Informație

Direcția de înfășurare a nucleozomilor


Știe cineva în ce direcție sunt înfășurați nucleozomii? Mă întreb:

  1. Relativ la direcția de răsucire a spiralei duble B-ADN (dreapta)
  2. Relativ la nucleozomii vecini. Se alternează pentru a preveni supraîncărcarea?

ADN-ul în formă de B este înfășurat în jurul histonelor într-un maniera stânga rezultând un superhelix solenoidal stângaci (vezi asta, asta și asta). Motivul acestei înfășurări este că reduce tensiunea elicoidală. Această postare conține mai multe informații despre tensiunea elicoidală a ADN-ului. De asemenea, rețineți că există excepții (adică direcția cu capătul drept), în special pentru histone la centromer, așa cum este descris în această lucrare.

Pentru a doua întrebare, modul exact în care sunt aranjați nucleozomii pentru a produce fibra de cromatină este, din câte știu, încă nu este pe deplin înțeles, dar cel mai acceptat model este un aranjament în zigzag (Woodcock CL & Ghosh RP, 2010 și Grigoryev SA & Woodcock CL).


Inhibarea direcționării ADN-ului CRISPR-Cas12a de către nucleozomi și cromatină

Nucleazele genomice trebuie să aibă acces la ADN cromatizat. Aici, investigăm modul în care AsCas12a scindează ADN-ul în nucleosomii umani și în matricele de nucleozomi condensate în fază. Folosind abordări cinetice cantitative, arătăm că desfacerea dinamică a nucleozomilor reglează accesibilitatea țintă la Cas12a și determină măsura în care ambii pași de legare-recunoaștere PAM și formarea buclei R-sunt inhibați de nucleozom. Relaxarea înfășurării ADN-ului în nucleozom prin reducerea flexibilității ADN-ului, adăugarea modificărilor histonice sau introducerea dCas9 țintă-proximală îmbunătățește ratele de scindare a ADN-ului de peste 10 ori. În mod neașteptat, Cas12a clivează ușor ADN-ul linker internucleozomal în cadrul unor matrice de nucleozomi separați de fază, asemănători cromatinei. Direcționarea către ADN este redusă numai

De 5 ori datorită nucleozomilor vecini și compactării cromatinei. Această lucrare explică observația că scindarea țintă în nucleozomi apare mai rar decât scindarea în afara țintei în regiunile genomice sărăcite de nucleozomi din celule. Concluzionăm că desfacerea nucleozomilor reglementează accesibilitatea la nucleaze CRISPR-Cas și propunem că creșterea dinamicii de respirație a nucleozomilor va îmbunătăți direcționarea ADN-ului în celulele eucariote.

Copyright © 2021 Autorii, unele drepturi rezervate exclusiv de licență Asociația Americană pentru Avansarea Științei. Nicio pretenție la lucrările originale ale guvernului SUA. Distribuit sub o licență Creative Commons Attribution NonCommercial 4.0 (CC BY-NC).

Cifre

Fig. 1. Despachetarea ADN-ului reglează clivajul Cas12a ...

Fig. 1. Despachetarea ADN reglează clivajul Cas12a al țintelor nucleozomale.

Fig. 2. Nucleozomii inhibă ADN-ul Cas12a în două etape ...

Fig. 2. Nucleozomii inhibă legarea ADN-ului Cas12a în două etape.

( A ) Parcele de clivaj Cas12a dependente de concentrație ...

Fig. 3. Interferența sterică de către un proximal ...

Fig. 3. Interferența sterică de către o nuclează proximală îmbunătățește clivajul ADN nucleosomal.

Fig. 4. Matricele de nucleozomi separați de fază inhibă minim ...

Fig. 4. Matricele de nucleozomi separați de fază inhibă minim accesibilitatea ADN-ului.


Fundal

Nucleozomii sunt unitățile de bază ale ambalării ADN în eucariote. Acestea conțin

147 pb de ADN, înfășurat în jurul unui octamer histonic, în aproximativ 1,7 ture superhelice [1,2,3]. Nucleozomii au roluri multiple în interiorul nucleului. În plus față de ambalarea ADN-ului, organizarea nucleozomilor joacă un rol crucial în controlul accesibilității ADN a multor proteine ​​care se leagă de ADN la elementele reglatoare de pe cromozomi. Pozițiile nucleozomilor influențează reglarea expresiei genelor [4,5,6,7], replicarea ADN [8, 9], repararea ADN [8, 10] și recombinarea ADN-ului [11]. Importanța poziției nucleozomilor în înțelegerea acestor procese a alimentat o dezbatere dacă poziția unui nucleozom este determinată parțial de preferințele secvenței inerente [12,13,14,15,16]. Opinia cea mai general acceptată este că poziționarea nucleozomilor este determinată de o combinație de secvență ADN, enzime de remodelare dependente de ATP, factori de transcripție și ARN polimeraze alungitoare [15]. Cu toate acestea, validitatea acestei paradigme depinde de acuratețea și precizia cu care sunt mapate pozițiile in vivo ale nucleozomilor.

Pentru cartografierea pozițiilor nucleozomilor, fibra de cromatină este de obicei digerată cu nuclează micrococică (MNază) urmată de secvențierea cu randament ridicat (MNază-seq). MNase generează o gamă largă de dimensiuni ale fragmentelor chiar și la nucleozomii bine poziționați, datorită dinamicii de desfacere a ADN-ului la intrarea și ieșirea nucleozomului în comparație cu ADN-ul din apropierea axei diadei. Fragmentele care au o dimensiune cuprinsă între 130 și 160 pb pot reprezenta nucleozomi intacti, unde variația lungimii ADN-ului care se înfășoară în jurul unui octamer histonic ar putea reprezenta clivaje interne la un capăt și clivaj linker la celălalt capăt. Astfel, datorită naturii clivajului MNase, există un grad de „neclaritate” în pozițiile nucleozomului determinat de MNase-seq.

ADN-ul linker este de aproximativ 25 de ori mai susceptibil la scindarea MNazei, în comparație cu ADN-ul nucleosomal [17], ceea ce înseamnă că, după o digestie extinsă, cea mai mare parte a ADN-ului linker va fi digerat, iar ADN-ul rămas va fi foarte îmbogățit în fragmente mononucleozomale. Cu toate acestea, digestia MNase produce fragmente de ADN care sunt protejate atât de nucleozomi, cât și de proteine ​​care nu se leagă de ADN-histone [18]. MNaza are, de asemenea, o specificitate puternică a secvenței ADN [19,20,21]. Mai mult, măsurarea ocupării nucleozomilor utilizând MNase a fost o problemă și s-au ridicat întrebări cu privire la gradul în care protecția MNase măsoară ocuparea nucleozomilor spre deosebire de accesibilitatea ADN-ului [22].

Au fost introduse metode alternative care promit să ocolească aceste probleme care implică utilizarea MNazei pentru cartografierea nucleozomilor [23, 24]. În metoda de mapare a clivajului H4S47C [23], înlocuirea unei cisteine ​​cu o serină în poziția 47 a histonei H4 o transformă într-o nuclează sit-specifică prin cuplarea cisteinei cu fenantrolină ex vivo. Fenantrolina chelează un ion de cupru, care în prezența peroxidului clivează ADN-ul în vecinătatea sa locală. Scindările datorate H4S47C-fenantrolinei-Cu + apar aproape de axa pseudo-diadică, unde ADN-ul are cea mai mică mobilitate. Capetele fragmentelor de ADN rezultate aproximează foarte bine pozițiile diadelor corespunzătoare nucleozomilor care au produs clivajul. Astfel, metoda de decolteare H4S47C mapează pozițiile diadelor nucleozomice cu rezoluția perechii de baze. Inițial, această metodă a fost utilizată pentru cartografierea nucleozomilor in vitro [3, 25]. Mai recent, această metodă a fost aplicată cu succes in vivo in Saccharomyces cerevisiae [23, 26], S. pombe [27, 28], și celule stem embrionare de șoarece [29].

Scindarea chimică ancorată H4S47C are loc la pozițiile ± 1 și ± 6 pb de la centrul nucleosomal. Acest lucru are ca rezultat un fragment care se întinde de la o parte a axei diadei unui nucleozom la axa diadei nucleozomului următor sau la un clivaj nespecific la o regiune sărăcită cu nucleozomi (NDR) datorită fenantrolinei libere. Modelul decolteurilor din jurul axei diadei a fost utilizat pentru a dezvolta un algoritm bayesian de deconvoluție pentru a deduce pozițiile cele mai probabile pentru centrele nucleozomice [23]. Astfel, în cartografierea clivajului H4S47C, pozițiile nucleozomilor au fost derivate luând în considerare grupuri de multe clivaje provenite din celule diferite și prezicând cele mai probabile locații ale nucleozomilor. Cu toate acestea, clivajele de fundal în regiunile lipite de nucleozomi și regiunile linker pot complica utilizarea metodei pentru determinarea ocupării nucleozomilor. Mai mult, nucleozomii se pot forma la diferite poziții alternative în celule diferite [30,31,32], ceea ce motivează dezvoltarea unei metode care cartografieză nucleozomii individuali, mai degrabă decât să se bazeze pe coordonatele deduse pentru locația cea mai probabilă a centrelor lor.

Aici introducem o metodă alternativă de decupare chimică care evită complicațiile inerente în maparea clivajului H4S47C. Cu clivaje H4S47C, fragmentul dintre două clivaje într-un singur nucleozom este de cel mult 12 bp și este prea scurt pentru a face parte din biblioteca de secvențiere. Am emis ipoteza că mutarea cisteinei într-o poziție proximală a ADN-ului pe o histonă care este mai departe de diadă ar elibera un fragment suficient de lung pentru a fi secvențiat și cartografiat în mod unic. Acest fragment ar reprezenta un singur nucleozom și ar indica în mod direct poziția acelui nucleozom la rezoluția perechii de baze. În acest studiu, descriem un nou mutant histonic, H3Q85C, care atunci când este prezent în două copii în nucleozom eliberează un fragment de ADN de 51-bp din fiecare nucleozom în urma unei reacții de clivare chimică. Acest fragment de 51 bp dintr-o singură celulă de drojdie permite atribuirea directă și precisă a poziției nucleozomului unic. Folosind datele de decolteare H3Q85C, am cartografiat pozițiile diadei nucleozomilor, ocuparea nucleozomilor, NDR-urile și lungimile linkerului cu o precizie fără precedent. Folosind aceste date, rezolvăm caracteristicile peisajului cromatinei cu precizie ridicată și propunem un model biofizic de organizare a nucleozomilor care prezice caracteristicile majore ale poziționării nucleozomilor, în ciuda ignorării secvenței ADN.


Sekulic, N. & amp Black, B.E. Bazele moleculare ale identității și întreținerii centromerului. Tendințe Biochem. Știință. 37, 220–229 (2012).

Allshire, R.C. & amp Karpen, G.H. Reglarea epigenetică a cromatinei centromerice: câini vechi, noi trucuri? Nat. Pr. Genet. 9, 923–937 (2008).

Westhorpe, F.G. & amp Straight, A.F. Centromerul: controlul epigenetic al segregării cromozomiale în timpul mitozei. Cold Harb Harb. Perspectivă. Biol. 7, a015818 (2015).

Warburton, P.E. și colab. Imunolocalizarea CENP-A sugerează o structură nucleozomică distinctă la placa kinetochorică internă a centromerilor activi. Curr. Biol. 7, 901–904 (1997).

Amor, D.J. și colab. Repoziționarea centromerului uman „în curs”. Proc. Natl. Acad. Știință. Statele Unite ale Americii 101, 6542–6547 (2004).

Bassett, E.A. și colab. Specificația centromerului epigenetic direcționează acumularea aurorei B, dar este insuficientă pentru corectarea eficientă a erorilor mitotice. J. Cell Biol. 190, 177–185 (2010).

Earnshaw, W.C. & amp Migeon, B.R. Trei proteine ​​centromere înrudite sunt absente din centromerul inactiv al unui cromozom izodicentric stabil. Cromozom 92, 290–296 (1985).

Barnhart, M.C. și colab. HJURP este un factor de asamblare a cromatinei CENP-A suficient pentru a forma o funcționalitate de novo kinetochore. J. Cell Biol. 194, 229–243 (2011).

Hori, T., Shang, W.-H., Takeuchi, K. & amp Fukagawa, T. CCAN recrutează CENP-A în centromer și formează nucleul structural pentru asamblarea kinetochore. J. Cell Biol. 200, 45–60 (2013).

Chen, C.-C. și colab. CAL1 este Drosophila Factor de asamblare CENP-A. J. Cell Biol. 204, 313–329 (2014).

Logsdon, G.A. și colab. Atât cozile, cât și domeniul de direcționare a centromerului CENP-A sunt necesare pentru stabilirea centromerului. J. Cell Biol. 208, 521–531 (2015).

Tachiwana, H. și colab. Implicarea HJURP în de novo Recrutare CenH3 (CENP-A) și CENP-C. Rep. Celulă 11, 22–32 (2015).

Mendiburo, M.J., Padeken, J., Fülöp, S., Schepers, A. & amp Heun, P. Drosophila CENH3 este suficient pentru formarea centromerului. Ştiinţă 334, 686–690 (2011).

Guse, A., Carroll, C.W., Moree, B., Fuller, C.J. & amp Straight, A.F. In vitro ansamblu centromer și kinetochore pe șabloane de cromatină definite. Natură 477, 354–358 (2011).

Falk, S.J. și colab. Cromozomi. CENP-C remodelează și stabilizează nucleozomii CENP-A la centromer. Ştiinţă 348, 699–703 (2015).

Sekulic, N., Bassett, E.A., Rogers, D.J. & amp Black, B.E. Structura (CENP-A – H4) 2 dezvăluie trăsături fizice care marchează centromeri. Natură 467, 347–351 (2010).

Carroll, C.W., Milks, K.J. & amp Straight, A.F. Recunoașterea dublă a nucleozomilor CENP-A este necesară pentru asamblarea centromerului. J. Cell Biol. 189, 1143–1155 (2010).

Kato, H. și colab. Un mecanism conservat pentru recunoașterea nucleozomilor centromerici de către proteina centromerică CENP-C. Ştiinţă 340, 1110–1113 (2013).

Luger, K., Mäder, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F. & amp Richmond, T.J. Structura cristalină a particulei nucleozomului la o rezoluție de 2,8 Å. Natură 389, 251–260 (1997).

Harp, J.M. și colab. Analiza difracției cu raze X a cristalelor care conțin două particule nucleice simetric nucleozomice. Acta Crystallogr. D Biol. Cristalogr. 52, 283–288 (1996).

Hasson, D. și colab. Octamerul este forma majoră a nucleozomilor CENP-A la centromeri umani. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 687–695 (2013).

Lee, J.Y. & amp Lee, T.-H. Efectele metilării ADN-ului asupra structurii nucleozomilor. J. Am. Chem. Soc. 134, 173–175 (2012).

Lee, J.Y., Wei, S. & amp Lee, T.-H. Efectele acetilării histonei de către Piccolo NuA4 asupra structurii unui nucleozom și a interacțiunilor dintre doi nucleozomi. J. Biol. Chem. 286, 11099–11109 (2011).

Ngo, T.T.M. & amp Ha, T. Nucleozomii suferă o spontană lentă. Acizi nucleici Res. 43, 3964–3971 (2015).

Tachiwana, H. și colab. Structura cristalină a nucleozomului centromeric uman care conține CENP-A. Natură 476, 232–235 (2011).

Ong, MS, Richmond, T.J. & amp Davey, C.A. Extinderea ADN-ului și îndoirea extremă în nucleul nucleozomului. J. Mol. Biol. 368, 1067–1074 (2007).

Vasudevan, D., Chua, E.Y.D. & amp Davey, C.A. Structuri cristaline ale particulelor nucleozomice care conțin secvența de poziționare puternică '601'. J. Mol. Biol. 403, 1–10 (2010).

Tan, S. & amp Davey, C.A. Studii structurale asupra nucleozomilor. Curr. Opin. Struct. Biol. 21, 128–136 (2011).

Lacoste, N. și colab. Localizarea greșită a variantei de histonă centromerică CenH3 / CENP-A în celulele umane depinde de chaperona DAXX. Mol. Celula 53, 631–644 (2014).

Foltz, D.R. și colab. Complexul uman asociat cu nucleozomul CENP-A centromeric. Nat. Cell Biol. 8, 458–469 (2006).

Okada, M. și colab. Complexul CENP-H – I este necesar pentru încorporarea eficientă a CENP-A nou sintetizată în centromeri. Nat. Cell Biol. 8, 446–457 (2006).

Heun, P. și colab. Localizarea greșită a Drosophila CID histonică specifică centromerului promovează formarea kinetocorilor ectopici funcționali. Dev. Celula 10, 303–315 (2006).

Van Hooser, A.A. și colab. Specificarea cromatinei care formează kinetochore de către histona H3 varianta CENP-A. J. Cell Sci. 114, 3529–3542 (2001).

Gascoigne, K.E. și colab. Asamblarea kinetocorului ectopic indus ocolește cerința pentru nucleozomii CENP-A. Celula 145, 410–422 (2011).

Warburton, P.E. Dinamica cromozomială a formării neocentromerilor umani. Cromozom Res. 12, 617–626 (2004).

Wei, S., Falk, S.J., Black, B.E. & amp Lee, T.-H. O nouă abordare hibridă cu o singură moleculă relevă mișcarea spontană a ADN-ului în nucleozom. Acizi nucleici Res. 43, e111 (2015).

Brunger, A.T. Versiunea 1.2 a sistemului de cristalografie și RMN. Nat. Protoc. 2, 2728–2733 (2007).

Davey, G.E., Wu, B., Dong, Y., Surana, U. & amp Davey, C.A. Extinderea ADN-ului în nucleozom facilitează alchilarea de către un agent antitumoral intercalant. Acizi nucleici Res. 38, 2081–2088 (2010).

Sambrook, J. & amp Russell, D. Clonarea moleculară: un manual de laborator (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).


Discuţie

Studii recente au demonstrat că mai multe complexe de remodelare a cromatinei dependente de ATP au capacitatea de a genera mișcarea nucleozomilor în cis pe un fragment ADN specific (Hamiche și colab., 1999 Längst și colab., 1999 Whitehouse și colab., 1999 Brehm și colab., 2000 Guschin și colab., 2000). Pentru complexul ISWI NURF, alunecarea mononucleozomilor a fost demonstrată până acum pe promotorul hsp70 și pe gena ARN 5S de arici de mare (Hamiche și colab., 1999). În acest raport, am extins analiza alunecării nucleozomilor de către NURF la promotorul modelului GAL4-E4 și am caracterizat impactul motivului de legare a ADN-ului GAL4 asupra rezultatului remodelării nucleozomilor. De asemenea, am comparat caracteristicile alunecării nucleozomilor induși de NURF și a mobilității nucleozomilor induși de tratamentul termic.

Stabilitatea nucleozomilor este influențată de flexibilitatea intrinsecă, dependentă de secvență, a dublei spirale (Luger și colab., 1997 Travers și Drew, 1997 Richmond și Widom, 2000). Am observat cel puțin șase poziții de translație diferite ale nucleozomului reconstituit prin dializă cu sare pe 369 pb GAL4-E4 fragment de promotor. La încălzire, nucleozomii N1, N2 și N3 sunt induși să alunece, generând o distribuție care prezintă o oarecare similitudine cu nucleozomii mobilizați de activitatea NURF dependentă de ATP. Aceste descoperiri sugerează că mecanismul acțiunii NURF are o componentă care poate imita alterările termice ale nucleozomilor care duc la mobilitatea nucleozomilor.

Mișcarea nucleozomului indusă de NURF pe GAL4-E4 promotorul redă GAL4 site-uri doar parțial lipsite de nucleozomi. Distribuția pozițiilor nucleozomilor poate fi perturbată în continuare prin introducerea GAL4-DBD în sistemul de remodelare purificat. În conformitate cu observațiile anterioare, am constatat că legarea GAL4-DBD la ADN nucleosomal în absența enzimelor de remodelare nu duce la repoziționarea nucleozomilor (Pazin și colab., 1994 Owen-Hughes și colab., 1996 Mizuguchi și colab., 1997). Cu toate acestea, activitățile combinate ale proteinelor GAL4-DBD și NURF duc la alunecarea extinsă a nucleozomilor pentru a elimina siturile de legare GAL4, lăsând o întindere extinsă de ADN fără nucleozomi. Sugerăm că un mecanism similar de alunecare a nucleozomilor extinși ar putea explica repoziționarea documentată a nucleozomilor prin factorul GAGA, HSF și NURF pe hsp70 și hsp26 promotori (Tsukiyama și colab., 1994 Tsukiyama și Wu, 1995 Wall și colab., 1995). Este probabil ca o astfel de generație de accesibilitate la cromatină să fie necesară pentru a facilita alte etape în activarea promotorului, de ex. legarea TFIID și recrutarea ARN polimerazei II. În acest context, este de interes ca un raport recent să demonstreze contribuțiile la alunecarea nucleozomilor și de către proteina care leagă TATA și alte proteine ​​care îndoiesc ADN-ul promotor (Lomvardas și Thanos, 2001).

Amplasarea relativă a siturilor GAL4 pe nucleozom poate avea, de asemenea, o influență puternică asupra direcției mișcării nucleozomilor. Când situsurile GAL4 tandem sunt plasate asimetric pe particula nucleozomică (de exemplu, suprapunând un linker și o margine a particulei core), legarea GAL4-DBD în prezența activității NURF mobilizează nucleozomii preferențial în direcția celuilalt ADN linker nelegat. S-a demonstrat anterior că GAL4-DBD se leagă cu o afinitate mai mare la ADN-ul liber decât la nucleozomi (Taylor și colab., 1991), și se desfășoară în cooperare de la un capăt al particulei miezului până când toate siturile sunt ocupate (Vettese-Dadey și colab., 1994). Prin urmare, legarea GAL4-DBD inițiată în ADN-ul linker și răspândirea în particula miezului ar trebui să constrângă direcția de alunecare a nucleozomilor prin asigurarea unei limite dominante împotriva alunecării înapoi datorită naturii bidirecționale a mobilității nucleozomilor induși de NURF (Hamiche și colab., 1999). Luate împreună, aceste descoperiri indică faptul că un factor de legare a ADN-ului ar trebui să fie continuu necesar pentru menținerea poziționării nucleozomilor induși de NURF, o concluzie în concordanță cu rezultatele unui studiu anterior care utilizează un sistem de asamblare a cromatinei brute care conține complexe ISWI (Pazin și colab., 1997 ).

În condițiile testului nostru, legarea GAL4-DBD a extins în mare măsură alunecarea indusă de NURF în cis. Cu toate acestea, s-a raportat că legarea factorilor de transcripție precum GAL4 sau receptorul glucocorticoid la ADN nucleozomal stimulează deplasarea indusă de SWI-SNF în trans (Owen-Hughes și Workman, 1996 Owen-Hughes și colab., 1996 Ostlund Farrants și colab., 1997). Aceste descoperiri subliniază diferențele în mecanismul de remodelare între NURF și alte complexe de remodelare a cromatinei dependente de ATP. Glisarea nucleozomului indusă de NURF poate fi eficientă funcțional numai atunci când structura ADN intrinsecă a secvențelor promotor specifice permite deplasarea nucleozomilor departe de elemente pentru recunoașterea de către mașinile de transcriere. În situațiile în care secvențele promotorului dictează poziții nucleozomice inerente stabile, sau în care vecinii imobile blochează alunecarea nucleozomului indusă de NURF, poate fi necesar să se aducă proteine ​​suplimentare de remodelare precum SWI-SNF cu capacitate de alunecare îmbunătățită sau evacuare a nucleozomilor. Studiile noastre actuale ar trebui să ofere un stimul pentru investigații suplimentare cu privire la forțele de alunecare nucleozomice relative ale familiei de complexe de remodelare a cromatinei dependente de ATP.


Cuprins

Modificările posttraducționale ale histonei au fost identificate și listate ca având un potențial rol de reglare asupra sintezei ARN în 1964. [1] De atunci, de-a lungul mai multor decenii, teoria cromatinei a evoluat. Modelele de subunități ale cromatinei, precum și noțiunea de nucleozom au fost stabilite în 1973 și, respectiv, în 1974. [2] Richmond și grupul său de cercetare au reușit să elucideze structura cristalină a histonei octamer cu ADN înfășurat în jurul său la o rezoluție de 7 Å în 1984. [3] Structura complexului nucleului octameric a fost revizuită șapte ani mai târziu și o rezoluție de 3,1 Å a fost elucidată pentru cristalul său la o concentrație mare de sare. Deși similitudinea secvenței este scăzută între histonele de bază, fiecare dintre cele patru au un element repetat constând dintr-o helică-buclă-helix numită motivul pliului histonelor. [4] Mai mult, detaliile interacțiunilor proteină-proteină și proteină-ADN au fost reglate fin prin studii de cristalografie cu raze X la 2,8 și respectiv 1,9 Å, în anii 2000. [5]

Histonele de bază sunt patru proteine ​​numite H2A, H2B, H3 și H4 și toate se găsesc în părți egale în celulă. Toate cele patru secvențe de aminoacizi ale histonei de bază conțin între 20 și 24% din lizină și arginină, iar dimensiunea sau proteinele variază între 11400 și 15400 de daltoni, făcându-le proteine ​​relativ mici, dar cu încărcătură pozitivă. [6] Conținutul ridicat de aminoacizi încărcați pozitiv le permite să se asocieze strâns cu ADN încărcat negativ. Heterodimerii sau intermediarii numai cu histone se formează din domenii cu pliuri de histone. Formarea numai a intermediarilor histonici are loc atunci când histonele de bază sunt împerecheate în heterodimerul cvasi-simetric în formă de semilună interblocat. Fiecare domeniu de pliere a histonelor este compus din 3 regiuni α-helix care sunt separate de bucle dezordonate. Domeniul de pliere a histonelor este responsabil pentru formarea heterodimerilor cap la coadă a două histone: H2A-H2B și H3-H4. Cu toate acestea, histonele H3 și H4 formează mai întâi un heterodimer și apoi la rândul său heterodimerul dimerizează pentru a forma un tetramer H32-H42. [7] Formarea heterodimerului se bazează pe interacțiunea interacțiunilor de resturi de aminoacizi hidrofobi între cele două proteine. [7]

Cvasi simetria permite heterodimerului să fie suprapus pe sine printr-o rotație de 180 de grade în jurul acestei axe de simetrie. Ca urmare a rotației, două capete ale histonelor implicate în legarea ADN-ului cu forma semilunară H3-H4 sunt echivalente, totuși organizează diferite întinderi de ADN. Dimerul H2A-H2B se pliază, de asemenea, în mod similar. H32-H42 tetramerul este înfășurat cu ADN în jurul său ca un prim pas de formare a nucleozomilor. Apoi, doi dimeri H2A-H2B sunt conectați la ADN-H32-H42 complex pentru a forma un nucleozom. [8]

Fiecare dintre cele patru histone de bază, pe lângă domeniile lor de pliere a histonelor, conțin, de asemenea, extensii flexibile, nestructurate numite „cozi” de histone. [9] Tratamentul nucleozomilor cu protează tripsină indică faptul că după îndepărtarea cozilor de histone, ADN-ul este capabil să rămână strâns legat de nucleozom. [6] Cozile de histone sunt supuse unei game largi de modificări care includ fosforilarea, acetilarea și metilarea reziduurilor de serină, lizină și arginină. [6]

Particula nucleosomului este cea mai de bază formă de compactare a ADN-ului în eucariote. Nucleozomii constau dintr-un octamer histonic înconjurat de 146 perechi de baze de ADN înfășurate într-un mod superhelical. [10] Pe lângă compactarea ADN-ului, histamerul octamer joacă un rol cheie în transcrierea ADN-ului care îl înconjoară. Histona octamer interacționează cu ADN-ul atât prin pliurile histonice de bază, cât și prin cozile N-terminale. Plica histonică interacționează chimic și fizic cu canelura minoră a ADN-ului. Studiile au descoperit că histonele interacționează mai favorabil cu regiunile îmbogățite cu A: T decât regiunile îmbogățite cu G: C în canelurile minore. [6] Cozile N-terminale nu interacționează cu o regiune specifică a ADN-ului, ci mai degrabă stabilizează și ghidează ADN-ul înfășurat în jurul octamerului. Cu toate acestea, interacțiunile dintre histonele octamer și ADN nu sunt permanente. Cele două pot fi separate destul de ușor și adesea sunt în timpul replicării și transcrierii. Proteinele specifice de remodelare modifică în mod constant structura cromatinei prin ruperea legăturilor dintre ADN și nucleozom.

Interacțiuni histone / ADN Edit

Histonele sunt compuse din reziduuri de aminoacizi încărcate în mod pozitiv, cum ar fi lizina și arginina. Sarcinile pozitive le permit să se asocieze strâns cu ADN-ul încărcat negativ prin interacțiuni electrostatice. Neutralizarea sarcinilor din ADN îi permite să se împacheteze mai bine. [6]

Interacțiuni cu canelura minoră Edit

Interacțiunea domeniilor de pliere a histonelor cu canelura minoră reprezintă cea mai mare parte a interacțiunilor din nucleozom. [11] Pe măsură ce ADN-ul se înfășoară în jurul histonei octamer, acesta își expune canelura minoră la histona octamer în 14 locații distincte. La aceste locuri, cei doi interacționează printr-o serie de legături slabe, non-covalente. Sursa principală de legături provine din legăturile de hidrogen, atât directe, cât și mediate de apă. [10] Legăturile de hidrogen pliate cu histone, atât cu coloana vertebrală fosfodiesterică, cât și cu bazele bogate în A: T. În aceste interacțiuni, plica histonică se leagă de atomii de oxigen și respectiv de lanțurile laterale hidroxil. [11] Împreună, aceste situri au în total aproximativ 40 de legături de hidrogen, dintre care majoritatea provin din interacțiunile coloanei vertebrale. [6] În plus, 10 din cele 14 ori în care canelura minoră este orientată către pliul histonei, un lanț lateral de arginină din pliul histonic este introdus în canelura minoră. De celelalte patru ori, arginina provine dintr-o regiune de coadă a histonei. [11]

Interacțiuni și modificări de coadă Editați

După cum sa menționat mai sus, s-a demonstrat că cozile histonice interacționează direct cu ADN-ul nucleozomului. Fiecare histonă din octamer are o coadă N-terminală care iese din nucleul histonei. Cozile joacă roluri atât în ​​interacțiunile inter, cât și în cele intra nucleosomale, care influențează în cele din urmă accesul genelor. [12] Histonele sunt molecule încărcate pozitiv care permit o legătură mai strânsă cu molecula de ADN încărcată negativ. Reducerea încărcăturii pozitive a proteinelor histonice reduce puterea de legare între histonă și ADN, făcând-o mai deschisă la transcrierea genei (expresie). [12] Mai mult decât atât, aceste unități flexibile dirijează înfășurarea ADN-ului într-o manieră stângaci în jurul octamerului histonei în timpul formării nucleozomilor. [6] Odată ce ADN-ul este legat, cozile continuă să interacționeze cu ADN-ul. Părțile cozii cele mai apropiate de legătura de hidrogen ADN și întăresc asocierea ADN-ului cu octamerul, părțile cozii cele mai îndepărtate de ADN, însă, funcționează într-un mod foarte diferit. Enzimele celulare modifică aminoacizii din secțiunile distale ale cozii pentru a influența accesibilitatea ADN-ului. Cozile au fost, de asemenea, implicate în stabilizarea fibrelor de 30 nm. Cercetările au arătat că îndepărtarea anumitor cozi împiedică formarea corespunzătoare a nucleozomilor și eșecul general de a produce fibre de cromatină. [12] În total, aceste asociații protejează ADN-ul nucleozomal de mediul extern, dar, de asemenea, scad accesibilitatea lor la replicarea celulară și la mașinile transcripționale.

Remodelarea și demontarea nucleozomilor Edit

Pentru a accesa ADN-ul nucleozomal, legăturile dintre acesta și octamerul histonei trebuie rupte. Această schimbare are loc periodic în celulă pe măsură ce se transcriu anumite regiuni și se întâmplă la nivelul genomului în timpul replicării. Proteinele de remodelare funcționează în trei moduri distincte: pot aluneca ADN-ul de-a lungul suprafeței octamerului, pot înlocui dimerul histonei cu o variantă sau pot elimina în totalitate histamerul octamer. Indiferent de metodă, pentru a modifica nucleozomii, complexele de remodelare necesită energie din hidroliza ATP pentru a-și conduce acțiunile.

Dintre cele trei tehnici, alunecarea este cea mai comună și cea mai puțin extremă. [13] Premisa de bază a tehnicii este de a elibera o regiune de ADN pe care histamerul octamer l-ar lega în mod strâns. În timp ce tehnica nu este bine definită, cea mai proeminentă ipoteză este că alunecarea se face într-un mod „inchworm”. În această metodă, folosind ATP ca sursă de energie, domeniul translocază al complexului de remodelare a nucleozomilor detașează o mică regiune de ADN de octona histonei. Această „undă” de ADN, spargând spontan și refacând legăturile de hidrogen pe măsură ce trece, apoi se propagă în jos ADN-ul nucleozomal până ajunge la ultimul loc de legare cu octonul histonei. Odată ce unda ajunge la sfârșitul histonei octamer, excesul care a fost odată la margine se extinde în regiunea ADN-ului linker. În total, o rundă a acestei metode mută histamerul octamer mai multe perechi de baze într-o anumită direcție - departe de direcția propagată de „undă”. [6] [14]

Numeroase rapoarte arată o legătură între bolile legate de vârstă, defectele congenitale și mai multe tipuri de cancer cu întreruperea anumitor histone post-modificări translaționale. Studiile au identificat că cozile N- și C-terminale sunt ținte principale pentru acetilare, metilare, ubiquitinare și fosforilare. [15] Noi dovezi indică mai multe modificări în nucleul histonei. Cercetările se îndreaptă spre descifrarea rolului acestor modificări ale nucleului histonei la interfața histonă-ADN din cromatină. P300 și proteina de legare a elementelor de răspuns AMPc (CBP) posedă activitate histonacetiltransferazei. p300 și CBP sunt cele mai promiscuoase enzime ale histonei acetiltransferazei care acetilează toate cele patru histone de bază pe reziduuri multiple. [16] Lizina 18 și lizina 27 de pe H3 au fost singurele situsuri de acetilare a histonei reduse la epuizarea CBP și p300 în fibroblastele embrionare de șoarece. [17] De asemenea, șoarecii knockout CBP și p300 au un defect al tubului neural deschis și deci mor înainte de naștere. p300 - / - embrionii prezintă o dezvoltare defectă a inimii. Șoarecii CBP +/− prezintă o întârziere a creșterii, anomalii cranio-faciale, malignități hematologice, care nu sunt observate la șoareci cu p300 +/−. [18] Au fost raportate mutații ale ambelor p300 în tumorile umane, cum ar fi carcinoamele colorectale, gastrice, mamare, ovariene, pulmonare și pancreatice. De asemenea, activarea sau localizarea a două histone acetiltransferaze poate fi oncogenă.


Ambalarea ADN a histonelor și nucleozomii

Plierea sau înfășurarea ADN-ului și împachetarea lor strâns în interiorul nucleului. ambalarea ADN este un proces vital în eucariote și facilitează acomodarea lungimii totale a ADN în nucleul celular. unitatea de bază a ambalării ADN-ului cu proteine ​​histonice este cunoscută sub numele de nucleozom. diferența cheie între histone și nucleozomi este. Consultați mai multe prelegeri mcat și materiale de pregătire pe site-ul nostru: instructor premedhqdime: histone dave carlsondna și pachet de cromozomi dna. Histonele sunt proteinele care promovează ambalarea ADN în fibre de cromatină. proteinele histonice sunt încărcate pozitiv, posedând mai mulți aminoacizi de arginină și lizină care se leagă de ADN-ul încărcat negativ. există două tipuri de histone: histone de bază. histone linker. h2a, h2b, h3 și h4 sunt histonele de bază. Plierea sau înfășurarea ADN-ului și împachetarea lor strâns în interiorul nucleului. ambalarea ADN este un proces vital în eucariote și facilitează acomodarea lungimii totale a ADN în nucleul celular. unitatea de bază a ambalării ADN-ului cu proteine ​​histonice este cunoscută sub numele de nucleozom. diferența cheie între histone și nucleozomi este. Un nucleozom este unitatea de bază a ambalajului ADN. constă dintr-un segment de ADN înfășurat în jurul unui nucleu „octamer” de 8 proteine ​​histonice (câte două dintre histonele nucleului). „cozile” acestor proteine ​​histonice ies în afară, unde pot fi modificate de o serie de histone acetiltransferaze, metiltransferaze, parps și altele.

Unitatea de bază a ambalării ADN cu proteine ​​histonice este cunoscută sub numele de nucleozom. diferența cheie între histone și nucleozomi este că histonele sunt proteinele care împachetează și comandă ADN în nucleozomi, în timp ce nucleosomii sunt unitățile de bază ale ambalării ADN-ului. conținut. 1. prezentare generală și diferența cheie 2. ce sunt histonele 3. ce sunt. Nucleozomii sunt unitatea structurală a cromatinei. constă dintr-o întindere de ADN înfășurată în jurul unui nucleu de histone. nucleul histonei este format din opt proteine ​​histonice. prin urmare, histonele sunt structura de bază a nucleozomilor. referință: 1. „ambalarea ADN: nucleozomi și cromatină”. știri despre natură, grup de publicare despre natură, disponibil aici. Individual nucleosomes can be seen as compact particles. they sediment at

11s. the nucleosome contains

200 bp of dna associated with a histone octamer that consists of two copies each of h2a, h2b, h3, and h4. these are known as the core histones. histones h3 and h4 are among the most conserved proteins known.

Histones | Dna Packing And Nucleosomes

instructor: dave carlson dna histones and packing of chromosomes dna. learn about histone, chromatin and dna packaging, its significance and how chromosome is formed. biology professor (twitter: @drwhitneyholden) walks students through the steps of dna packaging around proteins called histones to fit inside the nucleus in a each chromosome consists of one continuous thread like molecule of dna coiled tightly around proteins, and contains a portion of the 6400000000 basepairs dna packaging animation | chromatin, histone and nucleosome modifications this animation will explain the dna packaging mechanism and the role of video explains how histones protein helps in dna packaging and nucleosome assembly. source molecular biology of the gene (4th edition) james d. watson ratemyscience publish and rate science cathepsin l as a protease responsible for proteolytically processing the n terminal h3 tail. cell. 2008 oct 17 histones this lecture explains about the histone protein structure and also about the histone acetylation and histone methylation in details. histones are this video explains the dna packaging, structure of nucelosome, histone proteins and how are they wrapping up. thank you for watching. please like created by tracy kim kovach. watch the next lesson: nucleosome solenoid model by mizanur sir #biology lectures 1. now, what is #nucleosome? nucleosome is a small unit of chromosome. 2. in past it was called this is an introductory video on histone modification and how it affects gene expression and chromatin landscape in a context dependent manner.


Rezultate

Nucleosomes adopt multiple positions on the GAL4-E4 promoter

The positioning of a histone octamer with respect to DNA sequence is a function of the intrinsic, sequence-dependent bendability of DNA over the histone octamer ( Luger și colab., 1997 Travers and Drew, 1997 Richmond and Widom, 2000 ). We analyzed the distribution of mononucleosomes on a 369 bp DNA fragment containing five tandem GAL4-binding sites upstream of the adenovirus E4 TATA box and minimal core promoter ( Pazin și colab., 1994 Mizuguchi și colab., 1997 ). Mononucleosomes were reconstituted by salt dialysis using purified histone octamers, and fractionated by native PAGE. The electrophoretic migration of nucleosomes is influenced by the length and spatial orientation of the linker DNA extending from both ends of the core particle—migration is slow for centrally located nucleosomes and increases linearly as nucleosome placement approaches either fragment end ( Duband-Goulet și colab., 1992 Meersseman și colab., 1992 ). Using this assay, at least seven nucleosome species (N1–N7) could be observed on the 369 bp GAL4-E4 promoter fragment (Figure 1A).

We mapped the positions of reconstituted nucleosomes by exonuclease III (Exo III) digestion after elution of each species from the corresponding gel band. The upstream boundary of each nucleosome was determined using the site of a prominent pause in the pattern of Exo III digestion this pause is absent from the digestion pattern of free DNA (Figure 1B). Downstream boundaries were also determined by Exo III digestion (Figure 1B), or calculated using the location of the upstream nucleosome boundary. Accordingly, N1 and N2 nucleosomes were mapped centrally over the tandem GAL4-binding sites N3, N4 and N6 nucleosomes were located further upstream the N5 nucleosome was located over the TATA box and downstream sequences, and N7/N7′, the fastest migrating nucleosomes, mapped to either end of the GAL4-E4 fragment (Figure 1).

NURF catalyzes nucleosome sliding on the GAL4-E4 promoter

To assess the influence of NURF on the distribution of nucleosomes on the GAL4-E4 fragment, we incubated 369 bp mononucleosomes with NURF and ATP, and analyzed nucleosome positions by native gel electrophoresis. A change in nucleosome distribution was clearly apparent: N1, N2, N3 and N5 nucleosomes were depleted, while N6 and N7/N7′ nucleosomes became more prevalent (Figure 2, lane 2). In addition, the N4 nucleosome was weakly detected, and a novel position located between N4 and N5 (N5′) was sometimes observed. This distribution of nucleosomes did not change after incubation with higher levels of NURF or for a longer period (data not shown), indicating that nucleosome distribution had reached equilibrium.

To examine further the movement of nucleosomes from a single location, we purified N1, N2 and N4 nucleosomes by native gel electrophoresis. After incubation with NURF and ATP, all three individual nucleosome species showed movement primarily to the N6 and N7/N7′ positions, confirming these as the favored locations when nucleosomes are mobilized by NURF (Figure 2, lanes 4, 6 and 8). The results indicate that NURF catalyzes nucleosome movement from central to peripheral positions on the 369 bp GAL4-E4 promoter, leading to partial exposure of GAL4-binding sites (see Figure 1A).

Comparison of NURF- and heat-induced nucleosome sliding

The standard protocol for reconstituting nucleosomes by dialysis of a mixture of core histones and DNA from high salt ( Rhodes and Laskey, 1989 ) apparently traps some nucleosomes in non-equilibrium positions ( Drew, 1991 Widom, 1999 ). Such reconstituted mononucleosomes have been shown to undergo temperature-induced mobility and redistribution ( Pennings și colab., 1991 Flaus and Richmond, 1998 ). We examined how heat affects the distribution of mononucleosomes reconstituted on the 369 bp GAL4-E4 promoter. Analysis of nucleosome positions showed that as 369 bp nucleosomes were heated to temperatures up to 60°C before cooling and native gel electrophoresis (at room temperature), a gradual loss of N1, N2 and N3 nucleosomes was observed. Upon heating to 60°C, N5/N6 and N7/N7′ were the preferred nucleosome positions, with N7/N7′ being dominant the N4 position remained as a weakly detected band (Figure 3A, lanes 1–5). Heat- and NURF-induced relocation of nucleosomes bear interesting similarities, although there are noticeable differences—heating resulted in greater abundance of the N7/N7′ positions and failed to reveal the novel N5′ position.

A similarity between NURF- and heat-induced nucleosome sliding was also observed using the 359 bp hsp70 promoter fragment. Both heat treatment and the action of NURF relocated nucleosomes to the preferred N3 position (Figure 3B, lanes 2 and 4). In contrast, ACF, the ISWI-containing nucleosome assembly and spacing factor ( Ito și colab., 1997 , 1999 Eberharter și colab., 2001 ) mobilized nucleosomes to the N1 and N2 positions as much as the N3 position (Figure 3B, lane 5). On the GAL4-E4 promoter, ACF induced nucleosome movement preferably to N4 more than the N6 and N7 positions (Figure 3A, lane 8).

GAL4-DBD clears nucleosomes from cognate sites

In the absence of other factors, the repositioning of nucleosomes by NURF uncovers some, but not all, of the five GAL4-binding sites on the GAL4-E4 promoter. To evaluate the influence of the GAL4-DBD on nucleosome remodeling, we incubated purified N1 or N4 nucleosomes with NURF and saturating amounts of GAL4-DBD (GAL4 residues 1–147) ( Lin și colab., 1988 Carey și colab., 1990 ). The resulting complexes of GAL4-DBD and nucleosomes were analyzed by Exo III protection (the 369 bp fragment was 5′ end-labeled at the downstream end). When the N1 nucleosome was mobilized in the presence of both GAL4-DBD and NURF, we observed strong protection from digestion by Exo III at the upstream end of the 369 bp fragment (Figure 4, lane 6). Such enhanced protection from digestion was not detected in the absence of ATP or GAL4-DBD (Figure 4, lanes 4 and 5). Similarly, the N4 nucleosome displayed enhanced protection from Exo III digestion at the upstream fragment end (Figure 4, lanes 10–12). The results indicate that nucleosomes are relocated to the upstream end (or the downstream end see below) of the DNA fragment.

To confirm these findings, we analyzed the positioning of nucleosomes by restriction enzyme analysis after micrococcal nuclease (MNase) digestion and DNA purification ( Dong și colab., 1990 Studitsky și colab., 1994 Davey și colab., 1998 Studitsky, 1999 ). Nucleosomes reconstituted with uniformly labeled, 369 bp GAL4-E4 DNA were purified by glycerol gradient centrifugation to remove free DNA and dinucleosome particles. Analysis of the size of core particle DNA upon MNase digestion showed the expected ∼150 bp DNA (Figure 5A, left panel and B, lane 1). When GAL4-DBD was incubated with 369 bp nucleosomes, MNase digestion and DNA purification revealed fragments of ∼100 bp and from ∼145 to 240 bp (Figure 5B, lane 3). We attribute the ∼100 and ∼145 bp fragments to protection from cleavage by tandemly bound GAL4-DBDs and the nucleosome core particle, respectively, and the fragment series between ∼145 and 240 bp to combined protection by N1–N7 positioned core particles and GAL4-DBDs (Figure 5A, middle panel). When NURF and ATP were included in the incubation of GAL4-DBD and the N1–N7 nucleosome population, the MNase digestion pattern strikingly resolved into a major DNA species of ∼240 bp (Figure 5B, lane 4 and illustration), which is attributed to combined protection by tandemly bound GAL4-DBDs and a nucleosome relocated to either end of the 369 bp fragment. In such experiments, we also observed a faint, ∼145 bp fragment, and increased abundance of the ∼100 bp fragment. This increase may result from MNase cleavage at a more accessible junction between the GAL4-DBDs and the relocated nucleosome core particle, or reflect some loss of histone octamers during nucleosome repositioning.

We confirmed the positional assignments of the relocated nucleosomes by restriction enzyme analysis, using a BanI site at downstream position +20 and a Fnu4H1 site at −227 upstream of the GAL4-E4 promoter (Figure 5A, right). BanI digested a fraction (33%) of the 240 bp DNA, generating 173 and 65 bp fragments. This fraction represents nucleosomes that moved to the downstream end (N7′) of the GAL4-E4 fragment (Figure 5B, lane 6 and illustration). Fnu4H1 digested 68% of the 240 bp DNA, generating fragments of 183 and 57 bp this fraction represents nucleosomes that moved to the upstream end (N7) (Figure 5B, lane 8 and illustration). Collectively, our results indicate that the combined actions of GAL4-DBD and NURF mobilize nucleosomes to either one or the other end of the 369 bp fragment, away from the tandem GAL4-binding sites.

We also studied the effects on nucleosome positioning of GAL4(1–94), which lacks the cryptic activation region of GAL4(1–147) ( Lin și colab., 1988 Carey și colab., 1989 , 1990 Workman și colab., 1991 ). GAL4(1–94) also directs NURF-induced movement of nucleosomes to either end of the 369 bp fragment (Figure 5C, lanes 2 and 4). The results indicate that the minimal DNA binding and dimerization domains of GAL4 are sufficient to direct nucleosome repositioning.

Relative placement of GAL4 modulates direction of nucleosome movement

To explore further how placement of GAL4 sites in relation to the nucleosome core particle might direct nucleosome movements, we analyzed the repositioning of purified nucleosomes in which the GAL4 sites are located asymmetrically. In the N2 nucleosome, GAL4 sites are placed inside the core particle, bordering the upstream edge, whereas the N4 nucleosome has GAL4 sites placed in the linker and overlapping the downstream edge of the core particle (Figure 6). Control experiments were performed in which purified N2 or N4 nucleosomes were treated with NURF in the absence of GAL4-DBD, followed by MNase digestion, DNA purification and BanI or Fnu4H1 cleavage to map nucleosome positions. The repositioning of nucleosomes by NURF (alone) shows a moderate preference of N2 or N4 nucleosomes for upstream locations. The N2 species moves upstream to N7, N6, N4 positions (55% Fnu4H1-sensitive ∼13% N7), or moves downstream to N7′, N5′ positions (36% BanI-sensitive ∼6% N7′). The N4 species also moves upstream to N7, N6, N4 positions (63% Fnu4H1-sensitive ∼15% N7), or downstream to N7′, N5′ positions (43% BanI-sensitive ∼3% N7′) (Figure 6A).

The inclusion of GAL4-DBD in the reaction significantly alters the outcome of NURF-induced nucleosome mobility. As indicated by the presence of the 240 bp fragment protected from MNase digestion, the combination of NURF and GAL4-DBD drives the N2 nucleosome to one or the other end of the 369 bp fragment (Figure 6B, lane 2). Digestion of the 240 bp fragment with BanI (Figure 6B, lane 3) and Fnu4H1 (Figure 6B, lane 4), indicates that N7 (36% Fnu4H1-sensitive) and N7′ (64% BanI-sensitive) are the only major nucleosome positions adopted. The N4 nucleosome shows highly preferential movement to the upstream N7 nucleosome position. Eighty-nine percent of N4 nucleosomes were driven to the N7 (Fnu4H1-sensitive) position, while 11% moved to the N7′ (BanI-sensitive) position (Figure 6B, lanes 7 and 8). Hence, the relative placement of the GAL4-binding sites on the nucleosome core particle can have a significant influence on the direction of nucleosome movement. Given the bi-directional nature of NURF-induced nucleosome mobility ( Hamiche și colab., 1999 ), the results also imply that a DNA-binding protein can impose a substantial barrier to re-entry of nucleosomes that were moved away from its cognate sites.


6 RECOGNITION OF HISTONE MODIFICATIONS BY CHROMATIN REMODELERS

Most remodeling complexes contain domains that mediate their specific association with modified histones, in addition to interaction with sequence-specific DNA-bound transcription factors. For example, CHD family members often contain two tandem chromodomains (Fig. 6) (Brehm et al. 2004). The tandem chromodomains of human CHD1 allows it to specifically recognize a methylated lysine 4 residue (H3K4me) of a histone H3 tail (Hargreaves and Crabtree 2011). Because of their inherent weakness, interactions with modified histones are not likely to be primary targeting determinants, but may modulate the activity of the enzyme once it has been recruited by other means. As H3K4 methylation is an active mark at the 5′ end of genes, chromodomain-histone interactions are believed to modulate the activity of CHD1 at promoters. In agreement with this idea, the chromodomains of yeast and Drosophila CHD1 appear to be important for their ATPase and nucleosome remodeling activities, but did not significantly affect their chromosomal localization (Hauk et al. 2010 Morettini et al. 2011). Thus, the CHD1 chromodomain interaction with methylated H3K4 may play a regulatory role of the remodeling activity beyond its recruitment to active genes.

The plant homeodomain (PHD domain) is a versatile zinc finger domain that reads histone modifications along the amino-terminal tail of histone H3 (Sanchez and Zhou 2011). A PHD domain in the BPTF subunit of the NURF complex recognizes H3K4me3 and couples this modification to nucleosome remodeling (Hargreaves and Crabtree 2011). The CHD4 subunit of the NuRD complex contains two PHD domains, the second of which recognizes H3K9me3, and the first one interacts preferentially with the amino terminus of H3 if unmodified at K4 (Mansfield et al. 2011). Remarkably, DPF3b, a factor associated with human BAF, recognizes H3K14 acetylation through tandem PHD fingers (Zeng et al. 2010). Previously, recognition of acetylated histones was primarily attributed to bromodomains.

Bromodomains have the potential to facilitate the recruitment, retention, and/or activity of chromatin remodelers on acetylated nucleosomes. The presence of acetyl-lysine-binding bromodomains in several remodeling ATPases and associated subunits suggests that some remodelers are sensitive to the acetylation state of target nucleosomes (Horn and Peterson 2001 Workman 2006). All Snf2-like ATPases contain at least one bromodomain (Fig. 6) and additional ones may be found on other subunits of the Swi/Snf type complexes (Clapier and Cairns 2009).


Eukaryotic Chromosomal Structure and Compaction

If the DNA from all 46 chromosomes in a human cell nucleus was laid out end to end, it would measure approximately two meters. However, the diameter would be only 2 nm. Considering that the size of a typical human cell is about 10 µm (100,000 cells lined up to equal one meter), DNA must be tightly packaged to fit in the cell&rsquos nucleus. At the same time, it must also be readily accessible for the genes to be expressed. During some stages of the cell cycle, the long strands of DNA are condensed into compact chromosomes. There are a number of ways that chromosomes are compacted to fit in the cell&rsquos nucleus and be accessible for gene expression.

In the first level of compaction, short stretches of the DNA double helix wrap around a core of eight histone proteins at regular intervals along the entire length of the chromosome. The DNA-histone complex is called chromatin. The beadlike, histone DNA complex is called a nucleosome. DNA connecting the nucleosomes is called linker DNA. A DNA molecule in this form is about seven times shorter than the double helix without the histones. The beads are about 10 nm in diameter, in contrast with the 2-nm diameter of a DNA double helix. The next level of compaction occurs as the nucleosomes and the linker DNA between them are coiled into a 30-nm chromatin fiber. This coiling further shortens the chromosome so that it is now about 50 times shorter than the extended form. In the third level of packing, a variety of fibrous proteins is used to pack the chromatin. These fibrous proteins also ensure that each chromosome in a non-dividing cell occupies a particular area of the nucleus that does not overlap with that of any other chromosome.

Figure (PageIndex<1>): Levels of DNA Compaction: Double-stranded DNA wraps around histone proteins to form nucleosomes that have the appearance of &ldquobeads on a string.&rdquo The nucleosomes are coiled into a 30-nm chromatin fiber. When a cell undergoes mitosis, the chromosomes condense even further.

DNA replicates in the S phase of interphase. After replication, the chromosomes are composed of two linked sister chromatids. When fully compact, the pairs of identically-packed chromosomes are bound to each other by cohesin proteins. The connection between the sister chromatids is closest in a region called the centromere. The conjoined sister chromatids, with a diameter of about 1 µm, are visible under a light microscope. The centromeric region is highly condensed and will appear as a constricted area.


Priveste filmarea: Теплый, уютный и очень удобный женский кардиган на пуговицах спицами! Расчет на любой размер! Часть2 (Ianuarie 2022).