Informație

În miozina II sunt lanțuri ușoare reglatoare și esențiale proteine ​​care leagă calciu sau locuri de fosforilare?


Conform fiziologiei mele medicale de Rhodes și Bell, descrierea lor este după cum urmează:

lanțul ușor esențial este necesar pentru stabilitatea miozinei, iar celălalt lanț numit lanț ușor de reglare este fosforilat în timpul activității musculare și servește la modularea funcției musculare *

Cu toate acestea, conform biologiei moleculare ediția a IV-a:

afirmă că lanțurile ușoare își exercită funcția prin legarea calciului, nu menționează fosforilarea.

Deci, lanțurile ușoare reglează mioza prin legarea calciului, fosforilarea sau ambele?


Răspunsul este ambele, lanțurile ușoare de reglare, reglează miozina prin fosforilare, care poate fi dependentă sau independentă de $ ce {Ca ^ 2 +} $.

Fiziologie medicală:

Activitatea lanțului ușor de reglare a miozinei este la rândul său reglată prin fosforilare prin $ ce {Ca ^ 2 +} $ -dependent și $ ce {Ca ^ 2 +} $ -kinaze independente.

Sursa care susține calciul este esențială pentru fosforilarea în mușchiul scheletului tarantulei:

Contracția este modulată în mulți mușchi striați de $ ce {Ca ^ 2 +} $ - fosforilarea dependentă de calmodulină a lanțului ușor de reglare a miozinei (RLC) de către kinaza lanțului ușor de miozină.

Fosforilarea independentă de calciu a proteinelor reglatoare de către MLCK4:

Constatăm că MLCK4 este exprimat abundent și în mușchiul cardiac, iar analizele structurale indică faptul că este o kinază independentă de $ ce {Ca ^ 2 +} $ / calmodulină (CaM), spre deosebire de $ ce {Ca ^ 2 + } CMLCK stimulat de $ / CaM.


Rolul lanțurilor ușoare de miozină

Toate miozina II convențională, indiferent dacă sunt izolate de surse musculare scheletice, netede sau nevertebrate, au două capete atașate la o coadă extinsă de 16 nm α-spirală spirală. Capul poate fi împărțit într-un domeniu motor globular de ~ 770 aminoacizi care conține siturile de legare catalitică și actină și o regiune a gâtului de ~ 70 aminoacizi care leagă un lanț ușor esențial și unul de reglare (ELC și RLC). Regiunea gâtului cu LC-urile sale asociate joacă atât roluri structurale, cât și regulatoare. În timp ce mecanismul și amploarea reglării de către LC variază pentru diferite miozine, rolul structural poate fi o caracteristică mai fundamentală a motoarelor miozinei II. Înțelegerea noastră asupra regiunii gâtului a avansat rapid în ultimii ani, în principal din cauza a două tipuri de informații: (1) structurile de înaltă rezoluție ale domeniului de legare LC din miozina scoică reglată cu filament gros (Xie și colab., 1994) și a capului miozinei scheletice nereglementate (Rayment și colab., 1993) și (2) capacitatea de a îndepărta și / sau muta porțiuni ale lanțurilor grele și ușoare pentru analiză prin in vitro teste de motilitate.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


Opțiuni de acces

Obțineți acces complet la jurnal timp de 1 an

Toate prețurile sunt prețuri NET.
TVA va fi adăugat mai târziu în casă.
Calculul impozitului va fi finalizat în timpul plății.

Obțineți acces limitat la timp sau la articol complet pe ReadCube.

Toate prețurile sunt prețuri NET.


Interacțiunea lanțurilor ușoare ale miozinei scheletice cu ionii de calciu

Vizualizările articolelor sunt suma de descărcări a articolelor cu text integral din luna noiembrie 2008 (atât PDF, cât și HTML) în conformitate cu COUNTER, în toate instituțiile și persoanele. Aceste valori sunt actualizate în mod regulat pentru a reflecta utilizarea până în ultimele zile.

Citațiile reprezintă numărul de alte articole care citează acest articol, calculat de Crossref și actualizat zilnic. Găsiți mai multe informații despre numărul de citări Crossref.

Scorul de atenție altmetric este o măsură cantitativă a atenției pe care un articol de cercetare a primit-o online. Dacă faceți clic pe pictograma gogoașă, veți încărca o pagină la altmetric.com cu detalii suplimentare despre scor și prezența social media pentru articolul dat. Găsiți mai multe informații despre Scorul de atenție altmetric și despre cum este calculat scorul.

Notă: În locul unui rezumat, aceasta este prima pagină a articolului.


DIFOFORILAȚIA LUCRULUI LUMINOS REGULATOR MIOZINA LA T18 ȘI S19

Spre deosebire de majoritatea protein kinazelor, MLCK pare să aibă un singur substrat: miozina II (4) nu există dovezi convingătoare pentru niciun alt substrat fiziologic al acestei kinaze. Cu toate acestea, s-a arătat cu mulți ani în urmă că MLCK poate fosforila restul T18 vecin în LC20, dar acest lucru este observat doar la concentrații foarte mari (nefiziologice) de MLCK și apare mai lent decât fosforilarea la S19 (26, 27). În concordanță cu acestea in vitro studii, un stimul contractil maxim (de exemplu., creșterea extracelulară [K +] până la & gt100 mM) aplicată la mușchiul neted vascular intact determină fosforilarea LC20 exclusiv la S19 (28), iar tratamentul benzilor de mușchi netede vascular cu piele de triton cu [Ca 2+] ridicat rezultă, de asemenea, în LC20 fosforilarea exclusiv la S19 (5).

Interesul pentru posibilitatea ca difosforilarea LC20 (la T18 și S19) poate avea relevanță fiziologică a fost reînviată prin studii efectuate în mai multe laboratoare cu privire la efectele tratamentului benzilor musculare netede intacte sau cu piele de triton cu inhibitori de fosfatază. De exemplu, acidul okadaic cu membrană permeabilă (29) și microcistina impermeabilă la membrană-LR (30) au indus contracții lente și susținute ale traheei de miel intacte și, respectiv, a benzilor de mușchi netede arterial caudal de șobolan, care s-au corelat cu difosforilarea LC20. Cel mai interesant, aceste răspunsuri contractile și de fosforilare au fost Ca2+ -independente. Am concluzionat că kinaza responsabilă de inhibitorul fosfatazei, indusă de Ca 2+, LC independentă20 difosforilarea și contracția nu sunt MLCK pe baza următoarelor observații: (i) Activitatea MLCK este absolut dependentă de Ca 2+ și CaM, în timp ce LC20 difosforilarea și contracția evocate prin inhibarea fosfatazei sunt Ca2+ -independente (30) (ii) îndepărtarea CaM din benzile de mușchi neted arterial caudal de șobolan cu piele de Triton, prin tratamentul cu antifonistul CaM trifluoperazină în prezența Ca 2+, nu afectează difosforilarea indusă de Ca 2+, indusă de microistină a LC20 și contracție (31) (iii) LC20 în preparatele de miofilament a fost fosforilat numai la T18 de către kinaza endogenă, în timp ce MLCK (la concentrații mari) fosforilează T18 numai după S19 a fost fosforilat (30) (iv) LC20 în preparatele miofilamentelor a fost fosforilat atât la S19 cât și la T18 ca răspuns la microcistină-LR în absența Ca 2+ (30), în timp ce MLCK poate fosforila T18 doar la concentrații foarte mari (nefiziologice) (26) și stimuli care induc activarea maximă de MLCK în țesuturile musculare netede fosforilate LC20 exclusiv la S19 (28) (v) o varietate de inhibitori MLCK (AV25, ML-7, ML-9 și wortmannin) nu au avut niciun efect asupra contracției independente a Ca 2+ sau LC20 fosforilarea (30, 31) și (vi) LC independent de Ca 2+20 activitatea kinazei ar putea fi separată de MLCK prin extracție diferențială din preparatele de miofilament sau prin cromatografie de afinitate CaM-Sepharose (30).

Ultima observație ne-a permis să izolăm kinaza de miofilamentele de gizzard de pui folosind capacitatea sa de a fosforila LC20 în absența Ca 2+ ca test. Kinaza a fost identificată prin spectrometrie de masă ca kinază legată de integrină (ILK), care a fost confirmată prin western blot cu anti-ILK (32). Kinaza a fost exprimată în Escherichiacoli și se arată că fosforilează LC20 în miozină intactă într-o manieră independentă de Ca 2+ (32). ILK a fost descoperit într-un ecran cu două hibrizi de drojdie utilizând domeniul citoplasmatic al β1-integrinei ca momeală (33). Acest lucru a ridicat întrebarea cum o kinază asociată cu integrine la nivelul membranei plasmatice ar putea fosforila miozina în miofilamente. Am constatat că există două bazine destul de discrete de ILK în celulele musculare netede: unul este îndepărtat prin tratamentul cu Triton X-100, reprezentând probabil bazinul asociat integrinei de membrană, iar celălalt este reținut după tratamentul cu detergent și este capabil de difosforilarea miozinei (32). Ultimul fond „contractil” al ILK pare să se asocieze cu fosfataza lanțului ușor miozinic (MLCP) (34), sugerând un mecanism de localizare a ILK în apropierea LC20 substrat in situ.

A existat o mare controversă în legătură cu activitatea kinazică a ILK. Inițial, examinarea secvenței de aminoacizi a ILK a indicat faptul că unele reziduuri cheie care sunt conservate printre numeroase proteine ​​serină / treonină kinaze sunt diferite în ILK. Acest lucru a condus la unii autori care au concluzionat că ILK este o pseudokinază (35, 36). Cu toate acestea, de-a lungul mai multor ani au apărut numeroase studii care susțin ILK ca fiind de bună credință kinază (revizuită în Ref. 37). De exemplu, așa cum s-a descris mai sus, am început cu o activitate kinazică, am izolat enzima și am identificat proteina ca ILK. Cu toate acestea, controversa a fost reînviată recent recent cu determinarea structurii tridimensionale a unui complex al domeniului catalitic al ILK cu C-domeniul terminal al omologiei calponinei a α-parvinului (38). Pe baza acestei structuri, s-a ajuns la concluzia că ILK nu ar putea avea activitate kinazică. Au fost făcute mai multe ipoteze pentru a ajunge la această concluzie, în special că structura reprezintă conformația activă. Cu toate acestea, am arătat că α-parvinul este de fapt un inhibitor al ILK (39). În încercarea de a rezolva controversa odată pentru totdeauna, am efectuat o analiză cinetică aprofundată și extinsă a ILK exprimată în celulele insectelor utilizând sistemul baculovirus (39). Această lucrare susține concluzia că ILK este într-adevăr un de bună credință proteină serină / treonin kinază care prezintă proprietăți neobișnuite, ceea ce explică probabil motivul pentru care a fost considerat inițial de unii ca fiind o pseudokinază.

Aplicarea inhibitorilor de fosfatază este, desigur, o intervenție nefiziologică. Cu toate acestea, au fost identificate căile de transducție a semnalului fiziologic care conduc la inhibarea MLCP (2). Acest lucru este evident mai ales în contextul sensibilizării cu Ca2+ a contracției musculaturii netede prin care o varietate de stimuli contractili, care acționează prin intermediul receptorilor cuplați la proteina G cu domeniu transmembranar cuplat la G12/13 familie de proteine ​​G heterotrimerice, declanșează activarea kinazei Rho-asociate (ROCK), ducând la fosforilarea subunității care vizează miozina (MYPT1) a MLCP și, în unele cazuri, a CPI-17 (o proteină citosolică de 17 kDa). Fosforilarea MYPT1 la T855 (și uneori T697) are ca rezultat o schimbare conformațională care este transmisă subunității catalitice rezultând o activitate redusă de fosfatază (40-42). Fosforilarea CPI-17 la T38, care poate fi, de asemenea, catalizată de protein kinaza C, permite interacțiunea sa cu subunitatea catalitică a MLCP pentru a inhiba fosfataza (43). În majoritatea setărilor fiziologice, nivelul inhibiției MLCP este insuficient pentru a demonta activitatea bazală a ILK, deci LC20 difosforilarea nu este observată ca răspuns la majoritatea stimulilor contractili. Cu toate acestea, după cum sa discutat mai târziu, LC20 difosforilarea a fost observată în țesuturile musculare netede specifice ca răspuns la stimuli anumiți. Este important de reținut că acest lucru s-ar putea datora inhibării puternice a MLCP și / sau activării ILK sau a altor kinaze capabile să fosforileze LC20 la T18 și S19. Într-adevăr, s-a demonstrat că alte câteva proteine ​​kinaze difosforilează LC20 la T18 și S19 în miozină intactă in vitro într-o manieră independentă de Ca 2+: ROCK (44), citron kinaza legată de ROCK (45) și protein kinaza care interacționează cu fermoar (ZIPK) (46, 47). Rămâne de stabilit dacă aceste kinaze îndeplinesc acest rol în mușchiul neted într-un context fiziologic. Mai mult, importanța relativă a inhibiției MLCP impotriva activarea kinazei în contextul LC20 difosforilarea rămâne necunoscută.


Rezultate

Legarea RUNX1 la MYL9 promotor de ChIP

TFSEARCH pe MYL9 fragmentul promotor (până la aproximativ 1000 pb) a dezvăluit 4 situri consens RUNX1 într-o regiune îngustă de aproximativ 100 pb: la −676 / −671 (site I) −669 / −664 (site II) −643 / −638 (site III ) și −601 / −595 (site IV Figura 1A). Am efectuat imunoprecipitări pe probe de cromatină din celule HEL folosind un anticorp anti-RUNX1 pentru a identifica o interacțiune endogenă între RUNX1 și MYL9 genă. Am amplificat prin PCR MYL9 regiunea −729 / −542 care cuprinde toate cele 4 site-uri RUNX1. The MYL9 fragmentul a fost îmbogățit cu anticorp RUNX1, dar nu cu IgG martor (Figura 1B). Aceste studii indică faptul că RUNX1 se leagă de MYL9 regiunea promotorului in vivo.

Analiza ChIP care arată interacțiunea RUNX1 cu MYL9 promotor. (A) MYL9 regiunea din amonte care prezintă 4 site-uri de consens pentru RUNX1. (B) Analiza ChIP a legării endogene RUNX1 în celulele HEL megacariocitare. Imunoprecipitarea a fost efectuată folosind IgG martor (banda 1) sau anticorp anti-RUNX1 (banda 2). Probele au fost analizate prin PCR folosind grunduri pentru MYL9 regiunea −729 / −542 nucleotide și GAPDH. Liniile 3 și 4 arată amplificarea PCR a ADN-ului total de intrare și, respectiv, a ADN-ului genomic.

Analiza ChIP care arată interacțiunea RUNX1 cu MYL9 promotor. (A) MYL9 regiunea din amonte care prezintă 4 site-uri de consens pentru RUNX1. (B) Analiza ChIP a legării endogene RUNX1 în celulele HEL megacariocitare. Imunoprecipitarea a fost efectuată folosind controlul IgG (banda 1) sau anticorp anti-RUNX1 (banda 2). Probele au fost analizate prin PCR folosind grunduri pentru MYL9 regiunea −729 / −542 nucleotide și GAPDH. Liniile 3 și 4 arată amplificarea PCR a ADN-ului total de intrare și, respectiv, a ADN-ului genomic.

Legarea RUNX1 la site-urile I (-676 / -671) și II (-669 / -664) de către EMSA

Site-ul I și site-ul II sunt separate de o singură nucleotidă. Testul de schimbare a mobilității electroforetice (EMSA) a fost efectuat folosind extracte de celule HEL și oligo Wt cu ambele situri I și II, oligo mutant-I cu mutație în situs I și oligo mutant-II cu mutație în situs II (Figura 2A). Legarea de proteine ​​a avut loc cu Wt oligo (Figura 2B, benzile 2 și 5). Acest lucru a fost redus substanțial, dar nu a lipsit cu oligo mutant I și mutant II (benzile 3 și respectiv 4), indicând implicarea siturilor I și II în legare. Legarea proteinelor de oligo Wt a fost împiedicată de concurența cu oligo excesiv neetichetat (banda 6), dar nu a fost modificată de concurența cu oligo nespecific (banda 7). Pentru a examina implicarea RUNX1 în complexul proteic, a fost efectuat un experiment de supershift cu anticorp RUNX1 (Figura 2C). Legarea la olt Wt (banda 1) a fost abolită prin concurență cu anticorpul RUNX1 (banda 2), indicând faptul că RUNX1 este implicat în complexul proteină-ADN. Implicarea situsului I și a site-ului II în legarea de proteine ​​la oligo Wt a fost evaluată în continuare prin studii de concurență folosind oligo cu mutații ale situsului I sau site-ului II (Figura 2C). Legarea la Wt oligo (banda 8) a fost afectată de concurență cu cantități crescânde de sonde neetichetate cu mutații în situl I (benzile 7-3) sau site-ul II (benzile 9-13), sugerând că ambele site-uri I și II sunt implicate în a observat legarea RUNX1.

EMSA utilizând sonda oligonucleotidică Wt cu siturile I (-676 / -671) și II (-669 / -664) în MYL9 promotor și extract nuclear din celule HEL tratate cu PMA. (A) Sonda Wt -680 / -660 bp) și sondele Mt care conțin situsuri RUNX1 mutante I și II. (B) EMSA folosind Wt și Mt oligos (benzile 1-7). Banda 1, fără benzile de extragere 2 și 5, legarea proteinei la banda de sondă Wt 3-4, legarea redusă cu sondele Mt I și Mt II banda 6, pierderea legării prin concurență cu banda de sondă Wt nemarcată 7, fără pierderea legării prin concurență cu oligo nespecific. (C) Efectul anticorpului anti-RUNX1 (benzile 1 și 2) și al creșterii cantităților de sonde mutante nemarcate I (benzile 7 la 3) și II (benzile 9 la 13) asupra legării proteinelor de oligo Wt (−680 / −660 bp). banda 1, legarea proteinelor la sonda Wt banda 2, pierderea legării cu anticorpul anti-RUNX1. Banda 8 arată legarea la sonda Wt. Liniile 7 până la 3, concurență cu cantități în creștere a benzilor de sondă mutant sit I I 9-13, concurență cu cantități crescând de sondă mutant sit II. Există o scădere a legării proteinelor la sonda Wt cu o cantitate crescândă de sondă mutantă I sau mutantă II, indicând faptul că ambele situri sunt implicate în legarea proteinelor de ADN.

EMSA utilizând sonda oligonucleotidică Wt cu siturile I (-676 / -671) și II (-669 / -664) în MYL9 promotor și extract nuclear din celule HEL tratate cu PMA. (A) Sonda Wt -680 / -660 bp) și sondele Mt care conțin situsuri RUNX1 mutante I și II. (B) EMSA folosind Wt și Mt oligos (benzile 1-7). Banda 1, fără benzile de extragere 2 și 5, legarea proteinei la banda de sondă Wt 3-4, legarea redusă cu sondele Mt I și Mt II banda 6, pierderea legării prin concurență cu banda de sondă Wt nemarcată 7, fără pierderea legării prin concurență cu oligo nespecific. (C) Efectul anticorpului anti-RUNX1 (benzile 1 și 2) și al creșterii cantităților de sonde mutante nemarcate I (benzile 7 la 3) și II (benzile 9 la 13) asupra legării proteinelor de oligo Wt (−680 / −660 bp). banda 1, legarea proteinelor la sonda Wt banda 2, pierderea legării cu anticorpul anti-RUNX1. Banda 8 arată legarea la sonda Wt. Liniile 7 până la 3, concurență cu cantități în creștere a benzilor de sondă mutant sit I I 9-13, concurență cu cantități crescând de sondă mutant sit II. Există o scădere a legării proteinelor la sonda Wt cu o cantitate crescândă de sondă mutantă I sau mutantă II, indicând faptul că ambele situri sunt implicate în legarea proteinelor de ADN.

Legarea RUNX1 la site-ul III (-643 / -638) de către EMSA

Figura 3A prezintă legarea proteinelor nucleare de site-ul III care conține oligo Wt (benzile 2 și 4), care a fost abolită prin concurență cu oligo excesiv identic nemarcat (banda 3), dar nu cu un oligo mutant nemarcat cu site-ul RUNX1 mutat (banda 5) . Legarea de proteine ​​a fost abolită cu anticorpul RUNX1 (banda 6). Aceste rezultate indică faptul că RUNX1 se leagă de site-ul III.

EMSA folosind sonde oligonucleotidice Wt cu situsul III (-643 / -638 bp) și situsul IV (-601 / -595 bp) în MYL9 promotor și extract nuclear din celulele eritroleucemiei umane (HEL) tratate cu PMA. (A) Panoul superior arată sonda Wt (−652 / −632) și sonda Mt cu site-ul III mutat. Panoul de jos prezintă EMSA folosind sonde Wt și Mt: banda 1, fără extragerea benzii 2, legarea proteinelor la sonda Wt banda 3, pierderea legării cu sonda excesivă Wt sondă banda 4, legarea proteinelor la banda Wt sonda 5, fără pierderea legării pe concurență cu sonda mutantă nemarcată banda 6, pierderea legării cu anticorpul anti-RUNX1. (B) Panoul superior arată sonda Wt (-601 / -595) și sonda Mt cu situsul mutant IV. Panoul inferior arată EMSA folosind sonde Wt și Mt. Banda 1, legarea proteinei la sonda Wt banda 2, fără pierderea legării prin concurență cu sonda mutantă nemarcată banda 3, pierderea legării cu sonda excesivă Wt banda 4, legarea proteinelor la banda Wt sonda 5, pierderea legării cu anti-RUNX1 anticorp.

EMSA utilizând sonde oligonucleotidice Wt cu situsul III (-643 / -638 bp) și situsul IV (-601 / -595 bp) în MYL9 promotor și extract nuclear din celulele eritroleucemiei umane (HEL) tratate cu PMA. (A) Panoul superior arată sonda Wt (−652 / −632) și sonda Mt cu site-ul III mutat. Panoul de jos prezintă EMSA folosind sonde Wt și Mt: banda 1, fără extragerea benzii 2, legarea proteinelor la sonda Wt banda 3, pierderea legării cu sonda excesivă Wt sondă banda 4, legarea proteinelor la banda Wt sonda 5, fără pierderea legării pe concurență cu sonda mutantă nemarcată banda 6, pierderea legării cu anticorpul anti-RUNX1. (B) Panoul superior arată sonda Wt (-601 / -595) și sonda Mt cu situsul mutant IV. Panoul inferior arată EMSA folosind sonde Wt și Mt. Banda 1, legarea proteinei la sonda Wt banda 2, fără pierderea legării prin concurență cu sonda mutantă nemarcată banda 3, pierderea legării cu sonda excesivă Wt banda 4, legarea proteinelor la banda Wt sonda 5, pierderea legării cu anti-RUNX1 anticorp.

Legarea RUNX1 la site-ul IV (-601 / -595) de către EMSA

În Figura 3B, legarea de proteine ​​a fost observată cu Wt oligo-purtător de situs IV (banda 1). Nu s-a produs nicio competiție cu oligo mutant (banda 2), dar legarea a fost abolită de oligo Wt în exces (banda 3). Legarea de Wt oligo (banda 4) a fost inhibată de anticorpul RUNX1 (banda 5). Aceste rezultate indică faptul că RUNX1 se leagă de locul IV.

Studii de legare cu RUNX1 recombinant purificat

Pentru a furniza dovezi suplimentare despre legarea RUNX1 la MYL9 am efectuat studii folosind proteina RUNX1 recombinantă (Figura 4). Figura 4A prezintă legarea proteinelor de sonda care conține siturile I și II (banda 2). Această legare a fost concurată de sonda excesivă nemarcată (banda 3), neafectată de IgG normală (banda 4) și superschimbată de anticorpul anti-RUNX1 (banda 5). Studiile cu sonde care conțin situsul III (Figura 4B) și situsul IV (Figura 4C) au arătat, de asemenea, dovezi ale legării RUNX1. În fiecare caz, s-a observat legarea specifică de proteine ​​care a fost superschimbată de anticorpul RUNX1, dar nu de IgG nespecific. În studiile cu sonde care conțin situsul IV, s-a observat o bandă nespecifică numai cu sonda (banda 1) care nu era prezentă atunci când albumina serică bovină a fost omisă din amestecul de reacție. Complexul proteic ADN proeminent observat în prezența proteinei RUNX1 (banda 2) a fost abolit prin sonda excesivă nemarcată (banda 3) și a fost schimbat de anticorpul anti-RUNX1 (săgeată), dar nu de IgG. Aceste studii indică faptul că RUNX1 se leagă de toate cele 4 site-uri.

EMSA utilizând proteine ​​recombinante RUNX1 și sonde oligonucleotidice cu situsuri de legare RUNX1. (A) Legarea proteinei RUNX1 de sonda care conține siturile I și II (−680 / −660 perechi de baze [bp]): banda 1, sondă singură banda 2, legarea proteinelor de banda Wt sonda 3, pierderea legării cu sonda Wt excesivă neetichetată banda 4, fără pierderea legării cu banda IgG normală 5, supershift cu anticorp anti-RUNX1. (B) Legarea la sonda Wt care conține situl RUNX1 III (−643 / −638 bp): banda 1, sondă singură banda 2, legarea proteinei la banda sondei 3, pierderea legării cu sonda excesivă, marcată banda 4, fără pierderea legării cu banda IgG normală 5, supershift cu anticorp anti-RUNX1. (C) Legarea la sonda care conține RUNX1 site IV (−601 / −595) banda 1, sondă singură banda 2, proteină legată la sonda banda 3, pierderea legării cu sonda excesivă fără etichetă banda 4, supershift cu anticorp anti-RUNX1 banda 5 , fără pierderea legării cu IgG normal.

EMSA utilizând proteine ​​RUNX1 recombinante și sonde oligonucleotidice cu situsuri de legare RUNX1. (A) Legarea proteinei RUNX1 de sonda care conține siturile I și II (−680 / −660 perechi de baze [bp]): banda 1, sondă singură banda 2, legarea proteinelor de banda Wt sonda 3, pierderea legării cu sonda Wt excesivă neetichetată banda 4, fără pierderi de legare cu banda IgG normală 5, supershift cu anticorp anti-RUNX1. (B) Legarea la sonda Wt care conține situl RUNX1 III (−643 / −638 bp): banda 1, sondă singură banda 2, legarea proteinei la banda sondei 3, pierderea legării cu sonda excesivă, marcată banda 4, fără pierderea legării cu banda IgG normală 5, supershift cu anticorp anti-RUNX1. (C) Legarea la sonda care conține RUNX1 site IV (−601 / −595) banda 1, sondă singură banda 2, proteină legată la sonda banda 3, pierderea legării cu sonda excesivă fără etichetă banda 4, supershift cu anticorp anti-RUNX1 banda 5 , fără pierderea legării cu IgG normal.

Analiză tranzitorie-ChIP pe Wt și Mt. MYL9 promotor

Pentru a investiga în continuare recrutarea RUNX1 către MYL9 promotor in vivo, regiunea promotor -691 / + 4 bp care poartă cele 4 situri și aceeași regiune cu site-uri RUNX1 mutate individuale au fost donate în vectorul reporter de luciferază (Figura 5). Celulele HEL au fost transfectate individual fie cu vectorul Wt, fie cu mutant-luciferază și ChIP a fost efectuat cu anticorp anti-RUNX1. Probele imunoprecipitate au fost supuse PCR folosind un set de grund (arătat de săgeți în Figura 5) unde grundul înainte corespundea cu MYL9 promotorul (-140 / -107) și primerul invers au fost specifice genei coloanei vertebrale a luciferazei, așa cum este descris în „Testul tranzitoriu ChIP”. Această amplificare PCR ar reflecta legarea RUNX1 la vectorii reporter de luciferază cu Wt sau promotor mutant. MYL9fragmentul de plasmidă de gluciferază a fost îmbogățit și amplificat în ADN precipitat cu anticorp anti-RUNX1 din celule transfectate cu construct Wt, dar nu din celule transfectate cu oricare dintre constructele mutante (Figura 5A). Acest lucru indică faptul că întreruperea oricăruia dintre cele 4 site-uri a împiedicat recrutarea RUNX1 în regiunea promotorului și, important, că toate cele 4 site-uri interacționează între ele în legarea RUNX1 observată. Ca control, nativ endogen MYL9 fragmentul −729 / −542 care cuprinde toate cele 4 situsuri RUNX1 a fost, de asemenea, amplificat în paralel de la cromatina precipitată din celulele transfectate cu Wt sau constructele mutante. Primerii utilizați au fost specifici endogeni MYL9 promotor și la fel ca anterior folosit în experimentele ChIP prezentate în Figura 1B. Acestea au arătat, așa cum era de așteptat, îmbogățirea în celule transfectate cu constructe Wt și Mt (Figura 5B). Nu s-a observat nicio amplificare în ceea ce privește GAPDH (Figura 5C banda 2).

Analiza tranzitorie ChIP utilizând Wt și Mt MYL9 promotorul (−691 / + 4) -luciferază raportor construiește în celule HEL tratate cu PMA. Celulele au fost transfectate cu structuri reporter care conțin WtMYL9 regiunea promotorului (−691 / + 4) cu site-uri RUNX1 (casete deschise) sau cu site-uri RUNX1 I-IV mutate individual (casete umplute) așa cum se arată. ChIP a fost efectuat pe aceste celule folosind anticorp anti-RUNX1 sau IgG de control. PCR a fost efectuată folosind primerii (arătați de săgeți), unde primerul direct era specific pentru MYL9 regiunea (-140 / -107) și primerul invers au fost specifice genei luciferazei (Panoul A MYL9-plasmida luciferază). Ca martor, PCR a fost efectuată folosind un al doilea set de primeri (neprezentat) în care ambii primeri erau specifici endogenului MYL9 (panoul B endogen MYL9). În plus, GAPDH a fost amplificat (C). Fiecare panou prezintă produsele PCR obținute din amplificarea probelor imunoprecipitate cu anticorpi IgG sau anti-RUNX1 și a ADN-ului de intrare. (A) Îmbogățirea (anticorpul RUNX1) a MYL9-plasmida gluciferază este observată din celulele transfectate cu plasmida Wt conținând situsuri intacte RUNX1. Acest lucru a fost abolit cu mutații în oricare dintre cele 4 site-uri RUNX1. (B) După cum era de așteptat, Wt endogen MYL9 secvența a fost amplificată de la cromatină imunoprecipitată de anticorpul anti-RUNX1 din toate transfecțiile, Wt sau Mt. (C) GAPDH nu a fost amplificată de la cromatina imunoprecipitată de la niciuna dintre transfecții.

Analiza tranzitorie ChIP utilizând Wt și Mt MYL9 promotorul (−691 / + 4) -luciferază raportor construiește în celule HEL tratate cu PMA. Celulele au fost transfectate cu structuri de reporter care conțin WtMYL9 regiunea promotorului (−691 / + 4) cu site-uri RUNX1 (casete deschise) sau cu site-uri RUNX1 I-IV mutate individual (casete umplute) așa cum se arată. ChIP a fost efectuat pe aceste celule folosind anticorp anti-RUNX1 sau IgG de control. PCR a fost efectuată folosind primerii (arătați de săgeți), unde primerul direct era specific pentru MYL9 regiunea (-140 / -107) și primerul invers au fost specifice genei luciferazei (Panoul A MYL9-plasmida luciferază). Ca martor, PCR a fost efectuată folosind un al doilea set de primeri (neprezentat) în care ambii primeri erau specifici endogenului MYL9 (panoul B endogen MYL9). În plus, GAPDH a fost amplificat (C). Fiecare panou prezintă produsele PCR obținute din amplificarea probelor imunoprecipitate cu anticorpi IgG sau anti-RUNX1 și a ADN-ului de intrare. (A) Îmbogățirea (anticorpul RUNX1) a MYL9-plasmida gluciferază este observată din celulele transfectate cu plasmida Wt conținând situsuri intacte RUNX1. Aceasta a fost abolită cu mutații în oricare dintre cele 4 site-uri RUNX1. (B) După cum era de așteptat, Wt endogen MYL9 secvența a fost amplificată de la cromatină imunoprecipitată de anticorpul anti-RUNX1 din toate transfecțiile, Wt sau Mt. (C) GAPDH nu a fost amplificată de la cromatina imunoprecipitată de la niciuna dintre transfecții.

Luciferază-reporter studii pe MYL9 promotor

Rolul RUNX1 în reglare MYL9 promotorul a fost testat prin teste de reporter de luciferază folosind constructele Wt și Mt (Figura 6). Construcția în greutate cu toate cele 4 situri RUNX1 a prezentat o activitate de aproximativ 14 ori. Mutațiile în site-urile individuale RUNX1 au dus la o reducere marcată a activității. O construcție trunchiată (−591 / + 4) care nu conține site-uri RUNX1 a arătat, de asemenea, activitate semnificativ redusă (Figura 6).

Luciferază-reporter studii pe MYL9 promotor în celulele HEL tratate cu PMA. Sunt prezentate activitatea luciferazei cu construct Wt (□) și constructele cu situsuri RUNX1 mutate I-IV (■). Mutația oricăruia dintre cele 4 site-uri RUNX1 a dus la scăderea activității reporterului, sugerând că toate cele 4 site-uri RUNX1 sunt funcționale. Este prezentat și un construct trunchiat (−591 / + 4) fără site-uri RUNX1. Mediile ± SE sunt prezentate pentru 3 experimente independente în triplicate.

Luciferază-reporter studii pe MYL9 promotor în celulele HEL tratate cu PMA. Sunt prezentate activitatea luciferazei cu construct Wt (□) și constructele cu situsuri RUNX1 mutate I-IV (■). Mutația oricăruia dintre cele 4 site-uri RUNX1 a dus la scăderea activității reporterului, sugerând că toate cele 4 site-uri RUNX1 sunt funcționale. Este de asemenea prezentat un construct trunchiat (−591 / + 4) fără site-uri RUNX1. Mediile ± SE sunt prezentate pentru 3 experimente independente în triplicate.

Îmbunătățirea MYL9 exprimarea proteinelor și activitatea promotorului prin supraexprimarea RUNX1

Analiza imunoblot a celulelor HEL transfectate cu plasmida de expresie RUNX1-pCMV6 a arătat supraexprimarea RUNX1 cu o creștere a MLC (Figura 7A). Activitatea promotorului constructului Wt MYL9 conținând toate cele 4 situsuri RUNX1 a fost semnificativ îmbunătățită prin supraexprimarea RUNX1, nu s-a observat o creștere cu mutații în situsurile RUNX1 individuale (Figura 7A). Aceste rezultate sunt în concordanță cu concluzia că toate cele 4 site-uri RUNX1 sunt implicate în reglementarea MYL9 în celulele megacariocitare.

Efectul supraexprimării RUNX1 asupra expresiei proteinei MLC și MYL9 activitatea promotorului și efectul RUNX1 siARN asupra proteinei MLC și răspândirii celulelor în colagen și fibrinogen. (A) Analiza imunoblot a RUNX1 endogen, MLC și actină după supraexprimarea RUNX1 în celulele HEL (panoul superior). Efectul supraexprimării RUNX1 asupra MYL9 activitatea promotorului (panoul de jos). Construcțiile Wt și Mt corespunzătoare situsurilor I-IV au fost cotransfectate cu vectorul de expresie RUNX1-pCMV6 (bare negre), vectorul gol pCMV6 (bare deschise) sau niciunul (bare punctate) în celulele HEL. Activitatea reporterului a fost măsurată la 48 de ore. Graficele cu bare arată activitatea ca medie (± S.E) a 3 experimente independente în trei exemplare. (B) Panoul superior: inhibarea MYL9 de RUNX1 siRNA. Celulele HEL au fost transfectate cu RUNX1 sau siRNA simulat. Sunt prezentate imunobloturi de lizat pentru RUNX1, MLC și β-actină, reprezentative pentru 3 experimente. RUNX1 ARNsi a redus expresia endogenă a proteinei RUNX1 și MLC. Panouri medii și inferioare: inhibarea răspândirii celulare pe colagen și fibrinogen de către RUNX1 siARN. Celulele au fost transfectate cu GFP singur sau cu GFP și siARN, așa cum se arată, și tratate cu PMA. Suspensiile celulare au fost însămânțate timp de 120 de minute pe lamele acoperite fie cu 50 μg / ml colagen I, fie cu 100 μg / ml fibrinogen. Celulele aderate au fost fixate și marcate cu rodamină-faloidină pentru a decora filamentele de actină. Răspândirea celulară a fost măsurată ca suprafața medie a celulei a cel puțin 25 de celule GFP-pozitive pe probă, prezentată ± SEM. Răspândirea a fost redusă semnificativ (panoul din mijloc). P valorile arată comparație pentru a controla siARN. Actina corticală a fost absentă (panoul de jos) în celulele knockdown RUNX1 expuse la colagen și fibrinogen. Bara în panoul inferior, 10 mm.

Efectul supraexprimării RUNX1 asupra expresiei proteinei MLC și MYL9 activitatea promotorului și efectul RUNX1 siARN pe proteina MLC și răspândirea celulelor în colagen și fibrinogen. (A) Analiza imunoblotă a RUNX1 endogen, MLC și actină după supraexprimarea RUNX1 în celulele HEL (panoul superior). Efectul supraexprimării RUNX1 asupra MYL9 activitatea promotorului (panoul de jos). Construcțiile Wt și Mt corespunzătoare situsurilor I-IV au fost cotransfectate cu vectorul de expresie RUNX1-pCMV6 (bare negre), vectorul gol pCMV6 (bare deschise) sau niciunul (bare punctate) în celulele HEL. Activitatea reporterului a fost măsurată la 48 de ore. Graficele cu bare arată activitatea ca medie (± S.E) a 3 experimente independente în trei exemplare. (B) Panoul superior: inhibarea MYL9 de RUNX1 siRNA. Celulele HEL au fost transfectate cu RUNX1 sau siRNA simulat. Sunt prezentate imunobloturi de lizat pentru RUNX1, MLC și β-actină, reprezentative pentru 3 experimente. RUNX1 ARNsi a redus expresia endogenă a proteinei RUNX1 și MLC. Panouri medii și inferioare: inhibarea răspândirii celulare pe colagen și fibrinogen de către RUNX1 siARN. Celulele au fost transfectate cu GFP singur sau cu GFP și siARN, așa cum se arată, și tratate cu PMA. Suspensiile celulare au fost însămânțate timp de 120 de minute pe lamele acoperite fie cu 50 μg / ml colagen I, fie cu 100 μg / ml fibrinogen. Adhered cells were fixed and labeled with rhodamine-phalloidin to decorate actin filaments. Cell spreading was measured as the mean cell surface area of at least 25 GFP-positive cells per sample, shown ± SEM. Spreading was significantly reduced (middle panel). P values show comparison to control siRNA. Cortical actin was absent (bottom panel) in RUNX1 knockdown cells exposed to collagen and fibrinogen. Bar in bottom panel, 10 mm.

Inhibition of MYL9 and cell spreading by RUNX1 siRNA

We investigated MYL9 knockdown by RUNX1 siRNA. HEL cells were transfected with either a control nonsilencing siRNA or RUNX1 siRNA. Western blot analyses showed that both RUNX1 and MLC protein were decreased by RUNX1 siRNA (Figure 7B). Because of the role of myosins and MLC in cell spreading and cytoskeletal reorganization 20,21,36 and to obtain evidence of a functional effect, we studied cell spreading on collagen and fibrinogen. The siRNA knockdown of RUNX1 led to decreased cell spreading on collagen and fibrinogen, and loss of the cortical actin that was observed in control cells (Figure 7B). This is attributable to an effect on MYL9, but a concomitant effect on other cytoskeletal genes also regulated by RUNX1 18 cannot be ruled out.


A fluorescent protein biosensor of myosin II regulatory light chain phosphorylation reports a gradient of phosphorylated myosin II in migrating cells.

Phosphorylation of the regulatory light chain by myosin light chain kinase (MLCK) regulates the motor activity of smooth muscle and nonmuscle myosin II. We have designed reagents to detect this phosphorylation event in living cells. A new fluorescent protein biosensor of myosin II regulatory light chain phosphorylation (FRLC-Rmyosin II) is described here. The biosensor depends upon energy transfer from fluorescein-labeled regulatory light chains to rhodamine-labeled essential and/or heavy chains. The energy transfer ratio increases by up to 26% when the regulatory light chain is phosphorylated by MLCK. The majority of the change in energy transfer is from regulatory light chain phosphorylation by MLCK (versus phosphorylation by protein kinase C). Folding/unfolding, filament assembly, and actin binding do not have a large effect on the energy transfer ratio. FRLC-Rmyosin II has been microinjected into living cells, where it incorporates into stress fibers and transverse fibers. Treatment of fibroblasts containing FRLC-Rmyosin II with the kinase inhibitor staurosporine produced a lower ratio of rhodamine/fluorescein emission, which corresponds to a lower level of myosin II regulatory light chain phosphorylation. Locomoting fibroblasts containing FRLC-Rmyosin II showed a gradient of myosin II phosphorylation that was lowest near the leading edge and highest in the tail region of these cells, which correlates with previously observed gradients of free calcium and calmodulin activation. Maximal myosin II motor force in the tail may contribute to help cells maintain their polarized shape, retract the tail as the cell moves forward, and deliver disassembled subunits to the leading edge for incorporation into new fibers.


INTRODUCERE

Morphogenesis is a complex set of processes in which a number of cellular functions such as signal transduction, cell movements, rearrangements and shape changes, are involved. It is desirable to employ model systems for the investigation of such complex processes. Dorsal closure is a morphogenetic event that takes place during the late stages of embryogenesis in Drosophila melanogaster. Halfway through embryogenesis, the dorsal surface of the embryo is covered by an extraembryonic membrane, the amnioserosa. Later on, the lateral epidermis stretches dorsally and spreads over the amnioserosa. The two edges of lateral epidermis meet at the dorsal midline and fuse to close the dorsal surface of the embryo. This process is carried out by elongation of the epidermal cells without proliferation or cell recruitment (Martinez-Arias, 1993).

Dorsal closure is a process well suited to studies on the molecular and cellular basis of morphogenesis, and a number of loci involved in this process have been identified from their “dorsal open” or “dorsal hole” phenotypes, which are characterized by large holes in their dorsal cuticle (Noselli, 1998). They can be grouped into at least four classes genes involved in the Jun amino-terminal kinase (JNK) signaling cascade, genes encoding the components of the Decapentaplegic (Dpp)-mediated signal transduction pathway, genes involved in the Rho GTPase-mediated signaling pathway, and genes encoding cytoskeletal proteins and membrane-associated molecules for cell adhesion. Activation of the JNK signaling cascade is required in the dorsal-most cells of the lateral epidermis, the leading edge cells, to induce the expression of Dpp (Noselli, 1998). One of the target genes of Dpp signaling is zipper (zip), which encodes the heavy chain of nonmuscle myosin II, and Dpp signaling in the leading edge cells activates the transcription of zip (Ariquier et al., 2001).

At the leading edge of the lateral epidermis, filamentous actin (F-actin) and nonmuscle myosin II are prominently accumulated. The supracellular purse-string composed of the actomyosin contractile apparatus provides one of the major forces for promoting dorsal closure (Young et al., 1993). An analysis of the zip mutations demonstrated an embryonic lethality due to defects in dorsal closure, indicating that nonmuscle myosin II is required for the morphogenetic processes in dorsal closure (Young et al., 1993). Genetic interactions between zip and mutations in the components of the Rho signaling pathway suggest that nonmuscle myosin II is regulated by the Rho signals (Halsell et al., 2000).

Nonmuscle myosin II is a hexamer composed of two of each of three subunits the heavy chain, the regulatory light chain (MRLC) and the essential light chain. The force-generating activity of actomyosin is mainly regulated by phosphorylation and dephosphorylation of MRLC. Ca 2+ /calmodulin-dependent myosin light chain kinase (MLCK) and Rho-kinase/Rokα, one of the effectors of the Rho GTPase, are responsible for the phosphorylation of MRLC (Tan et al., 1992 Amano et al., 1996). However, myosin phosphatase dephosphorylates MRLC, leading to the inactivation of nonmuscle myosin II. Myosin phosphatase is a heterotrimer composed of a catalytic subunit belonging to protein phosphatase 1c (PP1c), the myosin-binding subunit (MBS) and M20 (Alessi et al., 1992 Hartshorne et al., 1998). MBS plays the regulatory roles of myosin phosphatase as a target of the upstream signals and as a determinant of substrate specificity. Myosin phosphatase is negatively regulated through phosphorylation of MBS by Rho-kinase/Rokα (Kimura et al., 1996 Kawano et al., 1999). Thus, Rho-kinase/Rokα doubly activates nonmuscle myosin II through direct phosphorylation of MRLC and inactivation of myosin phosphatase by phosphorylating MBS (Kaibuchi et al., 1999).

We have previously identified the Drosophila homolog of Rho-kinase that is encoded by DRhk, and have demonstrated that DRho-kinase associates with the GTP-bound DRho1 and phosphorylates the vertebrate MRLC and MBS (Mizuno et al., 1999). Recently, the same gene has been characterized genetically as Drok, and has been demonstrated to be involved in the establishment of planar polarity in adult structures such as the compound eye and wing (Winter et al., 2001). We have identified the Drosophila homolog of MBS to elucidate the functions of myosin phosphatase in morphogenesis, revealing that MBS functions in dorsal closure and that it acts antagonistically to the Rho signaling cascade and its effector Rho-kinase.


MATERIALE ȘI METODE

Celulele

Polarized epithelial cell lines, dog MDCK strains II (MDCK II), and mouse MTD-1A and mouse EpH4 were donated by M. Murata (Tokyo University, Tokyo, Japan), M. Takeichi (RIKEN, Center for Developmental Biology, Kobe, Japan), and E. Reichmann (University Children's Hospital, Zurich, Switzerland), respectively. They were cultured in DMEM with 10% fetal bovine serum (FBS). For live imaging, cells were cultured in phenol red-free DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing 10% FBS, 2 mM l -glutamine, and 20 mM HEPES, pH 7.4.

Antibodies and Reagents

Commercial antibody sources included Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) (actin, NMHC-IIA, MLCK, ROCK-I, and ZIP-kinase), BD Biosciences (San Jose, CA) (MYPT1), Cell Signaling Technology (MRLC, #3672 1P-MRLC, #3675 and 2P-MRLC, #3674, phospho-cofilin), Upstate Cell Signaling Solutions (Lake Placid, NY) (phospho-Thr850 MYPT1), Covance (Princeton, NJ) (NMHC-IIB), and Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) (2P-MRLC, ROCK-II). Rabbit anti NMHC-IIC polyclonal antibody was kindly provided by R. Adelstein (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Mouse anti-cofilin monoclonal antibody was provided by T. Obinata (Chiba University, Chiba, Japan). We localized filamentous actin (F-actin) by using Alexa Fluor 488-phalloidin (Invitrogen). Fluorescein isothiocyanate-, Cy3-, or Cy5-conjugated secondary antibodies were from Jackson ImmnoResearch Laboratories (West Grove, PA). Y27632, Calyculin A, ML-7, ML-9, latrunculin A, and (±)-blebbistatin were purchased from Calbiochem (San Diego, CA). Fibronectin was purchased from Sigma-Aldrich.

Fixation Protocols

We chose the following protocols for appropriate fixation of cells depending on antibodies used.

Formaldehyde (FA).

Fixation was performed with 1 or 4% paraformaldehyde in 0.1 M HEPES buffer, pH 7.5, at room temperature or on ice for 15 min, followed by washing with PBS containing 30 mM glycine (G-PBS).

Methanol.

Cells cultured on coverslips were immersed in methanol at −20°C for 10 min, followed by washing with G-PBS.

Trichloroacetic Acid (TCA).

TCA (10%) in distilled water was made from 100% TCA (wt/vol) stock solution just before use (Hayashi și colab., 1999). Cells were immersed in ice-cold 10% TCA for 15 min and then washed with G-PBS.

Fluorescence Microscopy

Fixed specimens were stained by conventional immunofluorescence microscopy (Yonemura și colab., 2004) and observed using a Nikon Eclipse E600 microscope. Images were recorded with a cooled charge-coupled device (CCD) camera (ORCA ER, 1344 × 1024 pixels Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) controlled by a Power Macintosh G4 and the software package IPLab Spectrum version 3.5.4 (Scanalytics, Fairfax, VA), by using a Plan APO 60×/1.40 numerical aperture (NA) oil Ph3 lens. Specimens also were analyzed using a confocal microscope, LSM510 (Carl Zeiss, Jena, Germany) with a PlanAPO 63×/1.40 NA oil differential interference contrast lens.

For live imaging, cells were cultured on glass-based dishes (Iwaki or MatTek, Ashland, MA) for 3 d and observed under a Leica DMIRE2 microscope equipped with incubator at 37°C. Images were recorded with a CCD camera (SensiCam QE Cooke, Auburn Hills, MI) controlled by MetaMorph software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), by using an HCX PL APO 63×/1.40 NA oil Ph3 lens. For wound closure analysis, an Olympus IX81 equipped with a CCD camera (ORCA ER AG Hamamatsu Photonics) controlled by MetaMorph software was used.

Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Cells were treated with ice-cold 10% TCA for 10 min and then washed with phosphate-buffered saline (PBS) and harvested in SDS-sample buffer without 2-mercaptethanol. Protein concentration was determined with a BCA protein assay kit (Pierce Chemical, Rockford, IL). After adding 2-mercaptoethanol and bromphenol blue (Nacalai Tesque, Koyoto, Japan) and boiling, cell lysates containing 5 μg of proteins were resolved on polyacrylamide gel (7.5 or 15%) and transferred onto polyvinylidene difluoride membranes (Millipore, Billerica, MA). Membranes were blocked in 5% nonfat dry milk and 0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline and incubated with antibody against NMHC-IIA (1:1000), NMHC-IIB (1:1000), NMHC-IIC (1:500), MRLC (1:100), 2P-MRLC (1:1000), phospho-MYPT1 (The850, 1:500), phospho-cofilin (Ser3, 1:500), 1P-MRLC (1:1000), MYPT1 (1:1000), or cofilin (1:100). Enhanced chemiluminescence (Immobilon Western Millipore) was used to image labeled proteins.

Plasmids and Transfection

Four types of mutant human MRLC (termed AA-, AD-, DD-, or AS-MRLC) and wild type MRLC (WT-MRLC) tagged with EGFP at the C terminus had been generated previously (Uchimura și colab., 2002). MDCK II or EpH4 cells were transfected with DNA in Ca 2+ -free DMEM (Sigma-Aldrich) by using Lipofectamine Plus (Invitrogen). Stable transfectants were selected by treatment with 400 μg/ml G-418 for 2 wk. Resistant colonies were cloned by a limiting dilution method and then screened by fluorescence microscopy.

Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Analysis

MDCK II cells expressing MRLC-EGFP or its mutants were plated on glass-based 35-mm culture dishes (Asahi Techno Glass, Funabashi, Japan) coated with 50 μg/ml fibronectin and cultured for 3 d until they contained well-developed stress fibers. For FRAP measurements, cells were observed using a Delta Vision microcopy system (Applied Precision, Seattle, WA) equipped with an Olympus IX71 microscope situated in a room maintained at 37°C. Time-lapse images were recorded using a cooled CCD camera (Series300 CSNAP Photometrics, Tucson, MA). Photobleaching was achieved with a 488-nm laser beam at 20 mW for 1 s focused by a PlanApo60×/1.40 NA oil Ph3 lens by using laser optics module (Applied Precision). Data analysis was performed using Meta Imaging version 6.1 (Molecular Devices).

Wound Closure Experiments

Single or several cells in cell sheets cultured on glass-based dishes were killed using a MicroPoint laser ablation system (Photonic Instruments, St. Charles, IL) attached to an Olympus IX81 microscope using a UplanApo 40×/1.00 Oil Iris Ph3 lens as described previously (Miyake și colab., 2006).


Actin Cellular Action

Examples of actin action at the cellular level include cell motility, cytokinesis, intracellular transport of vesicles and organelles, and cell shape. Each actin monomer is bound to a molecule of ATP or ADP and the presence of one of these is essential for proper G-actin functioning.

Figure 2.102 - Attachment of actin at the cell membrane complex known as the adherens junction Wikipedia


Spectroscopic studies on invertebrate myosins and light chains

Vizualizările articolelor sunt suma de descărcări a articolelor cu text integral din luna noiembrie 2008 (atât PDF, cât și HTML) în conformitate cu COUNTER, în toate instituțiile și persoanele. Aceste valori sunt actualizate în mod regulat pentru a reflecta utilizarea până în ultimele zile.

Citațiile reprezintă numărul de alte articole care citează acest articol, calculat de Crossref și actualizat zilnic. Găsiți mai multe informații despre numărul de citări Crossref.

Scorul de atenție altmetric este o măsură cantitativă a atenției pe care un articol de cercetare a primit-o online. Dacă faceți clic pe pictograma gogoașă, veți încărca o pagină la altmetric.com cu detalii suplimentare despre scor și prezența social media pentru articolul dat. Găsiți mai multe informații despre Scorul de atenție altmetric și despre cum este calculat scorul.

Notă: În locul unui rezumat, aceasta este prima pagină a articolului.


Priveste filmarea: Bucureşti, anii 70: Cum îşi făceau temele la matematică Piţi şi Gicuţă Hagi (Ianuarie 2022).