Informație

1.2.6: Revizuire - Biologie


Rezumat

După finalizarea acestui capitol, ar trebui să puteți ...

  • Descrieți scopul științei.
  • Distingeți între observații obiective și subiective.
  • Distingeți între măsurători cantitative și observații calitative.
  • Distingeți între raționamentul inductiv și deductiv și raportați-le la știința descriptivă și bazată pe ipoteze.
  • Descrieți pașii metodei științifice și explicați natura sa ciclică.
  • Distingeți între experimentele manipulative și studiile observaționale.
  • Identificați tipurile de variabile, grupul de control și replicile într-un studiu științific.
  • Discutați despre importanța evaluării inter pares.
  • Distingeți între știința de bază și cea aplicată și oferiți exemple despre valoarea științei de bază.

Știința este un mijloc de colectare sistematică a informațiilor despre lumea naturală. Știința se bazează pe obiectiv observații și urmarea metodei științifice îi ajută pe oamenii de știință să limiteze părtinire. Ambii inducţie și deducere sunt importante pentru metoda științifică. Observațiile conduc la o întrebare și la o ipoteză, un exemplu de raționament inductiv. Făcând predicții falsificabile pe baza ipotezei și testarea acestora prin intermediul experimente manipulative sau studii observaționale necesită raționament deductiv. În cele din urmă rezultate sunt colectate și oamenii de știință încheia dacă datele susțin ipoteza. Metoda științifică este un proces ciclic, în care ultimii pași ai procesului pot duce înapoi la pași anteriori.

Oamenii de știință își publică descoperirile în reviste științifice, care necesită evaluare inter pares.

Știință aplicată se concentrează pe rezolvarea problemelor moderne, dar stiinta de baza se concentrează pur și simplu pe extinderea cunoștințelor. Cu toate acestea, descoperirile științei de bază pot avea ulterior aplicații utile.


Stresul oxidativ scurtează telomerii in vivo? Un comentariu

Lungimea telomerilor, capacele de protecție ale cromozomilor, este din ce în ce mai utilizată ca biomarker al stării de sănătate individuale, deoarece s-a demonstrat că prezice șansele de supraviețuire într-o serie de specii endoterme, inclusiv la oameni. Se presupune că stresul oxidativ este o cauză majoră a scurtării telomerilor, dar cele mai multe dovezi până în prezent provin in vitro celule cultivate. Importanța stresului oxidativ ca determinant al scurtării telomerilor in vivo rămâne mai puțin clar și a fost recent pus la îndoială. Prin urmare, am revizuit studii corelative și experimentale care investighează legăturile dintre stresul oxidativ și scurtarea telomerilor in vivo. În timp ce studiile corelative oferă un sprijin echivoc pentru o conexiune între stresul oxidativ și uzarea telomerilor (10 din 18 studii), majoritatea studiilor experimentale publicate până acum (șapte din opt studii) susțin parțial sau pe deplin această ipoteză. Cu toate acestea, această legătură pare să fie dependentă de țesuturi în unele cazuri sau limitată la anumite categorii de persoane (de exemplu, dependentă de sex) în alte cazuri. Mai multe studii experimentale, în special cele care scad protecția antioxidantă sau creșterea generației pro-oxidante, sunt necesare pentru a ne înțelege mai bine importanța stresului oxidativ în determinarea lungimii telomerilor. in vivo. Studiile care compară creșterea cu indivizii adulți sau țesuturile proliferative cu cele neproliferative ar oferi perspective deosebit de importante.

1. Introducere

Datorită funcției centrale a telomerilor în protejarea capetelor cromozomilor și a integrității genomului, studiul lor a câștigat interes pentru diferite domenii ale biologiei, variind de la biologia celulară și epidemiologie la ecologie și biologie evolutivă [1,2]. S-a demonstrat că telomerii se scurtează odată cu vârsta într-o gamă largă de organisme [3,4] și, mai important, că lungimea și / sau rata de scurtare a telomerilor ar putea prezice supraviețuirea ulterioară [4,5]. În consecință, s-a sugerat că lungimea și / sau uzura telomerilor acționează ca un biomarker al „vârstei biologice” individuale. Dinamica telomerilor a fost legată nu numai de perspectivele individuale de supraviețuire, de condițiile de creștere timpurie și de succesul reproducerii, ci și de diferiți factori de stres fiziologic și psihologic. Se consideră astfel că telomerii sunt un biomarker al expunerii la provocările de mediu și la stilul de viață individual [1,2,6].

Deși rolul esențial al telomerilor în sănătatea și biologia îmbătrânirii este bine recunoscut, înțelegerea noastră asupra factorilor determinanți ai dinamicii telomerilor in vivo este încă imperfect. De exemplu, informații referitoare la in vivo efectele stresului oxidativ asupra lungimii și / sau ratei de scurtare a telomerilor rămân limitate, deoarece majoritatea studiilor efectuate până acum au folosit un in vitro abordare. Cu toate acestea, majoritatea studiilor privind dinamica telomerilor fac presupunerea că, deoarece există un in vitro efectul daunelor oxidative asupra telomerilor, este și cazul in vivo. Recenta lucrare de Boonekamp și colab. [7] evidențiază această limitare și decalajul care există în literatura de specialitate cu privire la acestea in vivo efecte.

Cu această revizuire, ne propunem să oferim o imagine mai clară a situației, concentrându-ne pe ceea ce facem și nu știm despre in vivo legături între stresul oxidativ și telomerii. Oferim un scurt rezumat al structurii telomerilor și mecanismelor principale prin care este reglementată lungimea telomerilor. Acoperim apoi in vivo aspecte ale impactului stresului oxidativ asupra dinamicii telomerilor. Analizăm literatura și evaluăm critic in vivo studii corelative și experimentale care investighează legătura dintre stresul oxidativ și lungimea și / sau scurtarea telomerilor. În cele din urmă, subliniem câțiva parametri cheie care ar putea contribui la rezultatele mixte publicate până acum și propunem diferite abordări experimentale care ar trebui să contribuie la furnizarea de date solide în studiile viitoare.

2. Structura și scurtarea telomerilor

Telomerele, complexe protectoare ADN-proteine ​​situate la capătul cromozomilor eucariote, sunt formate din secvențe de ADN necodificatoare care constau din repetări în tandem ale unei secvențe simple de nucleotide care este bogată în guanină (G) [8]. În timp ce lungimea telomerilor variază între cromozomi și specii, secvența este similară în toate eucariotele, indicând faptul că telomerii sunt o structură foarte conservată și antică, cu un rol evolutiv semnificativ în protejarea integrității genomului [9].

Lungimea telomerilor este dinamică și rezultă dintr-un echilibru între procesele de restaurare și pierderi. Deoarece replicarea ADN-ului este un proces parțial incomplet, de fiecare dată când o celulă împarte secvențele ADN telomerice ale cromozomilor se pierd, fenomen cunoscut sub numele de „problema de replicare finală” [10]. Telomerii se pot scurta cu 30 până la 200 bp per diviziune celulară, dar se crede că numai 10 bp pierderi se datorează problemei de replicare finală în celulele cultivate la om [11]. Se consideră că stresul oxidativ care duce la deteriorarea ADN-ului este principalul factor responsabil pentru pierderea rămasă [12].

Stresul oxidativ poate apărea din speciile reactive de oxigen (ROS) generate din surse exogene (radiații UV și poluanți), dar se crede că majoritatea ROS intracelular apare ca un produs secundar al metabolismului aerob și al producției de ATP în mitocondrii [13] . ROS sunt foarte reactivi și vor provoca daune oxidative diferitelor biomolecule. Astfel de daune pot fi prevenite fie prin mecanisme de apărare cunoscute sub numele de apărări antioxidante, fie reparate în unele cazuri după ce apar. Stresul oxidativ este astfel rezultatul unui dezechilibru între apărarea antioxidantă și producția de ROS. Datorită conținutului ridicat de guanină, se crede că telomerii sunt deosebit de sensibili la deteriorarea oxidativă [14]. Dacă nu este prevenită, deteriorarea oxidativă a regiunilor telomerice va duce la acumularea de daune ADN-ului și va exacerba pierderea telomerilor. Deși deteriorarea oxidativă poate provoca scurtarea telomerilor prin pauze dublu catenare la ADN, majoritatea pierderilor de telomeri cauzate de stresul oxidativ se produc în timpul replicării ADN ca urmare a deteriorării ADN-ului cu un singur fir [12]. Deoarece regiunile telomerice au o eficiență scăzută de reparare a daunelor ADN monocatenar, telomerii care conțin astfel de leziuni ADN monocatenar nu vor fi complet reproduse la următoarea diviziune celulară. Prin urmare, telomerii care conțin astfel de leziuni ADN se vor scurta mai mult după următoarea diviziune celulară, deoarece secvența dincolo de daune se va pierde [15]. Există diferite mecanisme pentru menținerea sau restabilirea lungimii telomerilor, iar principalul este activitatea telomerazei, o ribonucleoproteină capabilă să alungească telomerii [16]. În absența restaurării, lungimea telomerilor se scurtează cu fiecare diviziune celulară atunci când telomerii ating un prag de lungime critică, induc o oprire permanentă în ciclul celular cunoscut sub numele de senescență celulară, care poate fi urmată de moartea celulară. Având în vedere rolul lor în senescența celulară, se crede că telomerii sunt implicați și în senescența și îmbătrânirea organismului [1].

Majoritatea lucrărilor privind efectele stresului oxidativ asupra dinamicii telomerilor au fost efectuate in vitro. În afară de câteva studii [17,18], majoritatea in vitro experimentele au arătat că stresul oxidativ accelerează scurtarea telomerilor [12,15,19]. Prin urmare, se consideră că stresul oxidativ mediază efectele mai multor factori de mediu asupra dinamicii telomerilor la nivel organismal, dar în mod surprinzător in vivo efectele stresului oxidativ asupra dinamicii telomerilor au fost relativ puțin investigate, așa cum sa subliniat într-o publicație recentă [7].

3. Care sunt dovezile actuale care arată că stresul oxidativ scurtează telomerii in vivo?

Am căutat în literatura publicată folosind motorul de căutare Web of Science în mai 2017, folosind combinații dintre următorii termeni: telomer *, stres oxidativ, antioxidant *, deteriorare oxidativă, corelație *, experiment *. Am identificat studii de interes care raportează fie corelații între markerii stresului oxidativ (fără restricții asupra naturii markerilor) și lungimea și / sau scurtarea telomerilor, fie manipulări experimentale ale stresului oxidativ (epuizarea / suplimentarea antioxidantului) și măsurile ulterioare ale lungimii telomerilor și / sau scurtarea.

(a) Studii corelative

Optsprezece studii au raportat informații corelative despre legăturile dintre stresul oxidativ și telomerii (tabelul 1) opt la om și 10 la speciile aviare. În general, 10 din 18 studii raportează corelații semnificative între o varietate de markeri de stres oxidativ și lungimea și / sau uzura telomerilor. Studiile la om (șase din opt) au fost puțin mai susceptibile de a raporta rezultate semnificative decât studiile la păsări (patru din 10). Metodologia utilizată pentru măsurarea telomerilor nu a avut un efect major asupra rezultatului, cu două din cinci studii care utilizează fragment de restricție terminală (TRF) și șapte din 12 studii care utilizează PCR cantitativă (qPCR) raportând rezultate semnificative. În mod surprinzător, markerii de deteriorare oxidativă nu au fost mai susceptibili (șase din 14) să fie asociați cu lungimea telomerilor decât markerii apărării antioxidante (cinci din 12). La păsări, studiile privind reducerea telomerilor au fost puțin mai susceptibile de a găsi rezultate semnificative decât cele care privesc lungimea telomerilor în sine (patru din opt versus unul din opt). În general, dovezile corelative rămân echivoce în susținerea ipotezei că stresul oxidativ contribuie la scurtarea telomerilor in vivo.

Tabelul 1. Rezumatul studiilor corelative efectuate in vivo și testarea relațiilor dintre markerii stresului oxidativ și lungimea telomerilor (TL) și / sau scurtarea telomerilor (ΔTL). Direcțiile corelațiilor nu sunt prezentate în tabel, deoarece acestea au fost întotdeauna în direcția prezisă, și anume că daunele oxidative ridicate au fost asociate cu telomeri mai scurți sau scurtarea mai rapidă a telomerilor, în timp ce nivelurile ridicate de antioxidanți au fost asociate cu telomerii mai lungi sau reducerea redusă a telomerilor. Metoda de măsurare a lungimii telomerilor este indicată ca reacție în lanț cantitativă a polimerazei (qPCR), fragment de restricție terminală (TRF) sau fluorescență cantitativă in situ hibridizare (qFISH). RBC, TAC a celulelor roșii din sânge, capacitate antioxidantă totală SOD, enzima antioxidantă superoxid dismutază glutation, un ROM principal intracelular antioxidant, metaboliți oxigenici reactivi, un marker al deteriorării oxidative timpurii generale.

a Cu excepția unei corelații semnificative între afectarea proteinelor și TL numai la pacienții cu boală Parkinson.

(b) Studii experimentale

În total, opt studii au folosit o abordare experimentală controlată (adică manipularea stresului oxidativ) pentru a investiga legăturile dintre stresul oxidativ și telomeri (tabelul 2). Două studii au utilizat tratamentul cu l-butionină sulfoximină (BSO) pentru a reduce selectiv nivelurile endogene de glutation, un important antioxidant intracelular. Celelalte șase studii au utilizat suplimentarea cu diverși antioxidanți, singuri sau în combinație, cum ar fi vitaminele C și E, coenzima Q10 sau metionina. În general, șapte din opt studii oferă suport parțial sau total pentru un efect semnificativ al stresului oxidativ asupra lungimii telomerilor și / sau a ratei de scurtare. Singurul studiu care nu susține această ipoteză [45] a fost realizat în timpul dezvoltării embrionare, când activitatea telomerazei ar trebui să fie ridicată și nu a arătat nici un efect clar asupra nivelurilor de deteriorare oxidativă. Totuși, este demn de remarcat faptul că efectele stresului oxidativ asupra lungimii telomerilor sunt susceptibile să fie dependente de țesuturi [38] și, în unele cazuri, limitate la anumite grupuri de animale care ar putea fi mai sensibile la modificările apărării antioxidante decât altele [43]. , 44]. Dintre cele șase studii care au măsurat impactul tratamentului asupra nivelurilor de deteriorare oxidativă, cinci dintre ele au obținut rezultate care au fost în mare parte consecvente între efectele tratamentului asupra deteriorării oxidative pe de o parte și asupra lungimii și / sau scurtării telomerilor pe de altă parte. . În general, dovezile experimentale adunate până acum susțin în mare parte ipoteza că stresul oxidativ contribuie la scurtarea telomerilor in vivo.

Tabelul 2. Rezumatul studiilor experimentale efectuate in vivo și testarea efectelor epuizării sau suplimentării antioxidanților asupra lungimii telomerilor (TL) și / sau scurtării telomerilor (ΔTL). Metoda de măsurare a lungimii telomerilor este indicată ca PCR cantitativă (qPCR), fragment de restricție terminal (TRF) sau fluorescență cantitativă in situ hibridizarea (qFISH) și săgețile descriu efecte de scădere (↘), creștere (↗) sau nesemnificative (↔).

a În grupul „recuperat” numai la vârsta de trei luni.

4. Limitări ale dovezilor corelative și experimentale actuale

Mai multe aspecte experimentale ar putea explica eterogenitatea rezultatelor pe care le-am găsit în studiile analizate in vivo relațiile dintre stresul oxidativ și lungimea telomerilor. În primul rând, țesuturile prelevate, precum și momentul prelevării eșantionului sunt parametri cheie de luat în considerare. Într-adevăr, s-a arătat că o scurtare crescută a telomerilor ca răspuns la stresul oxidativ este probabil dependentă de țesuturi [38]. Cu toate acestea, majoritatea studiilor corelative (13 din 18) au măsurat markerii stresului oxidativ și lungimea telomerilor în diferite tipuri de țesuturi (de exemplu, stresul oxidativ în plasmă și lungimea telomerilor în ADN izolat din celulele sanguine). Acest lucru exclude probabil obținerea de informații solide, deoarece atât variațiile în lungimea telomerilor, cât și markerii stresului oxidativ pot fi dependenți de țesuturi (de exemplu [47,48]). În mod similar, măsurarea deteriorării oxidative a lipidelor / proteinelor, dar nu și a ADN-ului nu este ideală atunci când se testează efectul stresului oxidativ asupra lungimii telomerilor, deoarece nivelurile de deteriorare oxidativă a diferitelor biomolecule nu sunt neapărat corelate (de exemplu [49,50]).

Momentul eșantionării pentru a măsura atât stresul oxidativ, cât și lungimea telomerilor este, de asemenea, un parametru cheie de luat în considerare. Într-adevăr, nivelurile de stres oxidativ pot varia mult mai repede decât lungimea telomerilor. Mai mult, majoritatea efectelor stresului oxidativ asupra lungimii telomerilor ar trebui să fie vizibile numai după următoarea replicare celulară, deoarece este mai probabil să se producă daune monocatenare decât pauzele dublu catene, iar astfel de leziuni monocatenare vor scurta doar telomerii. în timpul replicării [12]. Prin urmare, efectele asupra scurtării telomerilor a creșterii stresului oxidativ la un moment dat ar putea fi vizibile doar mai târziu. Acest lucru implică nu numai faptul că studiile experimentale ar trebui să privească lungimea telomerilor suficient de mult pentru ca replicarea să aibă loc după manipulare, dar și că studiile corelative ar trebui să aleagă în mod înțelept momentul de eșantionare. De exemplu, o strategie de eșantionare potențială ar putea fi măsurarea lungimii telomerilor „inițiali” și a stresului oxidativ, măsurarea lungimii telomerelor „finale” ulterior (în mod ideal luând în considerare momentul diviziunii celulare în țesutul țintă), și apoi corelarea scurtării telomerilor cu oxidativul inițial nivelurile de stres. Într-adevăr, deoarece lungimea telomerilor este probabil determinată în mare măsură de moștenire și de condițiile de viață timpurie [51,52], utilizarea ratei de scurtare a telomerilor va evita acest „zgomot de fond” într-o corelație cu nivelurile de stres oxidativ. În consecință, arătăm în materialele electronice suplimentare S1 și S2, folosind unul dintre propriile noastre seturi de date (date disponibile în materialul suplimentar electronic, S3), că o astfel de abordare a fost singura care a relevat o relație semnificativă între deteriorarea oxidativă a ADN-ului și telomerii din cărbune tit (Periparus ater) cuiburi (informații despre stresul oxidativ și măsurătorile telomerilor au fost publicate anterior separat în [32,33]).

Stadiul de viață în care animalele sunt prelevate este, de asemenea, un aspect primordial de luat în considerare. De exemplu, este posibil ca telomeraza să fie activă în timpul dezvoltării embrionilor și, eventual, în stadiile de viață ulterioare, în special în țesuturile unor taxoni [3]. Acest lucru este important de luat în considerare, deoarece ar putea masca adevărata relație dintre stresul oxidativ și scurtarea telomerilor in vivo. În plus, în perioada de creștere, problema finală a replicării în timpul diviziunii celulare este probabil un factor cheie al scurtării telomerilor, care poate avea consecințe diferite pe care cercetătorii ar trebui să le ia în considerare. Într-adevăr, diviziunea celulară rapidă și problema de replicare finală asociată în timpul creșterii ar putea reduce probabilitatea de a găsi rezultate semnificative în studiile corelative, deoarece va reduce proporția relativă de scurtare a telomerilor legată de stresul oxidativ. Alternativ, diviziunea celulară rapidă legată de creștere ar putea crește probabilitatea de a detecta rezultate semnificative în studiile experimentale prin conversia rapidă a unei singure catene în scurtarea efectivă a telomerilor.

Natura manipulării experimentale ar trebui, de asemenea, să fie luată în considerare cu atenție. Într-adevăr, în timp ce studiile de suplimentare cu antioxidanți detaliate în tabelul 2 au avut destul de succes în găsirea efectelor benefice semnificative asupra lungimii telomerilor, orice rezultat nesemnificativ al unei astfel de suplimente nu ar fi surprinzător în opinia noastră. Într-adevăr, o astfel de suplimentare antioxidantă este probabil să fie benefică numai dacă este nevoie de antioxidanți suplimentari și nu dacă animalele nu sunt limitate în mod natural la resurse [53]. Acest lucru ar putea explica de ce, în unele cazuri, suplimentarea cu antioxidanți a fost benefică doar pentru anumite grupuri specifice de animale [43,44].

În cele din urmă, alte tipuri de prejudecăți, cum ar fi tendința statistică sau tendința de publicare, ar putea, de asemenea, distorsiona înțelegerea efectelor stresului oxidativ asupra telomerilor. Într-adevăr, ținând cont de faptul că „corelația nu este cauzalitate”, lipsa unei corelații semnificative nu este nici definitiv un bun suport împotriva cauzalității. Foarte important, eroarea statistică de tip II (adică „fals-negativ”) trebuie deci luată în considerare cu atenție înainte de a trage concluzii despre relații nesemnificative (așa cum se face de [7]), iar dimensiunile eșantionului trebuie să fie în general foarte mari pentru a limita tipul Eroare II. Potențialul prejudecată față de publicarea doar a rezultatelor semnificative ar putea, de asemenea, să modifice imaginea generală găsită în literatura științifică până acum. Acest lucru este probabil adevărat în special în studiile experimentale, deoarece accentul lor principal este pe legăturile dintre stresul oxidativ și scurtarea telomerilor. Studiile corelative sunt probabil mai puțin sensibile la această prejudecată, deoarece deseori raportează corelația dintre stresul oxidativ și telomerii ca parte a altor elemente biologice. informație.

5. Ce ar trebui să facem pentru a avansa terenul?

Credem că doar experimentele proiectate cu atenție vor oferi un răspuns solid la întrebarea despre importanța stresului oxidativ pentru scurtarea telomerilor in vivo. Manipularea directă a producției de ROS sau reglarea descendentă a apărărilor antioxidante este, fără îndoială, o abordare mai puternică decât suplimentarea cu antioxidanți, deoarece suplimentarea este eficientă doar ca răspuns la o limitare naturală a apărării antioxidante. Cu toate acestea, manipularea ROS in vivo este foarte provocator, așa cum sa subliniat într-o recenzie recentă [54]. Cu toate acestea, unele experimente care utilizează molecule pro-oxidante au reușit să inducă daune oxidative moderate (de exemplu [55]), iar măsurarea lungimii telomerilor într-un astfel de context ar trebui să ofere informații utile. Reglarea selectivă a glutationului antioxidant endogen utilizând BSO este, fără îndoială, unul dintre cele mai puternice instrumente disponibile cercetătorilor [38]. Această manipulare este extrem de selectivă, deoarece BSO inhibă numai sinteza glutationului și nu afectează alte căi celulare. De asemenea, merită menționat faptul că studiile experimentale sunt mai susceptibile să dezvăluie un impact semnificativ al stresului oxidativ asupra telomerilor decât studiile corelative. Într-adevăr, este posibil ca organismele în condiții naturale să poată, în majoritatea cazurilor, să mențină stresul oxidativ la un nivel de prag care nu are impact asupra telomerilor, în timp ce manipularea experimentală a stresului oxidativ ar putea perturba un astfel de echilibru.

Indiferent de tipul de manipulare experimentală utilizată, este important să se valideze impactul tratamentului asupra deteriorării oxidative (de preferință asupra ADN-ului) înainte de a examina impactul asupra lungimii și / sau scurtării telomerilor. Dacă este posibil, deteriorarea oxidativă și lungimea telomerilor trebuie măsurate în același tip de eșantion. Investigarea impactului tratamentului trebuie făcută în mai multe țesuturi, deoarece cel mai convingător studiu realizat până în prezent [38] a constatat efectele specifice ale țesutului BSO asupra lungimii telomerilor. După cum sa menționat în paragraful anterior, stadiul de viață, precum și tipul de țesut, ar putea constrânge efectele stresului oxidativ asupra dinamicii telomerilor. Efectuarea aceluiași experiment atât la indivizi în creștere, cât și la adulți și compararea țesuturilor proliferative cu cele neproliferative vor fi astfel importante, pentru a evalua sensibilitatea telomerilor la stresul oxidativ în diferite etape ale vieții, precum și importanța diviziunii celulare în dezvăluirea impactului a stresului oxidativ pe lungimea telomerilor. În cele din urmă, având în vedere diferitele constrângeri experimentale (de exemplu, injecții repetate sau suplimentarea continuă în apă / alimente, monitorizarea atentă a stării de sănătate) și considerații etice, sugerăm că astfel de studii ar trebui efectuate la animale captive.

6. Concluzie

Numărul limitat de studii care investighează in vivo legătura dintre stresul oxidativ și dinamica telomerilor evidențiază faptul că înțelegerea noastră despre această legătură rămâne încă incompletă. Deși studiile corelative afișează rezultate echivoce, constatările din numărul limitat de studii experimentale efectuate până acum par să indice că stresul oxidativ afectează scurtarea telomerilor in vivo. Cu toate acestea, studiile experimentale sunt mai susceptibile de a fi susceptibile la prejudecăți de publicare, așa cum s-a menționat mai sus. Cheia pentru o mai bună înțelegere a impactului stresului oxidativ asupra scurtării telomerilor in vivo va veni fără îndoială din studii experimentale solide, mai ales dacă sunt efectuate într-o gamă largă de organisme, deoarece există diferențe între taxoni în biologia telomerilor. În cele din urmă, atunci când numărul de studii publicate este suficient pentru a depăși limitările legate de eterogenitatea datelor, va fi de cea mai mare importanță efectuarea unei meta-analize cantitative a relațiilor dintre stresul oxidativ și lungimea telomerilor. in vivo.

Accesibilitatea datelor

Datele sunt accesibile ca fișier excel în materialul electronic suplimentar S3.


Metode

Clonarea, exprimarea proteinelor și purificarea SARS-CoV-2 M pro

Culturile celulare au fost crescute și proteinele exprimate conform metodei din ref. 7. Peletele celulare au fost resuspendate în tampon de liză (20 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCI, 5% glicerol), lizate prin omogenizare la presiune înaltă și apoi centrifugate la 25.000g timp de 30 min. Supernatantul a fost încărcat pe o coloană de afinitate Ni-NTA (Qiagen) și spălat în tampon de liză conținând 20 mM imidazol. M pro marcat cu His a fost eluat prin tampon de liză care a inclus 300 mM imidazol. Imidazolul a fost apoi îndepărtat prin desalinizare. A fost adăugată protează 3C rinovirus uman pentru a elimina eticheta His C-terminală. SARS-CoV-2 M pro a fost în continuare purificat prin cromatografie cu schimb de ioni, apoi M pro purificat a fost transferat la 10 mM Tris-HCI pH 8,0 prin desalinizare și depozitat la -80 ° C până la nevoie.

Cristalizarea, colectarea datelor și determinarea structurii

SARS-CoV-2 M pro a fost concentrat la 5 mg ml -1, incubat cu 0,3 mM carmofur (Selleck) timp de 1 oră, apoi complexul a fost cristalizat prin metoda de difuzie a vaporilor de picătură suspendată la 20 ° C. Cele mai bune cristale au fost cultivate folosind un tampon de godeuri conținând 0,1 M MES pH 6,0, 5% polietilen glicol 6000 și 3% DMSO. Soluția crioprotectoare a fost rezervorul, dar cu 20% glicerol adăugat.

Datele cu raze X au fost colectate pe linia fasciculului BL17U1 la Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) la 100 K și la o lungime de undă de 0.97918 Å folosind un detector de plăci de imagine Eiger X 16M. Integrarea și scalarea datelor au fost efectuate folosind programul XDS 21. Structura a fost determinată prin înlocuire moleculară (MR) cu PHASER 22 și Phenix 1.17.1 23 utilizând SARS-CoV-2 M pro (PDB ID 6LU7) ca șablon de căutare. Modelul de la MR a fost ulterior supus ciclurilor iterative de ajustare manuală a modelului cu Coot 0.8 24, iar rafinamentul a fost completat cu Phenix REFINE 25. Inhibitorul, carmofur, a fost construit conform hărții omise. Statisticile de etapizare și perfecționare sunt rezumate în tabelul suplimentar 1.

Testele antivirale și de citotoxicitate pentru carmofur

Un izolat clinic de SARS-CoV-2 (nCoV-2019BetaCoV / Wuhan / WIV04 / 2019) a fost propagat în celulele Vero E6 și titrul viral a fost determinat așa cum a fost descris anterior 20. Celulele Vero E6 au fost obținute de la ATCC cu autentificare. Autentificarea a fost efectuată printr-un control morfologic sub microscop și o analiză a curbei de creștere. Toate celulele au fost testate ca fiind micoplasmatic negative. Pentru testul antiviral, celulele Vero E6 pre-însămânțate (5 × 104 celule pe godeu) au fost pretratate cu concentrații diferite de carmofur timp de 1 oră și virusul a fost adăugat ulterior (MOI de 0,05) pentru a permite infecția timp de 1 oră. Apoi, amestecul virus-medicament a fost îndepărtat și celulele au fost cultivate în continuare cu mediu proaspăt care conține medicament. La 24 de ore după infecție, supernatantul celular a fost colectat și vRNA în supernatant a fost supus analizei qRT-PCR, în timp ce celulele au fost fixate și supuse imunofluorescenței pentru a monitoriza nivelul de NP intracelular așa cum a fost descris anterior 20. Pentru testele de citotoxicitate, celulele Vero E6 au fost suspendate în mediu de creștere în plăci cu 96 de godeuri. A doua zi, concentrațiile adecvate de carmofur au fost adăugate la mediu. După 24 de ore, numărul relativ de celule supraviețuitoare a fost măsurat folosind un test de numărare a celulelor Kit-8 (CCK8, Beyotime) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Toate experimentele au fost efectuate în triplicat și toate experimentele de infecție au fost efectuate la nivelul de biosecuritate 3 (BSL-3).

Rezumatul raportării

Mai multe informații despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul raportării cercetărilor în natură, legat de acest articol.


Priveste filmarea: URECHEA, ORGAN AL AUZULUI ȘI AL ECHILIBRULUI (Noiembrie 2021).