Informație

Conținutul mixului master PCR


Rulez reacții PCR cu diferite seturi de grunduri degenerate și vreau să știu ce ar trebui să intre în master mix


Mixul meu obișnuit de masterat:

  • Apă DEPC
  • Tampon PCR (-Mg)
  • 25mM MgCl2
  • 10mM dNTPmix
  • ADNc

Pe gheață îmi adaug primerii mei înainte și înapoi la tuburile corespunzătoare de PCR, adaug amestec master la fiecare tub de PCR, apoi chiar înainte de a le introduce în ciclorul termic, adaug taq și amestec.


Este acesta un mod adecvat de a o face? Obțin produs, dar mă gândesc că poate îl pot îmbunătăți schimbând ceea ce adaug la mixul master. De exemplu, este mai bine să adăugați taq în loc de ADNc la mixul master și apoi să adăugați ADNc înainte de a începe PCR? Este în regulă să adăugați atât ADNc cât și taq la mixul master împreună?


Întotdeauna adaug Taq la mastermix. Mai întâi facilitează manipularea și evită etapele de pipetare care pot provoca contaminare și pot fi uitate. Apoi, enzima este foarte stabilă și va tolera chiar și temperatura camerei fără probleme. Deoarece vom încălzi acest 30-40 până la 95 ° C, deci acest lucru nu este în mod clar problematic. Deoarece amestecul de reacție este răcit, reacția dvs. nu va începe. Și chiar dacă o va face, nu ar exista multă amplificare din cauza temperaturii scăzute.

Adăug, de obicei, tot ceea ce este același pentru toate reacțiile la mastermix (acest lucru poate include și ADN-ul). Dacă folosesc mai mult de un ADN, împart mastermix-ul în două. În acest fel nu veți face diferite erori de pipetă pentru șablon, ceea ce este deosebit de important pentru PCR în timp real. De obicei diluez ușor grundele, astfel încât să pot pipeta volume mai mari (pur și simplu folosesc o parte din apă folosită pentru a echilibra reacția PCR). Puteți, de asemenea, să preamestecați perechi de grund, dacă vreți, nu am văzut niciodată probleme în a face acest lucru.


Conținut master mix PCR - Biologie

Componenta amestecului master comercial disponibil cel mai sensibil la condiții nefavorabile este polimeraza. Amestecurile master disponibile pentru reacția în lanț comercială a polimerazei (PCR) sunt, în general, recomandate pentru depozitare la -20 ° C, altfel își pot pierde activitatea.

Scopul experimentului a fost de a verifica dacă stocarea amestecurilor în condiții adverse și extreme poate influența calitatea unui produs PCR. În a doua fază a cercetării, a fost indicat dacă reactivii PCR inactivi care și-au pierdut activitatea, își pot recupera proprietățile enzimatice.

Material si metode

Cinci mixuri master disponibile în comerț au fost incubate în condiții nefavorabile. După PCR, s-a efectuat o electroforeză și produsul obținut a fost o dovadă a unei reacții PCR adecvate.

Rezultate si discutii

Degradarea totală a amestecurilor a fost cauzată de incubația lor la temperatura camerei timp de 28 de zile și incubarea la 100 ° C timp de 60 de minute. Adăugarea de polimeraze la amestecurile degradate (incubația la temperatura camerei timp de 28 de zile) a dus la regenerarea tuturor celor cinci amestecuri. În cazul polimerazelor incubate la 100 ° C timp de 60 de minute, regenerarea a fost eficientă doar în două dintre cele cinci amestecuri.

Concluzii

Cercetările noastre confirmă faptul că mixul master PCR se caracterizează printr-o rezistență ridicată la condiții variate, precum și, în unele cazuri, poate fi reparat după degradare.


Thermo Scientific PCR Enzymes & Master Mixes

Portofoliul Thermo Scientific oferă tot ce este necesar pentru PCR de succes: o gamă de enzime în formate de mixare de sine stătătoare și master pentru aplicații de rutină, pornire la cald și de înaltă fidelitate kituri PCR directe și mixuri master pentru amplificare fără purificare ADN și tampoane și reactivi pentru a susține întregul flux de lucru PCR.

Produsele Thermo Scientific includ mărci cunoscute precum Phusion și ADN polimeraze DreamTaq.

Enzime PCR de rutină, pornire la cald, de înaltă fidelitate și directe, kituri și mixuri master

PCR de rutină

Enzime și mixuri master pentru aplicații generale de PCR care necesită performanțe consistente și fiabile de ADN polimerază.

Hot-Start PCR

Enzime și mixuri master pentru aplicații PCR care necesită specificitate și sensibilitate ridicate.

PCR de înaltă fidelitate

Enzime și mixuri master pentru aplicații PCR care necesită o amplificare foarte precisă.

PCR direct

Kituri pentru amplificarea ADN-ului din diferite tipuri de probe fără purificare ADN.

Aplicații PCR suplimentare

  • PCR cu ciclu rapid—Enzime rapide și mixuri master care permit un timp de ciclare foarte scurt al PCR
  • Multiplex PCR—Amestecuri master pentru amplificarea simultană a mai multor ținte ADN

America

Site-ul va fi afișat în limba engleză.

Folosim aceste cookie-uri pentru a ne asigura că site-ul nostru funcționează în siguranță și în mod corespunzător, acestea sunt necesare pentru ca serviciile noastre să funcționeze și nu pot fi oprite în sistemele noastre. De obicei, acestea sunt setate numai ca răspuns la acțiunile făcute de dvs. care reprezintă o cerere de servicii, cum ar fi conectarea, utilizarea unui coș de cumpărături sau completarea formularelor. Puteți configura browserul pentru a vă bloca sau avertiza în legătură cu aceste cookie-uri, dar unele părți ale serviciilor noastre nu vor funcționa fără ele. La fel ca celelalte cookie-uri pe care le folosim, cookie-urile strict necesare pot fi cookie-uri proprii sau terțe.

Folosim aceste cookie-uri pentru a ne aminti setările și preferințele. De exemplu, putem folosi aceste cookie-uri pentru a ne aminti preferințele de limbă.
Permiteți cookie-uri de preferință

Folosim aceste cookie-uri pentru a colecta informații despre modul în care interacționați cu serviciile noastre și pentru a ne ajuta să le măsurăm și să le îmbunătățim. De exemplu, putem folosi aceste cookie-uri pentru a determina dacă ați interacționat cu o anumită pagină.
Permiteți cookie-uri de performanță / statistici

Noi și partenerii noștri publicitari folosim aceste cookie-uri pentru a livra reclame, pentru a le face mai relevante și mai semnificative pentru dvs. și pentru a urmări eficiența campaniilor noastre publicitare, atât pe serviciile noastre, cât și pe alte site-uri web și pe rețelele de socializare.
Permiteți cookie-urile de marketing


SuperPlex Premix este ideal pentru PCR multiplex, cu amplificare imparțială a diferitelor ținte și randament ridicat de amplicon.

Takara Bio USA, Inc.
Statele Unite / Canada: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & bull Europa: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japonia: +81. (0) 77.565.6999
NUMAI PENTRU UTILIZAREA CERCETĂRII. NU DE UTILIZAT ÎN PROCEDURILE DE DIAGNOSTIC. & copia 2021 Takara Bio Inc. Toate drepturile rezervate. Toate mărcile comerciale sunt proprietatea Takara Bio Inc. sau a afiliaților săi din SUA și / sau alte țări sau proprietarii lor respectivi. Este posibil ca anumite mărci comerciale să nu fie înregistrate în toate jurisdicțiile. Informații suplimentare despre produs, proprietate intelectuală și utilizare restricționată sunt disponibile la takarabio.com.

Takara Bio Europe este membru al Takara Bio Group, o companie lideră în domeniul științelor vieții, care se angajează să îmbunătățească condiția umană prin biotehnologie. Prin mărcile noastre Takara, Clontech și Cellartis, misiunea noastră este să dezvoltăm instrumente și servicii inovatoare de înaltă calitate pentru a accelera descoperirea.


UITĂRI-ME-NU ™ AMESTECĂRI MASTER qPCR

Figura 1. Forget-Me-Not ™ EvaGreen® Master Mix (urmărire în 2 culori) conținând un colorant albastru deschis înainte (stânga) și după (dreapta) adăugarea șablonului care conține tamponul șablonului albastru închis.

Mixurile noastre master Forget-Me-Not ™ EvaGreen® qPCR sunt mix-uri master cu bază de coloranți EvaGreen® pentru utilizare în aplicații PCR în timp real și analiza curbei ADN topit. Aceste mixuri master pot fi utilizate în locul oricărui mix master SYBR® Green pe bază de coloranți. Amestecurile Master Forget-Me-Not ™ EvaGreen® qPCR conțin o concentrație scăzută de colorant albastru inert, permițându-vă să vedeți cu ușurință fântânile care conțin master mix.

Amestecurile master sunt disponibile fără colorant pasiv ROX, cu un tub separat de ROX sau premixat cu ROX (concentrații mari sau mici). Un kit este disponibil cu un sistem de urmărire în 2 culori care include tampon șablon ADN (un colorant albastru închis) care, atunci când este amestecat cu șablonul, vă va schimba reacția de la deschis la albastru închis când se adaugă șablonul (Figura 1, stânga). Sistemul de urmărire în 2 culori poate preveni greșelile de pipetare și evita pierderea de timp, reactivi și mostre prețioase de ADN.

Figura 2. Uitați-mă-nu Mixul master EvaGreen® qPCR funcționează la fel de bine sau mai bine decât alte mixuri master PCR pe bază de coloranți, cu luminozitate și sensibilitate excepționale.

Colorant EvaGreen®
Un colorant unic de legare a ADN-ului cu caracteristici ideale atât pentru analiza qPCR, cât și pentru analiza de înaltă rezoluție (HRM) *. Colorantul EvaGreen® se leagă de dsDNA printr-un nou mecanism de „eliberare la cerere”, care permite utilizarea unei concentrații relativ mari de coloranți în qPCR fără inhibarea PCR (Mao, și colab. 2007. BMC Biotech. 7, 76-91) . Faceți clic aici pentru mai multe informații despre colorantul EvaGreen®.

O caracteristică unică a colorantului EvaGreen® este siguranța sa. Coloranții care leagă ADN sunt în mod inerent periculoși datorită potențialului lor de a provoca mutații. Având în vedere acest lucru, oamenii de știință ai Biotium au proiectat colorantul EvaGreen® astfel încât să nu poată traversa membranele celulare, împiedicând astfel colorarea să fie în contact cu ADN-ul genomic din celulele vii. Toți ceilalți coloranți comerciali PCR intră în celule în câteva minute. SYBR® Green I, de exemplu, sa dovedit a fi mai toxic din punct de vedere ecologic decât bromura de etidiu, un mutagen bine cunoscut (Ohta și colab. 2001. Mut. Res. 492, 91-97). Laboratoarele independente au confirmat că colorantul EvaGreen este nemutagen, necitotoxic și sigur pentru viața acvatică pentru eliminarea directă în canalizare. Pentru detalii, descărcați Raportul de siguranță pentru vopsea EvaGreen®.

Un avantaj suplimentar al unui mix master bazat pe EvaGreen® este acela că vă puteți analiza produsul PCR prin electroforeză pe gel fără a fi nevoie să adăugați un alt colorant de legare a ADN-ului fie la tamponul de încărcare, fie la gel. Colorantul EvaGreen® din mixul master poate acționa ca o pre-colorare a ADN-ului, permițând vizualizarea directă a benzilor de ADN după electroforeză.

Cheetah ™ HotStart Taq
Cheetah ™ HotStart Taq ADN polimeraza este ADN polimeraza modificată chimic patentată de Biotium. Cheetah ™ Taq este complet inactiv la temperatura camerei și este complet activat după 2 minute la 95 ° C, făcându-l deosebit de potrivit pentru protocoalele PCR de ciclare rapidă.

ProdusVopsea de referințăCatalog nr.mărimea
Forget-Me-Not ™ EvaGreen® qPCR Master Mix (premixat low ROX sau High ROX)ROX scăzut31045-T1 ml (100 reacții)
31045-5mL 5 x 1 ml (500 de reacții)
31045-20mL 2 x 10 ml (2000 de reacții)
ROX ridicat31046-T1 ml (100 reacții)
31046-5mL 5 x 1 ml (500 de reacții)
31046-20mL 2 x 10 ml (2000 de reacții)
Forget-Me-Not ™ EvaGreen® qPCR Master Mix (urmărire în două culori) Fără ROX31041-T1 ml (100 reacții)
31041-1 5 x 1 ml (500 de reacții)
31041-20mL 2 x 10 ml (2000 de reacții)
Tub separat de ROX31042-T1 ml (100 reacții)
31042-1 5 x 1 ml (500 de reacții)
31042-20mL 2 x 10 ml (2000 de reacții)

Sonda universală qPCR Master Mix Forget-Me-Not ™ Universal Probe qPCR Master Mix este un produs de înaltă performanță pentru aplicații de PCR bazate pe sondă fluorescentă, inclusiv cuantificare și genotipare SNP. Acest kit este potrivit pentru toate tehnologiile bazate pe sonde fluorescente, inclusiv sonde de hidroliză (cum ar fi TaqMan® și sonde BHQ® cu etichetă dublă) și sonde de deplasare (cum ar fi balizele moleculare). Forget-Me-Not ™ Universal Probe qPCR Master Mix arată o concordanță excelentă a rezultatelor în reacțiile singleplex și multiplex, are o compatibilitate largă a instrumentelor și poate fi utilizat atât în ​​protocoale standard, cât și în protocoale rapide. Un kit separat este, de asemenea, disponibil cu ROX, dacă instrumentul dvs. necesită colorant de referință ROX. Kitul include un tampon de urmărire 40X Forget-Me-Not ™ care conține un colorant albastru inert. Aveți opțiunea de a adăuga un tampon de urmărire la mixul principal, la șablonul ADN sau de a nu utiliza tamponul de urmărire în reacțiile dvs. Adăugarea tamponului de urmărire la mixul principal vă permite să distingeți cu ușurință godeurile care conțin amestecul de reacție de godeurile goale. Pe de altă parte, adăugarea tamponului de urmărire la probele de șablon ADN vă permite să urmăriți ce reacții au fost adăugate șablon în timp ce configurați reacțiile PCR. Figura 3. Forget-Me-Not Universal Probe Master Mix funcționează excepțional de bine pentru reacțiile PCR ale sondei mutiplexate. ProdusVopsea de referințăCatalog nr.mărimea Forget-Me-Not ™ Universal Probe qPCR Master MixFără ROX31043-T1 ml (100 reacții) 31043-1 5 x 1 ml (500 de reacții) Tub separat de ROX31044-T1 ml (100 reacții) 31044-1 5 x 1 ml (500 de reacții) Ghid de selecție Master Mix

Catalog nr.Master MixEvaGreen & reg qPCRPCR bazat pe sondăOptimizat pentru dPCRUrmărire cu 1 culoareUrmărire 2 culori
31041Uitați-mă-nu și tranzacționați EvaGreen & reg qPCR Master Mix cu urmărire în două culori &Verifica &Verifica
31042Uitați-mă-nu și tranzacționați EvaGreen & reg qPCR Master Mix cu urmărire în două culori,
cu ROX separat
&Verifica &Verifica
31045Uitați-mă-Nu și tranzacționați EvaGreen & reg qPCR Master Mix (low ROX) &Verifica &Verifica
31046Uitați-mă-Nu și tranzacționați EvaGreen & reg qPCR Master Mix (ROX ridicat) &Verifica &Verifica
31043Forget-Me-Not & trade Universal Probe qPCR Master Mix (fără ROX) &Verifica &Verifica*
31044Forget-Me-Not și tranzacționați Universal Probe qPCR Master Mix, cu ROX separat &Verifica &Verifica*
31078N-Flux & trade 5X Digital PCR Master Mix &Verifica &Verifica
* Opțional

EvaGreen® Dye și Cheetah ™ HotStart Taq DNA Polymerase sunt acoperite de brevetele SUA și internaționale. QuantiNova este o marcă înregistrată a Qiagen Group. SYBR este o marcă înregistrată a Molecular Probes, Inc./Life Technologies. * HRM este o marcă înregistrată a Idaho Technologies, Inc./BioFire Defense, LLC și utilizarea sa poate necesita o licență.


America

Site-ul va fi afișat în limba engleză.

Folosim aceste cookie-uri pentru a ne asigura că site-ul nostru funcționează în siguranță și în mod corespunzător, acestea sunt necesare pentru ca serviciile noastre să funcționeze și nu pot fi oprite în sistemele noastre. De obicei, acestea sunt setate numai ca răspuns la acțiunile făcute de dvs. care reprezintă o cerere de servicii, cum ar fi conectarea, utilizarea unui coș de cumpărături sau completarea formularelor. Puteți configura browserul pentru a vă bloca sau avertiza în legătură cu aceste cookie-uri, dar unele părți ale serviciilor noastre nu vor funcționa fără ele. La fel ca celelalte cookie-uri pe care le folosim, cookie-urile strict necesare pot fi cookie-uri proprii sau terțe.

Folosim aceste cookie-uri pentru a ne aminti setările și preferințele. De exemplu, putem folosi aceste cookie-uri pentru a ne aminti preferințele de limbă.
Permiteți cookie-uri de preferință

Folosim aceste cookie-uri pentru a colecta informații despre modul în care interacționați cu serviciile noastre și pentru a ne ajuta să le măsurăm și să le îmbunătățim. De exemplu, putem folosi aceste cookie-uri pentru a determina dacă ați interacționat cu o anumită pagină.
Permiteți cookie-uri de performanță / statistici

Noi și partenerii noștri publicitari folosim aceste cookie-uri pentru a livra reclame, pentru a le face mai relevante și mai semnificative pentru dvs. și pentru a urmări eficiența campaniilor noastre publicitare, atât pe serviciile noastre, cât și pe alte site-uri web și pe rețelele de socializare.
Permiteți cookie-urile de marketing


Cum amestecați reacțiile PCR - swish, flick sau nimic? - (28.03.2005)

Cum vă amestecați tuburile de reacție înainte de a le plasa în termociclatorul? Dacă mastermixul dvs. este bine amestecat, este chiar necesar să amestecați tubul după ce adăugați șablonul? Doar curios ce cred toată lumea.

Știu mici detalii, dar o tehnică bună vine din acordarea atenției lucrurilor mici.

Am auzit că nu este bine să vortexezi ADN-ul și să pipetezi enzimele U & amp D. așa că mișcarea mi se pare cea mai bună soluție.

Am auzit că nu este bine să vortexezi ADN-ul și să pipetezi enzimele U & amp D. așa că mișcarea mi se pare cea mai bună soluție.

Mă întreb de ce se întâmplă asta cu vârtejul? Am fost învățat să-i fac o treabă și apoi să învârt lucrul în jos & # 33

Dacă folosesc tuburi simple de 0,5 sau 0,2 ml, pot roti tuburile și apoi învârti conținutul. Dar acum majoritatea oamenilor folosesc benzi sau plăci, vortexarea nu este atât de ușoară mai ales dacă nu aveți o centrifugă specială pentru a roti după vortex.

Îmi arunc fâșiile în centrifuga eppendorf super-cool, care se poate numi centrifugă cu plăci

Am fost învățat să arunc cu degetele și să colectez lichidul de la baza tuburilor.

Instrucțiunile despre amestecurile SYBR qPCR verzi spun adesea că nu ar trebui să fie vortexate.

Dacă nu aveți o centrifugă plăcută, alternativa ieftină este fie o cutie de 96 ART goală, fie o placă de microtitrare cu godeuri în V atașată pentru a spune bucăți de șnur lung de 2 ft la fiecare colț. Puneți tuburile de benzi în puțuri ferm, găsiți o parte neocupată a laboratorului și rotiți placa rotundă de corzi. Este nevoie de puțină practică și, ocazional, s-ar putea să vă pierdeți tuburile PCR, dar de obicei funcționează frumos, atâta timp cât nu există membri ai comitetului de siguranță în jur.

Este, de asemenea, cea mai distractivă parte a PCR. Cât de trist sunt?

De obicei adaug ADN-ul în tub, apoi adaug amestecul master complet (inclusiv Taq) direct în ADN, acest lucru ar trebui să-l amestece suficient pentru toate reacțiile, deoarece este un volum mult mai mare decât ADN-ul. Apoi învârt tuburile în jos, doar pentru a mă asigura.

Pentru filare, am folosit o filată pentru salată, una dintre acele lucruri folosite pentru a scoate apă din salată după spălare, cu câteva cutii de 200 uL în ea pentru a ține tuburile / benzile. Părea să funcționeze destul de bine.

De obicei, adaug ADN în tub, apoi adaug amestec complet complet (inclusiv Taq) direct în ADN, acest lucru ar trebui să-l amestece suficient pentru toate reacțiile, deoarece este un volum mult mai mare decât ADN-ul. Apoi învârt tuburile în jos, doar pentru a mă asigura.

Pentru filare, am folosit o filată pentru salată, una dintre acele lucruri folosite pentru a scoate apă din salată după spălare, cu câteva cutii de 200 uL în ea pentru a ține tuburile / benzile. Părea să funcționeze destul de bine.

Ceea ce fac este să pregătesc un mastermix cu totul, cu excepția ADN-ului. Îl arunc energic, îl învârt și îl adaug la fundul tuturor tuburilor. Apoi păstrez reactivii PCR și scot probele (cred că cea mai mare parte a contaminării nu provine din ampliconii supuși care plutesc în aer, ci din manipularea defectuoasă a probelor). Dacă ar trebui să adaug ulei mineral, o fac în acel moment. Apoi adaug probele în partea interioară a capacului fiecărui tub, închizându-l în acel moment. În cele din urmă, învârt tuburile pentru a aduce probele în jos și pun tubul pe termociclatorul fierbinte. Acest lucru îmi permite să verific dacă nu am probleme cu pipetarea eșantioanelor și funcționează, de asemenea, ca un PCR ieftin "pornit" și "pornind" ieftin prin sechestrarea probei din grunduri până când totul este la temperatura de topire. Pentru mine funcționează.
Noroc & # 33

Nu amestec amestecul meu pentru că ajung cu bule - cu siguranță într-un tub PCR nu este nevoie să amestec, deoarece volumul este atât de mic.

În general, nu amestec soluția mea finală de PCR.
Am amestecat șablonul cu un volum mic de apă (

2ul) într-un tub de reacție. Votez maestrul amestec viguros înainte de a adăuga taq. după adăugarea taq, votez puțin (juz un pic). apoi am pus mixul master în șablon.
Nu mai votez sau nu mă mai învârt, deoarece cred că 94C este suficient de fierbinte pentru a le amesteca și amprul este suficient de fierbinte pentru a spăla orice pe perete?


Priveste filmarea: CURS 2 Mixul de marketing Strategia de pret si de distributie (Ianuarie 2022).