Informație

Screening enzime?


Doresc să obțin o listă a tuturor enzimelor cunoscute și apoi să scap de cele care folosesc cofactori, cele care utilizează ATP și câteva altele. Care este cel mai simplu mod de a face acest lucru?


Ar trebui să puteți filtra baza de date UniProt pentru aceasta. De exemplu, această interogare de căutare:

ec: * NU cofactor: (chebi: *) NU adnotare: (tip: "activitate catalitică" atp) ȘI revizuit: da

... vă oferă toate curate manual (revizuit: da) enzime (ec: *) care nu au cofactor (NU cofactor: (chebi: *)) și nu catalizează reacțiile cu ATP (NU adnotare: (tip: "activitate catalitică" atp)).


Strălucind o lumină asupra promiscuității enzimei

Eforturile de screening au relevat enzime cu peste 100 de activități promiscue.

Screeningul de mare capacitate pentru activități promiscuoase poate fi realizat în picături care conțin celule unice.

Profilarea metabolică bazată pe activitate poate fi utilizată pentru a detecta activități promiscue.

Activitățile promiscue pot fi ineficiente, deoarece substraturile se leagă într-o poziție slabă.

Activitatea ineficientă poate rezulta și din legarea la o conformație enzimatică rară.

Majoritatea, dacă nu toate enzimele sunt capabile să catalizeze reacții secundare irelevante fiziologic - denumite reacții „promiscue” - pe lângă reacțiile pe care le-au evoluat pentru a cataliza. Activitățile promiscuoase pot oferi punctul de plecare pentru evoluția noilor enzime, atât în ​​natură, cât și în mâinile inginerilor de proteine. Lucrările recente sugerează că universul activităților promiscuoase disponibile în natură este enorm. Noile abordări cu randament ridicat ne-au avansat în mod semnificativ capacitatea de a identifica activități promiscue, stabilind scena pentru eforturile de biologie sintetică de a construi căi noi folosind catalizatori derivați din enzime promiscue prin intermediul evoluției direcționate.


Enzyme Discovery și Microbial Screening

Microorganismele evoluează și se adaptează la presiunea mediului de peste un miliard de ani. În consecință, microorganismele sunt o sursă extraordinară de enzime și diversitate moleculară. Acest lucru se reflectă în faptul că majoritatea proceselor biologice comerciale pentru producerea de biocombustibili, medicamente, substanțe chimice și molecule farmaceutice implică utilizarea enzimelor microbiene. În ultimii doi ani, CBB a colectat peste 2.000 de microorganisme despre care se știe că produc o serie de enzime relevante din punct de vedere industrial. Mai recent, aproximativ 40.000 de tulpini microbiene și 35.000 de probe diverse de sol din practic fiecare ecologie cunoscută de pe planetă au fost transferate către CBB de către Kemin Industries, Inc. Aceste microorganisme includ bacterii, actinomicete și ciuperci (vezi graficul cu bare de mai jos) și sunt disponibile pentru screening pentru diferite aplicații enzimatice, inclusiv metaboliți secundari, producția de substanțe chimice, rezoluția amestecurilor racemice, aplicații de biocombustibili, evaluarea de mediu a compușilor, recrutarea genelor pentru ingineria metabolică etc. Unele dintre microorganisme au fost izolate din probele de sol colectate înainte de „Tratatul de la Rio” ”Și, prin urmare, sunt„ fără redevențe ”. În mod colectiv, acestea reprezintă cea mai mare resursă deschisă pentru screeningul microbian și bazat pe sol disponibil la un loc.

Serviciile de screening microbian CBB și de descoperire a enzimelor includ:

  • Furnizarea bulionelor pentru screeningul metaboliților secundari pentru aplicații farmaceutice și agricole
  • Depistarea microorganismelor pentru activități enzimatice noi și noi
  • Proiectarea unei biblioteci de enzime clonate (în principal dioxigenaze) pentru diverse aplicații
  • Screening și recrutare de gene noi pentru ingineria metabolică
  • Screening pentru aplicații de biocombustibili, inclusiv microbi pentru hidroliza celulozei / ligninei și utilizarea aromelor pentru substanțe chimice de mare valoare

Descoperirea poate fi asociată cu clonarea genelor, după cum este necesar, producția la scară largă de enzime, dezvoltarea proceselor și evaluarea economiei. Vă rugăm să ne contactați pentru mai multe informații.


Top 5 strategii de screening ale bibliotecilor genetice

Acest articol aruncă lumină asupra primelor cinci strategii de screening ale bibliotecilor genetice.

Primele cinci strategii de screening sunt: ​​(1) Screening prin ADN hibridizare (2) Screening prin colonie hibridizare (3) Screening prin PCR (4) Screening prin test imunologic și (5) Screening prin funcția proteinei.

1. Screening prin hibridizare ADN:

Secvența țintă într-un ADN poate fi determinată cu o sondă ADN (Fig. 9.5). Pentru început, ADN-ul cu catenă dublă de interes este transformat în catenă simplă prin căldură sau alcali (denaturare). Cele două catene de ADN sunt menținute separat prin legarea la matricea solidă, cum ar fi nitroceluloză sau membrană de nylon.

Acum, se adaugă firele unice de sondă ADN (100-1.000 bp) marcate cu radioizotop. Hibridizarea (adică asocierea bazelor) are loc între secvențele complementare de nucleotide ale ADN-ului țintă și sondă. Pentru o pereche stabilă de baze, cel puțin 80% din bazele din cele două fire (ADN țintă și sondă) ar trebui să fie potrivite. ADN-ul hibridizat poate fi detectat prin autoradiografie.

Sonde ADN:

Sondele ADN utilizate pentru screening pot fi sintetizate în multe moduri.

Metoda primerului aleatoriu:

Primerii ADN marcați cu radioizotopi pot fi produși prin această tehnică (Fig. 9.6). ADN-ul dublu catenar care conține secvența necesară pentru a servi ca sondă este denaturat. Un amestec de oligonucleotide sintetice, cu toate combinațiile posibile de baze (A, G, C și T), cu o lungime de 6 nucleotide servesc fiecare ca primeri. Unii dintre acești primeri cu secvențe complementare se vor hibridiza cu ADN-ul șablon. Această întâmplare este în întregime întâmplătoare și probabilitatea este rezonabilă.

Prin adăugarea a patru dezoxiribonucleotide (una dintre ele este radiomarcată) și în prezența enzimei ADN polimerază a E. coli (fragment Klenow), primerii sunt extinși pe ADN-ul șablon. Deoarece se folosește o etichetă radioactivă, fragmentele de ADN nou sintetizate sunt marcate în locuri adecvate, iar acestea sunt sondele ADN. Un număr de sonde de ADN marcate pot fi produse dintr-un șablon de ADN neetichetat.

Sonde ADN neizotopice:

Pentru producerea sondelor de ADN neizotopice, una dintre cele patru deoxinucleotide (utilizate pentru extensia primerului descrisă mai sus) este marcată cu o etichetă (de exemplu, biotină). Eticheta sondelor ADN poate fi detectată prin utilizarea reacțiilor chimice și enzimatice.

2. Screening prin hibridizare Colony:

Secvența ADN din coloniile transformate poate fi detectată prin hibridizare cu sonde ADN radioactive (uneori pot fi folosite și sonde ARN marcate). Tehnica hibridizării coloniei este, de asemenea, denumită replica de placare de către unii autori. Tehnica descrisă în Fig. 9.7 este descrisă pe scurt.

Celulele transformate sunt cultivate ca colonii pe o placă principală. Probele din fiecare colonie sunt transferate într-o matrice solidă, cum ar fi nitroceluloză sau membrană de nailon. Transferul se efectuează cu atenție pentru a păstra modelul coloniilor pe placa principală. Astfel, hârtia cu nitroceluloză conține un model de fotocopie a coloniilor de plăci principale. Celulele coloniei sunt lizate și deproteinizate.

ADN-ul este denaturat și legat ireversibil de matrice. Acum se adaugă o sondă ADN radiomarcată care hibridizează cu ADN-ul țintă complementar. Moleculele sondei nehibridizate sunt spălate. Colonia cu sondă hibridizată poate fi identificată pe autoradiograf. Celulele acestei colonii (din placa principală) pot fi izolate și cultivate.

De multe ori mai multe colonii sunt detectate la hibridizare de către o sondă ADN. Acest lucru se datorează secvențelor suprapuse. Pentru a identifica care colonie are secvența completă a genei țintă, datele observate din analiza endonucleazei de restricție vor fi utile.

Modificări ale tehnicii de hibridizare a coloniei:

Câteva îmbunătățiri ale tehnicii de hibridizare a coloniei, descrise mai sus, au fost făcute în ultimii ani. În tehnica de ridicare a plăcii, hârtia cu nitroceluloză este aplicată direct pe suprafața superioară a plăcii principale de agar, făcând un contact direct. În acest fel, plăcile pot fi ridicate și se pot face mai multe amprente identice de ADN dintr-o singură placă. Această tehnică crește fiabilitatea. Mai recent, screeningul bibliotecilor de ADN se realizează prin tehnici automate.

3. Screening prin PCR:

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este la fel de bună ca tehnica de hibridizare pentru screening-ul bibliotecilor de ADN. Dar trebuie să existe informații adecvate (cu privire la secvențele sincere ale ADN-ului țintă) pentru a pregăti primerii pentru această metodă. Coloniile sunt menținute în plăci cu pereți multipli, fiecare godeu este ecranat prin PCR și godeurile pozitive sunt identificate.

4. Screening prin test imunologic:

Tehnicile imunologice pot fi utilizate pentru detectarea unei proteine ​​sau a unei polipeptide, sintetizate de o genă (prin transcripție urmată de traducere). Procedura adoptată pentru testul imunologic și tehnica de hibridizare (descrisă deja) sunt destul de comparabile. Procedura de screening prin test imunologic este prezentată în Fig. 9.8 și descrisă pe scurt mai jos.

Celulele sunt crescute ca colonii pe plăcile principale, care sunt transferate într-o matrice solidă (adică nitroceluloză). Coloniile sunt apoi supuse lizei și proteinele eliberate se leagă de matrice. Aceste proteine ​​sunt apoi tratate cu un anticorp primar care se leagă în mod specific de proteină (acționează ca un antigen), codificat de ADN-ul țintă. După îndepărtarea anticorpului nelegat prin spălări, se adaugă un al doilea anticorp care se leagă în mod specific la primul anticorp.

Din nou anticorpii nelegați sunt îndepărtați prin spălări. Al doilea anticorp poartă o etichetă enzimatică (de exemplu, peroxidază roșiatică de cal sau fosfatază alcalină) legată de acesta. Procesul de detectare este conceput atât de mult încât, sub forma unui substrat incolor pe care acționează această enzimă, se formează un produs colorat. Sunt identificate coloniile care dau rezultate pozitive (adică pete colorate). Celulele unei colonii specifice pot fi subcultive din placa principală.

5. screening-ul după funcția proteinelor:

Dacă ADN-ul țintă al bibliotecii genetice este capabil să sintetizeze o proteină (în special o enzimă) care nu este produsă în mod normal de celula gazdă, activitatea proteinei poate fi utilizată pentru screening. Se folosește un substrat specific, iar utilizarea acestuia de către o colonie de celule indică prezența unei enzime care acționează pe substrat. De exemplu, genele care codifică enzimele α-amilază și β-glucozidază pot fi identificate prin această tehnică.


Screeningul și tehnicile sale

Screeningul poate fi definit ca utilizarea procedurilor de selecție pentru izolarea speciilor cu randament ridicat din surse naturale, cum ar fi solul, apa, plantele și animalele care conțin o populație microbiană mare eterogenă. Tehnicile de screening sunt clasificate în principal ca screening primar și screening secundar.

Screening primar:

Screeningul primar constă în câteva teste preliminare necesare pentru izolarea speciilor microbiene care prezintă proprietăți bioactive. Aceste teste sunt efectuate pentru izolarea microorganismelor capabile să producă antibiotice, acizi organici, enzime și vitamine. Unele dintre tehnicile utilizate pentru screeningul primar sunt descrise după cum urmează:

  1. Tehnica plăcilor aglomerate:
  • Tehnica plăcilor aglomerate este cea mai simplă tehnică de screening utilizată pentru izolarea microorganismelor producătoare de antibiotice.
  • Solul sau alte surse de microorganisme sunt diluate în soluție salină sterilă și apoi răspândite pe plăci de agar nutritiv folosind tehnica plăcii de împrăștiere.
  • Plăcile de agar având 300 sau mai multe colonii pe placă sunt selectate deoarece sunt utile în localizarea coloniilor care produc activitate antibiotică.
  • Microorganismele care produc activitate antibiotică sunt indicate printr-o zonă de inhibiție în jurul coloniei (Fig. 2.2).
  • Coloniile producătoare de antibiotice sunt subculturate folosind un mediu similar.
  • Toate coloniile active sunt purificate prin tehnica streak plate, înainte de a face culturi stoc. Este necesar să continuați testele suplimentare pentru a confirma activitatea antibioticelor asociate cu un microorganism, deoarece zona de inhibare poate apărea din alte cauze, cum ar fi producerea de acid de către microorganism, care poate modifica pH-ul mediului, inhibând astfel creșterea altor organisme. din apropiere.

  • Tehnica plăcilor aglomerate oferă informații cu privire la activitatea inhibitoare a unei colonii împotriva microorganismelor necunoscute.
  • Este necesar să se confirme activitatea împotriva microorganismelor specifice. Prin urmare, tehnica plăcilor aglomerate a fost modificată prin introducerea unui & # 8216test-organism & # 8217.
  • Diluțiile de sol sau alte surse sunt răspândite pe suprafața plăcilor de agar, astfel încât să se dezvolte colonii izolate (aproximativ 50 până la 200 / placă).
  • După dezvoltarea unei creșteri bine izolate, suspensia organismului testat este răspândită pe aceeași placă de agar.
  • Plăcile sunt din nou incubate pentru creșterea microorganismelor testate. Formarea zonelor inhibitoare în jurul anumitor colonii indică activitatea lor antimicrobiană.
  • Coloniile producătoare de antibiotice sunt din nou izolate și purificate înainte de conservare și testare ulterioară.
  1. Metoda de contaminare accidentală:
  • În aceste tehnici, plăcile sunt incubate în continuare pentru studiul caracteristicilor de creștere ale microbilor nou izolați.
  • Aceste plăci sunt contaminate accidental de microorganisme de mediu. Dacă aceste plăci contaminate sunt incubate în continuare timp de 2 până la 5 zile, atunci microbii izolați (cei cu activitate antimicrobiană) prezintă o zonă de inhibare împotriva coloniilor (Fig. 2.3).

3. Tehnica culturii îmbogățirii:

  • În această metodă, s-au ajustat compoziția medie sau condițiile de incubație care favorizează creșterea microorganismelor dorite.
  • Microorganismele nedorite nu sunt dezvoltate deoarece nu găsesc condiții de creștere adecvate.
  • Este necesară examinarea surselor microbiene pentru a găsi microorganisme capabile să utilizeze surse specifice de carbon și azot.
  • Probele de sol sunt de obicei încălzite la 80 până la 100 ° C timp de 10 până la 20 de minute pentru izolarea actinomicetelor, a ciupercilor și a altor microorganisme purtătoare de spori.
  • Aceste specii purtătoare de spori sunt izolate în principal pentru producerea de antibiotice, enzime și alți metaboliți bioactivi. Tratamentul de preîncălzire ucide celulele vegetative, dar sporii nu sunt afectați.
  • Probele tratate termic sunt diluate și răspândite pe suprafața agarului nutritiv conținând cazeină la pH 10-12.
  • Coloniile înconjurate de o zonă liberă sunt izolate, purificate și apoi subculturate. Această zonă limpede indică faptul că speciile particulare elimină protează alcalină care degradează cazeina.

4. Metoda de colorare a indicatorului:

  • Coloranții indicatori de pH utilizați în principal pentru detectarea microorganismelor sunt capabili să producă acizi organici sau amine, de ex. roșu neutru, albastru de bromotimol etc.
  • Acești coloranți indicatori de pH sunt adăugați în mediul agar nutritiv slab tamponat care suferă modificări de culoare în funcție de pH-ul său.
  • Schimbarea culorii unui colorant în vecinătatea coloniei sugerează capacitatea celulelor de a produce acizi organici sau amine.
  • Producția de acizi organici m detectată prin adăugarea de carbonat de calciu în mediu.
  • Producția de acid este indicată de o zonă curățată de carbonat de calciu dizolvat în jurul coloniei

5. AUXANOGRAFIE:

  • Această tehnică este utilizată în mare măsură pentru detectarea microorganismelor capabile să sintetizeze vitamine extracelulare, aminoacizi sau alți metaboliți care stimulează creșterea.
  • Diluțiile de sol sunt aplicate pe plăcile de agar care produc colonii bine izolate. O altă placă de agar conține organismul testat.
  • Stratul de agar al primei plăci este transferat aseptic pe suprafața celei de-a doua plăci care conține organismul testat.
  • Vitaminele și aminoacizii care produc colonii prezente (în sol) pe suprafața primului strat de agar se pot difuza în stratul inferior al agarului.
  • Zona de creștere stimulată (zona expoziției) a organismului testat în apropierea coloniilor indică faptul că aceste colonii pot produce vitamine și aminoacizi.
  • Coloniile active izolate sunt purificate, subcultive și retestate pentru metaboliți.

Screening secundar:

  • Screeningul primar permite izolarea microorganismelor care posedă aplicații industriale importante.
  • Această tehnică nu oferă multe informații legate de procesul de fermentare, producția sau potențialul de producție al microorganismelor noi izolate.
  • Screeningul secundar ajută la detectarea microorganismelor utile în procesele de fermentare și la eliminarea celor lipsiți de potențial industrial.
  • Este necesar să se cunoască următoarele puncte asociate cu screeningul secundar pentru izolarea, standardizarea și caracterizarea noilor microorganisme producătoare de bioactivitate.
  • Screeningul secundar este foarte util pentru separarea noilor culturi microbiene care au aplicații industriale reale de izolatele obținute în screeningul primar.

(i) Oferă informații despre dacă microorganismele produc sau nu compuși chimici noi. Acest lucru poate fi confirmat prin comparație cu compușii cunoscuți folosind strat subțire, hârtie sau alte tehnici cromatografice.

(ii) Ajută la furnizarea de informații cu privire la randamentul produsului microorganismelor nou izolate. Aceste informații sunt foarte utile în selectarea culturilor specifice pentru procesul final de fermentare.

(iii) Screeningul secundar relevă faptul că pH-ul, temperatura, aerarea sau alte cerințe critice asociate microorganismelor bioactive pentru creșterea anumitor microbi și pentru formarea de noi produse chimice. Poate da o idee dacă lipsesc constituenții medii specifici sau unii constituenți pot produce efecte toxice asupra creșterii microorganismelor.

(iv) Tehnicile de screening detectează instabilitatea genetică a speciilor microbiene noi izolate, multe specii microbiene își pot pierde capacitatea de producție maximă a componentelor active prin procesul de mutație sau recombinare.

(v) Proprietățile fizice, chimice și biologice ale unui produs sunt determinate prin screening secundar. Oferă o idee despre stabilitatea chimică a produselor și solubilitatea produselor în diferiți solvenți organici.

(vi) Se relevă dacă un produs produs din fermentație apare în bulionul de cultură în mai multe forme chimice. Doi sau mai mulți compuși bioactivi diferiți, de asemenea, produși printr-o singură fermentare.

(vii) Oferă informații despre produse noi. Produsul poate avea o structură simplă, complexă sau macromoleculară.

(viii) Multe produse de fermentație (în principal antibiotice) sunt testate pentru a determina toxicitatea asupra animalelor, plantelor sau ființelor umane. Aceste tehnici oferă informații despre toxicitatea produselor care sunt utilizate în principal în scopuri terapeutice.

(ix) Se relevă dacă microorganismele sunt capabile să-și modifice sau să distrugă propriile produse de fermentare. Culturile microbiene pot produce enzime adaptive care distrug utilitatea produsului. Acestea pot produce o enzimă & # 8216racemază & # 8217 care schimbă configurația L a unui produs de aminoacizi într-un amestec de izomeri D și L.


Screening enzimatic la scară masivă utilizând matrice de picături Picoliter pe spectrometrie de masă inițiator-nanostructură 2019-097

Cercetătorii de la Berkeley Lab's Joint BioEnergy Institute (JBEI) au inventat o nouă abordare pentru screeningul bibliotecilor de enzime la scară masivă prin detectarea metabolitilor. Acest nou design de cipuri cuplează imagistica prin spectrometrie de masă bazată pe suprafață fără matrice și spectrometria de masă inițiator de nanostructuri, cu microfluidice de picături. Una dintre metodele convenționale pentru analiza spectrometriei de masă online este cuplarea ionizării prin electrospray cu microfluidici, dar au existat dificultăți cu sensibilitate scăzută de-a lungul a multe mii de măsurători consecutive.

Acest design este o abordare microfluidică nouă, care permite construirea rapidă și masivă a eșantioanelor direct deasupra unei suprafețe MS nanostructurate pentru screening combinativ de mare randament al activității enzimatice împotriva bibliotecilor de substrat prin spectrometrie de masă. Acest proces flexibil găzduiește mai multe picături pe sit, permițând investigarea mai multor combinații enzimă / substrat, precum și analiza interacțiunilor sinergice și a căilor metabolice în mai multe etape. Aceasta va fi prima platformă care va executa screeningul enzimatic la scară masivă, care va avansa biologia sintetică, producția de bioenergie și dezvoltarea medicamentelor.

ETAPA DE DEZVOLTARE: Principiu dovedit

STARE: Brevet în așteptare. Disponibil pentru licențiere sau cercetare colaborativă.


Capacități dintr-o privire

  • & gt400 colaboratori globali, inclusiv 14 parteneri din primele 20 de companii farmaceutice
  • 4 locații, inclusiv 400 de oameni de știință la care lucrează in vitro și in vivo biologie la Shanghai, 30 de oameni de știință din echipa noastră de farmacologie din Suzhou și 50 de oameni de știință din Qidong.
  • FACS certificat CAP, precum și servicii de patologie și un laborator de testare moleculară pentru virologie clinică
  • Un total de


Evoluția piratării, tehnica de screening pot îmbunătăți cea mai răspândită enzimă

Plantele au evoluat de-a lungul a milioane de ani într-un mediu care sa schimbat dramatic în ultimii 150 de ani de la începutul Revoluției Industriale: nivelurile de dioxid de carbon au crescut cu 50%, iar temperatura globală medie a crescut cu aproape 2 grade Fahrenheit. În timp ce adaptarea naturală nu a reușit să țină pasul, oamenii de știință au dezvoltat instrumente pentru a simula milioane de ani de evoluție în zile pentru a ajuta plantele să se adapteze.

Într - un nou studiu publicat în Jurnalul de chimie biologicăCercetătorii raportează o nouă strategie de screening care le-a permis să identifice, pentru prima dată, o formă mult mai eficientă a enzimei Rubisco, care catalizează primul pas de fixare a dioxidului de carbon în direcția creării biomasei vegetale în fotosinteză.

„Deși cea mai abundentă și probabil cea mai importantă enzimă de pe planta noastră, este posibil ca Rubisco să nu fi fost cel mai bun moment al evoluției. susținerea moleculelor de dioxid de carbon și a moleculelor de oxigen care creează un compus toxic care costă reciclarea energiei plantelor ", a declarat Don Ort, director adjunct pentru realizarea eficienței fotosintetice crescute (RIPE), care a susținut această lucrare. Ort este fiziolog la Unitatea de Cercetare a Photosintezei USDA / ARS și Profesor Robert Emerson de Biologie a Plantelor și Științe ale Culturilor la Institutul Carl R. Woese pentru Biologie Genomică de la Universitatea din Illinois.

"Am arătat că putem îmbunătăți eficiența lui Rubisco, capacitatea sa de a diferenția dioxidul de carbon de oxigen - acesta este adevăratul buzz", a spus autorul principal Spencer Whitney, profesor asociat la Universitatea Națională Australiană. "Rubisco-ul nostru este mai rapid și are o afinitate mai mare pentru dioxidul de carbon. În trecut, această determinare a durat aproximativ două săptămâni, dar noul nostru sistem de screening a redus acel timp mai mult de jumătate."

Folosind evoluția dirijată, adesea descrisă ca evoluție într-o eprubetă, echipa a testat 250.000 de Rubiscos mutanți din cianobacterii în E coli bacteriile proiectate astfel încât supraviețuirea lor depinde de eficiența enzimei. „Găsirea răspunsurilor cu privire la modul de îmbunătățire a Rubisco este ca și cum ai căuta un ac într-un fân”, a spus Whitney. „Frumusețea acestui sistem este că ne permite să scăpăm de toate acele bucăți de fân.”

Optsprezece mutanți Rubisco au supraviețuit ecranului, dintre care unii s-au dovedit a fi mult mai eficienți în fixarea dioxidului de carbon. Au descoperit că aceste mutații sunt localizate într-o regiune specifică, anterior neexplorată, a Rubisco cianobacteriană. Acum speră să facă modificări similare pentru a îmbunătăți Rubisco în culturi și a le crește creșterea și randamentul.


Screeningul activității enzimei multiplexate

Inhibitorii enzimatici sunt examinați pe scară largă în ceea ce privește potența, cu toate acestea, selectivitatea este adesea testată numai pe candidații principali, rezultând multe eșecuri clinice. Autorii au dezvoltat EnPlex pentru screening multiplexat, cu randament ridicat, al potenței și specificității compusului. În EnPlex, cantități mici de enzime purificate sunt cuplate cu microbere codificate în culori. Complexele de margele-enzimă multiplexate sunt apoi incubate cu un inhibitor care concurează cu sondele fluorescente bazate pe activitate pentru legarea la siturile active enzimatice. Aceste amestecuri sunt scanate prin citometrie în flux, în care un laser detectează culoarea mărgelei (identitatea enzimei) și altul detectează semnale fluorescente (activitatea enzimei). EnPlex a fost validat prin screening simultan & gt100 Ser hidrolaze, o superfamilie enzimatică relevantă clinic, împotriva unui grup de inhibitori cunoscuți. Rezultatele au confirmat interacțiunile cunoscute enzimă-inhibitor și au dezvăluit sute de interacțiuni noi. EnPlex a fost apoi utilizat pentru a examina o bibliotecă de compuși electrofili, identificând moleculele de plumb atât pe baza selectivității, cât și a potenței. Spre deosebire de EnPlex, metodele cu randament redus pot confirma interacțiunile enzimă-compus in situ și nu necesită purificare și imobilizare a proteinelor, totuși, EnPlex oferă atât o acoperire cu randament ridicat, cât și o sensibilitate crescută și ar putea fi utilizată pentru prioritizarea compușilor în timpul screening-ului primar pe baza atât a potenței, cât și a specificității.


Link-uri utile

Acesta este unul dintre cele peste 2.400 de cursuri pe OCW. Explorați materialele pentru acest curs în paginile legate de stânga.

MIT OpenCourseWare este o publicație gratuită și amplă deschisă de materiale de la mii de cursuri MIT, care acoperă întregul curriculum MIT.

Fără înscriere sau înregistrare. Răsfoiți liber și utilizați materialele OCW în ritmul dvs. Nu există înregistrare și nu există date de început sau de sfârșit.

Cunoașterea este recompensa ta. Utilizați OCW pentru a vă ghida propria învățare pe tot parcursul vieții sau pentru a învăța pe alții. Nu oferim credit sau certificare pentru utilizarea OCW.

Creat pentru partajare. Descărcați fișiere pentru mai târziu. Trimite prietenilor și colegilor. Modificați, remixați și refolosiți (nu uitați să menționați OCW ca sursă.)

Despre MIT OpenCourseWare

MIT OpenCourseWare este o publicație online de materiale de la peste 2.500 de cursuri MIT, împărtășind liber cunoștințele cu cursanții și educatorii din întreaga lume. Aflați mai multe & raquo

& copia 2001 & ndash2018
Institutul de tehnologie din Massachusetts

Utilizarea dvs. de către site-ul și materialele MIT OpenCourseWare este supusă licenței noastre Creative Commons și altor termeni de utilizare.


Priveste filmarea: Aplicação de enzimas na indústria: passado, presente e futuro (Ianuarie 2022).