Informație

Este corect să folosiți termenii multinucleați și sincitia în mod interschimbabil?


Dacă vedeți mușchiul scheletic, acesta are mai mulți nuclei și se spune că este „multinucleate"În mod similar, mușchiul cardiac are, de asemenea, mai mulți nuclei, dar este numit în mod specific"sincițialăDeci întrebarea mea este: Există vreun motiv în spatele acestui lucru sau termenii sunt interschimbabili? Listez sursele din care mi-a venit întrebarea în minte:

[Sursa1]

Fibrele musculare individuale se formează în timpul dezvoltării din fuziunea mai multor celule imature nediferențiate cunoscute sub numele de mioblaste în lungi, cilindrice, multi-nucleate celule. Diferențierea în această stare se finalizează în primul rând înainte de naștere. [Sursa2]

Cardiacul sincițiul este o rețea de cardiomiocite conectate între ele prin discuri intercalate care permit transmiterea rapidă a impulsurilor electrice prin rețea, permițând sincițiului să acționeze într-o contracție coordonată a miocardului. [Sursa3]


Nu, termenii multinucleați și sinciți nu sunt sinonimi în acest context. Majoritatea cardiomiocitelor nu sunt multinucleare. Pentru a fi clar, sincițiul este folosit pentru a se referi la celulele multinucleare care provin din fuziunea celulelor uninucleare, inclusiv a mușchiului scheletic, dar nu la asta se face referire în contextul mușchiului cardiac.

Pagina Wikipedia despre sincițium rezumă acest lucru frumos:

Prin urmare, țesutul cardiac este descris ca un sincițiu funcțional, spre deosebire de sincițiul adevărat al mușchiului scheletic.

„Discurile intercalate” ale mușchiului cardiac sunt umplute cu joncțiuni gap și desmosomi. Desmosomii țin celulele împreună fizic, în timp ce joncțiunile de spațiu permit ionilor (și moleculelor mici) să treacă direct între celule, formând „sinapse electrice”. Acest lucru permite propagarea semnalelor electrice între miocite pentru a coordona contracția.

Joncțiunile gap sunt formate din proteine, mai degrabă decât prin fuziuni ale membranei plasmatice, deci sunt relativ mici. Aceasta înseamnă că nu totul din citoplasmă poate trece prin ele, mai ales doar ioni și câteva molecule mici. Proteinele, de exemplu, nu ar trece prin joncțiuni. Prin urmare, celulele care sunt conectate prin joncțiuni gap, cum ar fi cardiomiocitele, sunt încă oarecum independente, spre deosebire de celulele complet multinucleare.

Există, de asemenea, tipuri de neuroni, inclusiv unii în SNC, care formează, de asemenea, joncțiuni de decalaj și acționează cel puțin oarecum concertat în acest fel.


Doar pentru a adăuga câteva informații legate de terminologia biologică în ansamblu, nu numai pentru mușchiul cardiac (care a fost deja corect abordat în răspunsul acceptat):

Multinucleate și sincițiul sunt nu sinonime și nu pot fi utilizate interschimbabil.

După cum arată clar numele, multinucleate se referă la o celulă (unică) care conține mai mulți nuclei.

Cu toate acestea, conform mecanismului de formare a unei astfel de celule, poate fi clasificat ca:

  • Coenocit: atunci când o singură celulă cu un singur nucleu efectuează mai multe diviziuni celulare fără a diviza citoplasma (citokineza);
  • Syncytium: când mai multe celule uninucleate se agregă, formând o singură celulă multinucleată.

Prin urmare, fiecare sincițiu este o celulă multinucleată, dar nu fiecare celulă multinucleată este o sincițiu.


Amibă

Un amibă (/ ə ˈ m iː b ə / mai puțin frecvent ortografiat amibă sau amibă plural am (o) ebas sau am (o) ebae / ə ˈ m iː b i /), [1] numit deseori an amoeboid, este un tip de celulă sau organism unicelular care are capacitatea de a-și modifica forma, în principal prin extinderea și retragerea pseudopodelor. [2] Amoebele nu formează în schimb un singur grup taxonomic, ele se găsesc în fiecare linie majoră de organisme eucariote. Celulele ameboide apar nu numai printre protozoare, ci și la ciuperci, alge și animale. [3] [4] [5] [6] [7]

Microbiologii folosesc adesea termenii „amoeboid” și „amoeba” interschimbabil pentru orice organism care prezintă mișcare amoeboidă. [8] [9]

În sistemele de clasificare mai vechi, majoritatea amibelor au fost plasate în clasa sau subfilul Sarcodina, o grupare de organisme unicelulare care posedă pseudopode sau se mișcă prin flux protoplasmatic. Cu toate acestea, studiile filogenetice moleculare au arătat că Sarcodina nu este un grup monofiletic ai cărui membri au o descendență comună. În consecință, organismele amoeboide nu mai sunt clasificate împreună într-un singur grup. [10]

Cei mai cunoscuți protiști ameboizi sunt Haos carolinense și Amoeba proteus, ambele fiind larg cultivate și studiate în săli de clasă și laboratoare. [11] [12] Alte specii bine cunoscute includ așa-numita „amoebă care mănâncă creierul” Naegleria fowleri, parazitul intestinal Entamoeba histolytica, care provoacă dizenterie amibiană și „amibă socială” multicelulară sau mucegai de nămol Dictyostelium discoideum.


Examen final A & ampP (Belmont, McGrew)

cavitatea corpului ventral
toracică (separată de restul cavității ventrale printr-o diafragmă în formă de cupolă. inima și plămânii sunt protejați de cutia toracică osoasă) și cavitățile abdominopelvice (cavitatea abdominală superioară - găzduiește stomacul, intestinele, ficatul și alte organe cavitatea pelviană inferioară- parțial închis de pelvisul osos și conține sistem de reproducere, vezică și rect

membranele seroase ale cavității corpului ventral
seroza parietală membranară cu strat dublu foarte subțire: parte a pereților cavității căptușelii membranei-seroza viscerală: acoperirea suprafețelor externe ale organelor

regiuni abdominopelvice
-regiunea lombilică: cea mai centrală, include regiunea ombilicală-epigastrică: imediat superioară ombilicală, acoperă cea mai mare parte a regiunii stomac-pubiene (hipogastrice): imediat inferioară celei ubilicale, cuprinde regiunile zonei pubiene-inghinale (iliace): laterale până la hipogastrice, suprapuse părților superioare regiunilor osos-laterale (lombare): între coaste și porțiuni evazate la nivelul osului hipos, lateral la regiunile ombilical-hipocondriace: regiunea epigastrică flancantă lateral și coastele inferioare suprapuse

cavitatea bucală
Denumită în mod obișnuit gura, conține dinții și limba.

cavitatea nazală
situat în interiorul și posteriorul nasului

Cavități orbitale
în craniu adăpostesc ochii și îi prezintă într-o poziție anterioară

cavități ale urechii medii
fiecare cavitate a urechii medii se află doar medial către un timpan și este sculptată în craniul osos. Aceste cavități conțin oase mici care transmit vibrații sonore către organul auzului din urechile interioare


2 Drosophila Miogeneză și perspective asupra rolului nautilus

Mai multe aspecte ale dezvoltării musculare par a fi conservate între Drosophila și organismele vertebrate. Printre acestea se numără conservarea genelor care sunt critice pentru procesul miogen, inclusiv factori de transcripție precum nautilus." Drosophila este un organism util pentru identificarea moleculelor care sunt esențiale pentru miogeneza în ambele Drosophila iar la alte specii. Nautilus pare a fi implicat în specificarea și / sau diferențierea unui subgrup specific de celule fondatoare ale mușchilor. La fel ca în cazul mai multor omologi ai vertebratelor și nevertebratelor, este capabil să inducă un program miogen de diferențiere care amintește de cel al precursorilor mușchilor somatici, atunci când este exprimat în alte tipuri de celule. Studiile au relevat un rol critic pentru Pax-3 în specificarea unui anumit subgrup de celule miogene, progenitorii mușchilor membrelor. Aceste celule miogene migrează de la somită în periferia organismului, unde se diferențiază. Aceste mioblaste nu exprimă MyoD sau myf5 până când nu au ajuns la destinație și încep procesul morfologic al miogenezei. Apoi încep să exprime aceste gene, eventual să pună în aplicare planul miogen. Astfel, la fel ca în cazul nautilusului, MyoD și myf5 pot fi necesare pentru manifestarea unui angajament muscular specific care a avut loc deja.


Rezultate

Exprimarea CIT-K în timpul dezvoltării testiculare

S-a arătat anterior că CIT-K este foarte abundent la testiculul șoarecelui adult (Di Cunto și colab., 1998), dar modelul său de localizare celulară și expresia dezvoltării nu au fost caracterizate. Pentru a clarifica aceste puncte, nivelurile de proteine ​​CIT-K și localizarea au fost analizate în diferite stadii de dezvoltare folosind un anticorp policlonal specific (Di Cunto și colab., 2000). Extractele de celule totale preparate din ziua postnatală (P) 4 și testicul de șoarece adult au prezentat o expresie robustă a CIT-K, comparabilă cu nivelurile observate în cerebelul în curs de dezvoltare (Fig. 1A). Interesant, nici o expresie nu a fost detectabilă în ovarele adulte (Fig. 1A). Imunohistochimia efectuată cu același anticorp a relevat că, în timpul embriogenezei și în primele zile postnatale, imunoreactivitatea CIT-K a fost concentrată în gonocite (Fig. 1B). În tubulii adulți, expresia CIT-K a fost localizată la celulele germinale ale compartimentului bazal (Fig. 1C) și a fost deosebit de pronunțată în diferențierea spermatogoniei de tip A (Fig. 1C). Prin contrast, expresia CIT-K în celulele straturilor suprabazale a fost foarte scăzută sau nedetectabilă (Fig. 1C).

Exprimarea CIT-K în timpul dezvoltării testiculare. (A) Extractele de proteine ​​din țesuturile de tip sălbatic de șoarece au fost sondate prin Western Blot folosind anticorpi anti-CIT-K (panoul superior) sau anti GAPDH (panoul inferior). Probele au fost cerebel la P4 (1), testicul la P4 (2) și P40 (3), ovar la P4 (4). (B-C) Secțiunile din testiculele de tip sălbatic de la șoarece la P4 (B) și P40 (C) au fost analizate prin imunohistochimie cu anticorpi anti-Citron purificați prin afinitate. Bare, 50μm.

Exprimarea CIT-K în timpul dezvoltării testiculare. (A) Extractele de proteine ​​din țesuturile de tip sălbatic de șoarece au fost sondate prin Western Blot folosind anticorpi anti-CIT-K (panoul superior) sau anti GAPDH (panoul inferior). Probele au fost cerebel la P4 (1), testicul la P4 (2) și P40 (3), ovar la P4 (4). (B-C) Secțiunile din testiculele de tip sălbatic de la șoarece la P4 (B) și P40 (C) au fost analizate prin imunohistochimie cu anticorpi anti-Citron purificați prin afinitate. Bare, 50μm.

Inactivarea CIT-K are ca rezultat epuizarea specifică a celulelor germinale testiculare

Șoareci heterozigoti pentru o mutație nulă a CIT-K gena prezintă durata de viață normală și fertilitatea. Prin contrast, șoarecii CIT-K - / - se caracterizează printr-o creștere redusă și mor în primele trei săptămâni postnatale datorită epilepsiei letale (Di Cunto și colab., 2000). La P14, comparativ cu controalele + / + și +/-, greutatea corporală a șoarecilor - / - este redusă cu aproximativ 25% (Di Cunto și colab., 2000). Autopsia efectuată la aceeași vârstă a relevat că majoritatea organelor somatice, cu singura excepție fiind creierul, prezintă o reducere similară a dimensiunii, dar mențin o structură histologică normală (Di Cunto și colab., 2000). Cu toate acestea, volumul testiculelor CIT-K - / - a fost redus cu aproximativ 70% (Fig. 2A), sugerând astfel o afectare specifică. Folosind examinarea histologică la animalele de control, spermatocitele mature par să se diferențieze în stratul interior al tubulilor seminiferi (Fig. 2B). Prin contrast, testiculele șoarecilor knockout au fost sever epuizate de precursori spermatogeni proliferatori și diferențiați (Fig. 2C). Epiteliul testicular a fost dramatic simplificat și părea să fie format în principal dintr-un singur rând de celule Sertoli (Fig. 2C). Un număr comparabil de celule Leydig a fost detectat în stroma interstițială a animalelor - / - și de control. Alte organe de reproducere, cum ar fi canalele deferente și epididimul, par să fie normale în eliminări (datele nu sunt prezentate). În mod surprinzător, analiza histologică a ovarelor P14 de la femele knockout și martor nu a arătat diferențe morfologice brute între genotipuri (Fig. 2D, E). În special, mai mulți foliculi în repaus și în creștere au fost detectați în tot cortexul ovarian al animalelor - (- Fig. 2D, E). Deoarece nu s-au observat diferențe semnificative între + / + și +/- controale, toate analizele ulterioare au fost efectuate numai la + / + și - / - animale.

Afectare testiculară specifică la șoareci CIT-K - / -. (A) Vedere frontală a testiculelor P14 CIT-K + / + și - / -. (B-E) Secțiuni histologice ale testiculelor P14 (B, C) și ovarelor (D, E) de la șoareci P14 CIT-K + / + (B, D) și - / - (C, E). Colorare hematoxilină și eozină, bară, 50μm.

Insuficiență testiculară specifică la șoareci CIT-K - / -. (A) Vedere frontală a testiculelor P14 CIT-K + / + și - / -. (B-E) Secțiuni histologice ale testiculelor P14 (B, C) și ovarelor (D, E) de la șoareci P14 CIT-K + / + (B, D) și - / - (C, E). Colorarea hematoxilinei și eozinei, bar, 50μm.

Analiza blocului spermatogen în testiculele CIT-K - / -

Pentru a elucida dacă testiculele postnatale ale șoarecilor knockout CIT-K mai conțin celule spermatogene și pentru a stabili în ce stadiu de diferențiere se produce epuizarea observată, am efectuat RT-PCR semicantitativă a diferiților markeri spermatogeni (Tanaka și colab., 2000 ). La P8, analiza transcrierilor care apar în celulele spermatogene timpurii înainte ca acestea să ajungă la stadiul spermatocitelor, cum ar fi omologul Vasa de șoarece (Mvh) și A-Myb (Mettus și colab., 1994 Tanaka și colab., 2000), nu au arătat diferențe între genotipuri (Fig. 3A). Prin contrast, ARNm-urile Dmc1 și Mlh1, care sunt exprimate în spermatocite înainte de a ajunge la stadiul pachytene (Baker și colab., 1996Habu și colab., 1996), au fost reduse dramatic în probele eliminabile (Fig. 3A). În mod surprinzător, expresia Calmegin, care începe în mod normal în spermatocitele pachitene (Watanabe și colab., 1994), nu a fost detectabilă în eliminări (Fig. 3A). La P14, nivelurile relative ale expresiei markerului spermatocitelor au fost comparabile cu probele P8 (datele nu sunt prezentate), iar ARNm-urile Mvh și A-Myb erau încă detectabile în testiculele knock-out (Fig. 3B). Cu toate acestea, dacă se compară cu controalele, nivelurile lor de expresie au fost reduse în mod clar în probele - / - (Fig. 3B). Luate împreună, aceste observații indică faptul că epiteliul testicular simplificat al șoarecilor CIT-K - / - conține încă celule germinale, care sunt complet incapabile să se diferențieze ca spermatocite meiotice și suferă epuizare progresivă.

Analiza blocului spermatogen la șoareci CIT-K - / -. (A-B) Expresia markerilor spermatogeni indicați a fost analizată prin RT-PCR în condiții semicantitative. Testul a fost efectuat pe ARN total extras de la șoareci knockout CIT-K (-) și de control șobolan (+) la șoareci P8 (A) și P14 (B). (C, D) Celulele germinale primordiale au fost identificate prin colorare cu fosfatază alcalină comparabilă secțiuni longitudinale ale testiculelor embrionare E12.5 CIT-K + / + (C) și - / - (D). (E, F) Gonocitele și spermatogonia nediferențiată au fost identificate pe secțiuni ale testiculelor P4 CIT-K + / + (E) și - / - (F) ale testiculelor prin imunocolorare anti-ciclină D1. (G) Numărul total de gonocite și spermatogonii nediferențiate a fost determinat pe secțiunile histologice colorate cu hematoxilină și eozină ale testiculelor de la șoareci CIT-K + / + (bare deschise) și - / - (bare închise) la șoareci la orele indicate. Valorile sunt exprimate ca procent din control. Barele de eroare sunt abaterea standard, P& lt0.01.

Analiza blocului spermatogen la șoareci CIT-K - / -. (A-B) Expresia markerilor spermatogeni indicați a fost analizată prin RT-PCR în condiții semi-cantitative. Testul a fost efectuat pe ARN total extras de la șoareci knockout CIT-K (-) și de control șobolan (+) la șoareci P8 (A) și P14 (B). (C, D) Celulele germinale primordiale au fost identificate prin colorare cu fosfatază alcalină comparabilă secțiuni longitudinale ale testiculelor embrionare E12.5 CIT-K + / + (C) și - / - (D). (E, F) Gonocitele și spermatogonia nediferențiată au fost identificate pe secțiuni ale testiculelor P4 CIT-K + / + (E) și - / - (F) ale testiculelor prin imunocolorare anti-ciclină D1. (G) Numărul total de gonocite și spermatogonii nediferențiate a fost determinat pe secțiuni histologice colorate cu hematoxilină și eozină ale testiculelor de la șoareci CIT-K + / + (bare deschise) și - / - (bare închise) la șoareci la orele indicate. Valorile sunt exprimate ca procent din control. Barele de eroare sunt abaterea standard, P& lt0.01.

Pentru a aborda dacă celulele germinale masculine ale șoarecilor knockout CIT-K sunt deja compromise în timpul dezvoltării embrionare, secțiunile seriale ale embrionilor masculini + / + și - / - au fost analizate în diferite stadii de dezvoltare prin histologie și histochimie cu fosfatază alcalină. Așa cum se arată în Fig. 3C, D PGC au fost ușor detectate în crestele genitale atât ale embrionilor de control, cât și ale embrionilor knockout și nu au fost observate celule ectopice alcaline-fosfatază pozitive, indicând astfel că specificația și migrarea precursorilor spermatogeni nu sunt grav afectate de absența CIT-K. Cu toate acestea, numărul lor a fost redus semnificativ la șoarecii eliminabili încă din E12.5 (Fig. 3C, D). În consecință, la E14.5 numărul de gonocite din lumenul CIT-K - / - cordoane seminifere a fost redus la aproximativ 60% din controale (Fig. 3G). După naștere, celulele care prezintă trăsăturile morfologice ale gonocitelor și spermatogonia de tip A au fost ușor de detectat pe secțiunile histologice ale testiculelor knockout (date neprezentate), în acord cu analiza RT-PCR. Pentru a confirma în continuare prezența acestor celule, am efectuat pe aceleași probe detectarea imunohistochimică a ciclinei D1, care a fost recent recunoscută ca un marker specific (Beumer și colab., 2000). Așa cum se arată în Fig. 3F, celulele ciclinD1-pozitive au fost detectate în lumenul tubular și pe membrana bazală a tubulilor knock-out, indicând în plus că au fost prezente atât gonocitele, cât și spermatogonia de tip A. Cu toate acestea, dacă se compară cu testiculele embrionare, numărul relativ de celule germinale a scăzut în continuare, fiind doar 30% din martor la P4 (Fig. 3E, G). Aceste date indică faptul că, pe lângă spermatogonia diferențiată, chiar și PGC-urile și gonocitele sunt semnificativ compromise de absența CIT-K.

Pierderea apoptotică a precursorilor spermatogeni CIT-K - / -

Pentru a investiga dacă epuizarea observată a precursorilor celulelor germinale testiculare a fost cauzată de proliferarea redusă sau de creșterea morții celulare, indicii apoptotici și proliferativi ai celulelor tubulare testiculare au fost determinați atât în ​​testiculele embrionare, cât și postnatale ale animalelor de tip sălbatic și knockout de către Caspase anti-activat -3 imunocolorare și respectiv marcare BrdU.

Așa cum se arată în Fig. 4A, B, numărul de celule apoptotice detectate în lumenul cordoanelor seminifere la E14.5 a fost în mod clar crescut în secțiuni de embrioni - / - versus + / +. Creșterea relativă a fost și mai semnificativă atunci când numărările absolute au fost normalizate pentru numărul redus de gonocite observate la eliminări (Fig. 4E).

Pierderea apoptotică a precursorilor spermatogeni la șoareci CIT-K - / -. Embrionii E14.5 din intersecția heterozigotă CIT-K au fost etichetați timp de 1 oră în uter cu BrdU și apoi prelucrați pentru imunohistochimie. (A, B) Gonocitele apoptotice au fost identificate prin imunohistochimie pentru Caspase-3 activată, ca celule pozitive intratubulare (vârfuri de săgeți roșii). Testul a fost efectuat pe secțiuni comparabile din testiculele CIT-K + / + (A) și - / - (B). Celulele interstițiale au prezentat o pozitivitate citoplasmatică de fundal atât în ​​probele de control, cât și în probele knock-out. (C, D) Indicele proliferativ tubular a fost determinat pe secțiuni adiacente celor utilizate pentru testul apoptozei, marcate prin imunocolorare anti-BrdU. (E) Reprezentarea grafică a indicilor apoptotici (Cas-3) și proliferativi (BrdU) la E14,5 în testiculele CIT-K + / + (bare deschise) și - / - (bare închise). Valorile sunt exprimate ca creștere relativă comparativ cu controlul. Barele de eroare prezintă abateri standard, P& lt0.01.

Pierderea apoptotică a precursorilor spermatogeni la șoareci CIT-K - / -. Embrionii E14.5 din intersecția heterozigotă CIT-K au fost etichetați timp de 1 oră în uter cu BrdU și apoi prelucrați pentru imunohistochimie. (A, B) Gonocitele apoptotice au fost identificate prin imunohistochimie pentru Caspase-3 activată, ca celule pozitive intratubulare (vârfuri de săgeți roșii). Testul a fost efectuat pe secțiuni comparabile din testiculele CIT-K + / + (A) și - / - (B). Celulele interstițiale au prezentat o pozitivitate citoplasmatică de fundal atât în ​​probele de control, cât și în probele knock-out. (C, D) Indicele proliferativ tubular a fost determinat pe secțiuni adiacente celor utilizate pentru testul apoptozei, marcate prin imunocolorare anti-BrdU. (E) Reprezentarea grafică a indicilor apoptotici (Cas-3) și proliferativi (BrdU) la E14,5 în testiculele CIT-K + / + (bare deschise) și - / - (bare închise). Valorile sunt exprimate ca creștere relativă comparativ cu controlul. Barele de eroare prezintă abateri standard, P& lt0.01.

În mod surprinzător, în ciuda numărului redus de gonocite, indicele de marcare BrdU al cordoanelor seminifere knockout a fost mărit de aproximativ 2,5 ori (Fig. 4C, E). Rezultate similare au fost obținute la P4 (datele nu sunt prezentate).

Luate împreună, observațiile de mai sus indică faptul că epuizarea izbitoare a celulelor germinale testiculare care apare la șoarecii knockout CIT-K este cauzată de pierderea progresivă apoptotică a precursorilor embrionari și post-natali.

Citokinezie defectă la precursorii spermatogeni CIT-K - / -

CIT-K s-a demonstrat anterior că este necesar pentru citokinezie la populații specifice din sistemul nervos central în dezvoltare (SNC), dar nu și în celelalte țesuturi somatice care îl exprimă la niveluri semnificative (Di Cunto și colab., 2000). Pentru a aborda dacă moartea celulară crescută a precursorilor testiculari CIT-K - / - este corelată cu o afectare specifică a acestui proces, am întrebat dacă o creștere a celulelor germinale care prezintă o morfologie binucleate sau multinucleate ar putea fi detectată în knockout. Examinarea secțiunilor semi-subțiri obținute din testiculele postnatale a arătat că numărul de gonocite și spermatogonii cu cel puțin două nuclee a crescut de aproximativ patru ori în probele - / - (Fig. 5A, C). Microscopia electronică a secțiunilor ultra-subțiri, obținute din aceleași probe, a demonstrat că aceste celule nu erau elemente mononucleare adiacente, ci sincitia reală (Fig. 5D), indicând astfel un bloc de citokinezie. În mod surprinzător, multe celule cu mai mult de două nuclee au fost observate în tubulii CIT-K - / -, dar niciodată în probele martor (Fig. 5A, B, D), indicând faptul că celulele cu deficit de citokinezie sunt capabile să intre din nou în ciclului celular și să sufere mai multe runde de sinteză a ADN-ului.

Citokinezie defectă în celulele germinale masculine CIT-K - / - nediferențiate. (A, B) Secțiunile semi-subțiri ale testiculelor P4 CIT-K + / + (A) și - / - (B) au fost analizate prin microscopie optică. Vârfurile roșii indică spermatogonia de tip A care prezintă mai mult de un nucleu. (C) Procentul de celule germinale nediferențiate care prezintă o morfologie binucleate / multinucleate a fost determinat pe secțiuni semi-subțiri prin microscopie optică. Barele de eroare prezintă abaterea standard, P& lt0.005. (D) Imagine de microscopie electronică a unui spermatogoniu P4 CIT-K - / - tip A, afișând trei nuclee înconjurate de aceeași citoplasmă. (E) Imunohistochimie anti-ciclină D1 efectuată pe testicul P4 CIT-K - / -, prezentând un spermatogoniu multinucleat care exprimă niveluri ridicate ale acestei proteine. (F) Câmp de mare putere de imunocolorare anti-activată Caspase-3, efectuat pe testicul P4 CIT-K - / -. Vârful roșu indică o celulă binocleată apoptotică timpurie. Bare, 20 μm.

Citokinezie defectă în celulele germinale masculine CIT-K - / - nediferențiate. (A, B) Secțiunile semi-subțiri ale testiculelor P4 CIT-K + / + (A) și - / - (B) au fost analizate prin microscopie optică. Vârfurile roșii indică spermatogonia de tip A care prezintă mai mult de un nucleu. (C) Procentul de celule germinale nediferențiate care prezintă o morfologie binucleate / multinucleate a fost determinat pe secțiuni semi-subțiri prin microscopie optică. Barele de eroare prezintă abaterea standard, P& lt0.005. (D) Imagine de microscopie electronică a unui spermatogoniu P4 CIT-K - / - tip A, afișând trei nuclee înconjurate de aceeași citoplasmă. (E) Imunohistochimie anti-ciclină D1 efectuată pe testicul P4 CIT-K - / -, prezentând un spermatogoniu multinucleat care exprimă niveluri ridicate ale acestei proteine. (F) Câmp de mare putere al imunomarcării anti-activate Caspase-3, efectuat pe testicul P4 CIT-K - / -. Vârful roșu indică o celulă binocleată apoptotică timpurie. Bare, 20 μm.

Interesant este că în imunohistochimia ciclinei D1 am observat că multe dintre gonocitele binucleate și multinucleate și spermatogonia prezintă imunoreactivitate ridicată pentru această proteină (Fig. 5E).

Pentru a stabili o legătură directă între blocul citokinezei și inducerea apoptozei în celulele germinale testiculare knockout, am încercat mai întâi să cuantificăm procentul de celule poliploide supuse apoptozei prin analiza FACS după marcarea dublă cu iodură de propidiu și anticorpi anti-Caspase-3, după cum sa raportat anterior pentru creier (Di Cunto și colab., 2000). Cu toate acestea, probabil din cauza raportului scăzut dintre celulele germinale și celulele suport în etapele analizate (P4 și P8), nu au fost obținute rezultate semnificative (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, pentru a aborda același punct, am încercat să stabilim procentul de celule Caspase-3-pozitive activate care afișează clar mononucleate versus morfologie binucleate sau multinucleate. O complicație potențială pentru acest tip de analiză este că celulele aflate în stadiile târzii ale procesului apoptotic suferă adesea condensare și fragmentare nucleară (Walker și colab., 1988), ceea ce face imposibilă evaluarea numărului inițial de nuclee. Prin urmare, celulele care prezintă nuclee condensate și fragmentate au fost excluse din numărare. Folosind aceste criterii, nu am putut identifica celulele apoptotice timpurii cu mai mult de un nucleu în secțiuni de tip sălbatic (numărul total de celule marcate = 92 pe 50 de secțiuni). Prin contrast, aproximativ 10% din celulele Caspase-3-pozitive au prezentat o morfologie binucleate sau multinucleate în eliminări (Fig. 5F, numărul total de celule marcate = 250 pe 25 de secțiuni).

Luate împreună, aceste observații indică faptul că absența CIT-K are ca rezultat citokinezie anormală și poliploidizarea precursorilor spermatogeni, care poate fi urmată de reintrarea în ciclul celular sau de inducerea morții celulare programate.


Inhibarea Sca-1 are ca rezultat miogeneza defectă și proliferarea susținută a mioblastilor

Celulele T supraexprimă Sca-1 agregate homotipic atunci când sunt cultivate in vitro, sugerând că Sca-1 este capabil să medieze aderența celulă-celulă (Bamezai și Rock, 1995). Anticorpii anti-Sca-1 au fost folosiți pentru a inhiba agregarea timocitelor care exprimă Sca-1 pe suprafețele lor (Bamezai și Rock, 1995 engleză și colab., 2000), sugerând că anticorpii specifici blochează legarea Sca-1 la ligandul său neidentificat. În timp ce legătura încrucișată a unor anticorpi monoclonali anti-Sca-1 s-a demonstrat că stimulează activarea celulelor T, legarea altora, cum ar fi anticorpii derivați de D7 și E13, s-a dovedit a fi inactivă (Bamezai și Rock, 1995), în concordanță cu rolul lor în inhibarea agregării. Pentru a examina în mod direct rolul Sca-1 în retragerea și diferențierea ciclului celular al mioblastului, am cultivat celule C2C12 în prezența anticorpilor anti-Sca-1 care s-au dovedit a bloca interacțiunile Sca-1 in vitro.

Clona E13-161.7 a fost inițial ridicată împotriva celulelor „pre-T” ale șoarecilor BALB / c (Aihara și colab., 1986), în timp ce clona D7 a fost ridicată împotriva liniei de celule T a mouse-ului dependent de interleukina 2 (IL-2) CTL- L (Ortega și colab., 1986). Deși ambii anticorpi reacționează cu Sca-1, ei recunosc epitopi diferiți, deoarece D7 nu poate bloca legarea E13-161.7 (Bamezai și Rock, 1995). În experimentele noastre, tratamentul cu anticorpi nu a modificat expresia Sca-1, așa cum a fost determinat de imunoblot (datele nu sunt prezentate). În timp ce tratamentul cu oricare anticorp singur nu a produs nicio diferență semnificativă în fuziunea mioblastului sau sinteza ADN-ului, în comparație cu celulele netratate sau celulele tratate în mod similar cu anti-CD34, care este un marker primitiv al celulelor stem, de asemenea, găsit pe mioblastele C2C12 (Beauchamp și colab., 2000) , cei doi anticorpi anti-Sca-1 în combinație au blocat formarea miotubului și au susținut proliferarea mioblastelor în comparație cu celulele de control netratate, similar cu efectele observate cu tratamentul PIPLC (indicele de fuziune 0,30 ± 0,06 versus 0,60 ± 0,05, P& lt0.001 11 ± 3% versus 3 ± 1% nuclei BrdU-pozitivi, P& lt0.001) (Fig. 3A, B). Aceste efecte asupra diferențierii mioblastelor și sintezei ADN-ului ar putea fi văzute până la 10 zile de tratament cu anticorpi, cu inversarea completă a acestor efecte la îndepărtarea anticorpului (date neprezentate).

Sca-1 este esențial pentru retragerea ciclului de celule mioblaste și formarea miotubului în timpul diferențierii. (A) Indicele de fuziune [numărul de nuclee din celulele fuzionate (≥2 nuclei) / nucleii totali] a fost scăzut în celulele cultivate timp de 5 zile în medii de diferențiere în prezența anticorpilor E13-161.7 și D7, comparativ cu celulele netratate (CNT) sau celule tratate fie cu anticorp singur, fie cu anticorp împotriva CD34, un marker primitiv de celule stem, de asemenea, găsit pe mioblastele C2C12. Datele afișate sunt medii ± s.e.m. (n= 3 * diferență semnificativă, P& lt0.05). (B) Procentul de celule BrdU-pozitive a fost crescut în celulele crescute timp de 5 zile în medii de diferențiere în prezența anticorpilor E13-161.7 și D7, comparativ cu celulele netratate (CNT) sau celulele tratate fie cu anticorp singur, fie cu anticorp anti-CD34. Datele afișate sunt medii ± s.e.m. (n= 3 * diferență semnificativă, P& lt0.05). (C) Analiza imunoblot a demonstrat reglarea descendentă a expresiei Sca-1 în celulele C2C12 transfectate stabil cu Sca-1 antisens (AS), comparativ cu celulele transfectate cu vector gol (SHAM). β-actina a fost utilizată ca martor. Sunt prezentate rezultate tipice din clona 6. (D) Citometria de flux a demonstrat o scădere a subpopulației de celule C2C12 care exprimă Sca-1 în culturi crescute timp de 2 zile în mediu de diferențiere (Ziua 2) și transfectate stabil cu antisens Sca-1 (AS portocaliu), comparativ cu celulele transfectate cu vector gol (S roșu) (* diferență semnificativă, P= 0,035). A existat o scădere mică, dar nu semnificativă statistic, a procentului de celule care exprimă Sca-1 în culturi proliferante (Pro) transfectate stabil cu antisens Sca-1 (AS albastru), comparativ cu celulele transfectate cu vector gol (S verde) (P= 0,4). Porțile (bara cenușie verticală) au fost stabilite prin legarea nespecifică a anticorpilor conjugați cu PE în fiecare experiment. Se prezintă un profil reprezentativ cu valori medii pentru procentul de celule Sca-1-pozitive și -negative date (n= 3). (E) Indicele de fuziune [numărul de nuclee din celulele condensate (≥2 nuclei) / nuclei total] a fost scăzut în celulele care exprimă antisens Sca-1 (AS) și crescut timp de 5 zile în medii de diferențiere, comparativ cu celulele care exprimă vectorul gol (SHAM) ). Datele afișate sunt medii ± s.e.m. (n= 4 * diferență semnificativă, P& lt0.05) (F) Procentul de celule BrdU-pozitive a fost crescut în celulele care exprimă antisens SCA-1 (AS) și crescut timp de 5 zile în medii de diferențiere, comparativ cu celulele care exprimă vectorul gol (SHAM). Datele afișate sunt medii ± s.e.m. (n= 4 * diferență semnificativă, P& lt0.05).

Sca-1 este esențial pentru retragerea ciclului de celule mioblaste și formarea miotubului în timpul diferențierii. (A) Indicele de fuziune [numărul de nuclee din celulele fuzionate (≥2 nuclei) / nucleii totali] a fost scăzut în celulele cultivate timp de 5 zile în medii de diferențiere în prezența anticorpilor E13-161.7 și D7, comparativ cu celulele netratate (CNT) sau celule tratate fie cu anticorp singur, fie cu anticorp împotriva CD34, un marker primitiv de celule stem, de asemenea, găsit pe mioblastele C2C12. Datele afișate sunt medii ± s.e.m. (n= 3 * diferență semnificativă, P& lt0.05). (B) Procentul de celule BrdU-pozitive a fost crescut în celulele crescute timp de 5 zile în medii de diferențiere în prezența anticorpilor E13-161.7 și D7, comparativ cu celulele netratate (CNT) sau celulele tratate fie cu anticorp singur, fie cu anticorp anti-CD34. Datele afișate sunt medii ± s.e.m. (n= 3 * diferență semnificativă, P& lt0.05). (C) Analiza imunoblot a demonstrat reglarea descendentă a expresiei Sca-1 în celulele C2C12 transfectate stabil cu Sca-1 antisens (AS), comparativ cu celulele transfectate cu vector gol (SHAM). β-actina a fost utilizată ca martor. Typical results from clone 6 are shown. (D) Flow cytometry demonstrated a decrease in the subpopulation of Sca-1-expressing C2C12 cells in cultures grown for 2 days in differentiation medium (Day 2) and stably transfected with Sca-1 antisense (AS orange), compared with cells transfected with empty vector (S red) ( * significant difference, P=0.035). There was a small, but not statistically significant, decrease in the percent Sca-1-expressing cells in proliferating cultures (Pro) stably transfected with Sca-1 antisense (AS blue), compared with cells transfected with empty vector (S green) (P=0.4). Gates (vertical gray bar) were established by nonspecific PE-conjugated antibody binding in each experiment. A representative profile is shown with mean values for percent Sca-1-positive and -negative cells given (n=3). (E) Fusion index [number of nuclei in fused cells (≥2 nuclei)/total nuclei] was decreased in cells expressing Sca-1 antisense (AS) and grown for 5 days in differentiation media, compared with cells expressing empty vector (SHAM). Data shown are mean±s.e.m. (n=4 * significant difference, P<0.05) (F) Percent BrdU-positive cells was increased in cells expressing Sca-1 antisense (AS) and grown for 5 days in differentiation media, compared with cells expressing empty vector (SHAM). Data shown are mean±s.e.m. (n=4 * significant difference, P& lt0.05).

Previously, it has been shown that D7 antibody alone can inhibit thymocyte aggregation by 80-90% (Bamezai and Rock, 1995) however, D7 was unable to block myotube formation in our studies in the absence of E13-161.7 antibody. This suggests that the mechanism for Sca-1-mediated myoblast differentiation is different from its mechanism for aggregation in thymocytes, perhaps involving other pro-differentiation events that are myoblast specific.

To determine whether Sca-1 expression is necessary for myoblast cell-cycle withdrawal and differentiation, we made stable cell lines expressing sense and antisense versions of full-length Sca-1. Sca-1-overexpressing cells behaved no differently than sham-transfected or untransfected cells (data not shown), and were not included in subsequent experiments. This suggested that Sca-1 does not confer a gain of function in cells already expressing Sca-1. Antisense-expressing cells showed a significant downregulation of Sca-1 expression, compared with a cell line stably transfected with empty vector (Fig. 3C,D). When grown in differentiation media, Sca-1 antisense-expressing cells displayed a fusion defect with short, paucinuclear myotubes (fusion index 0.09±0.07 versus 0.65±0.05 P<0.001) (Fig. 3E), and retained a higher proliferation index (29±4% versus 3±1% BrdU-positive nuclei P<0.001) (Fig. 3F), compared with untransfected or sham-transfected cells. These data demonstrated that Sca-1 is necessary for proper cell-cycle withdrawal and myotube formation during C2C12 differentiation.

Because others have shown that myoblasts that fail to differentiate undergo apoptosis, we also analyzed Sca-1 antisense-expressing cells for cell death and p21 expression. Compared with control C2C12 cells, which showed Sca-1 antisense-expressing cells, which continue to proliferate in differentiation medium, failed to induce p21 expression and demonstrated an increase in apoptosis (C.L.E., J.E.L. and H.S.B., unpublished). Although these data suggest that Sca-1 might influence p21 expression, and consequently protect against apoptosis, how Sca-1 couples to p21 expression remains to be determined.

Sca-1 inhibition arrests myoblast differentiation

Since experiments with blocking antibodies and antisense directed against Sca-1 suggested that Sca-1 regulates myoblast cell-cycle withdrawal and myotube formation, we wanted to determine whether blocking Sca-1 affected the expression of skeletal muscle differentiation markers. We grew C2C12 cells expressing Sca-1 antisense in differentiation medium for five days and co-stained these cells with antibodies against Myf5, MyoD and myogenin, as markers of specific stages of C2C12 differentiation (Fig. 4) (Sabourin and Rudnicki, 2000 Shimokawa et al., 1998). Myf5 and MyoD were observed both in >90% of proliferating control and antisense-expressing cells (P>0.1), whereas MyoD and myogenin were found in differentiated control (90% and 50%, respectively) and antisense (95% and 60%, respectively) cells, with no significant difference in the percent positive cells for either myogenic regulatory factor between control and antisense-expressing cells (P>0.1) (Fig. 4A). However, expression of the earliest marker of myogenic commitment, Myf5 (Beauchamp et al., 2000), persisted in cells expressing Sca-1 antisense grown under differentiation conditions (78%±12% Myf5-positive nuclei in antisense-expressing cells at day 5 versus 4%±3% in control C2C12 cells P=0.019) (Fig. 4A). To determine whether the Myf5-positive, Sca-1 antisense-expressing cells grown under differentiating conditions comprised the pool of proliferating cells previously detected (Fig. 3F), we labeled cells with BrdU, and co-stained with antibodies against BrdU and Myf5. The percentages of BrdU-positive control and antisense-expressing cells in proliferating and differentiating cultures were the same as reported above (Fig. 3F). However, the majority of Sca-1 antisense-expressing, Myf5-positive cells were actively proliferating (Fig. 4B). These studies demonstrate that inhibiting Sca-1 expression results in a proliferating pool of mononuclear myoblasts that persist in an early stage of differentiation, despite culture under conditions that would result in myotube formation in wild-type cells.

Sca-1 downregulation blocks myogenesis. Untransfected, control C2C12 cells (C) and cells expressing Sca-1 antisense (AS) were grown under proliferation conditions and in differentiation medium for 5 days (as described for Fig. 3). They were then metabolically labeled with BrdU and stained with DAPI to identify nuclei, with antibody against BrdU (red) to detect DNA synthesis, and with antibodies against Myf5 (green), MyoD (green) and myogenin (green) as markers of myoblast differentiation. Bar, 50 μm. (A) Whereas proliferating (Pro) control and antisense cells expressed Myf5 and MyoD, and myogenin was expressed under differentiation conditions in both cell lines, expression of the early myogenic marker Myf5 persisted in Sca-1 antisense cells under differentiation conditions. Quantitative analysis provided in text. (B) Wild-type cells were negative for Myf5 and BrdU after 5 days in differentiation medium, whereas Sca-1 antisense cells grown in differentiation medium for 5 days were positive for both Myf5 and BrdU. Quantitative analysis provided in text.

Sca-1 downregulation blocks myogenesis. Untransfected, control C2C12 cells (C) and cells expressing Sca-1 antisense (AS) were grown under proliferation conditions and in differentiation medium for 5 days (as described for Fig. 3). They were then metabolically labeled with BrdU and stained with DAPI to identify nuclei, with antibody against BrdU (red) to detect DNA synthesis, and with antibodies against Myf5 (green), MyoD (green) and myogenin (green) as markers of myoblast differentiation. Bar, 50 μm. (A) Whereas proliferating (Pro) control and antisense cells expressed Myf5 and MyoD, and myogenin was expressed under differentiation conditions in both cell lines, expression of the early myogenic marker Myf5 persisted in Sca-1 antisense cells under differentiation conditions. Quantitative analysis provided in text. (B) Wild-type cells were negative for Myf5 and BrdU after 5 days in differentiation medium, whereas Sca-1 antisense cells grown in differentiation medium for 5 days were positive for both Myf5 and BrdU. Quantitative analysis provided in text.

Sca-1 is necessary for appropriate regulation of Fyn activity during myogenesis

Some GPI-anchored proteins signal through Src-family tyrosine kinases (Horejsi et al., 1998 Marmor and Julius, 2000). Specifically, Sca-1/Ly-6A/E has been shown to signal through Fyn during T-cell activation in vitro (Lee et al., 1994). However, whereas in vitro crosslinking of Sca-1 in T cells results in Fyn autophosphorylation (Lee et al., 1994), observations with Sca-1-null mice suggest that Sca-1 downmodulates lymphocyte responses (Stanford et al., 1997). Recently, Fyn activity has been implicated in the regulation of anti-apoptotic pathways in differentiated myotubes, but specifically has been shown to be inactive during earlier stages of myogenesis (Laprise et al., 2002).

To determine whether Sca-1 function in myoblasts is mediated through Fyn, we assayed Fyn and Src activity in myoblasts stimulated to form myotubes. Both wild-type and Sca-1 antisense-expressing cells demonstrated constitutive Src activity, independent of differentiation stage or Sca-1 expression (Fig. 5A, bottom). Fyn activity was elevated in wild-type cells at day 5 in differentiation medium (Fig. 5A, top), consistent with the previously demonstrated role of Fyn in protecting differentiated myotubes against apoptosis (Laprise et al., 2002). By contrast, Fyn activity was elevated in Sca-1 antisense myoblasts at day 2 in differentiation medium, compared with wild-type cells (P=0.012) (Fig. 5A, top). This time point coincides with the transient increase in Sca-1 expression observed during myoblast cell-cycle withdrawal and early differentiation (Shen et al., 2003). This finding suggested that inappropriate Fyn activity at an earlier stage of myogenesis might provide a mechanism for the sustained proliferation and arrest in myogenic differentiation seen in Sca-1 antisense cells.

Fyn mediates Sca-1 function in myogenesis. (A) Fyn and Src kinase activities were measured in wild-type C2C12 cells (C white bars) and cells expressing Sca-1 antisense (AS gray bars). Cells grown in differentiation media for 2 and 5 days demonstrated an appropriate increase in Fyn activity in control and antisense-expressing cells at day 5 (top), low levels of Src activity at all time points (bottom), and an inappropriate increase in Fyn activity at day 2 in cells expressing Sca-1 antisense (top). Data shown are mean±s.e.m. (n=3 * significant difference, P& lt0.05). Pro, proliferating cells. (B) Control (solid white or grey) or mutant-expressing plasmids (hashed bars), both co-expressing GFP, were transfected into Sca-1 antisense (AS) or wild-type C2C12 (C) cells. Cells were grown in differentiation media for 5 days. The ratio of GFP-expressing (i.e. transfected) mononuclear cells:myotubes (≥2 nuclei) was lower in antisense cells (AS) transfected with dominant-negative Fyn-K299M compared with antisense cells transfected with control plasmid expressing GFP alone (GFP), and higher in wild-type (C) cells transfected with constitutively active Fyn-Y531F compared with GFP-transfected wild-type cells. Data shown are mean±s.e.m. (n=3 * significant difference, P& lt0.05).

Fyn mediates Sca-1 function in myogenesis. (A) Fyn and Src kinase activities were measured in wild-type C2C12 cells (C white bars) and cells expressing Sca-1 antisense (AS gray bars). Cells grown in differentiation media for 2 and 5 days demonstrated an appropriate increase in Fyn activity in control and antisense-expressing cells at day 5 (top), low levels of Src activity at all time points (bottom), and an inappropriate increase in Fyn activity at day 2 in cells expressing Sca-1 antisense (top). Data shown are mean±s.e.m. (n=3 * significant difference, P& lt0.05). Pro, proliferating cells. (B) Control (solid white or grey) or mutant-expressing plasmids (hashed bars), both co-expressing GFP, were transfected into Sca-1 antisense (AS) or wild-type C2C12 (C) cells. Cells were grown in differentiation media for 5 days. The ratio of GFP-expressing (i.e. transfected) mononuclear cells:myotubes (≥2 nuclei) was lower in antisense cells (AS) transfected with dominant-negative Fyn-K299M compared with antisense cells transfected with control plasmid expressing GFP alone (GFP), and higher in wild-type (C) cells transfected with constitutively active Fyn-Y531F compared with GFP-transfected wild-type cells. Data shown are mean±s.e.m. (n=3 * significant difference, P& lt0.05).

We also tested whether anti-Sca-1 antibodies, capable of producing a similar though less-robust effect on myoblast differentiation, likewise affected Fyn activity. In contrast with the upregulation of Fyn activity in Sca-1 antisense-expressing cells at 2 days in differentiation medium, we observed no detectable difference in Fyn activity in cells treated with antibodies compared with untreated cells or cells treated with anti-CD34 antibody (data not shown). Since the alteration in Fyn activity with antisense expression was significant but modest (Fig. 5A), and antisense expression probably has a more consistent effect on Sca-1 than antibody blockade, the ability to detect an alteration in Fyn activity with antibody blockade might fall below our threshold for detection. We did observe that antisense expression had a more-significant effect on BrdU incorporation and myoblast fusion, compared with antibody treatment, as shown in Fig. 3 (fusion index 0.30±0.06 with antibody treatment versus 0.09±0.07 with antisense expression 11±3% BrdU-positive nuclei with antibody treatment versus 29±4% with antisense expression), which is consistent with this explanation.

Why should there be such variability between antibody blockade and antisense expression? We showed that there is variability in Sca-1 expression, with Sca-1 + and Sca-1 - populations present at various times during differentiation (Fig. 1A). Such `shifting' antigen concentrations might explain the incomplete effect of antibody treatment on BrdU incorporation and myoblast differentiation, and the failure to detect a measurable change in Fyn activity. To evaluate further the role of Fyn in Sca-1-mediated myogenesis, we co-expressed a dominant-negative mutant of Fyn and GFP (K299M) (Ko et al., 2002) in Sca-1 antisense-expressing cells and found that the ratio of transfected myoblasts:myotubes (as indicated by GFP expression) after five days in differentiation medium was lower in cells expressing dominant-negative Fyn compared with cells expressing GFP alone (2.3±0.7 versus 5.7±1.6 P=0.006) (Fig. 5B). Conversely, we co-expressed a constitutively active form of Fyn and GFP (Y531F) (Maulon et al., 2001) in wild-type C2C12 cells and found that the ratio of transfected myoblasts:myotubes at five days in differentiation medium was higher in cells expressing active Fyn compared with cells expressing GFP alone (4.9±1.7 versus 1.7±0.8 P=0.044) (Fig. 5B). We also monitored BrdU incorporation in transfected cells, and observed that >90% of nuclei in mononuclear cells were BrdU positive (data not shown). These studies demonstrated that dominant-negative Fyn rescued the Sca-1 antisense phenotype, whereas active Fyn produced the Sca-1 antisense phenotype in wild-type C2C12 cells. It is important to note that whereas expression of Sca-1 antisense produced a tenfold change in myoblast fusion and BrdU incorporation, the effect of constitutively active Fyn was less pronounced. Although this may, in part, be explained by technical differences between transient transfection of mutant Fyn versus stable, constitutive expression of Sca-1 antisense, it also supports the possibility that Fyn alone may not be solely responsible for mediating Sca-1 effects. However, our observations suggest that the effects of Sca-1 in differentiating myoblasts are mediated at least in part by Fyn, that Sca-1 expression couples to the downregulation of Fyn activity during early myogenesis, and that inappropriate activation of Fyn is associated with sustained myoblast proliferation and a defect in myotube formation.

The role of Sca-1 in myoblast differentiation and cell-cycle withdrawal may be analogous to its role in T cells, where the absence of Sca-1 results in a more rapid and prolonged T-cell proliferative response (Stanford et al., 1997). Our findings also suggest that Fyn activity is temporally regulated during myoblast differentiation. Normally, Fyn activity is upregulated in differentiated myotubes, and is necessary for protecting post-mitotic muscle cells from apoptosis (Laprise et al., 2002). Downregulation of Sca-1 by antisense leads to premature activation of Fyn, which may be responsible for sustained proliferation. This suggests a role for Sca-1 in either suppressing Fyn activity or influencing the integration of Fyn with other signaling pathways that converge on the early myogenic program.

Although a role for Fyn in cellular proliferation and survival has been established in a variety of cell types (Resh, 1998), how Sca-1 couples to Fyn is not known. Plasma membrane microdomains couple signaling in space and time between GPI-anchored proteins on the extracellular surface and signaling proteins compartmentalized in the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane, such as non-receptor protein tyrosine kinases and G proteins (Alonso and Millan, 2001 Matko and Szollosi, 2002). Transmembrane-spanning coreceptors also coalesce in these microdomains, and may be required for transmitting signals from GPI-anchored proteins (Werlen and Palmer, 2002). Whether Sca-1 signals directly through Fyn, or brings components of membrane microdomains together that ultimately regulate Fyn activation, remains to be demonstrated.


Review of the taxonomic history and nomenclature of the yellow-green algae

The taxonomic history of the yellow-green algae is reviewed with emphasis on classification above the rank of genus. Numerous nomenclatural situations in need of rectification or clarification are discussed. At the ordinal level Heterocapsales is rejected because Heterocapsa is a genus of dinoflagellates. As a substitute name Heterogloeales is proposed. At the family level Hetero-gloeaceae is proposed to replace Heterocapsaceae, an invalid name, while Heterococcaceae is proposed to replace both Heterocloniaceae, an invalid name, and Heterodendraceae, an illegitimate name. At the generic level Brachynematella is proposed as a substitute name for the later homonym Brachynema Ålvik , Sphagnoikos for the later homonym Fremya P. A. Dangeard , Heterocalycina for the later homonym Heterocalyx Bursa , Xanthonema for the later homonym Heterothrix Pascher , and Radiosphaerella for the later homonym Radiosphaera Pascher . Meringosphaera subg. Eumeringosphaera sect. Raphidosphaera is elevated to generic rank. The type species of Bumilleria is shown to be B. borziana Wille rather than the universally cited B. sicula Borzì . The type species of Characiopsis is shown to be C. borziana Lemmeemann rather than C. minuta ( Braun ) Borzi or (C. pyriformis ( Braun ) Borzì . The type species of Neonema is shown to be N. quadratum Pascher rather than N. pumilum (W. and G. S. West ) Pascher . The type species of Pseudo-staurastrum is shown to be P. enorme ( Ralfs ) Chodat rather than P. hastatum ( Reinsch ) Bourrelly . A summary of names of higher taxa in the yellow-green algae is appended. For each name is given an indication of its status in accordance with the International Code of Botanical Nomenclature and a general guide to its application.

Offered in memory of the late Professor Dr. Bohuslav Fott .


Abstract

The transition zone (TZ) of eukaryotic cilia and flagella is a structural intermediate between the basal body and the axoneme that regulates ciliary traffic. Mutations in genes encoding TZ proteins (TZPs) cause human inherited diseases (ciliopathies). Here, we use the trypanosome to identify TZ components and localize them to TZ subdomains, showing that the Bardet-Biedl syndrome complex (BBSome) is more distal in the TZ than the Meckel syndrome (MKS) complex. Several of the TZPs identified here have human orthologs. Functional analysis shows essential roles for TZPs in motility, in building the axoneme central pair apparatus and in flagellum biogenesis. Analysis using RNAi and HaloTag fusion protein approaches reveals that most TZPs (including the MKS ciliopathy complex) show long-term stable association with the TZ, whereas the BBSome is dynamic. We propose that some Bardet-Biedl syndrome and MKS pleiotropy may be caused by mutations that impact TZP complex dynamics.

Cilia, or flagella (the two terms are used here interchangeably), are multifunctional organelles that were present in the last common eukaryotic ancestor (1). Defects in cilia are responsible for pleiotropic human diseases (called ciliopathies) and their function is essential for pathogenesis in protozoan parasites (2, 3).

During ciliogenesis, a microtubule organizing center called the “basal body” docks at the membrane. Basal bodies are built from nine microtubule triplets and two microtubules from each triplet extend to form a transition zone (TZ) and, ultimately, the axoneme. Thus, the TZ represents a structural junction between the basal body and the axoneme.

As expected from its strategic position between the basal body and the axoneme, the TZ acts as a “ciliary gate” that controls ciliary composition and function (4). Many ciliopathies are caused by defects in complexes that associate with the TZ, including Meckel syndrome (MKS), Joubert syndrome and Bardet-Biedl syndrome (BBS). Studies using murine kidney epithelial cells and embryos suggest that the MKS complex demarcates the ciliary membrane by forming a diffusion barrier at the base of the cilium (5 ⇓ –7). On the other hand, the BBS complex (BBSome) is an adapter for intraflagellar transport (IFT) complexes that cross the TZ barrier to transport sensory proteins between the ciliary membrane and the cell body (8, 9).

The TZ has distinctive structural features. At the proximal boundary of the TZ, where the basal body C tubule terminates, a “terminal plate” crosses the TZ. Studies in Tetrahimena suggest that the terminal plate contains pores for the passage of IFT “trains” that deliver axonemal components to the distal tip of flagella (10). Striated transitional fibers radiate from the distal end of the basal body triplets to join the plasma membrane (11 ⇓ ⇓ –14), forming blades thought to create a physical barrier preventing vesicles from entering the ciliary lumen. Electron microscopy (EM) studies in Chlamydomonas suggest that the junction of the transitional fibers and the membrane provides a docking site for IFT particles (15). Y-shaped linkers (or “Y linkers”) extend from the outer microtubule doublets of the TZ to the flagellar membrane, generating a stable (i.e., detergent resistant) membrane domain (16).

The distal boundary of the TZ is defined by the start of the nexin links and dynein arms on the outer axonemal doublets (13, 17), a location somewhat distal to that of the start of the central pair of microtubules in motile cilia. The basal plate anchors at least one microtubule of the central pair (18, 19) and is derived from two electron-dense discs that cross the distal TZ (20).

Although multiple studies have addressed the composition of flagella and basal bodies in a variety of systems (3, 21 ⇓ ⇓ ⇓ –25), biochemical studies on the TZ have been limited by difficulties in obtaining sufficient material of high quality. Recent elegant work used the specific biology of Chlamydomonas to purify TZ remnants from cell walls after axoneme disassembly, identifying proteins specific to green algae as well as orthologs of candidate ciliopathy genes (26).

Trypanosoma brucei is an excellent system to study ciliary biology, having unique tractability among flagellated cells. Trypanosomes possess a basal body pair that subtends a single flagellum and whose duplication reflects that of the mammalian centriole. The trypanosome flagellum exhibits the canonical features of the TZ and the trypanosome genome encodes much of the known conserved biology required for TZ function (such as IFT, MKS, and BBS proteins) (27, 28). Therefore, insights gained from trypanosome TZ biology are likely to apply to other eukaryotic cell types.

Here, we identified protein components of the TZ and nearby structures, using an innovative proteomic approach with general applicability for the biochemical analysis of discrete cytoskeletal structures. We leverage this proteome to uncover basic information about the function and dynamics of the TZ, providing insights into how ciliopathies might cause pleiotropic diseases.


Studies of HS in PM tissues

Although the bulk of neuropathology research in the past decades has been carried out on surgical tissue with its obvious advantages [optimally preserved tissues, homogeneous clinical cohorts and access to up-to-date electroencephalography (EEG) and neuroimaging studies] we should not neglect the ongoing contribution that autopsy samples can provide in the study of HS in epilepsy. Primarily, PM tissues enable comparisons of HS occurring in epilepsy syndromes other than TLE (also known as secondary HS 7 ), the effects of a lifetime of seizures on the severity of hippocampal neuronal loss and its associated pathology 186 , enable study of the bilaterality of HS 73 , the extent of involvement along the entire length of the hippocampus 25 (Figure 5) and to address degeneration in wider networks that have been implied from quantitative MRI studies in TLE 20, 187, 188 , in particular the amygdala, cortex 189 , thalamus 190 and cerebellum 191 . Neuropathology studies have, from the outset, recognized that more extensive pathology may accompany HS 15, 21 , the hippocampus being the epicentre of a wider process. Experimental data support widespread changes occurring following induced seizures 192 which could equally contribute to epileptogenesis. Involvement of wide networks has been shown in TLE 193, 194 and functional and structural imaging of TLE indicates altered brain connections or connectome in TLE 195, 196 . As such, in recent years there has been a move away from a ‘hippocampocentric’ view of TLE 197, 198 addressing contribution from other brain regions. The main studies have investigated (i) electrophysiological evidence to support origin of seizures from extrahippocampal structures 199, 200 (ii) if wider disease offers the explanation for poor outcomes (in terms of seizure-freedom) following localized surgery and (iii) if severity (or progression) of any extrahippocampal pathology correlates with comorbidities, such as cognitive decline.

Variability of hippocampal sclerosis (HS) in post-mortem and surgical samples. (A) Surgical hippocampectomy specimens, which on histological examination correlated to (i) end folium gliosis with no evidence of sclerosis (ii) ILAE Type 3 HS (end-folium sclerosis) (iii) ILAE type 2 HS (CA1 predominant sclerosis) and (iv) ILAE type 1 HS (classical hippocampal sclerosis). In all of the images the arrow indicates the pyramidal cell layer of CA1. (B) A 9.4T MRI image of a post-mortem hippocampus from a patient with longstanding epilepsy and ILAE type 2 (CA1 predominant pattern) of HS at this level (shown in C in a luxol fast blue/cresyl violet preparation), although in other levels the pattern was type 1 (classical). The MRI has the ability to identify subfields and white matter tracts and, indistinctly (arrowed), the dentate gyrus. Improved high fields sequences in the future may be able to identify and define patterns of HS pre-operatively. The MRI image was provided with courtesy of Dr Sofia Eriksson at the Department of Clinical and Experimental Epilepsy, UCL, Institute of Neurology. (D la Eu) Paired sections of hippocampus from one hemisphere labelled with (D la F) GFAP/counterstained with cresyl violet and (G la Eu) calretinin: at the level of the subthalamic nucleus (STNc D, G), lateral geniculate nucleus (LGNc E, H) and hippocampal tail (F, Eu). Classical pattern (ILAE type 1) HS is seen in the anterior levels with sprouting of calretinin-positive fibres visible in the dentate gyrus (arrow) at this low magnification in the tail gliosis and neuronal loss is visible in the CA4 region of the hippocampal tail. Bar is equivalent to approximately 3 mm (D la Eu).

The cellular and pathological basis of structural changes in extrahippocampal regions associated with HS typically manifests as neuronal loss and gliosis with few studies exploring the contribution of interneuronal populations 189, 201 . It remains to be established whether any more extended ‘network’ changes arise as a result of the same initial insult causing HS, if they are subsequent to HS through retrograde/anterograde degeneration, or if they arise independently. In PM series it is also possible to explore the long-term effects of seizures on the brain and any predisposition to neurodegenerative disease or accelerated ageing processes in HS. It has been observed from a patient cohort closely followed for decades at the National Society for epilepsy, Chalfont centre, that patients with pathology proven HS/TLE at PM were less likely to go into terminal seizure remission with advanced age compared with other epilepsies 8 . It has also been shown in this same PM cohort that accelerated tau accumulation in epilepsy was not associated with the severity of seizures and was also independent of the presence of HS but correlated with acquired and accumulative traumatic brain injury incurred from frequent seizures 202 . Continued donation of brain tissues from patients with epilepsy to tissue bank resources [for example the Epilepsy Society Brain and Tissue Bank at University College London (UCL)] will enable further studies of HS in the future.


Chapter 2 - Yeasts Pathogenic to Humans

The medically significant yeasts comprise more genera than the traditionally held pathogens in the genera Candida and Cryptococcus. Clinically important yeast forms can also be found among the endemic dimorphic fungi, the dematiaceous molds, and even a noncultureable fungus. Collectively, these fungal pathogens exhibit either teleomorphs of the ascomycota or basidiomycota, or their anamorphic forms express morphological and genetic features consistent with one of these taxa. They comprise a diverse spectrum of fungi that have found the means, primarily by exploiting a host organism's weakened immune system, to become noteworthy mycotic agents. Furthermore, they portend the potential for the spectrum of fungal pathogens to become wider and deeper in the number of etiological agents derived from normally benign species. Vigilance by the general as well as the medical mycologist must be maintained to better understand how to address the future challenges likely to be posed to public health by fungi, particularly the yeasts.


Priveste filmarea: Cum reactioneaza Romanii cand vad un Strain (Ianuarie 2022).