Informație

Procesul inhibitor al proteinelor


De obicei găsesc substanțe care activează proteinele, cum ar fi ApoA-I, dar nu găsesc substanțe care să o inhibe.

Așadar, într-un design experimental, aș putea considera că absența unui medicament care acționează direct asupra creșterii unei proteine ​​ar putea fi considerată un proces inhibitor?


Nu, absența unei substanțe stimulatoare nu este adecvată pentru a fi considerată inhibiție.

Pentru a vedea de ce, luați în considerare o situație în care există două astfel de substanțe, substanța A și substanța B, care pot stimula amândouă proteina P (există multe astfel de relații). Dacă adăugați doar substanța B, atunci proteina P va fi stimulată. Deoarece P este stimulat în acest caz, nu ar fi deci rezonabil să se descrie proteina inhibată de lipsa substanței A.


Elucidarea bazei moleculare pentru reglarea neurotransmisiei inhibitoare de către Artemisinine

Medicamentul antimalaric de primă linie artemisinin și derivații săi au fost, de asemenea, implicați în modularea mai multor căi celulare de mamifere, inclusiv identificarea recentă a receptorului de tip A al acidului γ-aminobutiric (GABA)AR) semnalizare în pancreas. Cu toate acestea, mecanismul lor molecular de acțiune rămâne evaziv. Aici, prezentăm structurile cristaline ale gefirinei, organizatorul central la postsinapsele inhibitorii, în complex cu arteunat și artemeter la rezoluție 1,5-Å. Aceste artemisinine vizează epitopul de gefirină care leagă receptorul neurotransmițătorului inhibitor universal, inhibând astfel interacțiunile critice dintre receptorii gefirinei și glicinei (GlyRs), precum și GABAARs. Înregistrările electrofiziologice relevă o inhibare semnificativă a neurotransmisiei mediată de gefirină de către artemisinine. Mai mult, analizele grupate în neuronii primari demonstrează o inhibare rapidă și o reglare dependentă de timp a gefirinei și GABAAParametrii cluster R. Datele noastre nu oferă doar un model cuprinzător pentru modularea neurotransmisiei inhibitoare mediată de artemisinină, ci și stabilesc artemisininele ca potențiali compuși de plumb care să interfereze farmacologic cu acest proces.

Cuvinte cheie: Receptorii GABA (A) antimalarici medicamente artemisinine receptorii gefirină glicină postsinapse inhibitorii proteine ​​de lumină lunară tulburări neurodezvoltare proteine ​​schele transmisie sinaptică.


6 Antibiotice utilizate în inhibitorii sintezei proteinelor

Următoarele puncte evidențiază cele șase antibiotice utilizate în inhibitorii sintezei proteinelor. Antibioticele sunt: 1. Cloramfenicol 2. Puromicina 3. Streptomicină 4. Actinomicina 5. Tetracicline și 6. Cicloheximidă.

Antibioticul # 1. Cloramfenicol (cloromicetină):

Inhibă sinteza proteinelor prin interferența cu transferul aminoacizilor de către s-ARN la ribozomi (numai 70 S).

Antibiotic # 2. Puromicină:

Acest antibiotic inhibă sinteza proteinelor în mod specific și reversibil. Previne alungirea lanțului polipeptidic deoarece are o grupare amino liberă care formează o legătură peptidică cu gruparea carboxilică terminală a lanțului polipeptidic în creștere.

Antibiotic # 3. Streptomicină:

Acest antibiotic nu inhibă sinteza proteinelor în sine (ca atare), dar pare să modifice ribozomii astfel încât mecanismul de traducere să fie perturbat, producând pro & shytein inactiv. Acest antibiotic a fost descoperit de S.A.Waksman, laureat al premiului Nobel din 1952 în categoria Fiziologie sau Medicină.

Antibiotic # 4. Actinomicină:

Acest antibiotic inhibă sinteza proteinelor prin inhibarea sintezei direcționate de ADN a m-ARN, adică inhibarea are loc la nivel de transcripție.

Antibiotic # 5. Tetracicline:

Acestea inhibă sinteza proteinelor în bacterii prin blocarea sitului & # 8216A & # 8217 de pe ribozom, astfel încât legarea amino-acil-ARNt este inhibată.

Antibiotic # 6. Cicloheximidă:

Inhibă sinteza proteinelor prin blocarea peptidil transferazei ribozomilor eucariote (numai 80 S). Pe lângă acestea, unele toxine precum toxina difterică și ricina sunt inhibitori puternici ai sintezei proteinelor. Toxina difterică inactivează factorul de alungire eucariotă eEF2 în timp ce ricina (din bobul de ricin) inactivează subunitatea 60 S a ribozomilor eucariote.

(Venkatraman, Ramakrishnan, Thomas A. Steitz și Ada E Yonath au împărtășit împreună Premiul Nobel din 2009 în chimie pentru activitatea lor de pionierat și de colaborare privind structura și funcția ribozomilor, care sunt cruciale pentru viață și sunt, de asemenea, o țintă majoră pentru noile antibiotice.

Prin utilizarea cristalografiei cu raze X, acești oameni de știință au cartografiat poziția fiecăruia dintre sutele de mii de atomi care alcătuiesc ribozomul și au generat modele tridimensionale care arată modul în care diferite antibiotice se leagă de ribozomi. Munca lor va ajuta enorm să producă antibiotice care nu sunt rezistente la bacterii, deoarece a devenit rezistentă la multe dintre medicamentele de pe piață.)


Localizare și funcție

BIRP implicate în inhibarea morții celulare: IAP

Localizarea țesutului și subcelulară a IAP-urilor de mamifere variază (vezi Tabelul 1) și poate fi importantă în determinarea contribuției relative a diferitelor IAP-uri la reglarea morții celulare în diferite tipuri de celule și ca răspuns la diferiți stimuli apoptotici.

XIAP pare a fi exprimat pe scară largă [5,6]. Are o localizare citoplasmatică și s-a raportat că inhibă moartea celulară ca răspuns la o varietate de stimuli apoptotici, inclusiv iradiere ultravioletă, factor de necroză tumorală (TNF), ligand Fas și o serie de medicamente toxice (revizuite de LaCasse și colab. [43]). XIAP interacționează foarte eficient și inhibă caspazele active 3, 7 și 9 [44,45,46]. De asemenea, a fost raportată interacțiunea XIAP prin intermediul domeniului RING-finger cu receptorii de tip I ai proteinei morfogenetice osoase (BMP), ceea ce ar permite, probabil, unor XIAP să se localizeze la membrana plasmatică [47]. A fost propus un rol pentru XIAP în reglarea căii de semnalizare a receptorilor BMP prin conectarea receptorului la molecula de semnalizare în aval TAB1.

Proteinele cIAP-1 și cIAP-2 au fost identificate inițial într-un complex cu receptorul TNF 2, o asociere indirectă rezultată din interacțiunea directă cu factorii asociați receptorului TNF (TRAF) 1 și 2 care implică domeniile BIR și TRAF ale proteinelor respective [3]. Expresia cIAP-1 și cIAP-2 este crescută după activarea factorului de transcripție NF-κB de către receptorul TNF, iar aceste IAP pot avea un rol în protejarea celulelor de apoptoza indusă de TNF prin reducerea cantității de activare a caspazei 8 [ 48]. Exact modul în care fac acest lucru nu este clar, deoarece caspaza 8 nu poate fi direct inhibată de cIAP-1 sau -2 sau de orice alte IAP cunoscute [49]. Poate că acționează prin inhibarea caspazelor din aval, cum ar fi caspaza 3, prevenind bucla de feedback implicată în activarea ulterioară a caspazei din amonte 8. Proteinele cIAP-1 și cIAP-2 s-au dovedit direct a inhiba activitatea caspazelor 3 și 7 [49 ]. Deși cIAP-1 și cIAP-2 pot fi găsite în complexul TNF-R și se presupune că sunt localizate parțial la membrana celulară, nu este clar ce proporție din cIAP-1 sau cIAP-2 celulară totală reprezintă acest lucru și când este transfectat în celule, tranzitoriu, cIAP-1 are o localizare perinucleară [50].

IAP ML-IAP de mamifere descris recent este detectabil în țesutul embrionar, în țesuturile adulte selectate și în mai multe linii celulare canceroase, în special în liniile celulare de melanom (vezi Tabelul 1) [14,15,16]. Un studiu a raportat exprimarea predominant în nucleu, dar și în structurile filamentoase din citoplasmă, în timp ce numai expresia citoplasmatică a fost raportată într-un alt studiu. Deși ML-IAP are un singur domeniu BIR, se raportează că interacționează și inhibă atât caspaza inițiator 9, cât și caspazele efectoare 3 și 7, inhibă moartea celulară indusă prin receptorii de moarte, prin supraexprimarea proteinelor căii celule-moarte FADD, Bax , RIP, RIP3 și DR3 sau ca răspuns la diferite medicamente toxice.

Primul NAIP gena a fost identificată ca o genă candidată defectă în atrofia musculară a coloanei vertebrale [5,20]. Acum este clar că ștergerea unei gene vecine care codifică neuronul motor de supraviețuire a proteinelor (SMN) este cauza bolii [51], dar este posibil ca pierderea NAIP funcțional să contribuie la severitatea bolii. Se raportează că NAIP inhibă moartea celulară ca răspuns la sevrajul seric, menadionă și TNF, dar din cauza NAIP ADNc utilizat în aceste experimente nu corespunde cu niciunul dintre NAIP gene și pot reprezenta secvențe derivate dintr-un număr de diferite NAIP genele, activitățile exacte ale proteinelor NAIP sunt neclare.

Cele mai puternice dovezi pentru reglarea morții celulare de dezvoltare de către IAPs provin din studii efectuate în Drosophila, unde pierderea DIAP1 are ca rezultat moartea extinsă a celulelor embrionare timpurii și o creștere corespunzătoare a activității caspazei [52]. Este încă necesar un studiu echivalent la mamifere pentru a stabili rolul acestor proteine ​​în moartea celulelor de dezvoltare ale mamiferelor (vezi secțiunea Frontiere). Un model de expresie perinuclear punctat a fost descris pentru DIAP2 atunci când este supraexprimat în celulele insectelor [53].

BIRP implicate în reglarea diviziunii celulare

Deși inițial descrisă ca o proteină care ar putea inhiba moartea celulară [21], Survivin funcționează în primul rând în reglarea diviziunii celulare, rol conservat în drojdie și C. elegans BIRP-uri, ale căror domenii BIR seamănă foarte mult cu cele ale lui Survivin [23,24,54,55,56,57,58,59]. Survivina se exprimă numai în timpul mitozei (vezi Tabelul 1). Localizarea subcelulară a arătat că Survivin este o proteină pasager cromozomială: adică este inițial asociată cu centromeri, dar la tranziția metafază-anafază părăsește centromerii și rămâne în zona mediană a fusului [56,57,58,60]. Poate fi găsit în mijlocul corpului la telofază, după care este omniprezent și degradat. În concordanță cu localizarea sa subcelulară, eliminarea Survivinei prin recombinare omologă are ca rezultat embrioni de șoarece care nu pot supraviețui după ziua 5 din cauza eșecului citokinezei [56].

The C. elegans proteinele BIR-1 și BIR-2 sunt, de asemenea, implicate în reglarea citokinezei [23,57]. BIR-1, la fel ca Survivin, este exprimat numai în timpul diviziunii celulare și este o proteină pasager cromozomială. Fenotipul embrionilor cu deficit de BIR-1 este identic cu cel al embrionilor deficienți pentru kinaza AOR-2 asemănătoare Aurorei, iar BIR-1 este necesar pentru localizarea AIR-2. Ca Survivin și C. elegans BIRP-urile, proteinele de drojdie ScBIR1P și Spbir1P au un rol în reglarea diviziunii celulare [24] și, deoarece drojdiile nu au caspaze, poate fi exclus un rol în reglarea morții celulare.

Mamiferul Bruce / Apollon are un model punctat de expresie celulară și se colocalizează cu proteina marker Golgi TGN38. De asemenea, a fost detectată expresia în dendrite și axoni ai neuronilor primari [22]. În timp ce Bruce are un domeniu BIR la capătul său amino, acesta are, de asemenea, activitate de conjugare a ubiquitinei ca rezultat al unui domeniu enzimatic de conjugare a ubiquitinei (UBC) la capătul carboxil al proteinei. Domeniul BIR al lui Bruce este cel mai similar cu domeniile BIR ale Survivinului și ale altor BIRP care sunt implicate în reglarea diviziunii celulare, deși funcția lui Bruce este necunoscută.

Mecanismul de inhibare a caspazei

Caspazele sunt produse ca zimogeni inactivi care sunt prelucrați într-o formă activă în urma stimulilor de moarte celulară. Se consideră că caspaza activă este un complex heterotetrameric generat din doi monomeri zimogeni. Căile de moarte celulară implică activarea secvențială a caspazelor inițiator și efector (a se vedea Figura 2). Activarea caspazelor inițiatorului, cum ar fi caspazele 9 și 8, este facilitată de proteinele adaptoare, cum ar fi Apaf-1 sau FADD, iar atunci când sunt activate, caspazele 8 și 9 pot procesa și activa caspazele efectoare din aval, cum ar fi caspazele 3 și 7. IAP-urile pot inhiba unele active caspase, în timp ce proteina de mamifer DIABLO antagonizează funcția IAP [61,62,63] (vezi figurile 2,3).

Rolul IAP-urilor în reglarea morții celulare. Apoptoza indusă de ligandul TNF sau Fas prin intermediul receptorilor de moarte (DR) implică recrutarea mediată de proteinele adaptorului și activarea caspazelor inițiatorului, cum ar fi caspaza 8 (C8), și activarea ulterioară a caspazelor din aval, cum ar fi caspaza 3 (C3) și 7 (nereprezentat). În moartea celulară indusă prin căi de stres, cum ar fi iradierea sau medicamentele, citocromul c (Cyt c) și DIABLO sunt eliberate din mitocondrii. Citocromul c se leagă de capătul carboxil al proteinei adaptoare Apaf-1, permițându-i să se desfășoare, să interacționeze cu caspaza inactivă 9 (Pro-C9) și să promoveze oligomerizarea și autoprocesarea acestuia pentru a da caspaza activă activă C9 9, apoi poate activa caspazele din aval. Membrii pro-supraviețuire ai familiei Bcl-2 inhibă moartea celulară prin căi de stres și pot preveni eliberarea citocromului c și DIABLO din mitocondrii. Caspazele din aval scindează substraturile celulare (cum ar fi poli (ADP-riboză) polimeraza (PARP) și inhibitorul DNazei activate prin caspază (ICAD)), rezultând multe modificări morfologice și culminând cu moartea celulară. IAP previn moartea celulelor prin interacțiunea cu și inhibarea caspazelor active, în timp ce antagonistul IAP DIABLO poate preveni aceste interacțiuni.

Mecanismul de inhibare a caspazei de către IAP și prevenirea acestuia de către antagonistul IAP DIABLO / Smac. (A) Terminul amino al subunității p10 a caspazei 9, dezvăluit în urma procesării automate, interacționează strâns într-o canelură a domeniului BIR3 al XIAP. (b) Regiunea linker în amonte de domeniul BIR2 al XIAP interacționează strâns cu situl catalitic al caspazei 3 (iar caspaza 7 C indică reziduul catalitic de cisteină), rezultând o inhibare eficientă a caspazei. A fost propusă o interacțiune mai puțin semnificativă a capătului amino al subunității mici a caspazei 3 într-o canelură a domeniului BIR2. (c) Terminul amino al DIABLO (roșu) este similar cu cel al caspazei 9 și concurează exact pentru același site de interacțiune din domeniul BIR3. (d) Se crede că o canelură similară din domeniul BIR2 al XIAP mediază interacțiunea cu DIABLO și oferă un mecanism pentru DIABLO de a elimina caspaza 3 din XIAP.

Domeniul BIR3 al XIAP interacționează cu și inhibă caspaza 9 procesată activă [46,63,64]. Terminația amino a DIABLO și cea a subunității p10 a caspazei active 9 - care este dezvăluită numai după autoprocesare - sunt similare și concurează exact pentru același sit într-o canelură a domeniului BIR3 al XIAP [64,65,66,67, 68,69] (Figura 3). Interacțiunile DIABLO și caspase 9 cu XIAP sunt astfel reciproc excluzive. Termenii amino ai Drosophila proteinele Grim, Reaper și Hid sunt similare cu capătul amino al DIABLO din primii patru aminoacizi, iar această regiune este responsabilă de interacțiunea cu IAP [67,68,69].

Punctul principal de contact dintre caspazele 3 și 7 și XIAP implică regiunea linker imediat în amonte de domeniul BIR2 al XIAP [31,32,33,70] (Figura 3). Linkerul formează un contact direct cu situl catalitic al caspazelor, blocând astfel activitatea acestora. A fost propusă o interacțiune suplimentară a capătului amino terminal al fragmentului p10 procesat al caspazei 3 în șanțul domeniului BIR2 [33] și, deși este dispensabilă pentru interacțiunea caspază și inhibarea de către XIAP, antagonistul IAP DIABLO / Smac este considerat a concura pentru același șanț, presupunând că scoateți caspaza 3 și o scoateți din IAP.

DIABLO este o proteină dimerică cu două terminații amino care pot interacționa cu domeniile BIR [65]. Deși DIABLO este capabil să interacționeze cu domeniile BIR2 și BIR3 individuale, deși cu o afinitate mai mare pentru BIR3, tipul de interacțiune favorizat cu XIAP de lungime completă nu este cunoscut. De exemplu, este posibil ca un dimer DIABLO să interacționeze simultan prin intermediul celor două terminații amino ale sale cu ambele domenii BIR2 și BIR3 pe o singură moleculă XIAP sau că cele două terminații amino interacționează cu domeniile BIR pe molecule XIAP diferite cu trei domenii diferite BIR posibile combinații (două domenii BIR2, un domeniu BIR2 plus BIR3 sau două domenii BIR3). Stabilirea acestei structuri poate fi dificilă, având în vedere că generația de XIAP cu lungime completă bine pliată a evitat cristalografii până acum.


5. Extensii viitoare: Redefinirea transcrierii, procesele de traducere și reprezentarea complexă ierarhică

Problema diagramei de proces curente este că procesele de transcriere și traducere nu sunt bine definite. În timp ce diagrama este definită ca diagramă de tranziție a stării, procesele de transcriere și traducere folosesc săgețile ca activare transcripțională și activare translațională care nu este în concordanță cu altă parte a diagramei. În versiunea viitoare a CellDesigner (așteptată în versiunea 2.5), notația diagramei de proces este extinsă și redefinită pentru a spori capacitatea de reprezentare pentru procesele de transcriere și traducere.

5.1 Procese de transcriere și traducere

Pentru o descriere simplă a transcripției, genele sunt reprezentate ca niște cutii dreptunghiulare simple, iar factorii de transcripție și alți factori de reglementare se leagă de casetă. O săgeată întreruptă care reprezintă procesul de transcriere este utilizată pentru a indica că ARN este transcris din secvență și ARN tradus în proteină (Fig. 9). Procesele de transcriere și traducere sunt reprezentate cu săgeți speciale care ar trebui să reprezinte procese complexe din spatele ei.


Fig. 9. Un exemplu simplu al unui proces de transcriere condus CREB faceți clic pentru o imagine mai mare
& gt & gt Verificați abrevierile

Fig.10 reprezintă mai multe detalii ale acestui proces. & # 12288 Deoarece o diagramă de tranziție de stare transcrierea va fi descrisă ca tranziție a nucleotidelor în ARN, iar traducerea va fi tranziția aminoacidului în proteină. Fig.10 reprezintă în mod explicit aceste procese. Cu toate acestea, în multe cazuri, astfel de procese nu trebuie să fie reprezentate în mod explicit, astfel încât vom defini simboluri dedicate pentru simplificarea activității utilizatorului și a rsquo-urilor, așa cum se vede în Fig. 2.5 eliberare.


Fig. 10. Procesul de transcripție condus de CREB cu mașini de transcriere reprezentate clic pentru o imagine mai mare
& gt & gt Verificați abrevierile

5. 2 Reprezentări ale structurii promotorilor

O nouă extensie permite utilizatorului să definească structura regiunii promotorului, exonului și histonelor. Regiunile promotorului specific, exonul și histona sunt reprezentate în partea superioară a cutiei (Fig. 11). Când sunt definite astfel de informații de structură, liniile pentru ambele părți și partea inferioară a casetei fie nu sunt afișate, fie estompate pentru a evidenția structurile reprezentate pe linia superioară.


Fig.11. Notă nouă pentru transcriere și traducere

Fig. 12 (a) indică un set de simboluri noi pentru transcriere, iar Fig. 12 (b) arată cum poate fi folosit.


Fig. 12 (a). Simboluri legate de transcriere și traducere


Fig.12 (b). Un exemplu de utilizare a simbolurilor legate de transcriere

Utilizând notația detaliată pentru regiunea promotorului, se poate descrie tranziția detaliată a stării pentru transcriere. Fig. 13 prezintă un exemplu de tranziție de stare a legăturilor factorilor de transcripție și a unui proces de transcripție.


Fig. 13. Un proces de transcriere în diagrama procesului

5.3 ARN

ARN-ul este reprezentat într-o cutie înclinată. Când structura exonului este reprezentată, exonii sunt reprezentați pe linia superioară (Fig. 14).


Fig. 14. Reprezentarea structurii exonului de clic ARN pentru o imagine mai mare

Splicarea alternativă poate fi reprezentată ca tranziția ARN-ului de la starea inițială la ARN multiplu cu diferite modele de splicing (Fig. 15).


Fig.15. Exemplu alternativ de îmbinare

5.4 Reprezentarea complexului ierarhic

Notarea actuală descrie complexul ca simplă asociere a mai multor simboluri proteice. Cu toate acestea, acest lucru nu este convenabil atunci când complexul în sine are un nume distinct. De exemplu, NF- & kappaB este un heterodimer de p65 și p50. Notarea curentă poate reprezenta NF- și kappaB doar ca o proteină elementară sau ca un complex de p65 și p50 fără a se numi atunci ca NF- și kappaB. Compromisul practic constă în denumirea fiecărei subunități ca NF- și kappaB (p65) și NF- și kappaB (p50), dar departe de a fi satisfăcătoare. Mulți receptori sunt complexi de subunități, fiecare având propriul său nume, astfel încât această denumire complexă este o problemă majoră, este o descriere adecvată și convenabilă. Pentru a rezolva această problemă, va fi introdusă reprezentarea ierarhică complexă care permite utilizatorilor să numească atât subunități, cât și complexe. Fig. 16 prezintă exemple de descriere atât de complexă.


Fig. 16. Exemple de descriere complexă ierarhică
& gt & gt Verificați abrevierile


Dosare suplimentare

Degradarea proteinelor prin PROTAC-uri pe bază de inhibitori covalenți

G. Xue, J. Chen, L. Liu, D. Zhou, Y. Zuo, T. Fu și Z. Pan, Chem. Comun., 2020, 56, 1521 DOI: 10.1039 / C9CC08238G

Pentru a solicita permisiunea de a reproduce materiale din acest articol, accesați pagina de solicitare a Centrului de autorizare a drepturilor de autor.

Daca esti un autor care contribuie la o publicație RSC, nu trebuie să solicitați permisiunea cu condiția să se acorde o confirmare corectă.

Daca esti autorul acestui articol, nu trebuie să solicitați permisiunea de a reproduce figuri și diagrame cu condiția să se acorde o confirmare corectă. Dacă doriți să reproduceți întregul articol într-o publicație terță parte (cu excepția tezei / disertației pentru care nu este necesară permisiunea), accesați pagina de solicitare a Centrului de autorizare a drepturilor de autor.


Abordările de biologie chimică conduc la descoperirea unei noi enzime de reglare a lipidării proteinelor

Un membru nou descoperit al familiei de proteine ​​acil proteo tioesterază (APT) a proteinelor S-acilare & quoteraser & quot duce la elucidarea unui rol pentru lipidarea proteinelor în reglarea redox mitocondrială.

Acțiune

Copiați linkul

Lipidarea dinamică a proteinelor prin modificarea reziduurilor de cisteină cu tioesterii acizilor grași oferă un mecanism de reglare a proprietăților la nivelul proteomei, cum ar fi hidrofobitatea și interacțiunile cu membrana. Analog cu semnalizarea fosforilării pe bază de kinază și fosfatază, proteina „S-acilare” (denumită și „S-palmitoilare”, din moment ce palmitatul este cea mai abundentă modificare post-translațională a lipidelor (PTM) utilizată în această cale) este modulată prin dedicat " enzime de scriere "(acil transferază) și" radieră "(deacilază). Deși mii de proteine ​​umane pot fi modificate prin S-acilare PTM, există doar 6 „radiere” adnotate pentru această marcă, numite tioesteraze acil-proteice (APT). O întrebare cheie pe care laboratorul meu a încercat să o investigheze în ultimii ani este modul în care este reglementat acest PTM, ipoteza fiind că reglarea spațială și temporală sunt aspecte critice ale acestei căi de semnalizare.

Pentru a studia reglarea APT în celulele vii, grupul meu a dezvoltat o suită de instrumente chimice, inclusiv sonde de pornire pentru APT (https://www.nature.com/articles/nchembio.2262 și https: //pubs.acs .org / doi / abs / 10.1021 / acs.biochem.7b00835) și sondele APT ratiometrice (https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2017/sc/c7sc02805a). Am devenit fascinați de lipidarea mitocondrială, deoarece multe proteine ​​mitocondriale pot fi modificate prin PTM-uri pe bază de S-acilare, așa cum s-a descoperit printr-o serie de metode proteomice imparțiale. Acest lucru ne-a fost interesant, totuși, deoarece niciunul dintre APT-urile cunoscute nu a fost adnotat ca funcțional în mitocondrii. Prin urmare, am pus întrebarea simplă: există o reglare mediată de enzime a acilării proteinelor în mitocondrii și, dacă da, cine sunt actorii acestui proces de reglementare?

Pentru a începe să răspundem la această întrebare, am sintetizat o sondă APT orientată spre mitocondrie, care ne-a permis să testăm experimental dacă există enzime active în acel compartiment. Într-adevăr, folosind această sondă, am descoperit că există APT în mitocondrii și, spre surprinderea noastră, am descoperit că APT1, membrul fondator al acestei clase de proteine ​​reglatoare, este parțial localizat în mitocondrii (https://www.nature.com/ articole / s41467-017-02655-1). APT1 a fost adnotat ca o proteină citosolică cu peste 20 de ani în urmă, astfel încât abordarea noastră de biologie chimică pentru atribuirea funcțiilor celulare a oferit noi perspective critice despre rolul potențial al APT în semnalizarea mitocondrială. Un pas următor critic, cu toate acestea, a fost adnotarea unui rol funcțional pentru APT în mitocondrii.

Ipoteza noastră a fost simplă: am folosi un inhibitor APT pan-activ și am căuta efecte celulare conectate la funcția mitocondrială, ceea ce ne-ar conduce la funcții și ținte ale APT1, deoarece acesta a fost singurul APT mitocondrial cunoscut. După cum se dovedește, această ipoteză a fost complet greșită, dar ne-a condus pe o cale interesantă (și incredibil de provocatoare). Am descoperit mai întâi că regularea redox a mitocondriilor a fost perturbată de inhibitorii APT și am validat-o ca fiind un efect derivat mitocondrial prin dezvoltarea, validarea și utilizarea unui nou inhibitor APT orientat către mitocondrie. În acel moment, am crezut că rămânem doar cu faptul că APT1 este responsabil pentru fenotip, moment în care vom încerca să afirmăm că acesta a fost un efect mitocondrial mediate de APT1. Cu toate acestea, APT1 nu a fost ținta, deoarece orice perturbare a acestei enzime nu a arătat niciun efect în testele noastre.

Prin urmare, am știut că există o enzimă nouă, necunoscută, pe care trebuie să o descoperim. Având în vedere complexitatea crescândă a proiectului, am făcut ca membrii echipei să adopte abordări diferite pentru a identifica noua noastră enzimă. Un grup a efectuat screening-ul cu enzime supra-exprimate și sondele noastre de activitate pentru a identifica proteine ​​noi cu activitate APT. Un al doilea grup a realizat profilarea proteinelor pe bază de activitate (ABPP) pentru a identifica țintele noului nostru inhibitor. Spre bucuria noastră, ambele abordări converg către aceeași țintă: ABHD10. Această enzimă nu avea o funcție endogenă cunoscută, dar era într-adevăr enzima pe care o căutam, întrucât recapitulează fenotipul antioxidant mitocondrial observat mai devreme. Printr-o serie de studii biochimice și celulare, am descoperit că ABHD10 este într-adevăr un APT și chiar am rezolvat o structură cristalină de înaltă rezoluție a proteinei, dezvăluind potențiale moduri de reglare. În cele din urmă, am adnotat PRDX5 ca prima țintă a ABHD10 și am elaborat un mecanism prin care ABHD10 controlează capacitatea antioxidantă a PRDX5 prin modificarea directă a sitului activ.

Colectiv, acest proiect m-a învățat câteva lucruri. În primul rând, putem adăuga o altă enzimă, ABHD10, la lista APT-urilor, aducând numărul de APT mitocondriale la două. În al doilea rând, am descoperit un nou mod de reglare redox prin lipidare, la care cu siguranță nu mă așteptam. În al treilea rând, această lucrare arată că abordările biologice chimice, care implică dezvoltarea sondelor simple și a inhibitorilor bruti, pot duce într-adevăr la descoperirea biologică. În cele din urmă, am învățat că adnotarea enzimei este foarte grea și valoarea muncii în echipă pentru a aborda acest tip de știință interdisciplinară. Acest proiect a necesitat finalizarea a trei investigatori principali (doi studenți absolvenți și un post-doctorat), precum și alți colaboratori din grupul meu și din alte grupuri. Dintr-o perspectivă managerială, știința bazată pe echipe nu este niciodată ușoară. Dar cred cu adevărat că acest proiect nu s-ar fi reunit dacă nu ar fi fost abordarea colaborativă pe care am adoptat-o.

Îi felicit cu adevărat pe Yang, Tian și Rahul pentru că au lucrat împreună pentru ca această lucrare să se întâmple. Saara-Anne, un doctorand / doctorand din grupul meu, a oferit asistență critică și ajutor cu experimente in vivo. Profesorul Masaki Fukata și echipa sa ne-au ajutat cu ecranul nostru, iar colegul meu profesorul Phoebe Rice ne-a ajutat cu structura (grupul meu nu a făcut niciodată nici o biologie structurală a proteinelor).


Abstract

Creșterea colesterolului lipoproteic cu densitate ridicată (HDL-C) este o strategie promițătoare în lupta de prevenire a bolilor cardiovasculare, iar inhibitori ai proteinelor de transfer al colesteril esterului (CETP) au fost dezvoltați pentru a realiza acest lucru. Primele rezultate sunt încurajatoare și, de fapt, la iepuri, inhibarea CETP reduce ateroscleroza. Deoarece datele umane privind reducerea sarcinii ateromului necesită mai mult timp, mecanismele biochimice care stau la baza ateroprotecției putative a inhibitorilor CETP sunt disecate în prezent și au apărut mai multe căi. În primul rând, inhibarea CETP crește HDL-C și reduce nivelurile de colesterol lipoproteic cu densitate scăzută (LDL-C) în concordanță cu activitatea de transfer lipidic CETP și rolul său în transportul invers al colesterolului (RCT). Acest lucru coincide cu creșteri benefice presupuse atât în ​​dimensiunea HDL, cât și în cea a LDL. Cu toate acestea, multe aspecte referitoare la impactul inhibării CETP asupra căii RCT rămân evazive, în special dacă este influențat primul pas referitor la efluentul de colesterol din țesuturile periferice în HDL. Mai mult, relevanța receptorului scavenger BI și, în consecință, rolul central al HDL în ECA umană este încă neclară. În al doilea rând, inhibiția CETP s-a arătat recent că crește enzimele antioxidante asociate cu HDL, la rândul său asociată cu scăderea oxidării LDL. Ateroprotecția la om este anticipată în prezent pe baza îmbunătățirii acestor parametri biochimici cunoscuți că influențează ateroscleroza, dar confirmarea finală cu privire la impactul inhibării CETP asupra rezultatului cardiovascular va trebui să provină din studiile care evaluează punctele finale clinice.

Mecanismul care stă la baza efectului ateroprotector presupus al inhibării CETP indică nu numai spre efecte benefice prin creșterea nivelului HDL-C. În plus, LDL-C și LDL dens mic pot scădea, în concordanță cu rolul CETP în transportul invers al colesterolului. Mai mult, inhibarea CETP poate îmbunătăți potențialul antioxidant al HDL.

Inhibarea proteinei de transfer a colesteril esterului (CETP) este promițătoare ca o abordare nouă pentru prevenirea bolilor coronariene (CAD) datorită efectului său profund asupra nivelului de colesterol lipoproteic cu densitate ridicată (HDL-C). Scopul acestei revizuiri este de a discuta impactul inhibării CETP dincolo de acest efect primar.

Funcția fiziologică a CETP în circulație, adică transferul de lipide neutre (esteri colesterilici [CE] și trigliceride [TG]) între lipoproteine ​​și cauzele și efectele variației naturale în activitatea CETP, a făcut obiectul multor recenzii privind inhibarea CETP și CETP. 1-6 Prin urmare, am ales să rezumăm înțelegerea actuală a remodelării lipoproteinelor de către CETP (Figura, 1 și 2). Important, în dislipidemiile caracterizate prin concentrații crescute de particule bogate în TG (în principal resturi de lipoproteine ​​cu densitate foarte mică [VLDL] și VLDL), transferul CE de la HDL se deplasează de la LDL spre VLDL, în special VLDL1 mare (Figura, 2). 7,8 Acest lucru este considerat a fi aterogen, deoarece VLDL-urile îmbogățite cu CE devin substraturi pentru lipaza hepatică (HL), rezultând generarea de LDL mici și dăunătoare. 9 Recent, creșterea activității CETP a fost într-adevăr asociată cu un risc crescut pentru CAD la subiecții cu TG crescute. 10 Luând acest lucru împreună, s-ar putea ipoteza că la indivizii hipertrigliceridemici, inhibarea CETP poate fi antiaterogenă prin reducerea formării LDL mici și dense.

Reprezentare schematică simplificată a efectelor inhibiției CETP asupra căii RCT și protecție împotriva inflamației și oxidării. Blițurile numerotate indică zonele de impact ale inhibiției CETP, care sunt detaliate în continuare în panourile respective. Blițurile cu săgeți în sus sau în jos indică reglarea ascendentă și respectiv reglarea descendentă. Săgețile negre indică transferul colesterolului liber (FC), CE sau săgețile deschise TG indică conversia particulelor lipoproteice. 1, RCT. ABCA1 transportă FC și PL peste membrana celulară la apoA-I sărac în lipide. LCAT esterifies FC into CEs, which are internalized into the core of maturing HDL. CETP transfers CEs from HDL to apoB lipoproteins ((V)LDL) in exchange for TG. CETP inhibition results in accumulation of CE-rich HDL and decreases LDL-CE. Normally, CE-rich LDL is taken up by the liver via the LDL receptor, and TG in TG-rich HDL is hydrolyzed by HL, resulting in regeneration of lipid poor apoA-I. 2, Under hypertriglyceridemic conditions, CETP preferentially transfers CE from HDL to TG-rich particles (TRL). This results in CE-rich VLDLs, which are a substrate for HL resulting in the formation of small dense LDL (sdLDL 3,5 ). 3, Efflux of cholesterol from macrophages. ABCA1 shuttles FC and PL to lipid-poor apoA-I particles. 30 SR-BI (or human homologue CLA-1) 50,51 can transfer FC to various-sized HDL particles 34 ABCG1 and ABCG4 may specifically transfer cholesterol to larger HDL particles (HDL2). 35 CETP inhibition increases the HDL2 fraction and may also increase lipid-poor apoA-I. 42 The total impact of CETP inhibition on cholesterol efflux is unclear. 4, Uptake of HDL-CE and LDL by the liver. LDL is taken up by the liver by the LDL receptor (LDL-R). CETP inhibition decreases LDL-C, 11 but expression of the LDL-R may be upregulated by CETP inhibition. 74,75 Specific-uptake CE from HDL by the liver is accommodated by SR-BI in mice and perhaps by CLA-1 in humans. ApoE-containing HDL is increased after CETP inhibition. 25,78 This may be taken up by the liver by CLA-1, the LDL-R, or other receptors. 5, Antioxidative action of HDL. HDL protects LDL from oxidation into oxLDL. Several enzymes present on HDL have been shown to account for this such as apoA-I, PON1, PAF-AH, and LCAT. CETP inhibition increases these proteins, except for the latter. 102,103,106,107,110,111 ApoA-II, which is also increased by CETP inhibition, has been shown to displace PON1 from HDL. 117 The ultimate effect of CETP inhibition on oxidation of LDL is not known.

Recent data on CETP inhibition in rabbits and humans show that pharmacological inhibition of CETP has similar effects on the lipid profile as naturally occurring CETP deficiency. 11 Notably, next to the marked increases in HDL-C and HDL size, the CETP inhibitor torcetrapib induced a significant increase in LDL size, caused by both an increase in large LDL particles and a decrease in small LDL particles, suggesting a less atherogenic lipid profile. 12 Recently, similar effects were reported for JTT-705. 13 In this review, we focus on how changes in lipoprotein concentrations and lipoprotein neutral lipid content after CETP inhibition may influence cholesterol exchange processes between the periphery, the circulation, and the liver, thereby covering the reverse cholesterol transport (RCT) pathway. We furthermore discuss the effects of CETP inhibition on fecal sterol excretion. Finally, we briefly touch on the effects of CETP inhibition on the anti-inflammatory and antioxidative properties of HDL.

CETP Inhibition and RCT

RCT is generally invoked to provide the rationale for the antiatherogenic properties of HDL. It concerns the removal of excess cholesterol from peripheral tissues for elimination by the liver and secretion into bile (Figure). 14 Many of its players have been identified, and their particular functions are confirmed by in vitro and animal studies. 15 The Figure, 1, illustrates the most direct route for removal of cholesterol in humans the ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) shuttles cholesterol from peripheral cells to lipid-poor apolipoprotein A-I (apoA-I). Next, lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) esterifies free cholesterol, and the resulting CEs induce maturation of HDL particles. These HDLs can deliver cholesterol to the liver via the scavenger receptor BI (SR-BI) as shown in mice. 16 In humans and rabbits, the presence of CETP in the circulation creates a major diversion from this route. In exchange for TGs, CETP facilitates transfer of CE from HDL to apoB-containing particles, which can also be taken up via the LDL receptor. Ultimately, excess liver cholesterol can be excreted as neutral sterols and bile acids into bile for removal via the feces. Although this model is widely accepted, it is of note that there exists very little experimental evidence that HDL is indeed central to this dynamic process in humans. Nevertheless, RCT provides an excellent tool to discuss the effects of CETP inhibition on HDL metabolism, and we review the role of CETP in each step of this pathway.

Cholesterol Efflux From Peripheral Tissues to HDL

One of the atheroprotective properties of HDL is its ability to act as an acceptor of cholesterol from peripheral cells, or specifically macrophage foam cells in the arterial wall. This initial step in RCT depends mainly on the presence of cholesterol transporters in the cell membrane and the presence and avidity of extracellular acceptor particles, mostly thought to be HDL. 17 CETP has been suggested to affect this process by changing the cholesterol efflux capacity of donor cells and by modulating the uptake capacity as well as availability of initial acceptor particles (Figure, 3).

Cholesterol Donor Capacity of Cells

A role for CETP in the cellular cholesterol donor capacity was proposed after it was shown that CETP is expressed by monocyte-derived macrophages present in fatty streaks and atherosclerotic plaques of human origin. 18,19 Zhang et al also reported that blood-borne macrophages of a CETP-deficient subject were less efficient in cholesterol efflux compared with a control subject, and that COS-7 cells transiently overexpressing CETP showed an increased efflux capacity to medium, whereas influx capacity was unaltered. 19 In contrast to this potentially antiatherogenic role for CETP in macrophages, suppression of CETP synthesis in a liver cell line (HepG2) enhanced cholesterol efflux to HDL, whereas this was unaltered in an adipose tissue cell line (SW872). 20,21 Considering the crucial role of macrophage foam cells in atherogenesis, further research into the exact function of CETP produced by these cells is warranted.

Cholesterol Acceptor Capacity of HDL Particles

By changing the neutral lipid composition and size of HDL, CETP may affect the avidity of these particles for cholesterol. In CETP-deficient individuals 2,22,23 and after CETP inhibition, 12,24–27 average HDL size increases, and the cholesterol content of mainly large HDL 2 particles is increased. 12,28 Indeed, it was reported that plasma from homozygotes for CETP null defects had a reduced acceptor capacity for cholesterol from lipid-laden macrophages. 28,29 These investigators concluded that the large CE-rich HDL particles in CETP deficiency are defective as cholesterol acceptors. These effects can be understood today when considering that ABCA1 only mediates cholesterol and phospholipid (PL) efflux to lipid-free or lipid-poor apoA-I. 30,31 In CETP deficiency, apoA-I synthesis is furthermore unchanged, 32 and recycling of HDL is thought to be compromised. 33 Thus, acceptor capacity in the form of lipid-poor apoA-I may be attenuated. However, other molecules that transport lipids across the cell membrane of macrophages, such as SR-BI, ABCG1, and ABCG4, were recently shown to also stimulate cholesterol efflux, but instead to larger HDL particles (HDL2). 31,34–37 This suggests that these transporters may accommodate cellular cholesterol efflux to the larger HDL particles as observed in CETP deficiency and after CETP inhibition. Indeed, with the present knowledge of ABCA1 and SR-BI transporters, Miwa et al recently readdressed cholesterol efflux in CETP deficiency using both serum and HDL from 3 homozygotes and 3 heterozygotes for a CETP null mutation (the CETP Int14 mutation). 38 Their results suggest that the ABCA1 pathway functions normally and is preferred under reduced CETP activity as seen in heterozygotes, whereas the SR-BI pathway is activated in complete absence of CETP.

These data furthermore suggest that CE-rich HDL particles are still efficient cholesterol acceptors. In vitro studies on cholesterol efflux have shown that the most important property of acceptor particles is PL content. 39 Also in plasma of hypertriglyceridemic subjects, it was observed that HDL-PL and not low HDL-C levels determined efflux from Fu5AH cells. 40 In this respect, it is interesting that increases in total HDL-PL have been observed after CETP inhibition in both humans and rabbits, but how this relates to efflux acceptor capacity has not been addressed to date. 25,26,41,42

Availability of Cholesterol Acceptor Particles

It was postulated that the driving force of cellular cholesterol efflux is not the concentration of the initial acceptors (lipid-poor apoA-I or HDL) but the presence of secondary acceptors (LDL and VLDL) and proteins and enzymes, such as LCAT, CETP, and lipases (phospholipid transfer protein, HL, lipoprotein lipase), which redistribute cholesterol to secondary acceptors and recycle initial acceptors. 39 This suggests that CETP enhances cellular cholesterol efflux rates, but evidence that relates CETP activity to efflux rates is spurious. In one in vitro study, it was indeed demonstrated that cholesterol efflux from red blood cells was highly correlated with LCAT and CETP activities in postprandial plasma as well as the concentration of secondary acceptors, such as chylomicrons, VLDL, and LDL, but not with the initial acceptor HDL. 43 However, in other in vitro studies, no association between CETP activity in plasma and cholesterol efflux from Fu5AH cells was observed. 44,45 A cholesterol efflux–enhancing role for CETP was also observed in human CETP transgenic mice but not in rabbits. Serum of human transgenic (htg) apoA-I/CETP mice showed an increased relative efflux efficiency per HDL particle compared with htg apoA-I mice, as assayed by measuring efflux from both cholesterol-loaded Fu5AH cells and fibroblasts. 46,47 After CETP inhibition, HDL from JTT-705–treated rabbits was equally efficient in accepting cholesterol from acetylated LDL-loaded J774 macrophages compared with HDL from control rabbits. 41 This is most likely related to the observed increase in apoA-I synthesis in rabbits after CETP inhibition. 42 Interestingly, it has been shown that in patients with low HDL-C, torcetrapib decreased the fractional catabolic rate of apoA-I, whereas the synthetic rate was unaltered. 26 This illustrates that the extrapolation of data from animals to man, even if these animals possess endogenous CETP, is challenging.

Together, it is difficult to establish the role of CETP in the important initial step in the RCT pathway, which in vivo occurs within the confinement of the arterial wall. Here, we depend on artificial systems in which only 1 factor that contributes to cholesterol efflux can be assessed at once. For example, SR-BI–mediated efflux is usually addressed in the rat hepatoma cell line Fu5AH, whereas for ABCA1 expression, fibroblasts or cAMP-stimulated macrophages are generally used. 15 There is accumulating evidence that both cholesterol efflux pathways work complementarily, and respond diversely to, for example, the PL content of acceptor particles or metabolic changes. 36,48,49 Moreover, because the relative contributions of ABCA1, SR-BI (and human homologue CLA-1), 50,51 ABCG1, and ABCG4 in macrophage efflux are not firmly established in human physiology, 17 we wish to refrain from predicting to what extent CETP inhibition will affect the initial step in the RCT pathway.

Uptake and Storage of Cholesterol in Adipose Tissue

Adipose tissue is an important storage and sensing organ for cholesterol homeostasis, and the metabolic consequences of adiposity play a role in the progression of atherosclerosis. 52,53 Moreover, both adipocytes and adipose tissue-derived macrophages secrete inflammatory proteins that may contribute to the development of a systemic inflammatory state. 54 Therefore, it is of interest to underline that in addition to the liver, adipose tissue is the second major site of CETP production. 55 Maybe the adipocyte may quickly regulate plasma CETP levels in response to physiological changes. 56 Indeed, CETP gene expression in adipose tissue is significantly upregulated by dietary cholesterol as observed in hamster and human adipose tissue. 21,55 There are indications that CETP plays a role in the selective uptake of HDL CE in adipose tissue, which could accommodate removal of cholesterol from the circulation. 57,58 Vassiliou and McPherson showed in vitro that extracellular CETP (mimicking CETP in the circulation) accounts for 14% of CE-selective uptake in adipose tissue independent of the presence of apoB receptors and SR-BI. These authors propose that this so-called lateral cholesterol transport and storage may be antiatherogenic, and that CETP inhibitors may influence this process. This was addressed recently in liver cells, as is discussed below. 59

CETP may also play a role in intracellular cholesterol homeostasis Izem and Morton showed that suppression of CETP synthesis in the adipose tissue cell line SW872 causes CE accumulation. 21 CETP activity is moreover positively correlated with BMI and waist-to-hip ratio, but it is unclear whether this is cause or consequence. 60,61 Interestingly, a significant weight gain was observed in rabbits receiving JTT-705 in combination with a severe hypercholesterolemic diet for 3 months compared with controls on the same diet. 62 However, this was not observed in a previous study on a milder hypercholesterolemic diet. 63

Given this information, it could be inferred that inhibition of CETP gives rise to a reduction in lipid uptake in adipose tissue, but whether this will have an impact on cholesterol homeostasis, systemic inflammatory status, and atherosclerosis is unclear. Therefore, it would be of interest to study the effect of CETP inhibition on adipose tissue, inflammatory markers, and body weight changes.

Uptake of Cholesterol by the Liver

In mice, which lack CETP, ∼70% of circulating CE is taken up directly from HDL by the liver, 64 which is mediated by SR-BI. 65 Similar data have been obtained in the hamster, a low-CETP animal. 66 As soon as higher CETP levels come into play, the delivery route of CEs to the liver changes dramatically. In rabbits, 70% of CEs are transferred from HDL to apoB-containing particles and subsequently taken up in the liver by the LDL receptor and related receptors and only 30% via apoA-I–containing particles. 67 In humans, a recent kinetic analysis by Schwartz et al indicates that irreversible CE output from lipoproteins to the liver comes from apoB-containing particles and not from HDL. 68 This would suggest that HDL-mediated cholesterol uptake in the liver does not play an important role in humans. This could mean that CETP inhibition will affect the normal uptake of CEs in the human liver via the LDL pathway. Therefore, we discuss the effects of CETP on both HDL and LDL receptor–mediated pathways as illustrated in the Figure, 4.

SR-BI/CLA-1

CLA-1, the human homologue of SR-BI, is expressed mainly in adrenal tissues, liver, and reproductive organs and was shown to have receptor affinity for all lipoproteins, including native HDL, LDL, and VLDL, but also modified oxidized LDL (oxLDL) and acetylated LDL. 69,70 However, the data on the relationship between HDL remodeling by CETP and cholesterol uptake by SR-BI are contradicting. Kinoshita et al observed that in SR-BI–overexpressing Chinese hamster ovary cells, the uptake of CE per HDL particle is increased from CE-rich HDL of CETP-deficient individuals compared with normal HDL. 71 This suggests that SR-BI may efficiently take up cholesterol from CE-enriched HDL after loss of CETP function. In contrast, CETP enhances CE uptake in the liver of mice overexpressing human LCAT or apoA-I, 72,73 leading to less atherosclerosis in htg LCAT/CETP mice. 72 Moreover, the enhanced liver uptake was directly from HDL and not attributable to transfer to apoB-containing particles. 73 Because the role of CLA-1 in humans is not established, the implications of CETP inhibition for this cholesterol uptake route in the liver cannot be properly discussed.

LDL Receptor

As already indicated, the main route for delivery of CE to the liver in humans is thought to be mediated by apoB-containing lipoproteins. Remarkably, increased apoB catabolism has been observed in homozygous CETP deficient subjects compared with unaffected controls. 74 This is consistent with upregulation of the LDL receptor in rabbits injected with antisense CETP oligonucleotides 75 and downregulation of the LDL receptor in mice that overexpress human CETP. 76 It has been suggested that upregulation of the LDL receptor in homozygous CETP deficiency is a compensatory mechanism to counteract reduced affinity for the LDL receptor of the observed polydisperse apoB-containing particles. 77 Depending on the CETP inhibitor, marked 12,25 or modest 24,27 reductions in LDL-C have been shown in humans. A similar effect was also observed when CETP inhibitors were used in combination with statins. 12,26,27 Whether this is also attributable to an upregulation of the LDL receptor remains to be determined. Alternatively, the reduced LDL-C levels after CETP inhibition can also be explained by the decreased CETP-mediated transfer of CE from HDL to LDL. In this case, CEs are not removed from the circulation via LDL, and the influx into the liver may in fact be reduced. In this respect, it is interesting to note that after CETP inhibitor treatment, LDL size increases, particularly by a decrease in small LDL, which may suggest that the remaining LDL particles are less atherogenic. 12,13

As an alternative pathway, the uptake of CE by the liver could also be mediated via apoE-containing HDL because CETP inhibition is associated with increased apoE levels. 25,27,78 It has been shown that apoE-containing HDL particles can be taken up by the members of the LDL receptor family 79–81 but also by SR-BI. 82,83 Furthermore, Yamashita et al showed that apoE-rich HDL from CETP-deficient individuals had a higher affinity for LDL receptors on fibroblasts than LDL itself. 84 Although Clark et al did not confirm that the increase of apoE levels can be accounted for by an apoE-enrichment of HDL, it can be hypothesized that CETP inhibitors may lead to enhanced removal of CE via apoE-containing HDL particles. 25,78

Receptor-Independent Selective Uptake of HDL-CE

In 1987, Granot et al reported that addition of CETP to liver cells (HepG2) in vitro enhanced selective uptake of HDL-CE. 85 Later, this was attributed to the indirect effect of CETP-mediated transfer of HDL-CE to other lipoproteins before uptake because this presumed that selective uptake of HDL-CE could be blocked by antibodies against the LDL receptor and other apoB and apoE receptors. 86 In contrast, Gauthier et al recently observed that exogenous CETP enhanced the uptake of HDL-CE in mouse hepatocytes of both LDL receptor-null mice and SR-BI−/− mice in vitro. 59 Torcetrapib partially inhibited this selective uptake mediated by endogenous CETP in these experiments. In vivo, in adenoviral CETP-expressing mice, high doses of intravenously injected torcetrapib attenuated CETP-mediated decrease in total cholesterol only partially. The authors suggest that the remaining decrease in total cholesterol was attributable to hepatic cholesterol clearance by cell-associated CETP, and that this antiatherogenic function of CETP may not be inhibited by torcetrapib. Nevertheless, the overall importance in humans needs to be established because kinetic analysis by Schwartz suggests that selective uptake of HDL-CE in man plays a minor role in total hepatic uptake of CE. 68

In summary, CETP inhibition is likely to influence the hepatic uptake of CE from the circulation via apoE-rich HDL, maybe in combination with upregulation of the LDL receptor.

Secretion of Cholesterol by the Liver Into the Intestine

The ultimate step in the removal of cholesterol from the body is the excretion of neutral sterols and bile acids in the feces, which can be upregulated in humans by the infusion of apoA-I or reconstituted HDL (rHDL). 87,88 These studies support the idea that HDL is central to the removal of (peripheral) cholesterol in humans, and it was hypothesized that increasing HDL-C and apoA-I levels by CETP inhibition may also increase fecal cholesterol excretion. However, Brousseau et al did not observe a difference in fecal sterol excretion, even after torcetrapib induced a 100% to 125% increase in HDL-C in patients with low HDL-C at baseline. 26 Similarly, in rabbits, attenuation of CETP activity by red pepper was shown to slightly increase TG excretion but did not affect cholesterol excretion. 89 In htg CETP mice, it has also been observed that liver cholesterol levels and cholesterol synthesis are strongly affected by infusion of rHDL, but this had no effect on fecal excretion. 90 A lack of change in fecal cholesterol secretion was also observed in ABCA1 knockout mice that have almost no HDL-C in the circulation. 91 Together, these data suggest that the earlier steps in the RCT pathway (ie, the enrichment of HDL with CE), and, consequently, the increase of HDL-C, have little to do with the removal of cholesterol from the human body as a final step in RCT. On the other hand, it could be that fecal sterol excretion does not accurately reflect changes in hepatic cholesterol influx after CETP inhibition. This hypothesis is supported by the observation that rats metabolize CE taken up via HDL CE more efficiently into bile acids than CE from LDL. 92,93 Finally, it may be that torcetrapib did not induce fecal sterol excretion to the same extent as a large intravenous dose of apoA-I, but there may have been a reduction in fecal sterol excretion, which was too small to detect. Although there is no evidence that CETP inhibition stimulates fecal cholesterol excretion, overexpression of human CETP in mice has been shown to enhance fecal cholesterol excretion. 94 This effect could be related to the increased CE content of the liver of these mice, but these investigators also observed a small increase in the expression of ABCG5. Because this transporter is known to affect hepatic sterol excretion, this suggests that CETP can affect cholesterol output in this model, albeit not along the classical route of RCT. 94

In summary, these CETP inhibition data support the view that HDL may not represent the major vehicle to deliver CE to the liver for subsequent elimination in bile in humans. There is no consensus regarding the significance of this final excretion step with respect to maintaining whole body flux in RCT, neither whether this final step in RCT is actually connected to and reflects what is assumed the most important step for the atherosclerosis process (ie, cholesterol efflux from macrophages). 95,96 This leaves the question whether CETP inhibition may affect atherogenesis by altering RCT as yet unanswered.

CETP Inhibition and Anti-Inflammatory and Antioxidative Properties of HDL

It has been long recognized that apart from its role in RCT, HDL possesses properties that may reduce atherosclerosis by attenuating inflammation of the vascular wall and by preventing oxidation of LDL. 97 For details, we refer to a recent review by Barter. 98 It was recently shown that rHDL can effectively block neutrophil infiltration in the carotid artery of the rabbit, 99 an early event of inflammation of the vessel wall. 100 Other investigators reported that apoA-I can inhibit T-cell activation of macrophages, which, in turn, will reduce the production of inflammatory cytokines and chemokines. 101 In addition, through prevention of LDL oxidation, a key event in atherogenesis, HDL has also been shown to inhibit the formation of foam cells. 102,103 Most of this effect is currently attributed to enzymes that are associated with HDL (Figure, 5), but also, physicochemical properties of HDL subfractions have been implicated. 104–106 First, apoA-I was shown to prevent LDL oxidation. 102,103 Second, paraoxonase 1 (PON1), exclusively present on HDL, protects LDL from oxidation but also enhances cholesterol efflux from macrophages and, as such, may play a dual role in the protection against atherosclerosis. 107–109 Other HDL-associated enzymes that may reduce propagation of oxidation of LDL are platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH or lpPLA2) 110 and LCAT. 106,111

Because of the strong impact of CETP inhibition on HDL, it is plausible that CETP inhibition modifies the anti-inflammatory and antioxidative properties of HDL. Currently, there are no data on the effects of CETP inhibitors on changes in the anti-inflammatory properties of HDL. Antioxidative properties can be indirectly addressed by measuring resistance of LDL to oxidation or antibody levels against oxLDL, which, however, does not give information on the underlying mechanism. In 78 postmenopausal women, CETP activity and oxidation of LDL were weakly correlated. 61 In vitro, LDL incubated in plasma containing a CETP inhibiting antibody was more resistant to oxidation, indicating that CETP inhibition might reduce oxidative modification of lipoproteins. 112 In contrast, it was also shown that CETP may be antiatherogenic because it prevented cholesterol loading of oxLDL. 113 Studies in mice have also provided equivocal data. Introduction of the human CETP gene in mice did not affect oxLDL antibodies in the circulation. 114 However, in ovariectomized mice, a lack of CETP resulted in higher oxLDL antibody levels, suggesting that CETP is protective under these physiological conditions.

Data on antioxidative enzymes in CETP deficiency or after CETP inhibition are scarce. Elevation of PON1 activity was observed in 1, but not in a second homozygous CETP-deficient individual. 115 Moreover, when adjusted for HDL-C or apoA-I levels, lower specific PON1 activity was observed in CETP-deficient individuals compared with controls. This could be connected to the observation that human apoA-II can displace PON1 from HDL particles taken the increased LpAI:AII fraction in CETP deficiency. 28,116,117 Zhang et al recently showed that PON1 and PAF-AH increased significantly after treating rabbits with JTT-705, 78 but it should be noted that this was not observed by Huang et al in a previous report. 62

Recently, Bisoendial et al have assessed PON1 activity and autoantibodies against oxLDL after CETP inhibition with JTT-705 in patients with very low HDL-C. 13 The data indicate that CETP inhibition improves the antioxidative status of these individuals, but the sample size is small, and further studies are warranted.

Impact of CETP Inhibition on Atherogenesis and Concluding Remarks

The purpose of CETP inhibition therapy is to protect against CAD by reducing atherosclerosis or stabilizing vulnerable plaques. Awaiting the first human data, studies with rabbits have provided a basis for optimism. Already in 1998, Sugano et al observed markedly reduced atherosclerosis in Japanese white (JW) rabbits on a high-cholesterol diet (0.3%) using an antisense strategy that inhibits CETP expression. 75 Furthermore, 3 different vaccines that induce antibodies against CETP have been shown to reduce atherosclerosis in New Zealand white (NZW) rabbits on a cholesterol-rich diet. 118–120 Pharmacological inhibition with JTT-705 prevented atherosclerosis progression in JW rabbits on a 0.2% cholesterol diet. 63 However, no significant effects were observed in a different study in JW rabbits that received a similar dose of JTT-705, but were on a 0.25% cholesterol diet. 62 This may be explained by more severe diet-induced hypercholesterolemia in the latter rabbits, but the treatment period was also shorter. More recently, pharmacological inhibition of CETP with torcetrapib also prevented atherosclerosis in NZW rabbits on a 0.2% cholesterol/10% coconut oil diet. 121

It is a major challenge to determine what mechanisms are primarily responsible for the atheroprotective effect of CETP inhibition. Of course the marked increase in HDL-C levels is put forward but which functions of HDL are responsible for atheroprotection? Moreover, as illustrated in this review, CETP does not only affect HDL metabolism but also LDL metabolism. To protect the arterial wall against atherosclerosis, the following processes are thought important: (1) preventing inflammation, and internalization/modification of LDL to attenuate foam cell formation (2) stimulating cholesterol efflux from lipid-laden macrophages and (3) enhancing LDL uptake by the liver, thereby limiting LDL modification and plasma residence time of this atherogenic lipoprotein. The current literature provides evidence that CETP inhibition may affect each of these processes. At the same time, this review shows that many aspects regarding the functions of CETP in human metabolism and the importance of human RCT are still elusive. The first issue that remains to be resolved is the role of CETP in adipose tissue. Second, with respect to the classical concept of RCT, there is concern that CETP inhibition reduces the flux of cholesterol through RCT both by decreased recycling of HDL acceptor particles and by diminished hepatic cholesterol uptake via the LDL receptor. The unchanged fecal cholesterol excretion after CETP inhibition may be considered an indication of this however, it can also indicate that HDL is not central to liver cholesterol uptake in man. Importantly, this does not rule out that HDL serves as an initial acceptor of cholesterol from lipid-laden macrophages in the intima. There remains a strong need to determine what parameter can give us in vivo information on this crucial first step of RCT, rather than waiting for changes in arterial wall morphology or atheroma burden. Furthermore, it is not clear what the relative contribution of RCT to human atheroprotection is, especially when compared with the anti-inflammatory and antioxidation properties of HDL. Finally, this review has addressed the complex biology of CETP in RCT, but it remains to be seen whether this is relevant when it comes to atheroprotection.

Despite all the uncertainties, the impact of CETP inhibition on raising HDL-C and decreasing both LDL-C and small dense LDL illustrates its potential to reduce atherosclerosis in man. Moreover, CETP inhibition may protect against atherosclerosis by improving the anti-inflammatory and antioxidant actions of HDL, as demonstrated previously in rabbits and now for the first time in man. These data suggest that CETP inhibition goes beyond raising HDL-C levels alone.

This work was supported by the Netherlands Heart Foundation grant 2003B191.


Inhibition of constitutive protein secretion from lactating mouse mammary epithelial cells by FIL (feedback inhibitor of lactation), a secreted milk protein

M.E. Rennison, M. Kerr, C.V. Addey, S.E. Handel, M.D. Turner, C.J. Wilde, R.D. Burgoyne Inhibition of constitutive protein secretion from lactating mouse mammary epithelial cells by FIL (feedback inhibitor of lactation), a secreted milk protein. J Cell Sci 1 October 1993 106 (2): 641–648. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.106.2.641

The effect of a protein feedback inhibitor of lactation (FIL) on casein synthesis and secretion was examined using isolated acini from lactating mouse mammary gland. As previously found, FIL partially inhibited protein synthesis but produced an additional inhibition of constitutive casein secretion. The inhibition of synthesis and secretion showed similar dose-dependency and the inhibition was fully reversible. Constitutive secretion of pre-formed protein was inhibited by FIL in a pulse-chase protocol, indicating that the inhibitor regulated protein secretion by reducing protein movement through the secretory pathway independently of any initial inhibition of synthesis. Regulated exocytosis was not inhibited since casein release due to elevation of cytosolic Ca2+ concentration by the ionophore ionomycin was unaffected. Brefeldin A, which is known to block ER-to-Golgi transport, also inhibited both protein synthesis and secretion in mammary cells. The action of FIL on synthesis and secretion and previously described actions on casein degradation would be consistent with a block at an early stage in the secretory pathway. In support of this idea FIL treatment was found to result in vesiculation and swelling of the endoplasmic reticulum. These data provide evidence for a novel control of a constitutive secretory pathway by a physiological extracellular regulatory protein.


Priveste filmarea: Proteina vegetala. De unde o iei? Cantitate. Calitate. Ajuta la ceva? Ce zic studiile? Giveaway! (Noiembrie 2021).