Informație

2.4.1: Microscopie pe câmp întunecat - Biologie


OBIECTIVE DE INVATARE

  • Generalizați procesul de microscopie în câmp întunecat

Strălucire pe fundal întunecat

Microscopia cu câmp întunecat este utilizată în mod ideal pentru a ilumina probele nepătate, determinându-le să pară aprinse puternic pe un fundal întunecat. Acest tip de microscop conține un condensator special care împrăștie lumina și o face să reflecte specimenul într-un unghi. În loc să lumineze proba cu un con umplut de lumină, condensatorul este conceput pentru a forma un con gol de lumină. Lumina de la vârful conului este focalizată în planul specimenului; pe măsură ce această lumină trece peste planul specimenului, se răspândește din nou într-un con gol. Obiectivul obiectiv stă în golul întunecat al acestui con; deși lumina călătorește și depășește obiectivul obiectiv, nu intră raze în el.

Întregul câmp pare întunecat atunci când nu există probă pe etapa microscopului; astfel denumirea de microscopie în câmp întunecat. Când o probă este pe scenă, lumina de la vârful conului o lovește. Razele împrăștiate de probă și captate în obiectivul obiectiv fac astfel imaginea.

Probele observate la microscopie în câmp întunecat ar trebui să fie pregătite cu atenție, deoarece praful și alte particule împrăștie, de asemenea, lumina și sunt ușor de detectat. Lamelele de sticlă trebuie curățate temeinic de praf și murdărie străine. Poate fi necesară filtrarea mediilor de probă (agar, apă, soluție salină) pentru a exclude contaminanții confuzi. Materialele de probă trebuie să fie împrăștiate subțire; prea mult material pe diapozitiv creează multe straturi și margini suprapuse, ceea ce face dificilă interpretarea structurilor.

Microscopia în câmp întunecat are multe aplicații în microbiologie. Permite vizualizarea bacteriilor vii și distinge unele structuri (tije, tije curbate, spirale sau coci) și mișcare.

Puncte cheie

  • În microscopia cu câmp întunecat, lumina ajunge la specimen dintr-un unghi cu ajutorul unui disc opac.
  • Specimenul apare luminat pe un fundal întunecat.
  • Microscopia cu câmp întunecat este cea mai utilă pentru organismele vii extrem de mici, care sunt invizibile în microscopul cu lumină.

Termeni cheie

  • condensator: O lentilă (sau o combinație de lentile) concepută pentru a aduna lumina și a o focaliza pe un specimen sau o parte a unui mecanism.

Microscopie de coerență optică de depolarizare circulară pe câmp întunecat

Microscopia de coerență optică (OCM) este o modalitate de imagine structurală utilizată pe scară largă. Pentru a-și extinde aplicarea în imagistica moleculară, nanorodurile de aur sunt utilizate pe scară largă ca agenți de contrast pentru OCM. Cu toate acestea, ele oferă adesea o sensibilitate limitată ca urmare a raportului slab semnal / fundal. Aici demonstrăm experimental că o nouă implementare OCM bazată pe detectarea depolarizării circulare pe câmp întunecat poate detecta în mod eficient semnalul depolarizat circular de la nanoroduri de aur și, în același timp, poate suprima eficient semnalele de fundal. Acest lucru are ca rezultat o îmbunătățire semnificativă a raportului semnal / fundal.


1. Introducere

NIH prezice că vor exista aproximativ 50.000 de noi tipuri de cancer de cap și gât în ​​2016 în SUA, iar costul estimat cheltuit pentru îngrijirea cancerului de cap și gât va fi de aproximativ 4,0 miliarde de dolari [1]. Incidența cancerului la cap și gât este mult mai gravă în țările cu venituri mici și medii (LMIC). Aproximativ 1 milion de cazuri noi de cancer la cap și gât sunt așteptate în LMIC în fiecare an, în conformitate cu cele mai recente fapte de cancer și figuri [2]. Pe baza raportului de la National Cancer Data Base, rata de supraviețuire pe 5 ani este de 77% dacă cancerul de cap și gât este diagnosticat în stadiul I, în timp ce rata de supraviețuire pe 5 ani este aproape redusă la jumătate dacă este diagnosticată în stadiul IV [ 3]. Diagnosticul precoce al cancerului de cap și gât este important pentru a îmbunătăți raportul cost-beneficiu al furnizării asistenței medicale în SUA și în LMIC, unde există resurse limitate pentru tratamentul cancerului. Prin urmare, este necesară o tehnică simplă de utilizat și cu costuri reduse, care poate fi utilizată de nespecialiști și care poate diagnostica în mod eficient leziunile în stadiul lor precanceros, astfel încât să poată fi făcute intervenții cu costuri relativ mici la începutul cursului boală.

Neovascularizarea este deosebit de importantă pentru dezvoltarea cancerului, deoarece dimensiunea tumorii este limitată la 1-2 mm înainte de apariția angiogenezei, cunoscută și sub numele de activarea comutatorului angiogen [4, 5]. Odată ce comutatorul angiogen este activat, neovascularizarea se va forma în jurul regiunilor hipoxice pentru a asigura o cantitate adecvată de oxigen și nutriție pentru a alimenta creșterea tumorii. Această proliferare a vasculaturii poate fi cuantificată prin creșterea densității microvaselului și se observă în leziunile precanceroase și canceroase [6 & # x020138]. Cu toate acestea, puține studii au utilizat in vivo morfologie vasculară pentru depistarea precancerelor capului și gâtului. Spre deosebire de neovascularizare în procesul normal de vindecare a rănilor, neovasculatura indusă de tumoră este foarte dezorganizată, cu scurgeri, întortocheate și dilatate [9]. Astfel, imagistica cantitativă a neovascularizației poate fi un mijloc eficient de detectare a pre-cancerelor de cap și gât.

Mai multe tehnici optice fără etichete, inclusiv tomografia cu coerență optică (OCT) [10, 11], tomografia optică laminară (LOT) [12], microscopia cu câmp întunecat (DF) [13] și microscopia cu polarizare încrucișată (CP) [14], au fost explorate pentru imagistica vasculară neinvazivă in vivo. OCT oferă imagini vasculare fără rezoluție de înaltă rezoluție (câțiva microni) utilizând efectul Doppler cu laser rezultat din mișcarea celulelor sanguine. Adâncimea de detectare pentru TTPM în țesuturile mucoasei bucale este de aproximativ 900 și # x000b5m cu un laser de 950 nm [15, 16]. LOT utilizează modelarea Monte Carlo, oglinzile de scanare și fibrele optice pentru a reconstrui sensibilitatea la adâncime (

2 mm) imagini vasculare cu rezoluție sub-milimetrică. Atât DF cât și CP sunt tehnici simple pentru a imagina vasculatura in vivo. Microscopia DF și CP poate oferi imagini cu rezoluție micronică a vasculaturii din cavitatea bucală cu o adâncime de detectare de până la 1 mm [17, 18]. Microscopia DF este sensibilă la lumina împrăștiată înapoi, respingând în același timp reflexia speculară a țesutului, pur și simplu prin re-proiectarea diferitelor căi de iluminare și colectare cu ajutorul unui stop și iris. Microscopia CP colectează lumina numai cu polarizare ortogonală. Prin urmare, este puțin probabil ca reflexia speculară să fie colectată, deoarece starea sa de polarizare este aceeași cu lumina iluminatoare. Heger și colab. au combinat tehnici CP și DF și au demonstrat că tehnica CPDF a arătat un contrast vascular superior tehnicii CP numai [19]. Pentru a determina ce tehnică este mai potrivită pentru aplicația LMIC, am rezumat costul componentelor critice pentru sistemele tipice de microscop OCT, LOT și CPDF (Tabelul 1). Prețurile au fost estimate de la Thorlab, Prixmatix și Melles Griot. Datorită naturii cu costuri reduse și simplității proiectării sistemului pentru microscopia CPDF, am ales să investigăm modificările vasculare asociate carcinogenezei folosind microscopia CPDF.

Tabelul 1

OCTLOTMicroscopie CPDF
SursăLaser sursă măturat$35,000Laser DPSS$6,000Modul LED$2,000
DetectorDBD$1,5507 APD$8,000Cameră CMOS$350
Obiectiv
obiectiv
Obiectiv de scanare 5X$900Obiectiv de scanare 4.6X$900Planul 4X Achromat$200
Alte componente criticeSistem Galvo$2,4002 sisteme Galvo$4,800stop și iris$100
Total $39,850 $19,700 $2,650

(DBD: detector dual echilibrat, DPSS: stare solidă pompată cu diode, APD: detector fotodiodă avalanșă).

În acest studiu, am dezvoltat o tehnică low-cost și fără etichete, adică microscopie cu câmp negru polarizat încrucișat (microscopie CPDF), pentru a imagina modificările neovascularizației asociate cu pre-cancer și dezvoltarea cancerului. Imaginile vasculare au fost procesate cu un algoritm Gabor pentru a extrage în mod obiectiv și automat caracteristicile vasculare. Simulările au fost efectuate pentru a evalua acuratețea segmentării navei și extracția caracteristicii. Sensibilitatea și specificitatea pentru segmentarea vaselor măștilor Gabor au rămas ambele peste 80%, iar erorile la extracția caracteristicilor vasculare au fost sub 5%. Mai mult, contrastul vascular și diametrul vasului au fost identificați ca fiind cei doi factori primari care au afectat precizia segmentării. După ce au fost evaluate acuratețea algoritmului nostru, am monitorizat vasele de sânge într-un model de tumoră inductibilă de pungă de obraz de hamster, un model inductibil bine stabilit pentru cancerul de cap și gât [20], pe parcursul celor 17 săptămâni de inducere a tumorii. Tortuozitatea și lungimea vasculară a martorului și a pungilor de obraz tratate cu cancerigen urmează tendințe semnificativ diferite prin transformarea malignă. Rezultatele noastre sugerează că monitorizarea caracteristicilor vasculare cu microscopie CPDF cu costuri reduse este o abordare promițătoare pentru detectarea pre-cancerului capului și gâtului în LMIC.


Priveste filmarea: activitati inedite (Ianuarie 2022).