o echivalență de măsurare. Performanța echivalentă este evidentă pe mai multe volume și pe instrumentele BioTek.

Figura 3. Comparații între determinările lungimii traseului de 1 cm (BioCell) și analiza micro-volumului (Take3) utilizând absorbanța proteinelor native la A280. Graficul din stânga sus ilustrează porțiunea extinsă a graficului mai mare la concentrații scăzute de BSA.

În aplicațiile care explorează profilarea expresiei proteinelor, eșantionul constă din multe proteine ​​diferite, toate fiind exprimate în cantități diferite, fiecare cu abundență variabilă a aminoacizilor care conțin inel fenilic. Prin urmare, absorbtivitățile molare nu pot fi cunoscute. De obicei, o curbă de calibrare utilizând o proteină model, cum ar fi albumina serică bovină (BSA) este utilizată pentru a interpola concentrațiile amestecului de proteine ​​din eșantion din măsurători OD. Desigur, va exista o anumită inexactitate în această metodă, măsura determinată de cantitățile relative de expresie ale fiecăreia dintre proteine ​​și de abundența lor relativă de aminoacizi care conțin inel fenilic comparativ cu BSA. În timpul procesului de izolare a proteinelor, este de asemenea posibil să existe tampoane de eluție și alți constituenți ai probei să interfereze cu cuantificarea. Aceste substanțe interferente includ acizi nucleici, lipide și carbohidrați care pot absorbi la 280 nm, rezultând astfel o distorsiune. Prin urmare, cu excepția cazului în care proba constă dintr-o proteină individuală foarte purificată, determinările de proteine ​​A280 sunt cele mai potrivite pentru o evaluare rapidă care oferă o estimare a concentrației totale de proteine.

Analize colorimetrice

Utilizarea reactivilor colorimetric tinde să ofere determinări de sensibilitate mai mari în raport cu A280. Protocoalele standard solicită de obicei un exces mare de reactiv de lucru în raport cu proteina pentru a asigura generarea semnalului maxim din proba de proteine. Doi dintre cei mai comuni reactivi colorimetrici sunt descriși mai jos.

Testul acidului bicinchoninic colorimetric (BCA) se bazează pe legături peptidice din proteine ​​pentru a reduce Cu2 + la Cu + în condiții alcaline. Ionii Cu + chelează apoi cu două molecule BCA, producând un complex violet care absoarbe puternic la 562 nm. Testul BCA folosește același principiu ca testul Lowry mai vechi, cu modificări care duc la formarea unui reactiv de detecție mai stabil în condiții alcaline și care necesită doar un proces cu o singură etapă. Testele BCA sunt mai puțin afectate de variațiile structurale ale proteinelor decât metodele spectroscopice UV, deși generarea semnalului este proporțională cu numărul de legături peptidice din proteina expusă mediului apos. Reactivul este compatibil cu mulți surfactanți utilizați pentru solubilizarea proteinelor.

Testul BCA necesită o curbă standard (Figura 4) care se execută simultan cu proba și o etapă de incubare necesară. Testul BCA este incompatibil cu chelatori de cupru, tampoane cu capacitate mare de tamponare și agenți reducători. Sensibilitatea mai mare a testului BCA în raport cu absorbanța proteinei native la A280 este evidentă în Figura 4.

Figura 4. Curbele de calibrare pentru albumina serică proteică bovină (BSA) utilizând atât absorbanță nativă la A280, cât și cu reactivul colorimetric BCA. Analiza micro-volumului cu probe de 2 ml pe accesoriul de microplacă Take3 cu cititor de microplăci BioTek & rsquos Epoch.

Testul Bradford

Testul colorimetric Bradford poate fi utilizat pentru a măsura rapid concentrația de proteine ​​prin utilizarea colorantului Coomassie Brilliant Blue G-250. În soluțiile acide, colorantul se află într-o formă roșie încărcată negativ, care donează electroni grupelor ionizabile proteine ​​și rsquos, rezultând o denaturare parțială a proteinei. Porțiunea hidrofobă a colorantului se leagă apoi de buzunarele hidrofobe expuse, iar regiunea încărcată negativ creează legături ionice cu grupuri aminice încărcate pozitiv din apropiere ale proteinei. This results in a visible shift to a stable blue form with an absorbance spectrum maximum at 595 nm indicative of protein levels in solution.

The Bradford assay is faster and more stable than the aforementioned BCA assay, however, the response will vary with protein composition and is susceptible to interference, and possible formation of precipitate, by elevated detergent and buffer concentrations. The assay requires use of a standard curve, run at the same time as the sample, and may require sample dilution to fit within the linear range of the assay due to nonlinearity at very high protein concentrations.

Micro-Volume In-Situ BCA Analysis

Micro-volume methods, using a modified protocol that calls for changes in the relative concentrations of protein and BCA working reagent from a 20:1 volume ratio of BCA working reagent to protein to a 1:1 ratio, can shift the working range of the BCA calibration curve relative to microplate- or cuvette-based measurements. The Take3 plate is particularly suited for this modified protocol as sample and working reagent can be sequentially added directly to the microspots of the Take3 plate and the reaction incubation and subsequent analysis performed therein. This &ldquoin-situ&rdquo assay workflow (Figure 5) is simple and resembles the workflow for a typical microplate assay where reagents and samples are added sequentially to microplate wells without the need for offline color development. This significantly improves ease of use. Further, as only 2 &muL of sample is consumed, this promotes sample conservation.

Figura 5. In-situ work flow for micro-volume BCA analysis using a 1:1 BCA working reagent to sample ratio with Take3 accessory. Total assay volume is 4 &muL.

The in-situ work flow provides two main advantages over the standard 20:1 protocols. First, the assay volume is only 4 &muL, which leads to fast reaction kinetics. The reaction is complete in less than 30 minutes compared to the typically recommended 2 hours in the 20:1 protocol. Also, the sensitivity of the assay is improved by the significant reduction in protein dilution with the BCA reagent, which extends the dynamic range to much lower protein concentrations to a limit of quantification of about 0.01 mg/mL BSA (Figure 6).

Figura 6. Take3 micro-volume analysis comparison between an in situ assay and one conducted in a micro-centrifuge tube using a 20:1 volume ratio of BCA working reagent to BSA standard.

Protein Purity Assessment

In addition to protein quantification, an assessment of protein purity is essential for downstream applications. The A260/A280 ratio, where samples are measured at the nucleic acid absorbance peak (A260) and again at the protein absorbance peak (A280), is commonly used to approximate nucleic acid purity. This measurement may also be used to estimate protein purity where a ratio of 0.60 is generally indicative of a pure protein sample.

As seen in Table 3, very low levels of nucleic acid contamination can have a large effect on the A260/A280 ratio when estimating protein purity. Proteins are generally considered pure if results indicate 95-99% purity, depending on the downstream application. Confirmation of protein purity can be achieved by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis or the more sensitive silver staining method can be used to determine the purity of proteins present at very low concentrations.

Table 3. Calculated percent accuracy determinations from spectral data of varying DNA/protein mixtures. Extinction coefficients of 50 ng/&muL/OD and 0.667 &mug/&muL/OD for DNA and protein, respectively, were used to compare calculated determinations versus expected values, expressed as percent accuracy.

Best Practices

  • The assay method should be best suited to the sample type and conditions.
  • Use appropriate precautions to protect samples from foreign debris and contamination.
  • Replicate sample testing improves result confidence.
  • Colorimetric protein assays require standard curves each time the assay is performed.
  • When working in microplate formats, choose flat-bottomed and optically clear plates.


Protein Quantification via BioTek&rsquos Microplate Instruments

BioTek has a number of microplate-based instruments for protein measurement via absorbance and fluorescence.


Measuring protein concentration, Bradford vs. Nanodrop? - Biologie

Biophotonics is the study of the interaction of light with biological material (Lague, 2005). Through the use of light, many properties of living and nonliving things can be discovered. Among those things possible is the identification of a substance by its protein concentration as determined from spectrophotometry and the usage of a Bradford assay. The purpose of this lab was just that – to identify two unknown substances by their calculating their protein concentrations and then comparing them to a table of known values.

In the Bradford assay, we used the dye Coomassie G-250 which binds to proteins mostly at arginine but also at tryptophan, tyrosine, histidine and phenylalanine residues (Olson, 2007). When the dye is allowed to interact with a substance that contains protein, the arginine groups of the protein bind to Coomassie. This converts Coomassie G-250 which reaches its maximum absorbance potential at 595 nm and turns blue (Olson, 2007). Coomassie without the influence of protein is a brown color. Using these properties, we were able to prepare a set of standards using known protein concentrations. To calculate absorbances of the standards and the unknown samples, we used spectrophotometry. A spectrophotometer consists of a spectrometer to produce light of a specific color and a photometer to measure the intensity of the light (Caprette, 2005). Therefore, if a container (or more formally, a cuvette) of liquid of some opacity is placed between the spectrometer and the photometer, the photometer reader would change depending on the amount of light able to pass through the cuvette and the absorbance level could be recorded. Using these methods, we were able to measure the absorbances of the standards, plot them, and use them as our basis for concluding the identities of two unknown substances.


What is Lowry Protein Assay?

Lowry protein assay is a biochemical assay used to determine the total level of protein in a solution. Oliver H. Lowry is the person who developed this reagent in 1940. The procedure depicts the total protein concentration of the solution by a color change that is proportional to the protein concentration in the solution. Hence, this is also a colorimetric protein assay.

The reaction between copper ions (Cu+) produced by the oxidation of peptide bonds and Folin–Ciocalteu reagent is the basis of this procedure. Also, this reagent contains phosphomolybdic acid and phosphor-tungstic acid. However, the reaction mechanism of Lowry protein assay is not well understood. But it involves the oxidation of cysteine, tryptophan and tyrosine residues by the reduction of Folin–Ciocalteu reagent.

Figure 02: Lowry protein assay

The cysteine residues contribute to the absorbance observed in Lowry protein assay and the reaction results in a brilliant blue molecule heteropoly molybdenum blue. The reduction of this molecule is measured by absorbance at 660nm. Hence, the concentration of cysteine and tryptophan residues that reduced Folin–Ciocalteu reagent deduces the total concentration of the protein in the solution.


COMMENTARY

Background Information

Protein-protein interactions play essential roles in many cellular processes, including signal transduction, cargo transportation, and antigen recognition, among others (Kuzmanov & Emili, 2013 Skipper, 2005 Stelzl et al., 2005 ). Specific and efficient labeling of a protein can help in the study of protein-protein binding interactions and avoid artifacts associated with nonspecific or heterogeneous labeling (Seidel et al., 2013 ). As discussed in this unit, an NHS ester can be used for N-terminal site-specific protein labeling. This easy-to-apply labeling method provides site-specific, stoichiometric labeling of a protein of interest. We have described detailed methods for converting commercially available NHS esters bearing different labels to a thioester in situ and subsequently attaching it to the N-terminal Cys of a recombinant protein via an NCL reaction mechanism.

The early version of the NCL reaction was first reported by Wieland et al., who demonstrated that a Cys amino acid can rapidly react with the C-terminal thioester of another amino acid derivative (Wieland, Bokelmann, Bauer, Lang, & Lau, 1953 Fig. 2A). Four decades later, this concept was expanded to produce proteins by total synthesis or semisynthesis (Dawson et al., 1994 Muir et al., 1998 ). We describe here a method that utilizes the Wieland reaction by first converting an NHS ester to a thioester in situ with a thiol reagent (MESNa). Then, the thioester derivative reacts with a protein N-terminal Cys revealed after proteolysis with TEV or SUMO protease. The label thus attaches to the protein N-terminus via a stable amide bond (Fig. 2B). Notably, this labeling process can be quickly adopted by most molecular biology labs, even if they lack synthetic chemical experience or facilities. Specificity and high stoichiometry of the process are readily achievable. Even considering that Lys is one of the most abundant residues in proteins (Brooks et al., 2002 ), the level of nonspecific labeling of Lys residues is estimated to be <0.5% per site on a protein subjected to the labeling procedure described here, compared to nearly 90% for N-terminal Cys labeling (Dempsey et al., 2018 ).

MST is an emerging technique that applies thermophoresis, the motion of molecules in a temperature field, to characterize biomolecular interactions (Asmari et al., 2018 ). MST refers to the motion of molecules in a microscopic temperature gradient. A temperature gradient induces not only a flow of heat but also a flow of biomolecules (Jerabek-Willemsen et al., 2011 ). The coupled heat flow and mass flow is known as the Ludwig-Soret effect, or thermophoresis. Thermophoresis is dependent on the size, charge, and solvation entropy of the molecules (Braun & Libchaber, 2002 ). These factors all contribute to the Ludwig-Soret effect by influencing the Soret coefficient, a ratio of Fickian and thermal diffusion coefficients (Niether & Wiegand, 2019 ). Proteins usually are “thermophobic,” meaning the thermophoresis of a protein has a direction from a hot zone to a cold zone (Iacopini & Piazza, 2003 ). The thermophoresis of a protein typically differs from the thermophoresis of a protein-ligand complex, meaning that complex formation can be evidenced as a change in the Soret coefficient.

A major advantage of MST over other fluorescence-related techniques is its ability to measure size changes and subtle changes in surface area, charge, or conformation upon occurrence of a binding event. MST requires relatively small volumes and shorter times (within minutes), making it a relatively high-throughput method (Rainard, Pandarakalam, & McElroy, 2018 ). In contrast to non-fluorescence-based techniques such as SPR, MST does not require an immobilized system, which can give rise to surface effects (Baksh, Kussrow, Mileni, Finn, & Bornhop, 2011 Schuck, 1997 ). ITC, another label-free method that measures the enthalpy of a binding event in a time-dependent manner, requires large amounts of materials and longer times compared to MST (Wiseman, Williston, Brandts, & Lin, 1989 ). Compared to other fluorescence-based techniques, MST is sensitive to a broader range of physical changes (size, charge, hydration shell, and conformation, among others). For example, fluorescence polarization (FP) measures the fluorescent molecule's rotational motion, which reflects only the size change of the molecule (Dandliker & Feigen, 1961 ). This feature helps MST users determine binding affinity via a subtle shift in protein size, something that FP experiments cannot track.

Protein-protein interaction measurements are the focus of this protocol, with the goal of generating a dissociation constant, KD. Competition assays can also be performed using MST. Moreover, MST experiments can also be used to study cooperativity in protein-protein binding, in which a third component can serve as an allosteric regulator that may enhance or weaken the interaction between two proteins. A well-labeled protein can also be used in MST for the analysis of small molecule–protein interactions (Jerabek-Willemsen et al., 2011 ), making the technique applicable to drug-discovery programs. Furthermore, nucleic acid–protein or nucleic acid–small molecule interactions can also be measured by MST to study gene expression and RNA macromolecular systems (Corbeski et al., 2018 Moon, Hilimire, Sanders, & Schneekloth, 2018 ).

Three types of reagents and techniques are commonly used for fluorescent labeling of proteins for MST studies: (1) Amine labeling directly with NHS esters (2) Cys labeling with a maleimide group and (3) multi-histidine tag labeling with a Ni + fluorescent tag. However, these methods can result in nonselective, nonhomogeneous labeling, which may affect the accuracy in the binding measurement. For example, Cys and Lys residues might play essential roles for enzymatic functions or might be located at the binding interface, and the labeling of these important residues might affect the structure or function of the protein of interest (Spicer & Davis, 2014 Tonazzi, Giangregorio, Palmieri, & Indiveri, 2005 ). The His tag itself might change the charge or oligomeric states of proteins, and the presence of metals such as Ni + that are used to coordinate fluorophores to the His tag may lead to unintended consequences (Booth et al., 2018 ). Also, a heterogeneous population may result in complex binding behaviors (Kastritis & Bonvin, 2013 ). N-terminal labeling with a thioester generated in situ from an NHS ester can circumvent these liabilities. As described here, single-site (N-terminal Cys) labeling and high stoichiometry are readily obtained. As the N-terminus of a protein is often unstructured and peripheral to function, the addition of fluorescent molecules to that site is generally well tolerated.

Another advantage of the NHS ester labeling methods presented in this article is their compatibility with the vast number of commercially available NHS esters that include fluorophores NHS esters and crosslinkers, spin labels, and affinity-tag NHS esters. In this sense, the application of the NHS ester labeling methods can be further extended beyond protein-protein interactions to proteomics studies, NMR-based structure studies, and signaling pathway studies, among others.

Critical Parameters

Choosing the fluorophore NHS ester

Users should choose the proper fluorophore NHS ester to use depending on instrument availability and detector channel (green, blue, or red) of the MST instrument. The stability and aqueous solubility of NHS esters also need to be considered. Some NHS esters may have high solubility in organic solvents but lower solubility in aqueous solutions. As organic solvents often tend to denature proteins, a fluorophore NHS ester that has better aqueous solubility should be preferred for protein labeling. An advantage of using NHS esters, as described in this protocol, is that over a thousand of them are commercially available, providing a wide variety to choose from. Users can easily find alternatives for a specific detector channel. For example, the dye Cy5 is widely used for red detector channels however, the Cy5-NHS ester dissolves poorly in aqueous solution (∼0.19 mM in buffered water). In this case, alternatives to Cy5, such as Alexa Fluor 647 NHS ester, NT-647 NHS esters, or Sulfo-Cy5 NHS ester (>10 mM in buffered water), can be used instead.

On the other hand, the choice of the fluorophore NHS ester should also be based on the needs of the specific research project. Fluorophores differ in their extinction coefficient and quantum yield, and thus some might be brighter or have enhanced photostability (Brelje et al., 2002 ). Another factor that affects the MST measurement is the sensitivity of the detector. For example, as the Pico Red detector has higher sensitivity than the Nano Blue detector (lowest working concentrations: 50 pM for Pico red versus 5 nM for Nano Blue), the Cy5 dye typically gives a higher fluorescence signal than fluorescein at a given concentration. When fluorescence intensity is a limiting factor in the MST measuring conditions, switching from fluorescein to the more expensive Cy5 label might facilitate acquisition of better-quality data. Other fluorophores in the red channel, such as NT-647 and Alexa Fluor 647, are also recommended.

NHS ester concentration

The concentration of NHS ester used should be determined by the reaction needed but also influenced by the solubility of the reagent. In most cases, using 1-2 mM NHS ester is recommended, as it is beneficial for it to be in large excess over the N-Cys-containing protein, whose concentration usually ranges from 5 to 100 μM. In such a pseudo-first-order reaction, the rate is proportional to the concentration of the NHS ester employed.

Labeling buffer

A proper labeling buffer composition keeps the protein stable throughout the labeling reaction. The reducing agent TCEP is added to prevent Cys oxidation to disulfides and other species. Other thiol-reducing reagents such as dithiothreitol (DTT) or β-mercaptoethanol (BME) should be avoided, as they may generate less reactive thioesters than MESNa. When labeling proteins with disulfide bonds, reducing agents such as TCEP should be depleted in the reaction buffer and be avoided in buffers through the purification steps. Glycerol should be avoided in the labeling buffer as the impurities associated with it can react with the N-Cys and reduce reaction yield. After the labeling reaction is completed, generating stable amide bonds, adding back glycerol for protein storage or stability purpose will not reverse the reaction.

Labeling reaction time

The recommended reaction time is 24-48 hr. Based on our experience, ∼65% of labeling occurs in 24 hr at room temperature, and the reaction plateaus by 48 hr. However, the reaction rate is also affected by temperature, ionic strength, and pH, so users might need to adjust the reaction time based on specific reaction settings. In general, if cold temperature is desired because the labeled protein is unstable at room temperature, we recommend performing the reaction at 4°C for 36-48 hr. Usually, 24 hr is sufficient at room temperature if the extent of labeling is low, the reaction can be extended for longer.

Labeling reaction pH

A pH of 6.8-7.0 is recommended. Although raising the pH to 8 will generally increase the reactivity of the N-terminal Cys, it will also increase the reactivity of other primary amine groups, leading to nonspecific labeling. It is also important to keep the pH at around 6.8-7.0 during the removal of excess dye by dialysis or with a desalting column, as elevated pH at this step might lead to some nonspecific labeling.

Quenching the reaction and removing the dye

Cysteamine or cysteine (50-200 mM) are used for quenching the reaction, as they compete with N-Cys for reaction with the thioester. Adjust the pH of the quenching solution to pH 6.8-7.0 before adding it to the reaction. After quenching, expeditious removal of the excess dye molecules is beneficial to reduce nonspecific interactions. As described in Basic Protocol 2, users should perform two rounds of dialysis for ∼4-10 hr using dialysis tubing with the appropriate molecular weight cutoff alternatively, 1-2 rounds with a desalting column should successfully remove >99% of the residual dye. Further purification with size-exclusion column or ion-exchange chromatography is also recommended, to remove the residual dye or aggregated/degraded protein that, in rare cases, forms during the labeling reaction.

Working concentration for the ligand and target protein

In any binding experiment, the concentration of unlabeled ligand should be carefully determined before the assay, as errors in ligand concentration will propagate into mischaracterization of the KD value. This applies to protein ligands but is also crucial for other biopolymers and small molecules. If the binding is expected to be of high affinity, a lower stock concentration of the unlabeled ligand is acceptable. It should be noted that different detectors have different upper and lower detection limits. For example, 50 pM is the lower limit for the Pico Red detector, and for the Nano Blue detector, it is 5 nM. Further, regarding fluorescence intensity, the Nano Blue detector saturates at 2500 counts, and the Pico Red detector saturates at 25,000 counts.

MST sample preparation

MST uses a small volume of protein: 8 µl of a sample can fill a capillary. However, we usually use a minimum of 20 µl in small plastic tubes to avoid volume alteration by evaporation, insufficient mixing, and pipetting errors. Choosing the proper containers for sample preparation (such as PCR tubes) is important, as higher-volume tubes have a higher surface area, increasing the amount of protein that sticks to the tube's walls.

Binding check experiment

A binding check experiment can be conducted before the standard MST measurement. This is a good way to know if the binding event triggers enough thermophoresis changes on a fluorescent-labeled protein to be measurable by an MST instrument. A two-point (zero and highest ligand concentration) MST measurement is performed before the serial titration binding affinity experiment. The low ligand concentration points represent the target protein's unbound state, and the high ligand concentration points represent the bound state between the target protein and its ligand. Usually, if the unit difference in Fnorm for the unbound vs. the bound state is >5, this indicates that the serial titration experiment has a large enough signal-to-noise ratio to enable the KD value to be obtained from the MST measurement.

Analysis of the MST trace

It is important to choose a proper time range for the analysis of MST traces. The default time range by MO.Affinity Analysis software to conduct analysis is 1.5, 2.5, 5, 10, 15, or 20 s of on-time (time that the laser is on). Generally, it is recommended to use the shortest on-time that gives a good signal-to-noise ratio. Longer on-times are more likely to be associated with confounding convection effects.

Troubleshooting

Please see Table 1 for a list of common issues and potential solutions.

Issue Possible reason Soluţie
Low percentage of TEV/SUMO protease cleavage The ratio of protease to the protein used is low the protease activity is low the cleaving buffer is not compatible with TEV/SUMO cleavage Increase the amount of protease add and use fresh protease. TEV/SUMO protease activity can be inhibited by certain detergents (Vergis & Wiener, 2011 ). Consider conducting a buffer exchange to remove these detergents before adding the protease.
NHS ester not fully dissolved The NHS ester used has low aqueous solubility the thioester conversion by MESNa is incomplete Dissolve the NHS ester in a small amount of organic solvent (e.g., DMSO) first and then dilute with aqueous buffer. Consider a change to a more soluble form of the NHS ester. Extend the MESNa treatment time to allow full conversion.
Protein precipitation during the concentration process Protein has low solubility or is sensitive to mechanical force Add glycerol (to 10% [v/v] final) before the start of the concentration process. Adjust the concentration temperature from 4°C to 18°C, as higher temperature may improve solubility. Avoid long centrifuge runs (>10 min), and gently mix the protein solution in between the runs or use ammonium sulfate precipitation to concentrate the protein.
Low labeling efficiency The concentration of protein or NHS ester in the labeling reaction is too low the N-terminal Cys of the target protein is oxidized The protein concentration is directly related to the reaction rate. Try to concentrate the protein first before mixing with the thioester labeling reagents. Add reducing agent (1 mM TCEP is recommended) during protein purification and labeling to protect the Cys from oxidation/formation of a disulfide bond. Near-stoichiometric (>90%) labeling is hard to achieve and unnecessary, especially when the KD is much greater than the target protein concentration. However, as the unlabeled protein is still capable of binding to the ligand and affecting the equilibrium, it is important to consider the total protein concentration and not just the concentration of labeled protein in KD calculations.
High nonspecific labeling NHS ester is not fully converted to the thioester labeling reaction time is conducted for too long, or pH is not maintained in 6.8-7.0 range Extend the MESNa incubation time or increase MESNa concentration. The NHS ester itself does not have N-terminal Cys labeling selectivity it needs to be fully converted to thioester by MESNa. Or decrease the NHS ester concentration used to 1 or 0.5 mM. Shorten the labeling reaction time from 24 hr to 6 or 12 hr. Lower the reaction buffer pH from 6.8 to 6 or 6.5.
The fluorescence signal is too low for MST Target protein concentration used is too low LCD excitation power is too low Increase the fluorescent-labeled protein concentration. Increase the LCD power.
Fluorescence intensity is too high for MST Too much target protein is used the LCD excitation power is set too high Lower the concentration of fluorescent-labeled protein. Lower the LCD power.
High variation in fluorescent intensity among capillaries The target protein was not mixed well a large pipetting error occurred a buffer dilution effect may be occurring aggregation may have occurred Mix the target protein well when diluting or mixing with the ligand. Be careful when pipetting, and double-check the volume after each pipetting step. The buffer used to prepare the dilution steps should be of precisely the same composition as the ligand working solution. Centrifuge the samples after thawing before starting the experiment.
Sticking or adsorption to the capillary surface, or the fluorescence peak shows a shoulder peak or asymmetric peak The standard capillary glass surface is prone to have protein stick to it the target protein is less stable and tends to stick to the glass surface Use premium capillaries (NanoTemper MO-K025). Add different detergents in the assay buffer, such as NP-40 (0.01-0.05%) or Pluronic F-127 (0.01-0.05%). Add stabilizing additives such as BSA, casein to the assay buffer.
Aggregation during MST measurement Target protein or ligand is not stable Use premium capillaries. Optimize the assay buffer condition (detergents, additives, salt concentration, pH). Consider lowering the MST power—MST utilizes an IR laser to generate the thermal gradient, and thus a portion of the protein might be destabilized and start to aggregate during the thermal gradient (2-6°C).
Ligand-induced fluorescence change Fluorescence quenching enhancement by the ligand may have occurred ligand-induced aggregation or nonspecific adsorption to the capillary may have occurred Perform an SD test, a solubility test of denatured samples in SDS: Mix 10 μl each of supernatant from tubes 1-3 (high ligand concentration) and tubes 14-16 (lowest ligand concentration) of the MST mix with 10 μl 4% SDS/40 mM DTT, and incubate 5 min at 95°C. Fill the capillaries with the incubated samples and record the fluorescence intensity. If fluorescence intensity from all samples is identical, the intensity change is due to a binding event the binding-induced fluorescence changes can then be used directly to determine the binding affinity. Otherwise, optimize the assay condition to prevent aggregation or adsorption.
Low signal-to-noise ratio in the MST curve The ligand concentration is too low compared to the KD the binding induced thermophoresis cannot be readily discriminated from background noise Increase ligand working concentration. Adjust the MST power, buffer composition, labeling dye, and ligand concentration. Also, consider reversing the assay design by swapping the labeling reaction from the target protein to the ligand.

Understanding Results

By following the labeling and purification procedure described in Basic Protocol 1 (or Alternate Protocol) and Basic Protocol 2, users can obtain an N-terminally fluorescent-labeled protein of interest. Following Basic Protocol 3, the binding affinity of the labeled protein of interest to an unlabeled binding protein partner can be accurately measured by MST binding assays.

As we describe in the example outlined in Basic Protocol 4, we generate N-terminal fluorescein-labeled protein FAM-WWP2 using 5/6-carboxyfluorescein NHS ester. The FAM-WWP2 is purified to 2 mg/ml, with ∼80% labeling efficiency. We use a working concentration of 50 nM FAM-WWP2 in the MST binding assay. We also prepare the ligand E2 protein at a working concentration of 1.5 mM. With the MST pre-test, MST assay conditions are validated, as indicated by symmetric fluorescence peak with ∼300 intensity, and smooth MST traces are obtained (Fig. 4A and 4B). We prepare 16 serial concentrations of ligand E2 by 1:2 dilution and measure the binding affinity to FAM-WWP2 in the MST binding assay. The capillary scan and MST traces are recorded with symmetric fluorescence peaks and smooth MST curves (Fig. 4C and 4D). After gathering data from three MST measurement replicates, we use the Monolith analysis software MO.Affinity Analysis to fit the binding data. We plot a dose-response curve and select the KD model to calculate the binding affinity between E2 and WWP2 proteins. The final calculated KD value is 9.6 ± 1.1 μM (Fig. 4E).

Time Considerations

There are two main components for consideration in this protocol: NHS ester labeling and MST binding assays. A general outline of the timeline to complete each step for the study of a protein of interest and its binding to one ligand is given below, which may vary depending on protein expression systems, protein characteristics, and MST instrument/detector.

Protein expression and purification (for the target and binding partner): 3 days to 6 weeks (highly dependent on the expression system used)

Labeling the protein N-terminal with NHS esters: 2-3 days

Purification of N-terminal labeled protein: 1-3 days

MST measurements of protein binding affinity: 1-2 days.

Mulțumiri

We thank Dr. Kelly Arnett for helpful comments and discussion and the Center for Macromolecular Interactions at the Harvard Medical School Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology for assistance with MST measurements. We thank the US National Institutes of Health for grant funding (R01CA74305).

Conflict of Interest Statement

Autorii declară că nu au conflicte de interese.

Author Contributions

Hanjie Jiang: Conceptualization data curation formal analysis investigation methodology writing-original draft. Philip A. Cole: Conceptualization funding acquisition methodology resources supervision validation writing-review & editing


Priveste filmarea: Dispozitiv Renson pentru măsurarea concentrației de dioxid de carbon din încăperi (Decembrie 2021).